CN106942203B - 一种ips细胞保存液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种IPS细胞保存液及其制备方法。本发明提供了一种IPS细胞保存液，每100mL IPS细胞保存液中包括水及以下组分：白蛋白0.1‑0.5g、低分子肝素钠0.1‑0.3g、黄芪甲苷0.05‑0.15g、葡萄糖0.1‑0.3g、氯化钠0.5‑1.5g、维生素C1.0‑2.0g、甘氨酸0.2‑0.6g、醋酸钠0.4‑0.6g、醋酸0.03‑0.05g和甘油1.0‑2.0g。本发明的IPS细胞保存液保存IPS细胞72h后，细胞存活率>94％，细胞结团率<0.4％；同时，本发明的IPS细胞保存液成分明确，操作简单，安全性高，无毒无副作用。

Description

一种IPS细胞保存液及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种IPS细胞保存液及其制备方法。
背景技术
IPS细胞(诱导性多能干细胞)是将一些多能遗传基因倒入皮肤等细胞中制造而成，即让普通体细胞“初始化”，使其具备干细胞功能。“IPS细胞”不仅在细胞形态、生长特性，干细胞标志物表达等方面与ES细胞(胚胎干细胞)非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。IPS细胞除了不能生成胚胎以外，可以产生所有的细胞，如果用于医疗，那么理论上可以治愈所有疾病——凡是不好的组织都去除，替换为重新生长的正常组织。
中国专利CN102365933B公开了一种间充质干细胞保存液及其制备方法与应用，该间充质干细胞保存液含有占保存液体积5-15％的人AB型脐带血血浆和70-80AXaIU/mL的低分子肝素钙；所述的人AB型脐带血血浆与间充质干细胞来自同一提供者。该发明的间充质干细胞保存液能延长间充质干细胞的活性维持时间，且保存72h后，不影响其表型特征，但该发明在细胞密度较高的情况下细胞结团率较高。
中国专利申请CN105087472A公开了一种诱导多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法，所述冻存液以IMDM/F12基础培养基为基质，每100mL诱导多能干细胞冻存液中包括以下体积浓度的组分：2～20v/v％DMSO；0.5～5v/v％右旋糖酐40；0.5～5v/v％白蛋白；1ng～1000ng Thiazovivin；余量为IMDM/F12基础培养基。该发明虽然冻存效果较好，但DMSO具有细胞毒性，与蛋白质疏水集团发生作用，导致蛋白质变性，具有血管毒性和肝肾毒性，如果低温保存的细胞复苏后直接医用，过多的DMSO对人体具有毒性，并且这种传统的冻存液要求在超低温下保存，移植前需要复苏等过程，给应用带来很多不便。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种IPS细胞保存液及其制备方法。本发明提供的IPS细胞保存液对IPS细胞的活力和形态具有优良的维持作用，且长期保存中细胞结团率较低，从而显著提高了IPS细胞的治疗效果。同时，本发明保存液安全性高、便于临床使用。
本发明提供了一种IPS细胞保存液，每100mL IPS细胞保存液中包括水及以下组分：
白蛋白0.1-0.5g、低分子肝素钠0.1-0.3g、黄芪甲苷0.05-0.15g、葡萄糖0.1-0.3g、氯化钠0.5-1.5g、维生素C 1.0-2.0g、甘氨酸0.2-0.6g、醋酸钠0.4-0.6g、醋酸0.03-0.05g和甘油1.0-2.0g。低分子肝素钠购于南京南大药业有限责任公司。
本发明细胞保存液对维持IPS细胞渗透压及活力有较好的作用，同时还可以有效的防止细胞的结团，利于临床的应用。经试验证实，IPS细胞保存72h后，细胞存活率>94％，细胞结团率<0.4％。
低分子肝素钠与普通肝素钠相比，具有半衰期长，生物活性高的优点，出血副作用少，用低分子肝素时可以不用监测凝血指标，比较安全，且抗血栓作用时间可长达24h，可用于抑制IPS细胞聚集成团。
黄芪甲苷是黄芪皂苷的主要活性成分之一，具有清除自由基延缓衰老、增强细胞生理代谢、提高氧化作用、提高细胞活性等作用，本发明采用黄芪甲苷可以延缓细胞的衰老和缓慢增殖，从而提高IPS细胞的活性。
进一步地，所述IPS细胞保存液每100mL中由水及以下组分组成：
白蛋白0.3g、低分子肝素钠0.2g、黄芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化钠1.0g、维生素C 1.5g、甘氨酸0.4g、醋酸钠0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
本发明采用甘油作为保护剂，代替了DMSO，避免了蛋白质的变性及临床使用的危害。本发明细胞保存液不仅可以很好地维持细胞活性剂增殖活性，又不导致细胞的变异及细胞的结团，可以满足临床使用。
进一步地，所述IPS细胞保存液的pH为7.2-7.4，渗透压为311-330mmol/L。
进一步地，所述IPS细胞保存液中IPS细胞的浓度为0.5×107-5×107cell/mL。
同时，本发明也提供了一种IPS细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
S1将氯化钠和醋酸钠加入到40mL水中，搅拌溶解，得溶液A；
S2将甘氨酸加入到20mL水中，搅拌溶解，得溶液B；
S3将步骤S1所得溶液A与步骤S2所得溶液B混合均匀，边搅拌边加入白蛋白、葡萄糖、维生素C、低分子肝素钠、黄芪甲苷和甘油，再加入醋酸，搅拌均匀，水定容至100mL，即得。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)在4-10℃，本发明的IPS细胞保存液保存IPS细胞72h后，细胞存活率>94％，细胞结团率<0.4％，即72h后细胞活性较好，且细胞结团率较低；
(2)本发明的IPS细胞保存液成分明确，操作简单，安全性高，无毒无副作用，不影响IPS细胞的形态，便于细胞的运输及保存，便于临床应用。
附图说明
图1：不同保存液中IPS细胞活力测定。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，这些实施例只用于例证的目的，并不限制本发明的保护范围。
实施例1 一种IPS细胞保存液
所述IPS细胞保存液，每100mL中包括水及以下组分：
白蛋白0.1g、低分子肝素钠0.1g、黄芪甲苷0.05g、葡萄糖0.1g、氯化钠0.5g、维生素C 1.0g、甘氨酸0.2g、醋酸钠0.4g、醋酸0.03g和甘油1.0g。
制备方法：
S1将氯化钠和醋酸钠加入到40mL水中，搅拌溶解，得溶液A；
S2将甘氨酸加入到20mL水中，搅拌溶解，得溶液B；
S3将步骤S1所得溶液A与步骤S2所得溶液B混合均匀，边搅拌边加入白蛋白、葡萄糖、维生素C、低分子肝素钠、黄芪甲苷和甘油，再加入醋酸，搅拌均匀，水定容至100mL，即得。
实施例2 一种IPS细胞保存液
所述IPS细胞保存液，每100mL中包括水及以下组分：
白蛋白0.3g、低分子肝素钠0.2g、黄芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化钠1.0g、维生素C 1.5g、甘氨酸0.4g、醋酸钠0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制备方法与实施例1类似。
实施例3 一种IPS细胞保存液
所述IPS细胞保存液，每100mL中包括水及以下组分：
白蛋白0.5g、低分子肝素钠0.3g、黄芪甲苷0.15g、葡萄糖0.3g、氯化钠1.5g、维生素C 2.0g、甘氨酸0.6g、醋酸钠0.6g、醋酸0.05g和甘油2.0g。
制备方法与实施例1类似。
对比例1 一种IPS细胞保存液
所述IPS细胞保存液，每100mL中包括水及以下组分：
白蛋白0.3g、低分子肝素钠0.2g、葡萄糖0.2g、氯化钠1.0g、维生素C 1.6g、甘氨酸0.4g、醋酸钠0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制备方法与实施例1类似。
与实施例2的区别在于，未添加黄芪甲苷，增加了维生素C的用量。
对比例2 一种IPS细胞保存液
所述IPS细胞保存液，每100mL中包括水及以下组分：
白蛋白0.3g、肝素钠0.2g、黄芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化钠1.0g、维生素1.5g、氨基酸0.4g、醋酸钠0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
制备方法与实施例1类似。
与实施例2的区别在于，将低分子肝素钠替换为肝素钠。
试验例一、细胞活力检测
1.试验材料：实施例1-3及对比例1-2制备的保存液保存的IPS细胞，调节细胞浓度为1×106cell//mL。
2.试验方法：
(1)采用水浴复温法，将保存液于40℃水浴中融化，取出；
(2)MTT法测定细胞活性：用96孔培养板，分别取50μL加入不同保存液的细胞悬浮液及相应不含细胞的保存液加入培养孔中，再加入MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)10μL，在37℃、5％CO2培养箱中孵育4h后，加入20％SDS-50％DFM溶液150μL继续孵育3h，然后以相应无细胞孔调零，在酶标仪上测定OD值，并计算细胞存活率，公式如下：
细胞存活率＝(ODt-OD空白)/(OD0-OD空白)。
其中，OD0：保存液保存IPS细胞0h的OD值；ODt：保存液保存IPS细胞t h的OD值。
3.试验结果：细胞活力检测结果见表1所示。
表1 细胞活力检测结果
Figure BDA0001301866380000051
由表1与图1可知，本发明制备的IPS细胞保存液对IPS细胞的活力具有优良的维持作用。与对比例1-2组相比，本发明实施例1-3制备的IPS细胞保存液对IPS细胞的活力维持作用较好，说明本发明IPS细胞保存液的配方组成合理，且IPS细胞保存液的pH及渗透压影响着IPS细胞的活力。
试验例二、细胞结团率检测
分别取在细胞保存液保存12h、24h、48h、72h后的IPS细胞悬液1mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝(v:v)＝3:1轻轻混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞结团率的检测，检测结果见表2。
表2 细胞结团率检测结果
Figure BDA0001301866380000052
Figure BDA0001301866380000061
由表2可知，本发明制备的IPS细胞保存液在保存IPS细胞过程中结团率较低。与对比例1-2组相比，本发明实施例1-3制备的IPS细胞保存液对IPS细胞的结团率较低，说明本发明IPS细胞保存液在运输及保存后，在外力作用下可自动散开，重新形成新的细胞悬液。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (3)

1.一种IPS细胞保存液，其特征在于，每100mL IPS细胞保存液中包括水及以下组分：
白蛋白0.1-0.5g、低分子肝素钠0.1-0.3g、黄芪甲苷0.05-0.15g、葡萄糖0.1-0.3g、氯化钠0.5-1.5g、维生素C1.0-2.0g、甘氨酸0.2-0.6g、醋酸钠0.4-0.6g、醋酸0.03-0.05g和甘油1.0-2.0g；
所述IPS细胞保存液的pH为7.2-7.4，渗透压为311-330mmol/L；
所述IPS细胞保存液中IPS细胞的浓度为0.5×107-5×107cell/mL。
2.如权利要求1所述的IPS细胞保存液，其特征在于，所述IPS细胞保存液每100mL中由水及以下组分组成：
白蛋白0.3g、低分子肝素钠0.2g、黄芪甲苷0.1g、葡萄糖0.2g、氯化钠1.0g、维生素C1.5g、甘氨酸0.4g、醋酸钠0.5g、醋酸0.04g和甘油1.5g。
3.如权利要求1或2所述的IPS细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1将氯化钠和醋酸钠加入到40mL水中，搅拌溶解，得溶液A；
S2将甘氨酸加入到20mL水中，搅拌溶解，得溶液B；
S3将步骤S1所得溶液A与步骤S2所得溶液B混合均匀，边搅拌边加入白蛋白、葡萄糖、维生素C、低分子肝素钠、黄芪甲苷和甘油，再加入醋酸，搅拌均匀，水定容至100mL，即得。
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