CN110463689A - 一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法 - Google Patents

一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于原代肝细胞冻存与复苏领域。所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％溶液A、10％‑45％胎牛血清、10％二甲基亚砜和0％‑35％水，所述溶液A由如下组分组成：D‑葡萄糖、羟乙基淀粉、乳糖酸、聚乙烯吡咯烷酮、五水D‑棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽、别嘌醇、牛磺熊去氧胆酸和甘草酸二氨。本发明还公开了一种肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法。本发明的原代肝细胞冻存液可以降低原代肝细胞在冻存过程中的损伤、提高解冻后原代肝细胞活力与贴壁效率，可广泛用于肝脏基础研究与新药研发过程中。

Description

一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的 方法
技术领域
本发明涉及一种原代肝细胞冻存液、肝细胞冻存的方法及肝细胞复苏的方法，属于肝细胞冻存与复苏技术领域。
背景技术
原代肝细胞是指从肝组织取出后立即培养的肝细胞，可广泛用于基础研究与药物研发，包括肝脏研究、肝炎病毒研究，药物代谢及毒性研究。然而，分离的原代肝细胞长期保存难、个体差异大、运输困难等局限性限制了其广泛应用。冻存可以在较大程度上解决长期保存难、个体差异大、运输困难等局限性。
目前，原代肝细胞冻存液及相应肝细胞的冻存与复苏方法有两种，具体如下：
第一种，传统的癌细胞冻存液，是在DMEM培养基中加入45％v/v的FBS和10％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。冻存方法为程序降温盒于-80℃放置至少3h，最后转移到液氮中长期保存。复苏方法是置于37℃水浴锅中迅速解冻细胞，然后经过离心，去掉上清，利用铺板培养基重悬细胞即可。该冻存液在冻存癌细胞上具有优异的效果，但对原代肝细胞的冻存效果很差，存在细胞活力低、细胞难以贴壁的情况。因此，该冻存液及复苏方法并不适用于原代肝细胞的冻存与复苏。
第二种，CryoStorCS10冻存液，生产厂家为BioLifeSolutions，具体成分不详，因为生产厂家未公开，但价格昂贵，目前市场售价为3500人民币/100mL。冻存与复苏方法按该冻存液的说明书进行。采用该冻存液冻存的肝细胞，复苏后细胞活力高，但出现细胞不贴壁的几率非常大。因此，采用该冻存液冻存的肝细胞，仅可用于药物代谢研究。而药物毒性、药物诱导、肝脏基础研究等研究均需要用到贴壁的原代肝细胞。因此，该冻存液具有严重的局限性。
鉴于此，有必要提供一种新的、高效的原代肝细胞冻存液及利用其进行肝细胞冻存与复苏的方法，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的之一，提供一种原代肝细胞冻存液。本发明的原代肝细胞冻存液，具有维持肝细胞正常渗透压、保护肝细胞膜、降低冻存与复苏对肝细胞活力与贴壁能力的影响等优点。相比于现有技术的癌细胞冻存液和CryoStorCS10冻存液，采用本发明的原代肝细胞冻存液可显著提升复苏后原代肝细胞的活力与贴壁能力。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、10％-45％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜和0％-35％的水，其中，所述溶液A由如下组分组成：100mg/mL-140mg/mL的D-葡萄糖、90mg/mL-130mg/mL羟乙基淀粉、70mg/mL-90mg/mL乳糖酸、40mg/mL-60mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、30mg/mL-50mg/mL五水D-棉子糖、10mg/mL-15mg/mL氢氧化钾、6mg/mL-9mg/mL磷酸二氢钾、2mg/mL-4mg/mL七水硫酸镁、2mg/mL-4mg/mL腺苷、1mg/mL-3mg/mL还原性谷胱甘肽、0.2mg/mL-0.4mg/mL别嘌醇、5×10-3mg/mL-7×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1×10-3mg/mL-10mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
本发明的各个原料介绍：
1、D-葡萄糖
是重要的能源物质，为肝细胞提供能量。购自中国阿拉丁公司或者美国Sigma公司。以上市售产品效果大同小异，可以达到同等的预期效果。
2、聚乙烯吡咯烷酮
聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，可以阻止细胞间冰晶形成，降低冰晶对肝细胞的损伤。购自美国Sigma公司。
3、牛磺熊去氧胆酸，简称TUDCA具有利胆、细胞保护、拮抗疏水性胆汁酸的细胞毒性、抗凋亡、抗氧化的作用。购自中国阿拉丁公司或者美国Sigma公司。以上市售产品效果大同小异，可以达到同等的预期效果。
4、甘草酸二氨，具有抗炎、抗氧化、抗肝脏毒物、稳定细胞膜等作用。购自中国阿拉丁公司。
5、胎牛血清，英文全称是fetalcalfserum，简称FBS，是血清中的一种，主要是来自剖腹产的胎牛。胎牛血清是在屠宰怀孕母牛的时候，通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛血清采自出生10至14天的小牛。胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少；牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有如下作用：(1)提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。(2)提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其它激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。(3)有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。(4)是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。(5)起酸碱度缓冲液作用。(6)提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。在本发明中，胎牛血清用作为肝细胞提供短暂的营养支持，具有一定程度的保护或修复肝细胞作用。
上述胎牛血清可以市售购买，如购自美国ThermoFisherScientific公司，货号为10091148；或者购自以色列BiologicalIndustries公司，货号为04-001-1A；或者购自美国Hyclone公司，货号为SH30079.03。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等的预期效果。
6、二甲基亚砜
二甲基亚砜(DMSO)是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。购自美国Sigma公司。
7、羟乙基淀粉、乳糖酸、五水D-棉子糖、氢氧化钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、腺苷、还原性谷胱甘肽和别嘌醇，均为器官保存液——UW液的主要成分，可以保存肝脏、肾脏等器官，降低器官的冷缺血损伤。上述9种组分，购自中国阿拉丁公司或者美国Sigma公司。以上市售产品效果大同小异，可以达到同等的预期效果。在本发明中，这9种组分可显著降低原代肝细胞在超低温冻存与复苏过程中的冰晶损伤。但是，如果冻存液中仅有这9种组分，其冻存效果还是不理想，因此需要加入D-葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、牛磺熊去氧胆酸、甘草酸二氨以及胎牛血清。
本发明的原代肝细胞冻存液，采用上述15种组分的组合，并采用相应的含量，具有维持肝细胞正常渗透压、保护肝细胞膜、降低冻存与复苏对肝细胞活力与贴壁能力的影响等优点。相比于现有技术的癌细胞冻存液和CryoStor CS10冻存液，采用本发明的原代肝细胞冻存液可显著提升复苏后原代肝细胞的活力与贴壁能力。
本发明的有益效果：
(1)本发明的原代肝细胞冻存液，具有维持肝细胞正常渗透压、保护肝细胞膜、降低冻存与复苏对肝细胞活力与贴壁能力的影响等优点。相比于现有技术的癌细胞冻存液和CryoStor CS10冻存液，采用本发明的原代肝细胞冻存液可显著提升复苏后原代肝细胞的活力与贴壁能力。
(2)本发明利用上述原代肝细胞冻存液，进行肝细胞的冻存与复苏，具有细胞活力高、细胞贴壁情况优异、肝细胞形态维持好的优点，且方法简单，操作容易。
(3)本发明的原代肝细胞冻存液，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、45％的胎牛血清和10％的二甲基亚砜，其中，所述溶液A由如下组分组成：120mg/mL的D-葡萄糖、111mg/mL羟乙基淀粉、79.6mg/mL乳糖酸、51mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、39.6mg/mL五水D-棉子糖、12.5mg/mL氢氧化钾、7.56mg/mL磷酸二氢钾、2.73mg/mL七水硫酸镁、2.98mg/mL腺苷、2mg/mL还原性谷胱甘肽、0.3mg/mL别嘌醇、6×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
采用上述进一步的有益效果是：上述为最佳参数。采用上述参数得到的分离液的去除死肝细胞的效果最好。
进一步，所述甘草酸二氨由异甘草酸镁代替。
进一步，所述胎牛血清由2％v/v-4％v/v的人血白蛋白代替。
采用上述进一步的有益效果是：采用人血白蛋白，可以替代胎牛血清的作用，起到稳定渗透压，保护细胞的作用，同时排除一些使用胎牛血清引入的不安全因素，如朊病毒、PERV病毒、人畜共患病原体、支原体、过敏源等。
上述人血白蛋白可以市售购买，如购自深圳市卫光生物制品股份有限公司，国药准字S20033032。
本发明的目的之二，提供一种肝细胞冻存的方法。本发明利用上述原代肝细胞冻存液，进行肝细胞的冻存，具有减少冰晶形成而降低低温对原代肝细胞的伤害的优点，且方法简单，操作容易。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肝细胞冻存的方法，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入上述原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。
本发明的有益效果是：
本发明利用上述原代肝细胞冻存液，进行肝细胞的冻存，具有减少冰晶形成而降低低温对原代肝细胞的伤害的优点，且方法简单，操作容易。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的上述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为0.1×107个活细胞/mL-1×107个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置至少3h，最后转移到液氮中长期保存。
进一步，所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并离心；
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台盼蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力，将细胞活力大于80％的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。
更进一步，步骤1中，所述肝组织来源于鱼类、禽类、啮齿类动物、兔子、猪、狗、树鼩、猴子或者人体捐献材料中的一种或多种。
进一步，步骤1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。
进一步，步骤1中，所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配，37℃水浴锅预热60min。
上述威廉姆斯E培养基可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为12551032；或者购自美国Sigma公司，货号为W1878；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-WE001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等的预期效果。上述Ⅳ型胶原酶可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为C5138。
进一步，步骤2中，所述细胞筛的孔径为70μm。
采用上述进一步的有益效果是：细胞筛采用上述孔径，可以得到单细胞悬液。
进一步，步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v-10％v/v胎牛血清。
更进一步，所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素。
更进一步，所述胎牛血清由2％v/v-4％v/v的人血白蛋白替代。
进一步，步骤4中，所述0.4％m/v台盼蓝染色液是将0.4g台盼蓝固体溶解到100mL磷酸缓冲液中所得。
更进一步，所述磷酸缓冲液是由8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH值为7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存所得。
上述磷酸缓冲液溶液英文缩写为PBS，可以市售购买，如购自美国Hyclone公司，货号为SH30256.01。
进一步，步骤2、步骤3和步骤5中，所述离心的重力加速度均为50g，温度均为4℃，时间均为5min。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述离心条件，可以沉降活肝细胞，去除一部分死肝细胞、肝非实质细胞及细胞碎片。
本发明的目的之三，提供一种肝细胞复苏的方法。本发明对上述冻存后的肝细胞进行复苏，具有降低因急剧升温对原代肝细胞的影响、降低离心对肝细胞的影响、维持肝细胞正常渗透压等优点，且方法简单，操作容易。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种肝细胞复苏的方法，包括：取上述冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，直接用于接种，或者再静置30min-45min，经过离心，去掉上清，加入复苏培养基或者等渗溶液进行重悬。
本发明的有益效果是：
本发明对上述冻存后的肝细胞进行复苏，具有降低因急剧升温对原代肝细胞的影响、降低离心对肝细胞的影响、维持肝细胞正常渗透压等优点，且方法简单，操作容易。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述复苏培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白组成。
上述2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白是取20g-40g牛血清白蛋白，溶解到100mL威廉姆斯E培养基中，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，得到牛血清白蛋白母液，4℃保存；用时将牛血清白蛋白十倍稀释到复苏培养基中。
上述牛血清白蛋白购自中国阿拉丁公司或者美国Sigma公司。以上市售产品效果大同小异，可以达到同等的预期效果。
进一步，所述等渗溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、威廉姆斯E培养基和DMEM培养基中的一种。
上述威廉姆斯E培养基可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为12551032；或者购自美国Sigma公司，货号为W1878；或者购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-WE001。以上市售产品成分大同小异，可以达到同等的预期效果。
进一步，所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述离心条件，可以去除冻存液成分，去除一部分死肝细胞及细胞碎片。
附图说明
图1为实施例2中，利用本发明的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。其中，细胞比例尺为50μm。
图2为对比例1中，利用现有技术的癌细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。其中，细胞比例尺为50μm。
图3为实施例2中，利用本发明的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况图。其中，细胞比例尺为50μm。
图4为对比例1中，利用现有技术的癌细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况。其中，细胞比例尺为50μm。
图5为对比例2中，利用现有技术的CryoStor CS10冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。其中，细胞比例尺为50μm。
图6为对比例2中，利用现有技术的CryoStor CS10冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况。其中，细胞比例尺为50μm。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
本实施例的原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、10％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜和35％的水，其中，所述溶液A由如下组分组成：100mg/mL的D-葡萄糖、130mg/mL羟乙基淀粉、70mg/mL乳糖酸、60mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、30mg/mL五水D-棉子糖、15mg/mL氢氧化钾、6mg/mL磷酸二氢钾、4mg/mL七水硫酸镁、2mg/mL腺苷、3mg/mL还原性谷胱甘肽、0.2mg/mL别嘌醇、7×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1×10-3mg/mL-甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
一种肝细胞冻存的方法，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入上述的原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。具体为：向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的上述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为0.1×107个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置3h，最后转移到液氮中长期保存。
所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的树鼩肝组织，用灌注溶液I灌注10min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min，pH值为7.0，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。上述上述威廉姆斯E培养基可以市售购买，如购自美国Thermo Fisher Scientific公司，货号为12551032。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并离心。其中，所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v胎牛血清；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台盼蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液。所述0.4％m/v台盼蓝染色液是将0.4g台盼蓝固体溶解到100mL磷酸缓冲液中所得，所述磷酸缓冲液是由8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH值为7.2-7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存所得。
迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板插入计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。将细胞活力大于80％的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。
一种肝细胞复苏的方法，包括：取上述冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，直接用于接种。其中，所述复苏培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v的牛血清白蛋白组成。
实施例2
本实施例的原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、45％的胎牛血清和10％的二甲基亚砜，其中，所述溶液A由如下组分组成：120mg/mL的D-葡萄糖、111mg/mL羟乙基淀粉、79.6mg/mL乳糖酸、51mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、39.6mg/mL五水D-棉子糖、12.5mg/mL氢氧化钾、7.56mg/mL磷酸二氢钾、2.73mg/mL七水硫酸镁、2.98mg/mL腺苷、2mg/mL还原性谷胱甘肽、0.3mg/mL别嘌醇、6×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
一种肝细胞冻存的方法，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入上述的原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。具体为：向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的上述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为0.5×107个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置6h，最后转移到液氮中长期保存。
所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的大鼠肝组织，用灌注溶液I灌注10min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解45min，pH值为7.2，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。上述威廉姆斯E培养基可以市售购买，如购自立沃生物科技(深圳)有限公司，货号为LV-WE001。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并离心。其中，所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和8％v/v胎牛血清；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台酚蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液。所述0.4％m/v台酚蓝染色液是将0.4g台酚蓝固体溶解到100mL磷酸缓冲液中所得，所述磷酸缓冲液是由8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH值为7.2，高压蒸汽灭菌，4℃保存所得。
迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板插入计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。将细胞活力大于80％的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。
一种肝细胞复苏的方法，包括：取上述冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，再静置30min，经过离心，去掉上清，加入复苏培养基进行重悬。其中，所述复苏培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v的牛血清白蛋白组成。所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
实施例3
本实施例的原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、25％的人血白蛋白、10％的二甲基亚砜和20％的水，其中，所述溶液A由如下组分组成：140mg/mL的D-葡萄糖、90mg/mL羟乙基淀粉、90mg/mL乳糖酸、40mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、50mg/mL五水D-棉子糖、10mg/mL氢氧化钾、9mg/mL磷酸二氢钾、2mg/mL七水硫酸镁、4mg/mL腺苷、1mg/mL还原性谷胱甘肽、0.4mg/mL别嘌醇、5×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和10mg/mL甘草酸二氨。人血白蛋白可以市售购买，如购自深圳市卫光生物制品股份有限公司，国药准字S20033032，其中蛋白浓度为20％，在本实施例使用时，用超纯水(ddH2O)稀释至3v/v％。调pH值至7.4,4℃保存。
一种肝细胞冻存的方法，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入上述的原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。具体为：向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的上述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为1×107个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置4h，最后转移到液氮中长期保存。
所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的鸡肝组织，用灌注溶液I灌注10min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织。其中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得。所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，37℃水浴锅溶解30min，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配。上述威廉姆斯E培养基可以市售购买，如购自美国Sigma公司，货号为W1878。
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过孔径为70μm的细胞筛，得到单细胞悬液并离心。其中，所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液。其中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和10％v/v人血白蛋白；所述青链霉素中，含有100U/mL的青霉素和100mg/mL的链霉素；所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
进一步，步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和8％v/v胎牛血清。
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台盼蓝染色液以体积比1:1混匀，得到混合液。所述0.4％m/v台盼蓝染色液是将0.4g台盼蓝固体溶解到100mL磷酸缓冲液中所得，所述磷酸缓冲液是由8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾组成，pH值为7.2，高压蒸汽灭菌，4℃保存所得。
迅速将20μL混合液加入到计数板中，然后将该计数板插入计数仪中，在计数仪上读出相应的细胞密度与细胞活力。将细胞活力大于80％的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。
一种肝细胞复苏的方法，包括：取上述冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，再静置45min，经过离心，去掉上清，加入等渗溶液进行重悬。其中，所述复苏培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和4％m/v的牛血清白蛋白组成。所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。所述等渗溶液为生理盐水。
对比例1
对比例1采用现有技术的癌细胞冻存液。现有技术的癌细胞冻存液无具体的生产厂家，根据文献(Int Immunopharmacol.2005Mar；5(3):555-69.DOI:10.1016/j.intimp.2004.11.003)，是在DMEM培养基中加入45％v/v的FBS和10％v/v的二甲基亚砜(DMSO)。
分别采用对比例1的现有技术的癌细胞冻存液与本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，对原代肝细胞活细胞进行冻存与复苏。与本发明实施例2不同的是，对比例1进行原代肝细胞的冻存时，采用癌细胞冻存液取代实施例2的原代肝细胞冻存液，其余都相同；对比例1进行原代肝细胞的复苏时，是从液氮中取出冻存的细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻细胞，然后经过离心，去掉上清，加入铺板培养基进行重悬。其中，铺板培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清组成。
分别采用对比例1的现有技术的癌细胞冻存液与本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，对原代肝细胞活细胞进行冻存与复苏，独立重复3次，得到细胞活力与细胞得率的比较，具体如表1所示。
表1对比例1和实施例2的试验结果
如图1所示，利用本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。
如图2所示，利用对比例1的现有技术的癌细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。
如图3所示，利用本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况图。
如图4所示，利用对比例1的现有技术的癌细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况。
由表1、图1、图2、图3和图4可知，采用对比例1现有技术的癌细胞冻存液冻存的原代肝细胞经过台盼蓝染色后，37.4％±6.7％细胞出现细胞不着色的情况，且细胞形态不规则、细胞贴壁比例仅为10％±1.5％；而采用实施例2的原代肝细胞冻存液冻存的原代肝细胞经过台盼蓝染色后，95.2％±3.2％细胞出现细胞不着色的情况，且细胞形态规则、细胞贴壁比例83.6％±2.9％。因此，利用本发明的原代肝细胞冻存液，进行肝细胞的冻存与复苏，具有细胞活力高、细胞贴壁情况优异、肝细胞形态维持好的优点。
对比例2
对比例2采用现有技术的CryoStor CS10冻存液。现有技术的CryoStor CS10冻存液购自美国BioLife Solutions公司，具体成分不详，因为生产厂家未公开。
分别采用对比例2的现有技术的CryoStor CS10冻存液与本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，对原代肝细胞活细胞进行冻存与复苏。与本发明实施例2不同的是，对比例2进行原代肝细胞的冻存时，采用CryoStor CS10冻存液取代实施例2的原代肝细胞冻存液，其余都相同；对比例2进行原代肝细胞的复苏时，是从液氮中取出冻存的细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻细胞，然后经过离心，去掉上清，加入铺板培养基进行重悬。其中，铺板培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素和5％v/v的胎牛血清组成。
表2对比例2和实施例2的试验结果
如图1所示，利用本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。
如图5所示，利用对比例2的现有技术的CryoStor CS10冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞台盼蓝染色图。
如图3所示，利用本发明实施例2的原代肝细胞冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况图。
如图6所示，利用对比例2的现有技术的CryoStor CS10冻存液，进行原代肝细胞的冻存和复苏，得到的原代肝细胞贴壁情况。
由表2、图1、图5、图3和图6可知，采用对比例2现有技术的CryoStor CS10冻存的原代肝细胞经过台盼蓝染色后，93.4％±3.7％细胞出现细胞不着色的情况，且细胞形态规则、细胞贴壁比例75.2％±2.5％。而采用实施例2的原代肝细胞冻存液的原代肝细胞经过台盼蓝染色后，96.2％±3.2％细胞出现细胞不着色的情况，且细胞形态规则、细胞贴壁比例84.2％±3.1％。因此，利用本发明的原代肝细胞冻存液，进行肝细胞的冻存与复苏，具有更优异的细胞贴壁比例。
另一方面，基于市场调研，现有技术的CryoStor CS10冻存液的成分不明、价格昂贵，售价约3500人民币/100mL。而本发明的原代肝细胞冻存液，具有成分明确、价格便宜的优点,成本约300人民币/100mL，具有广阔的市场潜力。
由对比例1和对比例2可知，本发明的原代肝细胞冻存液，具有维持肝细胞正常渗透压、保护肝细胞膜、降低冻存与复苏对肝细胞活力与贴壁能力的影响等优点。相比于现有技术的癌细胞冻存液和CryoStor CS10冻存液，采用本发明的原代肝细胞冻存液可显著提升复苏后原代肝细胞的活力与贴壁能力。而且，本发明的原代肝细胞冻存液，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种原代肝细胞冻存液，其特征在于，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、10％-45％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜和0％-35％的水，其中，所述溶液A由如下组分组成：100mg/mL-140mg/mL的D-葡萄糖、90mg/mL-130mg/mL羟乙基淀粉、70mg/mL-90mg/mL乳糖酸、40mg/mL-60mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、30mg/mL-50mg/mL五水D-棉子糖、10mg/mL-15mg/mL氢氧化钾、6mg/mL-9mg/mL磷酸二氢钾、2mg/mL-4mg/mL七水硫酸镁、2mg/mL-4mg/mL腺苷、1mg/mL-3mg/mL还原性谷胱甘肽、0.2mg/mL-0.4mg/mL别嘌醇、5×10-3mg/mL-7×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1×10-3mg/mL-10mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
2.根据权利要求1所述的原代肝细胞冻存液，其特征在于，所述原代肝细胞冻存液，由如下体积百分数的组分组成：45％的溶液A、45％的胎牛血清和10％的二甲基亚砜，其中，所述溶液A由如下组分组成：120mg/mL的D-葡萄糖、111mg/mL羟乙基淀粉、79.6mg/mL乳糖酸、51mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、39.6mg/mL五水D-棉子糖、12.5mg/mL氢氧化钾、7.56mg/mL磷酸二氢钾、2.73mg/mL七水硫酸镁、2.98mg/mL腺苷、2mg/mL还原性谷胱甘肽、0.3mg/mL别嘌醇、6×10-3mg/mL牛磺熊去氧胆酸和1mg/mL甘草酸二氨，调pH值至7.4,4℃保存。
3.根据权利要求1所述的原代肝细胞冻存液，其特征在于，所述甘草酸二氨由异甘草酸镁代替。
4.根据权利要求1所述的原代肝细胞冻存液，其特征在于，所述胎牛血清由2％v/v-4％v/v的人血白蛋白代替。
5.一种肝细胞冻存的方法，其特征在于，包括：向经过常规处理后的肝细胞中加入权利要求1-4任一项所述的原代肝细胞冻存液，混匀后冻存。
6.根据权利要求5所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，向经过常规处理后的肝细胞中加入冰浴的权利要求1-4任一项所述的原代肝细胞冻存液，至冻存液中的细胞浓度为0.1×107个活细胞/mL-1×107个活细胞/mL,充分混匀，分装到冻存管中,放于程序降温盒中并于-80℃放置至少3h，最后转移到液氮中长期保存。
7.根据权利要求5或6所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，所述常规处理后的肝细胞由如下方法制备得到：
步骤1：两步胶原酶灌注法分离原代肝细胞
取新鲜的肝组织，用灌注溶液I灌注10min-30min，直至冲洗干净肝组织中的血液，然后再用37℃预热的灌注溶液II灌注15min-30min，直至肝组织失去弹性，得到消化好的肝组织；
步骤2：消化终止与细胞分散
将步骤1得到的消化好的肝组织转移到含有常温灌注溶液II的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液并过细胞筛，得到单细胞悬液并离心；
步骤3：细胞洗液清洗
将步骤2得到的离心后的上清去掉，加入预冷的细胞洗液，巴氏吸管重悬细胞，再离心，重复本步骤2次，得到清洗好的单细胞悬液；
步骤4：细胞活力的检测
取步骤3得到的清洗好的单细胞悬液与0.4％m/v台盼蓝染色液以体积比1:1混匀，然后检测细胞活力，将细胞活力大于80％的单细胞悬液离心，去掉上清，即得到常规处理后的肝细胞。
8.根据权利要求7所述的肝细胞冻存的方法，其特征在于，步骤1中，所述灌注溶液I是由8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、1g/L葡萄糖、1mM丙酮酸纳和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸组成，pH值为7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存所得；所述灌注溶液II是在威廉姆斯E培养基中添加2mM氯化钙、15mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸和0.3g/LⅣ型胶原酶，pH值为7.0-7.4，用0.22μm微孔滤器过滤除菌，现用现配，37℃水浴锅预热60min；步骤3中，所述细胞洗液是在DMEM/F12培养基中加入1％v/v青链霉素和5％v/v-10％v/v胎牛血清；步骤2、步骤3和步骤5中，所述离心的重力加速度均为50g，温度均为4℃，时间均为5min。
9.一种肝细胞复苏的方法，其特征在于，包括：取权利要求5-8任一项冻存后的肝细胞，置于37℃水浴锅中迅速解冻，转移到生物安全柜中，以滴加方式加入到10倍体积的、37℃预热的复苏培养基中，颠倒混匀后，直接用于接种，或者再静置30min-45min，经过离心，去掉上清，加入复苏培养基或者等渗溶液进行重悬。
10.根据权利要求9所述的肝细胞复苏的方法，其特征在于，所述复苏培养基由1％v/v的ITS通用型培养添加剂、2mmol/L的L-谷氨酰胺、10μg/L的表皮生长因子、18mg/L的氢化可的松、40μg/L的地塞米松、1％v/v的青链霉素、10％v/v的胎牛血清和2％m/v-4％m/v的牛血清白蛋白组成；所述等渗溶液为生理盐水、磷酸盐缓冲液、威廉姆斯E培养基和DMEM培养基中的一种；所述离心的重力加速度为50g，温度为4℃，时间为5min。
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