CN105076114A - 脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用，其中保存液成分包括NaCl质量分数为0.85～0.92％的生理盐水，以及添加在生理盐水中的胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸和L-谷氨酰胺。本发明的相比血清的保存液，尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源。采用比较成分较少的功能成分，维系细胞的基本代谢，使其性能比较平缓，无巨大的变动；这些成分基本又能提供作为一些基本的活性营养物质和能量物质，以维持较低的代谢水平，使细胞活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植脐带细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果。

Description

脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用

技术领域

本发明属于细胞保存液技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞无血清保存液及其应用。

背景技术

UC-MSCs(脐带间充质干细胞)已广泛应用于细胞移植替代治疗，而移植和替代治疗中细胞的活性与细胞质量是治疗成功的关键。脐带间充质干细胞培养之后，直至抑制手术和操作之前，都是采用临床常用细胞保存液对UC-MSCs进行短期保存。其中，在细胞的保存过程中，为了保证细胞能持续维持细胞代谢以及避免其他各方面伤害等等，在保存液中都添加有血清作为细胞保护成分。

而经过反复的研究和跟踪，由于血清中存在许多未知的成分，包括生长抑制因子、毒性因子，以及其他的大分子蛋白等等；虽然这些成分之间相互中和，最终细胞的性状保存后变化较低，但是中间生长抑制因子和毒性因子等多种物质作用于细胞使细胞所产生的应激反应，并不能当成是没发生过，而这些中间过程可能包含有氧化应激水平的增高、能量代谢会失衡、ATP水平快速下降等等，这些都会引起细胞活性与质量的明显下降，最终导致在移植和替代治疗之后不与损伤组织融合并且一段时间之后死亡，影响了治疗效果。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种对移植备用的细胞起到保护作用，可以长效保持移植细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果的脐带间充质干细胞无血清保存液。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种脐带间充质干细胞无血清保存液，包括NaCl质量分数为0.85～0.92％的生理盐水，所述生理盐水中还添加有胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸和L-谷氨酰胺。

在上述保存液的基础上，本发明还提出将上述保存液用于细胞移植替代治疗中对脐带间充质干细胞进行保存的应用。

相比现有技术的血清保存液，本发明的保存液，尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源。采用比较成分较少的功能成分，维系细胞的基本代谢，使其性能比较平缓，无巨大的变动；这些成分基本又能提供作为一些基本的活性营养物质和能量物质，以维持较低的代谢水平，使细胞活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种脐带间充质干细胞无血清保存液，采用注射用生理盐水作为基础(NaCl的质量分数为0.85～0.92％)，在其中添加胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸、以及L-谷氨酰胺。

L-谷氨酰胺(L-glutamine)在氨基酸组分中的有重要作用，谷氨酰胺可以合成核酸和蛋白质，是细胞生长必需成分，而谷氨酷胺缺乏会使细胞生长不良甚至导致细胞死亡。所以本发明在保存液中添加一定浓度的L-谷氨酰胺，在保存中满足细胞基本代谢所需的谷氨酷胺，维持代谢活动处于相对较低的水平，避免胁迫式的进行大量代谢，反而会大大缩短组织细胞的寿命和活性。同时，本发明中添加L-谷氨酰胺的目的还在于，其在机体内能参与消化道黏膜黏蛋白构成成分氨基葡萄糖的生物合成，从而促进黏膜上皮组织的修复；跟踪用于体外之后其可以有助于细胞膜结构的补充和修复功能，避免细胞的裂解死亡；所以在本发明保存液中使用还能借助其进行细胞的修复功能。

而本发明上述亚硒酸钠和N-乙酰半胱氨酸消除保存能引起细胞活性降低或者死亡的细胞毒素。其中，亚硒酸钠含有的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，可以促进氢过氧化物代谢，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害，这一点上对干细胞具有良好的损伤保护作用。相比血清中通过较多天然成分自身相互中和细胞毒素保护细胞的不同，上述保存液是尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源，并且同时消除过氧化氢的伤害，因为是细胞生长和克隆的主要毒性物质，可由培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等产生，引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和DNA损伤而导致细胞死亡。而N-乙酰半胱氨酸是活性氧自由基的清除剂，它可以改善氧化应激引起的不同种类细胞的损伤；对亚硒酸钠的所减缓之外的其他的氧化损伤等进行弥补，保证细胞温和的保存环境。

在上述细胞能基本稳定存活之后，通过激素的添加从细胞的基本生长、稳定代谢和凋亡这几方面控制细胞的代谢维持于稳定状态，主要是胰岛素、糖皮质激素、雌激素与孕激素。其中，胰岛素本身的是血糖调节激素，专用至培养基中之后，能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸的效率，从而提升RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是比较重要的细胞存活因子，同时还能抑制细胞凋亡。

而雌激素与孕激素是两种相互拮抗的激素，体外用于细胞保存时，可以相互调节和平衡作用于细胞线粒体的有氧呼吸，通过控制有氧呼吸的程度从而抑制细胞过快大量代谢调亡，同时具有促进UC-MSCs增殖的作用。

而糖皮质激素是一种甾体类化合物，它能够影响细胞内的三大代谢，同时它具免疫抑制作用，调节内环境的稳定影响细胞的生长，用于维持和稳定细胞内的代谢环境水平。

氢化可的松也是激素，是一种糖皮质激素，具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等；用在细胞保存液中，首先可以免疫抑制和抗毒作用，可以避免细胞进一步自身抗毒和免疫反应，从而降低了细胞自身产生性状变异和分化的情形。

在上述基础上，还添加腺苷(Adenosine，Ado)，其是一种内源性核苷，它是产生ATP的前体物质同时也是ATP的代谢产物，腺苷能够通过调控细胞内ATP水平，是尽量避免细胞内大量ATP代谢，避免强烈的代谢会造成细胞自身性状的变化过大，对细胞具有保护作用。

同时，采用的作为保存液的基础是NaCl质量分数为0.85～0.92％的注射用生理盐水，一方面可以利用无机离子提供保存液中的离子强度，用于提供细胞外渗透压，避免在保存过程中发生水的跨膜移动，从而破坏细胞内的体液容量平衡和细胞形态变化。而更主要地，Na⁺阳离子有利于维持细胞间的信息传递，利于维持细胞的活性，因为本身阳离子对于组织细胞来说，需要通过相应的运载和信号蛋白才能被细胞接收，是属于高度不通透的，所以细胞膜对于这些需要主动识别和运载的阳离子相比水分子等非电解质更加敏感，可以刺激脐带间充质干细胞膜的通透性变化，使细胞自身能具有良好的应变能力。

根据细胞最佳的渗透压耐受范围260～320mmol/L，采用质量分数0.85～0.92％的NaCl，同时进一步控制各成分的用量；首先，激素是一些特定功能细胞代谢的产物，如果大量添加那么会导致干细胞向相应类型的细胞进行诱导和分化，所以这一种情形中控制其量使其满足促进生长而避免诱导的发生，添加在基础培养基中之后，胰岛素浓度控制0.08～0.l2μg/L、雌激素浓度控制l0^-7～l0^-8mol/L、孕激素浓度控制l0^-7～10^-8mol/L、氢化可的松浓度控制l0^-5～10^-6mol/L、腺苷的浓度控制为0.4～0.6mmol/L。

进一步，其中亚硒酸钠和N-乙酰半胱氨酸的结合，能满足相应的基本功能即可，因此控制亚硒酸钠浓度20～35nmol/L、N-乙酰半胱氨酸的浓度控制0.9～1.2mmol/L。

L-谷氨酰胺添加量加大之后，其会促进细胞自身进行大量的核酸和蛋白质合成，而保存液中并没有提供细胞进行大量合成这些大分子的原料，而刺激产生了相应的酶之后细胞内代谢趋势会被改变，所以避免胁迫式代谢L-谷氨酰胺的浓度控制0.4～0.6mmol/L，保证细胞内温和的保存环境。

本发明的上述脐带间充质干细胞保存液，相比血清的保存液，将其中的功能成分进行删减，上述保存液是尽量减低能够产生多种成分的毒素伤害的物质来源。采用比较成分较少的功能成分，维系细胞的基本代谢，使其性能比较平缓，无巨大的变动；这些成分基本又能提供作为一些基本的活性营养物质和能量物质，以维持较低的代谢水平，使细胞活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植脐带细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果。

在上述保存液的基础上，本发明还提出采用上述脐带间充质干细胞无血清保存液对脐带间充质干细胞进行保存中的应用。采用上述保存液进行脐带间充质干细胞进行保存，对细胞起到保护作用，可以长效保持移植脐带细胞的活性与质量，使细胞活性处于较稳定的状态，避免了生长和培养导致的形状变异或者分化等情形，提髙移植细胞治疗的临床效果。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S10，获取脐带：无菌条件下取健康足月剖腹产儿的近胎儿段脐带，挤净挤血后将挤带轻轻放入内含200μg/ml青霉素、200μg/ml链霉素的PBS液的蓝色广口瓶中，置于冰盒尽快拿回实验室。将脐带标本用镊子轻轻从广口瓶中取出置于培养皿中，PBS充分洗净残余挤血，将脐带中的动静脉剔除，将脐带剪成1cm左右的脐带段，充分剪碎至1mm³大小，分装入15ml离心管中。

以上从脐带取出到完成要保证在6小时内，因为分离干细胞过程超过6个小时后，细胞本身离体时间过长，可能品质会大大降低。

S20，制备脐带消化酶：胶原酶II100mg、胶原酶IV100mg、100mg透明质酸酶以及150UDNA酶溶于10mlPBS后充分混匀，0.22μm滤膜过滤、除菌；分装于1.5mlEP管，-20℃避光保存备用。(以上酶液购自美国Sigma公司)

S30，将步骤S10中细碎获得的细碎组织用步骤S20的酶液进行消化，消化后加入1ml血清以终止消化；即可收获得到较粘稠的UC-MSCs；

然后将收货的UC-MSCs悬液接种到T-25cm²细胞培养瓶中，加入适量的完全培养基，放置在细胞培养箱中培养。3天后首次换液，采用半量换液法，以后每3天换液，生长旺盛后可转入新的T-25cm²的细胞培养瓶中培养。

当培养至细胞融合达到80％以上时，弃掉培养基；用PBS轻轻洗2次，加入适量0.25％胰蛋白酶，室温静置2min，显微镜下观察，可见细胞间隙增加，细胞皱缩呈亮圆状，加入少量胎牛血清(终止反应)，弃去胰酶；加入完全培养基，用弯头滴管轻柔均匀吹打瓶底，将细胞按1:2比例进行传代接种，标记为P1代；之后每传一次，分别记作P2、P3、P4......，取P3代细胞用于后续保存实验。

S40，取上述步骤S30中的P3代UC-MSCs用相应移植保存液洗涤2遍后，用本发明的保存液进行保存试验，在保存液保存6、9、12h，进行后续细胞形状测量。其中，该步骤中的保存液成分按照：含有0.lμg/L的胰岛素、l0^-8mol/L的雌激素和10^-8mol/L的孕激素、10^-6mol/L的氢化可的松、30nmol/L的亚硒酸钠、0.5mmol/L腺苷、1mmol/L的N-乙酰半胱氨酸、0.5mmol/L的L-谷氨酰胺的0.9％氯化钠注射液。

S50，将步骤S40中保存6、9、12h后的细胞进行细胞形状检测；当然在该步骤中为了能具有效果进步性的参考和对比，所以在进行检测的过程中，以本发明的上述保存液保存的UC-MSCs作为实验组，而以现有的5种通常采用的保存液作为对照组(现有的5种保存液为0.9％WT氯化钠注射液、5％WT葡萄糖注射液、复方电解质注射液、1％WT人血白蛋白溶液、5％WT人血白蛋白溶液)，同样将细胞保存2、4、6h后进行如下步骤：

(1)台盼蓝染色法测细胞活性(％)

经不同时间保存后的UC-MSCs离心(l000rpm、5min)弃去上清；用PBS重悬细胞沉淀，充分混匀，取18μl细胞悬液与2μl的0.4％苔盼蓝染液充分混匀；取适量悬液滴加到血球计数板计数腔内，加盖玻片，显微镜下观察；分别计数活细胞与死细胞，计数过程在3min内完成，未着色的细胞为活细胞，染成蓝色的细胞为死细胞。细胞存活率(％)＝活细胞数/总细胞数×100％。

其中，保存温度分别在4℃的冰箱、和常温24℃保存，保存后的检测的细胞存活率如下表：

从上表的结果可以看出，保存2h时，在4℃与24℃条件下，5种保存介质中UC-MSCs活性与对照组无明显差异；

保存4h后，4℃与24℃条件下不同保存介质中的细胞存活均有轻度下降，(92％左右，90％左右)；保存6h后，细胞活性呈时间依赖性下降，4℃条件下，0.9％氯化钠注射液中UC-MSCs存活率为(82％左右)，5％人血白蛋白溶液中UC-MSCs存活为(65％左右)，而24℃条件下下降更为明显。而且根本发明的保存液相比，本发明保存液保存的细胞的存活性上，结果上是明显优于其他组的。

(2)细胞贴壁率测定(％)：

将上述制备的UC-MSCsP3代细胞消化后PBS制成细胞悬液，以2×l06/组用常用的5种通常采用的保存液作为对照组(现有的5种保存液为0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液、复方电解质注射液、1％人血白蛋白溶液、5％人血白蛋白溶液)、以及本发明的保存液作为实验组于在4℃的冰箱、和常温24℃保存2h、4h、6h三组；

按时间点保存结束后，离心l000rpm、5min，弃上清；用正常完全培养基(每500mlα-MEM液体培养基中加入55ml胎牛血清和5ml双抗溶液)轻轻漂洗细胞一次，再用完全培养基重悬细胞，每组以2×10⁴/孔接种于24孔板中，放置于细胞培养箱中培养24h；待细胞贴壁后，微量移液器移除培养液，用PBS轻轻漂洗2次，去除未贴壁细胞；70％WT乙醇固定20min后PBS轻轻漂洗1-2次；结晶紫染液染色15min(100μl，没过孔板底部)；去离子水轻轻漂洗2～3次，尽可能去除背景颜色；置于显微镜下观察、计数、拍照；并计算细胞贴壁率＝已贴壁细胞总数/接种细胞数×l00％。贴壁率的结果如下：

以上检测保存后的贴壁率是基于UC-MSCs是一种贴壁型细胞，其活性的一项指标就是细胞能够贴壁、增殖，因此UC-MSCs贴壁性能的差异即反映了细胞活力的差异。将6种保存介质分别保存2h、4h、6h的UC-MSCs接种培养24h后进行贴壁率统计。UC-MSCs贴壁率呈时间依赖性下降，说明保存时间越长、细胞活性越低，这一点与事实吻合。而且经保存液介质保存6h后UC-MSCs最大细胞贴壁率仅为75％左右(4℃条件下经0.9％氯化钠注射液保存)。室温(24℃)条件下，各种保存介质中的UC-MSCs贴壁率下降更快。而相比相互下降的速度，本发明的保存液保存的效果相比还是比较显著的。

针对干细胞保存中因为缺血、缺氧、饥饿等环境中存放会出现氧化应激水平的明显增高，引起细胞损伤；以及细胞在营养与能量缺乏时，细胞内能量代谢会失衡，细胞会发生自噬，当受损细胞的积累率超过细胞自噬的清除能力，细胞能力过度消耗，ATP水平快速下降，细胞活性下降甚至死亡等等的损伤机理；本发明中采用上述无血清的保存液，并尽量保持保存液成分的单一，从而减少对细胞代谢水平的影响，并且移植备用的细胞起到保护作用，可以长效保持移植细胞的活性与质量，提髙移植细胞治疗的临床效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞无血清保存液，包括NaCl质量分数为0.85～0.92％的生理盐水，其特征在于，所述生理盐水中还添加有胰岛素、雌激素和孕激素、氢化可的松、亚硒酸钠、腺苷、N-乙酰半胱氨酸和L-谷氨酰胺。

2.如权利要求1所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述胰岛素在生理盐水中的浓度为0.08～0.l2μg/L。

3.如权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述雌激素在生理盐水中的浓度为l0^-7～l0^-8mol/L；

和/或，所述孕激素在生理盐水中的浓度为l0^-7～10^-8mol/L。

4.如权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述氢化可的松在生理盐水中的浓度为l0^-5～10^-6mol/L。

5.如权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述腺苷在生理盐水中的浓度为0.4～0.6mmol/L。

6.如权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述亚硒酸钠在生理盐水中的浓度为20～35nmol/L；

和/或，所述N-乙酰半胱氨酸在生理盐水中的浓度为0.9～1.2mmol/L。

7.如权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞无血清保存液，其特征在于，所述L-谷氨酰胺在生理盐水中的浓度为0.4～0.6mmol/L。

8.如权利要求1至7任一项所述的脐带间充质干细胞无血清保存液在脐带间充质干细胞保存中的应用。