CN113423268B - 干细胞的低温保存 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于干细胞群，包括间充质干细胞(MSCs)如脂肪来源的基质干细胞(ASCs)的低温保存的方法。更具体地，本发明涉及N‑乙酰半胱氨酸(NAC)在低温保存方法中的应用、从所述方法获得的细胞群、包含所述细胞的组合物，及其应用。

Description

干细胞的低温保存
发明领域
本发明涉及用于低温保存干细胞群，包括间充质干细胞(MSCs)如脂肪来源的基质干细胞(ASCs)的方法。更具体地，本发明涉及N-乙酰半胱氨酸(NAC)在低温保存方法中的应用。
发明背景
全球修复和再生医学市场要求治疗细胞的生存能力和功能被保持，允许细胞从制造地运输到患者，完成安全和质量控制测试，以及形成细胞库。在使用之前或期间，在恢复到常温之前，细胞被冷冻保存或低温维持。这些疗法的成功至少部分取决于不仅保留细胞结构而且保留细胞功能的能力。
无论类型如何，细胞保存的目标都是在给定的时间段内停止生物时间，然后按需恢复细胞活力、结构和功能。理想情况下，冷冻保存的细胞/组织在解冻后应具有相同的特性。在许多情况下，这一目标的达到远未实现。保存结果通常以在储存后立即测量的高度细胞活力的保留为特征，随后在24–48小时内下降，同时细胞反应性、功能和繁殖能力下降。对于低温保存，大多数细胞系统的存储间隔通常限于1–3天。
许多研究已经观察到细胞特性(例如细胞活性、存活率、增殖潜力)受冷冻和解冻过程的影响。由于代谢和生化过程的温度依赖性解偶联，保存过程对细胞施加了许多压力。这些尤其包括通过破坏氧化呼吸产生自由基，其由于脂质过氧化、DNA和RNA损伤、细胞骨架结构组分改变的下游效应对细胞是有害的。细胞膜结构、流动性和组织的改变也可以激活膜受体，引发一系列细胞内事件，包括刺激应激反应途径和细胞凋亡。通过关闭膜结合的Na+/K+泵和Ca2+离子通道，细胞离子平衡失调会激活应激反应机制，包括从细胞内储存物释放钙、渗透流入和细胞肿胀。许多另外的应激反应机制也可以通过低温储存来激活，从而损害细胞。
冷冻保护剂如二甲基亚砜(DMSO)、甘油或动物来源的血清通常被添加到低温保存培养基中，以最大程度减少这些负面影响。然而，仍然需要改进干细胞低温保存的方法。
发明概述
本发明被总结为提供涉及干细胞低温保存，包括间充质干细胞(MSCs)如脂肪来源的基质干细胞(ASCs)低温保存的方法和组合物，以及所述组合物的用途。特别地，为了促进干细胞的研究和临床应用，发明人已开发出新的低温保存方法，其涉及用N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理细胞，这导致解冻后活细胞数量的增加、生长速率增加、线粒体活性增加和/或恢复改善，同时维持细胞的结构和/或功能特性，如其治疗应用所需的那些。
本发明提供了用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；和(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。在一些实施方案中，方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)洗涤经处理的干细胞群以去除NAC和获得经洗涤的干细胞群，以及冷冻经洗涤的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。在任何方法中，处理步骤可以包括将干细胞群用NAC孵育至少约1、2、4、6、8、10、12、16、24或48小时，然后冷冻干细胞群。处理步骤可以包括向干细胞群添加NAC至大约0.5-10mM的初始浓度范围。处理步骤可以包括一次或多次另外添加NAC以维持预先选定水平的NAC浓度。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(d)培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(d)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。培养步骤可以包括添加NAC至大约0.5-5mM的初始浓度范围。培养步骤可以包括一次或多次另外添加NAC以维持预先选定水平的NAC浓度。在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤扩增的干细胞群以去除NAC和获得经洗涤的并扩增的干细胞群的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括洗涤解冻的干细胞群或扩增的干细胞群以及将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(e)冷冻扩增的或经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群或冷冻的经洗涤的并扩增的干细胞群。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(e)冷冻扩增的或经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群或冷冻的经洗涤的并扩增的干细胞群；和(f)解冻冷冻的扩增的或冷冻的经洗涤的并扩增的干细胞群以获得解冻的扩增的干细胞群。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：(g)洗涤解冻的扩增的干细胞群以及将细胞重悬于药学上可接受的载体中。
本发明还提供了用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；和(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。培养步骤可以包括添加NAC至大约0.5-5mM的初始浓度。在一些实施方案中，培养步骤包括一次或多次另外添加NAC以维持预定水平的NAC浓度。
在本发明的任何方法中，冷冻步骤可以包括以约-0.5至约-10℃/分钟的速度降低温度至-70℃至-130℃。在一些实施方案中，冷冻步骤包括在10-60min内将温度从+4℃降至-100至-180℃。
在本发明的任何方法中，干细胞群可以在37℃下解冻。冷冻的干细胞群的细胞密度范围可以为大约1百万至大约5千万个细胞/mL，优选大约2500万个细胞/mL。
在一些实施方案中，干细胞群基本上是纯的。在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞(MSCs)。在一些实施方案中，干细胞是脂肪来源的基质干细胞(ASCs)。在一些实施方案中，干细胞是人类细胞。在优选的实施方案中，干细胞是人ASCs。
在本发明的任何方法中，方法还可以包括将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。方法可以包括将干细胞群冷冻在多个冷冻小瓶中。
在一些实施方案中，方法包括对多种干细胞群重复本发明的任一种方法的步骤。方法可以包括在多个冷冻小瓶中冷冻多种干细胞群。方法还可以包括将多个低温保存小瓶在液氮存储容器中储存至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。
本发明还提供了包含根据本发明的方法获得的多个低温保存小瓶的液氮存储容器。
本发明提供了通过本发明的方法获得的干细胞群。
在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天和/或约4天后活细胞的数量可以增加。在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相比对照干细胞群，解冻后活细胞的数量可以增加至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约2倍或至少约5倍。在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相比对照干细胞群，解冻后的生长速率可以增加至少约至少约1.03倍、1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍或至少约2倍。在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天和/或约4天后线粒体活性可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％。在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相比对照干细胞群，解冻后ASCs恢复所花的时间可以减少。在任何本发明的方法或本发明的干细胞群中，相对于对照干细胞群，解冻后细胞恢复所花的小时数可以减少至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
本发明提供了包含本发明的干细胞群和低温保存培养基的低温保存组合物。组合物可被冷冻。在一些实施方案中，组合物含有NAC。
本发明还提供了包含本发明的干细胞群和药学上可接受的载体的药物组合物。组合物可以包含大约1百万个细胞至大约1.5亿个细胞，优选地大约3000万个细胞或大约1.2亿个细胞。在一些实施方案中，细胞密度为大约100-2000万个细胞/mL。
本发明提供了NAC用于干细胞的低温保存，例如在本发明的方法中的用途。
本发明还提供了本发明的干细胞群、本发明的药物组合物或本发明的低温保存组合物，其用于治疗的用途。
本发明还提供了本发明的干细胞群、本发明的药物组合物或本发明的低温保存组合物，其用于在有需要的患者中治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中。
本发明还提供了治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括向有需要的对象施用本发明的干细胞群、本发明的药物组合物或本发明的低温保存组合物。
本发明还提供了干细胞群，其用于在有需要的患者中治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中，其中所述方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(d)任选地培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(e)向患者施用干细胞群。
本发明还提供了在有需要的患者中治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(d)任选地培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(e)向患者施用干细胞群。
本发明提供了干细胞群，其用于在有需要的患者中治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中，其中所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(d)向患者施用干细胞群。
本发明还提供了在有需要的患者中治疗瘘和/或治疗和/或预防炎症性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(d)向患者施用干细胞群。
在一些实施方案中，干细胞群用于根据本发明的用途或根据本发明的治疗方法还包括本文所述的干细胞低温保存方法的在向患者施用干细胞群之前的任一个步骤。
在干细胞群、药物组合物或低温保存组合物用于根据本发明的用途或本发明的治疗方法的一些实施方案中，方法包括给予大约100万至1.5亿个细胞，优选大约3000万个干细胞或大约1.2亿个干细胞。方法可以包括给予大约100万至大约1000万个细胞/kg。方法可以包括注射本发明的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物。干细胞可以是如本文中定义的。在一些实施方案中，干细胞是同种异体的或自体的。在优选的实施方案中，干细胞是人同种异体ASCs。
本发明提供了低温保存试剂盒，其包含：冷冻小瓶、含有NAC的容器和含有干细胞群的容器。
附图的简要说明
图1.示出了示例性的测定的流程图。
图2.解冻后接种在冷冻前用多种化合物(NAC；LY294,002；sc-79或艾塞那肽(Exendin-4))处理过的ASCs之后24小时，相比未经处理的(NT)细胞的MTS测定。代表MTS的技术六次技术重复中的单次实验的数据。
图3.解冻后接种在冷冻前用6mM NAC(NAC)处理过的ASCs之后24小时，相比未经处理的(NT)细胞的细胞数量。代表三次技术重复中的单次实验的数据。
图4.解冻后接种在冷冻前用6mM NAC(NAC)处理过的ASCs之后，相比未经处理的(NT)细胞，1、4和7天的细胞密度(A)，以及24小时(B)和96小时(C)的MTS测定。MTS结果以相对于未经处理的细胞，490nm处的吸光度的百分比表示。对于细胞计数，显示了代表三次重复的单次实验的数据，以及对于MTS，显示了代表6次技术重复的单次实验的数据。图4A中的0天时间点显示了细胞接种密度，而不是如其他时间点所示的存活贴壁细胞数。
图5.显示解冻后接种之后1、4和7天，来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的ASCs的细胞密度的图。将ASCs用6mM NAC预处理，并与未经处理的细胞进行比较。代表三次技术重复中的一次实验的数据。
图6.显示接种解冻的ASC之后7、11和14天的细胞密度的图，所述ASC用添加至接种培养基的2、6或12mM NAC解冻后处理。代表三次技术重复中的两次实验的数据。
图7.通过流式细胞术进行的ASC特性测定。解冻后两周分析ASCs(来自供体A且在冷冻前用6mM NAC处理)，并与未经处理的细胞比较CD29、CD73、CD90和CD105。图中显示了阳性细胞的百分比。实验以三次技术重复进行。
图8.使用用6mM NAC预处理的来自供体A的解冻的ASCs的淋巴细胞增殖测定，并与未经处理的细胞比较。在96小时使用1:75的ASC:PBMC比例进行分析。(A)活化的PBMCs和ASC存在下的PBMCs的最大增殖之间的重叠。(B)解冻后NAC处理的和未经处理的ASCs的淋巴细胞增殖之间的比较。结果在右下图中量化。
图9.显示ASC和单核细胞共培养的计划和时间，以及进行的评估ASC对巨噬细胞和mDC分化和功能影响的分析的图表。
图10.单独的成熟DC培养物或在用NAC预处理或未处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的解冻的ASCs存在下的成熟DC培养物的2x的显微图像。
图11.单独的成熟DC培养物或在的用NAC预处理或未处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的解冻ASCs存在下的成熟DC培养物的20x的显微图像。
图12.表示通过流式细胞术测量的在不存在或存在用或未用NAC预处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的ASCs的情况下，mDC对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)颗粒的吞噬作用的直方图。
图13.通过流式细胞术测量的在不存在或存在用或未用NAC预处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的ASCs的情况下，mDC的吞噬细胞受体CD206(甘露糖受体)的表面表达。ASC诱导mDC中CD14、CD206和CD163的表达。ASC NAC预处理没有改变这些影响。
图14.通过流式细胞术测量的在不存在或存在用或未用NAC预处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的ASCs的情况下，mDC的吞噬细胞受体CD163(清道夫受体)的表面表达。ASC诱导mDC中CD14、CD206和CD163的表达。ASC NAC预处理没有改变这些影响。
图15.通过流式细胞术测量的表示在不存在或存在用或未用NAC预处理的来自两个不同供体(供体A(DON A)和供体B(DON B))的ASCs的情况下，mDC的CD14和CD1a(抗原呈递分子)的表面表达的点图。mDC是CD14-CD1a+，但ASC的存在会产生新的调节性CD14+CD1a-DC群体。ASC NAC预处理没有改变这种影响。
发明详述
本发明涉及用于干细胞低温保存的方法和组合物，其中在冷冻前(“NAC预处理”)和/或在干细胞解冻后(“解冻后处理”)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理干细胞群。
本发明人测试了许多已知可调节细胞凋亡损伤(如缺氧、血清剥夺、氧化应激(例如由过氧化氢处理引起的)、Fas配体诱导的死亡等)的化合物，目的是提高细胞对冷冻-解冻过程的抵抗力。与未处理的对照细胞相比，发现NAC赋予解冻后的干细胞在增加活细胞数量、增加生长速率、增加线粒体活性和/或改善恢复方面的优势。增加解冻后立即可用的活细胞数量是有用的，例如用于急性治疗。这些优势将有助于促进干细胞储物和细胞系的储存、运输和处理，以及基于细胞的疗法的制备和运输，例如通过减少解冻后在培养中恢复和/或扩增冻存细胞所需的时间。
N-乙酰半胱氨酸
N-乙酰半胱氨酸(NAC)，又称N-乙酰-L-半胱氨酸，是天然存在的氨基酸L-半胱氨酸的N-乙酰衍生物的非专有名称。它是一种抗氧化剂，具有的分子量为163.2gmol-1，且化学结构如下：
NAC以等商品名销售。它已被批准用于几种适应症，包括治疗扑热息痛(对乙酰氨基酚)过量(作为注射剂和口服剂)，以及作为粘液溶解剂，以松散患囊性纤维化或慢性阻塞性肺病个体的粘稠粘液(静脉内摄入、通过口服或作为薄雾吸入)。NAC还被用于或研究治疗其他适应症，包括肝功能衰竭、各种癌症、甲基丙烯腈中毒、减少放射性造影剂引起的肾病以及减少心脏搭桥手术期间的再灌注损伤。
用NAC预处理
本文公开了用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括在冷冻前用NAC处理干细胞群，即干细胞群的“预处理”。因此，“NAC预处理的细胞”是指用NAC处理过、然后冷冻的细胞。
用干细胞低温保存的方法可以包括以下步骤：(a)用N-乙酰半胱氨酸处理干细胞群(如ASCs)以获得经处理的干细胞群；和(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群。
用NAC处理干细胞群(“处理”或“处理步骤”)通常通过向干细胞群的合适的细胞培养基添加NAC来进行。可以制备NAC的储备溶液，例如于水中，然后可以在培养基中将NAC稀释至所需的浓度。
技术人员会知道用于支持特定细胞类型生长的合适的细胞培养基。细胞培养基可以是液体或固体形式，包括凝胶状培养基，如琼脂、琼脂糖、明胶和胶原基质。培养基可以是“限定的培养基”，其由化学限定的(通常是纯的)组分制成，并且其不包含表征不良的生物提取物，如酵母提取物和牛肉汤。培养基可以是“基础培养基”，其促进许多类型的微生物的生长，这些微生物不需要任何特殊的营养补充剂。大多数基础培养基通常包含四种基础化学基团：氨基酸、糖类、无机盐和维生素。基础培养基通常用作更复杂的培养基的基础，向其中添加补充剂，如血清、缓冲剂、生长因子、脂质等。基础培养基的实例包括但不限于：Eagle基础培养基、最低必需培养基、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、培养基199、营养混合物Ham’sF-10和Ham’s F-12、McCoy’s 5A、杜氏MEM/F-12、α改良的最低必需培养基(αMEM)、洛斯维·帕克纪念研究所培养基(Roswell Park Memorial Institute Media)1640(RPMI 1640)和Iscove改良杜氏培养基(IMDM)。通常，0-20％胎牛血清(FBS)或1-20％马血清将被添加到上述培养基中，以支持MSCs的生长。然而，如果FBS中MSCs所需的生长因子、细胞因子和激素被识别并以适当的浓度提供在生长培养基中，则可以使用限定的培养基。可包含在培养基中的抗生素包括但不限于青霉素和链霉素。化学限定的培养基中青霉素的浓度为约10至约200单位/ml。化学限定的培养基中链霉素的浓度为约10至约200μg/ml。例如，ASCs合适的细胞培养基是完全DMEM(DMEM/F-12培养基-GlutaMAXTM-I，Gibco，补充了100μg/mL青霉素/链霉素和10％FBS)。
处理步骤可以包括向干细胞群添加NAC至大约0.5-10mM NAC，例如，大约2-8mM或大约4-6mM的初始浓度范围。也可以使用0.5-20mM NAC的初始浓度，例如，大约3-15mM NAC、0.5-12mM或4-12mM NAC。在特别优选的实施方案中，NAC的初始浓度为大约6mM。“初始浓度”是指当添加至干细胞群中的NAC浓度。然而，应理解，在添加至细胞中后，NAC的初始浓度可能降低，例如，通过NAC被降解或代谢。然而，处理步骤可以包括一次或多次另外添加NAC，例如以维持NAC浓度至干细胞群暴露的浓度。因此，“处理步骤”可以包括用初始浓度的NAC处理干细胞群，任选地监测处理步骤期间的NAC水平，以及添加一次或多次另外添加的NAC，以维持NAC浓度在初始浓度或预定水平(例如，上述的NAC浓度)。
处理步骤可以包括将干细胞群用NAC孵育至少约1、2、4、6、8、10、12、16、24或48小时，然后冷冻干细胞群。例如，用NAC孵育干细胞群可以进行约1至约48小时、约2-24小时或约6-24小时，然后冷冻干细胞群。孵育可以在任何合适的条件下进行(例如，其中干细胞群是稳定的)。在优选的实施方案中，孵育在特定细胞类型的培养条件下进行。例如，ASCs可以在完全DMEM(DMEM/F-12培养基-GlutaMAXTM-I，Gibco，补充了100μg/mL青霉素/链霉素和10％FBS)中与NAC一起孵育，并在37℃、5％CO2下孵育。在一个实施方案中，干细胞群在整个培养期间不与NAC一起孵育。培养期是在细胞培养容器中接种干细胞群和冷冻干细胞群之间的时期。在一个实施方案中，将干细胞群在未添加NAC的培养基中孵育第一时间段，然后在添加NAC的培养基中孵育第二时间段。
如本文所公开的已进行NAC“处理步骤”的干细胞群被称为“经处理的干细胞群”。
在处理步骤后，将经处理的干细胞群冷冻。如本文所公开的已进行冷冻(“冷冻步骤”)的干细胞群被称为“冷冻的干细胞群”。如本文所公开的已进行解冻(“解冻步骤”)的干细胞群被称为“解冻的干细胞群”。因此，方法可以包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。
在冷冻经处理的干细胞群之前，可以去除NAC(即因此细胞不再暴露于细胞外NAC)。通常，这可以通过例如用(1)不包含NAC的细胞培养基(例如，如处理步骤中所用的)；(2)磷酸盐缓冲盐水(PBS)；和/或(3)冷冻培养基，洗涤干细胞群来进行。如本文所公开的已进行洗涤(“洗涤步骤”)的干细胞群被称为“经洗涤的干细胞群”。洗涤还可以用作培养基更换步骤，使得细胞可以在不同的培养基，如冷冻培养基中冷冻。因此，方法可以包括以下步骤：(a)用N-乙酰半胱氨酸处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)洗涤经处理的干细胞群以去除N-乙酰半胱氨酸和获得经洗涤的干细胞群，以及冷冻经洗涤的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；以及(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。
洗涤经处理的干细胞群可以通过任何合适的方法进行。对于贴壁细胞，可以通过简单的移液将含有NAC的溶液(例如培养基)更换为不同的溶液(例如不含NAC和/或是冷冻培养基的溶液)。对于悬浮细胞(包括胰蛋白酶消化的贴壁细胞)，可以将细胞沉淀，例如使用离心机，将上清液去除，任选地洗涤(例如用培养基或PBS)，然后重新悬浮在所需培养基(例如培养基或冷冻培养基)中。过滤、超滤或透析也可用于洗涤细胞。用于胰蛋白酶消化贴壁细胞的方法是本领域已知的，并且在实施例中例示了合适的方法。
冷冻解冻后，可以培养细胞(“培养”或“培养步骤”)，例如以允许细胞恢复和/或增加细胞数量。所得的细胞被称为“扩增的干细胞群”。如本文所用，当提及细胞时，术语“扩增的”应被视为具有其在本领域中的通常含义，即已在体外增殖的细胞。“增殖”是指细胞数量的增加。“增殖(Proliferating)”和“增殖(proliferation)”是指细胞进行有丝分裂。因此，方法还可包括以下步骤：(d)培养解冻的干细胞群，以获得扩增的干细胞群。
如本文所用的“培养”是指本领域公认的术语，即在合适的培养基中实现细胞生长的任何方法。可以通过本领域已知的用于培养干细胞的任何技术来培养细胞。培养步骤可以是小规模、培养基规模或大规模。如果总培养体积小于约100mL，则可以认为是小规模的培养。如果总培养体积在约100mL至约5L之间，则可以认为是培养基规模的培养。如果总培养体积(例如在生物反应器中)大于约5L，并且可能大于10L、100L、500L或1000L，则可以认为是大规模规模。
“细胞培养”是指体外细胞的生长。在这样的培养中，细胞增殖，但它们本身并没有组织成组织。“组织培养”是指组织(例如，原始器官或成体器官的体外外植体)的维持或生长，以保持其结构和功能。“单层培养”是指这样一种培养，其中细胞在合适的培养基中繁殖，同时主要是相互附着和附着在基质上。此外，“悬浮培养”是指这样一种培养，其中细胞繁殖，同时悬浮在合适的培养基中。同样，“连续流培养”是指在新鲜培养基的连续流中培养细胞或外植体以维持细胞生长，例如活力。“汇合培养”是这样一种细胞培养，其中所有细胞都接触，并因此培养容器的整个表面都被覆盖，并意味着细胞也已达到了其最大密度，但汇合并不一定意味着分裂将停止或群体大小将不会增加。
对各种培养技术及其扩大规模的讨论可以在Freshney,RI,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications,第7版,Wiley-Blackwell 2016年1月中找到。培养步骤可在任何类型的容器中进行(有关MSCs制造的综述，包括对不同类型容器的讨论，参见Mizukami et al.“Mesenchymal Stromal Cells:From Discovery to Manufacturing and Commercialization”Stem CellsInternational(2018)文章编号4083921,1-13https://doi.org/10.1155/2018/4083921)。可用于本文公开的方法中的容器的实例包括单层培养或扁平二维烧瓶，其由单个隔室或多层容器细胞工厂如Nunc细胞工厂(Nunc Cell Factories)和Corning Cell Stacks组成。作为烧瓶的替代品，可以使用滚瓶，即将圆柱瓶放入旋转装置中，在该装置中细胞可以在大约瓶子的内表面上形成单层。适用于细胞大规模扩增的生物反应器，包括MSCs(如ASCs)，可商购获得，并且可以包括2D(即基本平面的)和3D扩增生物反应器。可用于本文公开的方法中的此类生物反应器的实例包括但不限于活塞流生物反应器、灌注生物反应器、连续搅拌罐生物反应器或固定床生物反应器。生物反应器可以以分批、补料分批或灌注模式运行。由于MSCs的锚定依赖性，生物反应器中的培养需要使用微载体，这些微载体通常是小珠子(直径为100-200μm)，它们很容易维持悬浮，并为细胞提供表面以附着和生长。微载体的实例包括Cytodex-3微载体(GE Healthcare)。细胞通常在31℃-37℃的温度下，在湿润环境中生长。因此，在一些实施方案中使用微载体在大规模生物反应器中进行解冻的干细胞群(例如MSCs，如ASCs)的培养以获得扩增的干细胞群。
可以在NAC存在下进行解冻的干细胞群的培养，例如以改善恢复和/或增加细胞数量。换言之，除用NAC预处理外，还可以使用解冻后NAC处理。因此，方法还可以包括以下步骤：(d)在N-乙酰半胱氨酸存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。培养解冻的干细胞群可以包括在该细胞类型合适的细胞培养条件下，添加NAC至大约0.5-5mM NAC，如大约0.5-4mM或大约1-2mM，优选大约2mM的初始浓度范围。可能需要进一步添加NAC以维持细胞培养基中NAC的浓度(例如，由于NAC被降解或代谢)。因此，培养步骤可以包括在培养基中添加初始浓度的NAC，然后进一步添加NAC以维持初始浓度的NAC或维持预定水平的NAC浓度(例如，如上所述的NAC浓度)。可以作为单独的单剂量的NAC或与其他营养素组合(例如在分批补料培养中)添加进一步的添加物。“培养步骤”还可以包括监测NAC的水平，并添加一次或多次进一步的NAC添加物以维持初始浓度或预定水平。可选地，可以连续补充NAC，例如在灌注培养过程中于新鲜培养基中。
可以在任何下游使用干细胞群之前根据需要去除NAC。因此，方法还可以包括洗涤扩增的干细胞群以去除NAC和获得经洗涤的并扩增的干细胞群的步骤。洗涤步骤可允许培养基例如更换为药学上可接受的载体、不包含NAC的溶液/培养基或冷冻培养基。可以通过任何合适的方法进行洗涤，包括离心、过滤、超滤或透析。对于贴壁细胞，可以通过简单的移液将含有NAC的溶液(例如培养基)更换为不同的溶液。对于悬浮的细胞(包括胰蛋白酶消化的贴壁细胞)，可以将细胞沉淀(例如使用离心机)，将上清液去除，任选地洗涤(例如用培养基或PBS)，然后重新悬浮在所需的溶液(例如，培养基、冷冻培养基或药学上可接受的载体)中。因此，方法还可以包括以下步骤：洗涤解冻的或扩增的干细胞群(例如，步骤(c)或(d)的)，并将细胞重悬(例如悬浮细胞或胰蛋白酶消化的贴壁细胞)在药学上可接受的载体中。
可将扩增的干细胞群冷冻，例如用于作为细胞储备物存储和/或用于运输。方法还可以包括以下步骤：(e)冷冻扩增的干细胞群(例如，来自步骤(d)的)以获得冷冻的扩增的干细胞群。方法还可以包括以下步骤：(e)冷冻扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群；和(f)解冻冷冻的扩增的干细胞群以获得解冻的扩增的干细胞群。方法可以包括以下步骤：(e)冷冻经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群。方法还可以包括以下步骤：(e)冷冻经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群；和(f)解冻冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群以获得解冻的扩增的干细胞群。如上文讨论的，由于可以在NAC存在下进行步骤(d)的“培养步骤”，在这些情况下，扩增的干细胞群可被认为在冷冻前用NAC“预处理”。可以根据需要通过洗涤去除NAC，然后可以使用冷冻和/或洗涤以将培养基例如更换为冷冻培养基。任选地，方法还可以包括以下步骤：(g)洗涤解冻的扩增的干细胞群并将细胞(例如，悬浮或胰蛋白酶消化的贴壁细胞)重悬于药学上可接受的载体中。
从上文讨论的方法获得的冷冻的干细胞群(例如ASCs)形成种源细胞储备物。例如，可以将干细胞群等分于多个冷冻小瓶中，例如至少约10个、至少约20个、至少约50个、约100个、约1000个、约2000个、约5000个或更多个冷冻小瓶中，并冷冻保存(例如在液氮存储容器中)。然后可以将单个冷冻小瓶单独解冻以用于下游使用。从上文讨论的方法获得的解冻的或扩增的干细胞群(例如ASCs)可以是治疗性干细胞群。例如，解冻的或扩增的干细胞群(例如ASCs)可以于合适的制剂(例如含有药学上可接受的载体的药物组合物)中，以用于给予有需要的患者。
方法还可以包括将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
解冻后NAC处理
本文公开了用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群(如ASCs)以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；和(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。在NAC存在下培养解冻的干细胞群(即解冻后NAC处理)可以改善恢复和/或增加活细胞数量。
培养解冻的干细胞群可以包括在细胞类型合适的细胞培养条件下添加NAC至大约0.5-5mM NAC，如大约0.5-4mM或大约1-2mM，优选大约2mM的初始浓度范围。可能需要进一步添加NAC以维持细胞培养基中NAC的浓度(例如，由于NAC被降解或代谢)。因此，培养步骤可以包括在培养基中添加初始浓度的NAC，然后进一步添加NAC以维持初始浓度的NAC或维持预定水平的NAC浓度(例如，用于如上所述的解冻后处理的NAC浓度)。进一步的添加可以作为单剂量添加，任选地与其他营养素组合(例如在补料分批培养中)。“培养步骤”还可以包括监测NAC的水平，并添加一次或多次进一步的NAC添加物以维持初始浓度或预定水平。可选地，可以连续补充NAC，例如在灌注培养过程中提供的新鲜培养基中。
方法还可以包括将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
低温保存
在本文中，术语“低温保存”被用于描述细胞在低温环境，即-70℃至-196℃中的储存。这些温度适合长期储存(数月至数年)。如本文所讨论的，在干细胞的上下文中使用术语“冷冻(freezing)”至“冷冻(freeze)”和“冷冻(frozen)”是指将细胞暴露于这样的低温下的行为，以及细胞已经经受了这样的低温。
通常，冷却后，随着外部培养基冷冻，细胞通过失水达到平衡，从而增加细胞内溶质浓度。低于约-10至-15℃会发生细胞内冷冻。细胞内冷冻和溶液效应都是造成细胞损伤的原因。细胞外冰造成的物理损伤主要是细胞渗透性脱水引起的质膜损伤的结果。
一旦系统冷冻，并非所有生物过程都会停止。在冷冻期间，细胞保持在生化活跃的未冷冻状态，同时被包裹在冷冻的冰基质中。直到温度降至冷冻保护剂/细胞溶液混合物的玻璃化转变点(Tg)以下(通常低于-100℃)，细胞才会进入玻璃态，其中生化和生物分子活动停止。
在冷冻和随后的解冻过程中，当温度高于Tg时，每个细胞内会发生一系列重要的分子和生化事件，这会极大地影响其解冻后的活力和功能。在该温度范围内(从大约+15℃到-99.9℃)，可以在低温保存和低温储存之间的细胞反应机制中看到许多相似之处。此类事件包括自由基的形成、生化途径的解偶联、细胞内废物积累、离子梯度破坏、蛋白质变性和降解，以及酶裂解和活化。这些和其他事件可以激活凋亡和/或坏死细胞死亡途径，其可能导致延迟性发作的细胞死亡现象。这可以被观察为在储存后立即测量的存活率与24–48小时后的真实存活率之间的脱节。
低温保存培养基
可以在低温保存培养基(“冷冻培养基”)中冷冻干细胞群(如ASCs)。培养基可以在冷冻解冻后保留(在一定程度上)细胞的一种或多种特性(例如活力)和/或可以帮助恢复。低温保存培养基可以含有例如约0.5-10mM浓度的NAC。在一个实施方案中，低温保存培养基不含有NAC。低温保存培养基通常含有一种或多种低温保存剂如DMSO、PVP、丝胶或甲基纤维素，和/或可以含有可商购获得的低温保存溶液。可将一种或多种低温保存剂或低温保存溶液添加至干细胞培养基中，如DMEM，以产生低温保存培养基。在一个实施方案中，低温保存培养基不含任何添加的生长因子。在一个实施方案中，低温保存培养基不含任何添加的EGF和bFGF。在一个实施方案中，低温保存培养基不含添加的亚硒酸钠。在一个实施方案中，低温保存物物不含NAC并且不含任何添加的生长因子。在一个实施方案中，低温保存培养基不含NAC并且不含任何添加的EGF和bFGF。在一个实施方案中，低温保存培养基不含NAC并且不含任何添加的亚硒酸钠。在一个实施方案中，低温保存培养基不含NAC并且不含任何添加的生长因子并且不含任何添加的亚硒酸钠。在一个实施方案中，低温保存培养基不含NAC并且不含EGF和bFGF并且不含任何添加的亚硒酸钠。
低温保存剂(或冷冻保护剂)在理想情况下是无毒的，可在冷冻期间保护细胞，替代水和/或具有高玻璃化转变温度。不希望受理论束缚，假设冷冻保护剂尤其通过以下机制保护细胞免于冷冻：平衡外部渗透压、经由优先排斥稳定生物分子、在生物分子周围形成保护玻璃，以及防止脂质膜中的破坏性相变等。
在过去，DMSO、甘油和动物血清已被用作冷冻保护剂。
DMSO通常以1％-20％(v/v)的范围，如5％-15％，即约1％、2％、5％、10％或20％添加至低温保存培养基。大约10％的终浓度是特别优选的。
DMSO可与血清，即胎小牛/牛血清(FCS/FBS)或人血清组合使用。例如，低温保存培养基可含有20％-95％血清(人或FCS)和5％-15％DMSO。在本文所述的任何一种方法中使用的特别优选的低温保存培养基(例如用于MSCs，如ASCs)含有大约10％DMSO和大约90％FCS(或FBS)。例如，用于诸如人ASCs的MSCs群体的低温保存培养基可含有于FBS中的5％-15％的DMSO。用于人胚胎干细胞群的冷冻培养基可含有10％DMSO、30％FBS和60％条件化HES培养基。
DMSO可与人血清白蛋白组合使用。例如，低温保存培养基可含有约2％-10％的人血清白蛋白和约5％-15％的DMSO。特别优选的低温保存培养基含有大约10％DMSO和大约5％人血清白蛋白。
其他分子，如甘油、乙二醇、羟基纤维素或二糖蔗糖、麦芽糖和海藻糖，在冷冻培养基中与DMSO组合时，已被证明可以增强细胞活力。
海藻糖是一种于能够在几乎完全脱水的情况下存活的多种生物体中以高浓度发现的二糖，并已显示在冷冻期间稳定某些细胞。海藻糖被认为通过在冷冻期间保持磷脂头基间距和抑制脂质相变和分离来维持膜的热力学稳定性。海藻糖的特点是其不易穿透脂质双层，并且必须通过内吞作用或其他暂时破坏细胞膜的方法加载到细胞内。例如，用于ASCs的低温保存培养基可以包含浓度在约50-200mM，如大约100mM的海藻糖。海藻糖可用于降低与其他冷冻保护剂相关的潜在毒性，例如当以上文讨论的浓度与DMSO组合使用时(参见，例如Buchanan et al.Cell Preservation Technology(2005)3(4):212-222)。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、丝胶和麦芽糖以及甲基纤维素(MC)是可选的低温保存剂。这些化合物已经作为例如ASCs的低温保存溶液、作为DMSO或动物来源血清的替代物进行了测试(Miyagi Shiohira et al.Cell Medicine(2015)8:3-7)。
PVP是一种高分子聚合物，降低冷冻点并抑制细胞外盐浓度升高，从而在冷冻解冻过程中稳定细胞膜。PVP可以以约1％至40％，如约8％至25％，例如约1％、5％、10％、20％或40％的水平添加到低温保存培养基中。除PVP外，低温保存培养基还可含有任选地约5％-20％(例如，10％人血清)的人血清。例如，用于ASCs的低温保存培养基可含有10％PVP和10％人血清。
MC是一种高分子聚合物，其可以在低温保存溶液中替代动物来源的血清，尽管DMSO(或另一种低温保存剂)的存在对于在冷冻解冻过程后保持细胞活性是必需的。低温保存培养基可含有约0.5％-2％w/v MC，例如约1％w/v MC，与如上文讨论的合适浓度的DMSO组合。例如，低温保存培养基可含有约1％MC和约10％DMSO。
丝胶是一种茧来源的蛋白质，其也可以在低温保存溶液中替代动物来源的血清。低温保存培养基可含有约0.5％-2％w/v丝胶，例如约1％w/v丝胶。丝胶可与麦芽糖(例如50-200mM麦芽糖)和/或如上文讨论的合适浓度的DMSO组合使用。例如，低温保存培养基可含有约1％丝胶、100mM麦芽糖和10％DMSO。
有各种可商购获得的低温保存溶液，例如：FM-1(Kyokuto PharmaceuticalIndustrial Co.,Ltd,Tokyo,Japan)、cell banker冷冻保护剂系列(Nippon ZenyakuKogyo Co.,Ltd.,Fukushima,Japan)；CryoStor(Stem Cell Technologies)；Synth-a-Freeze低温保存培养基(Thermo Fisher Scientific)和MesenCultTM-ACF冷冻培养基(StemCell Technologies)。
Cell banker冷冻保护剂系列允许在-80℃下快速低温保存细胞，并且其使用与冷冻和解冻后提高的存活率相关。含有血清的cell bankers 1和1+可用于几乎所有哺乳动物细胞的低温保存。此外，非血清型cell banker2允许在无血清培养条件下低温保存细胞。另一方面，STEMCELLBANKER(cell banker 3)是一种化学成分明确的细胞低温保存溶液，不含异种(即不含非人类动物产物)，并优化干细胞的保存性能，如体细胞和诱导的多能干细胞。
系列(BioLife Solutions,Inc.)是一种不含血清、不含动物成分且明确的低温保存培养基，含有各种浓度的DMSO(CS10 10％DMSO；CS5 5％DMSO；CS2 2％DMSO)。CS10已用于MSCs(包括ASCs)、胚胎干细胞(ES)和诱导的多能干细胞(iPS)的低温保存。Synth-a-Freeze低温保存培养基(Thermo Fisher Scientific)已被用于冷冻保存诱导的多能干细胞(iPS)。
细胞特异性低温保存培养基也是可获得的，如ES和iPS细胞的mFreSRTM和FreSRTM-S低温保存培养基、MSCs的MesenCultTM-ACF冷冻培养基和来源于ES/iPS细胞的神经祖细胞的STEMdiffTM神经祖细胞冷冻培养基。例如，可将MSCs冷冻保存于MesenCultTM-ACF冷冻培养基(Stem Cell Technologies)中，其可以在MesenCultTM-ACF Plus或MesenCultTM培养基(Stem Cell Technologies)中培养MSC后使用以冷冻保存MSCs
用于各种干细胞类型的示例性的低温保存培养基和冷冻保护剂显示在下表中：
关于MSCs的低温保存的其他细节提供于例如Marquez-Curtis et al.(Cryobiology(2015)71(2):181-197)和Francois et al.(Cytotherapy(2012)14(2):147-152)中。
冷冻方案和存储条件
冷冻速率必须足够快以避免导致细胞脱水和损伤的溶质和电解质失衡，并且必须足够慢以防止细胞外和细胞内冰晶形成。冷冻保护剂降低了培养基的冷冻点，因此细胞和含有冷冻保护剂的低温保存培养基的混合物是一种共熔系统，因为组合冷冻点低于单个组分。在冷冻过程中，流体从未冷冻的细胞中较低的溶质浓度移动到部分冷冻的培养基中，同时质膜防止细胞外冰晶进入。缓慢冷冻允许液体以导致细胞和培养基之间渗透压平衡的速率移出细胞，直到培养基冷冻时。如果速度太慢，细胞会严重脱水或其质膜受到不可逆转的损坏。如果速率太高，流体迁移不足，并且细胞在低温保存过程中保留了高水平的可冻结水，这导致致命的细胞内冰损伤。
在本文描述的方法中，可以使用机械或受控速率冷冻机来冷冻干细胞群。可以对受控速率冷冻机进行编程，以以特定速率将细胞冷却至大约-80℃。大多数细胞(包括MSCs)低温保存至-80℃的典型冷冻速率为-1℃/分钟。如冷冻速率可以通过在将干细胞群放入机械-80℃冷冻机之前对其进行隔离来实现，例如使用闭孔聚乙烯泡沫容器(例如BioCision)、聚苯乙烯泡沫塑料容器或异丙醇(IPA)填充的容器(例如Mr.FrostyTM(Thermo Scientific))。和Mr.FrostyTM都规定了-1℃/分钟的冷冻速率。然而，冷冻方案可能需要对给定的细胞类型或细胞系进行优化，以在解冻后实现最大的生存能力和功能的维持。在本文所述的方法中，冷冻步骤可以以约-0.5至约-10℃/分钟，优选约-3至约-5℃/分钟，例如大约-1、-2、-3、-4、-5或-10℃/分钟的速率进行。最终的冷冻温度可以在约-70℃到约-130℃之间，因此，在公开的方法中，冷冻步骤可以包括以约-0.5至约-10℃/分钟的速率将温度降低到-70℃至-130℃之间。温度可在10-60分钟内从+4℃降至-100-180℃之间。
干细胞群可以以任何细胞密度冷冻。冷冻的干细胞群优选的细胞密度范围为大约100万至大约5000万个细胞/mL，优选大约2500万个细胞/mL。
冷冻后，可以将冷冻的细胞群储存在-196℃的液氮中直至需要。热依赖性代谢过程通常不会在-100℃以下发生，因此干细胞在液氮中处于代谢停滞状态。对于-100℃以上低温机械应力不太严重的温度，可以使用多种容器。但是，在液氮温度下储存物质时，必须使用专门设计用于承受低温的容器(即“冷冻小瓶”)。市面上有多种专门设计用于低温用途的容器，包括塑料冷冻小瓶(例如带有螺旋顶盖)或玻璃安瓿(其可能是火焰密封的)。常用尺寸为1.2、2.0、4、5、10和15mL冷冻小瓶(参见，例如和小瓶)。通常，将0.5-1.0mL细胞悬液放入1.2或2.0mL小瓶中。各种尺寸和类型的液氮储存容器可商购获得(参见例如Thermo ScientificTM LocatorTM Plus系统和CryoExtraTM高效低温储存系统)。
在优选的实施方案中，细胞群(例如ASCs)在一个或多个冷冻小瓶中于-80℃下冷冻在低温保存培养基(例如于FBS中的10％DMSO)中，然后转移到液氮储存容器中。
本文所述的干细胞低温保存方法可以包括在多个冷冻小瓶中冷冻干细胞群，如ASCs。多个冷冻小瓶中的每一个中的干细胞群可以是相同的，即从本文公开的任何一种方法中获得的单个干细胞群的等分试样。在一些情况下，该方法还可以包括对多个干细胞群重复本文所述的干细胞低温保存方法中的任一种的步骤。重复的步骤可以依次进行，即接续前面的方法步骤。可选地，重复的步骤可以并行进行，即对多个干细胞群同时进行方法步骤。每次重复可以包括相同的方法步骤，或者可以包括不同的方法步骤，如本文所述。多个干细胞群可以包含从同一供体获得的干细胞群(例如ASCs)(例如，其中通过在单独的程序中使用本文所述的相同方法步骤，或通过使用如本文所述的不同方法获得不同的群)。多个干细胞群可以是从不同供体获得的干细胞群体(例如ASCs)。可选地，多个干细胞群可包含不同类型的MSCs。例如，多个干细胞群可包含以下MSCs中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种：来源于骨髓、脐带、牙髓、血液(例如外周、脐带或月经)、胎盘和脂肪的MSCs。这些方法还可以包括在多个冷冻小瓶中冷冻多个干细胞群。方法还可以包括将多个冷冻小瓶在液氮存储容器中存储至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月或至少1年。可以在-80℃下冷冻冷冻小瓶，然后转移至液氮存储容器中。多个冷冻小瓶为多于1个冷冻小瓶，例如至少约10个、至少约20个、至少约50个、约100个、约1000个、约2000个或约5000个或更多个冷冻小瓶。
本文还提供给了含有根据本文所述的方法获得的多个低温保存小瓶的液氮储存容器。
玻璃化是另一种冷却形式，其涉及对浸入开放储存容器内的低温保存培养基中的细胞进行极快速(>-1000℃/秒)冷却。通过将冷冻小瓶中的样品投入液氮中，可以实现快速冷冻。该过程抑制了冰的形成，尽管它需要具有潜在细胞毒性浓度的冷冻保护剂，并且使用开放式容器有污染的风险。玻璃化已成功冷冻保存人胚胎干细胞(hESCs)。与慢速冷冻和快速解冻方法相比，在含有DMSO和乙二醇的低温保存培养基中，人胚胎干细胞的毛细管玻璃化已被证明可将冷冻保存细胞的存活率提高超过一个数量级。简言之，在较低DMSO和EG溶液中平衡后，将hEScs集落(100-400个细胞)置于包含20％DMSO、20％乙二醇和0.5M蔗糖的低温保存培养基中。集落被装入吸管并投入液氮中。
解冻方案
通常，细胞在其生长温度或接近其生长温度，例如～37℃处被解冻。因此，在本文公开的方法中，干细胞群可在37℃处解冻。
在冷冻和解冻过程中，细胞会经过一个冰晶形成温度-15℃至-60℃。通常采用通过浸入37℃水浴中以大约90-100℃/分钟的速度快速解冻以防止冰晶形成。然而，在较低温度或较慢速率下解冻可以减少某些类型的损伤，如通过粘附介导的信号传导检测到的氧化应激，同时允许膜密封由冰结晶形成的任何孔。在本文所述的方法中，干细胞群通常在37℃下解冻。这种快速解冻步骤可以通过将冷冻小瓶中的细胞投入37℃的水浴中来实现。然而，解冻方案可能需要针对给定的细胞类型或细胞系进行优化，以实现最大活力和/或细胞功能的维持。
可以洗涤解冻的细胞以去除低温保存培养基，然后进行培养。上文讨论的洗涤方法(例如，有关NAC的去除和/或培养基更换)的实例也适合该目的。
解冻后评估
干细胞群的解冻后评估(例如以检查NAC预处理或解冻后处理的影响)可能包括以下一项或多项(或全部)测试：细胞活力、形态、细胞表面标记物评估、分化测定和其他功能特性的分析。示例性的评估在实施例中提供。
活力
如本文所用，术语“活力”或“有活力的”是指在冷冻保存和解冻后能够正常生长和发育的细胞。因此，评估干细胞群相对于未经NAC预处理、解冻后NAC处理或两者同时处理的类似干细胞群的活力，可用于确认细胞没有由于NAC预处理和/或解冻后处理而受到负面影响(即活力减少)(然而，NAC预处理和/或解冻后处理可能对活细胞数量、生长速率和恢复率等有积极影响，如下文进一步讨论的)。
可以在所公开的方法中使用用以确定细胞活力水平的实验的实例包括台盼蓝染色和MTS测定，如实施例中所讨论的。MTS测定是功能性活力(即新陈代谢)的度量，而台盼蓝测定度量结构性活力(即膜完整性)。本领域技术人员已知的其他方法，如阿尔玛蓝测定，也可以用于细胞活力的测量。
MTS测定是一种比色方法，用于确定增殖或细胞毒性测定中活细胞的数量。例如，CellTiterAQueous One Solution试剂含有一种新型四唑鎓化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓，内盐；MTS(a)]和电子偶联试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES)。PES具有增强的化学稳定性，使其能够与MTS组合形成稳定的溶液。这种方便的“One Solution”形式是对第一版CellTiterAQueous测定的改进，其中使用吩嗪硫酸甲酯(PMS)作为电子耦合试剂，并且PMS溶液和MTS溶液单独提供。MTS四唑鎓化合物(Owen试剂)被代谢活性细胞生物还原成有色甲臜产物，其可溶于组织培养基中。可以通过直接将少量的CellTiterAQueous One Solution试剂加入到培养孔中，孵育1–4小时，然后用96孔板读数仪记录490nm处的吸光度，来进行测定。
分化能力
低温保存后，为了使干细胞适用于各种治疗应用，细胞必须保持活力，维持在未分化状态并保留其分化能力。任何分化都会限制它们在下游应用中的使用。因此，评估干细胞群相对于未经NAC预处理、解冻后NAC处理或两者的类似干细胞群的分化能力，可用于确认细胞的特性不受NAC预处理和/或解冻后处理的影响。
在本文中，术语“分化(differentiation)”或“分化(differentiate)”是指多能或专能(非特化)干细胞转变为更特化的细胞类型的过程。
确定胚胎或诱导的多能干细胞的分化潜能或多能性的一种方法是测量表面标志物如OCT4和SSEA-4的水平，例如通过免疫荧光显微术(Xu,C.,et al.,(2001)NatBiotechnol.19:971-974)。OCT4和SSEA-4是未分化干细胞的标志物(即具有分化为其他谱系的潜力)。OCT4是一种胚胎基因转录因子，其在发育多能性控制中发挥作用，因此当OCT4基因活性在多能干细胞分化中受到抑制时，就会发生分化。还可以通过流式细胞术确定SSEA4表达。
MSCs具有分化成不同组织如骨骼、软骨、肌腱和脂肪组织的能力。它们被认为是专能成体祖细胞，因为它们的分化潜能比多能/全能干细胞更受限制，如胚胎或诱导的多能干细胞，后者具有分化成所有成体组织的潜力(Jiang et al.,(2002)Nature 418(6893):41-49)。测试不同组织中MSCs的分化潜能的方法在现有技术中是已知的(例如Guilak et al.,J Cell Physiol.(2006)206(1):229-237；Zuk et al.,Mol Biol Cell.(2002)13(12):4279 4295)。
细胞形态和/或大小
干细胞群的表型可以通过形态学和/或大小来评估。术语“表型”是指细胞的可观察特征，如大小、形态、蛋白质表达，包括细胞表面标志物等。因此，评估干细胞群相对于未经NAC预处理、NAC解冻后处理或两者同时处理的类似细胞干群的细胞形态和/或大小，可用于确认细胞的特性不受NAC预处理和/或解冻后处理的影响。
使用倒置培养显微镜可以查看和成像细胞形态和/或大小。
人类iPSC和ESC具有相似的特征，包括形态、增殖、表面标志物、基因表达、体外分化能力和畸胎瘤形成(参见，例如Thomson et al.Science(1998)282(5391):1145-1147；Xuet al.Nat.Biotechnol.(2001)19(10):971-974；Takahashi et al.Cell(2007)131(5):861-872；Courtot et al.Biores.Open Access(2014)3(5):206-216；Kato etal.Scientific Reports(2016)6:34009)。
取决于起源组织，MSCs在形态学和免疫表型上相似但不完全相同(Colter etal.,Proc.Natl Acad.Sci.USA(2000)97(7):3213-3218；Kern et al.,Stem Cells(2006)24(5):1294 1301；Huang et al.,J.Dent.Res.(2009)88(9):792-806；Carvalho et al.,Curr.Stem Cell Res.Ther.(2011)6(3):221-8；Harris et al.,Curr.Stem CellRes.Ther.(2013)8(5):394-9；Li et al.,Ann N Y Acad Sci.(2016)1370(1):109-118)。
细胞表面标志物的表征
可以通过分析一种或多种细胞表面标志物来进行干细胞群的表型表征。因此，评估相对于未经过NAC预处理、NAC解冻后处理或上述两种处理的类似干细胞群，所述干细胞群上一种或多种细胞表面标志物的表达，可用于确认细胞的特性不受NAC预处理和/或解冻后处理影响
结合目标细胞表面标志物的抗体的存在或不存在可以通过不同的方法来确定，包括但不限于免疫荧光显微术、放射照相术和流式细胞术。抗体表面标志物表达谱的确定可以是直接的，使用标记的抗体，或者其可以是间接的，使用针对目标细胞标志物的第一特异性抗体的第二标记抗体，从而实现信号放大。在流式细胞术中，通过使用标记的抗体，可以将荧光染料的水平与与抗体特异性结合的细胞表面标志物的数量相关联。干细胞群中一种或多种细胞表面标志物的差异表达允许识别和/或分离所述群体，例如使用FACS(荧光激活细胞分选)。
例如，根据国际细胞治疗学会(International Society for CellularTherapy)，定义MSCs的最低标准可以是CD105、CD73、CD44和CD90的表达，以及CD45、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA II类表达的缺乏(Dominici et al.,Cytotherapy.(2006)8(4):315-7)。可用于评估CD73、CD90和CD105标志物的抗体实例在实施例5中提供。可用于评估其他标志物的抗体可商购获得，例如从Beckton Dickinson，其实例列出如下。
标志物 荧光染料 抗体来源
CD45 FITC 小鼠IgG1k
CD34 APC 小鼠IgG1
CD14 APC 小鼠IgG2ak
CD11b PE 小鼠IgG1k
CD79α PE 小鼠IgG1k
CD19 APC 小鼠IgG1
HLA II类 APC 小鼠IgG1
例如，可以通过检查CD29、CD73、CD90和CD105的表达来进行ASCs群体的解冻后评估(例如，如实施例5中的)。这种分析可用于确认细胞的特性不受NAC预处理或解冻后处理的影响。
与特定干细胞类型相关的细胞表面标志物是已知的，且示例如下。
其他功能特性
评估干细胞群的其他功能特性(相对于未经NAC预处理、NAC解冻后处理或两者的类似干细胞群)可用于确认细胞的特性不受预处理和/或NAC解冻后处理影响。例如，对于ASCs，可以评估的其他功能特性包括：ASCs抑制受刺激淋巴细胞增殖的能力(例如，如实施例6中的)；ASCs的免疫调节能力，例如对单核细胞分化(例如，如实施例7中的)；ASCs调节吞噬作用的能力，例如金黄色葡萄球菌颗粒，通过成熟树突细胞(mDCs)；ASC介导的mDCs细胞表面上的CD206和CD163之一或两者的上调(例如，如实施例9中的)；和/或ASC介导的调节CD14-CD1a+mDCs至CD14+CD1a-mDCs(例如，如实施例9中的)。
因此，在本文公开的任何方法中，可以评估解冻的ASCs群体的以下特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或所有七种：(1)细胞活力；(2)细胞表面标志物CD29、CD73、CD90和CD105的表达；(3)抑制受刺激淋巴细胞增殖的能力；(4)对单核细胞分化的免疫调节作用；(5)调节成熟树突细胞吞噬作用的能力，例如金黄色葡萄球菌颗粒；(6)上调mDCs细胞表面上CD206和CD163之一或两者的能力；以及(7)调节CD14-CD1a+mDCs至CD14+CD1a-mDCs，对于每种特性，可以相对于未经NAC预处理、NAC解冻后处理或上述两种处理的类似ASCs群体进行评估，以允许确认细胞的特性不受影响和/或细胞活力不受NAC预处理和/或解冻后处理的负面影响(即降低细胞活力)。类似地，还公开了通过本文描述的任何一种方法获得的ASCs群体，其具有这些特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种或者所有七种(例如，如相对于未经NAC预处理、NAC解冻后处理或这两种处理的类似ASCs群体评估的，如上文讨论的)。
干细胞的类型
干细胞群可以是多能干细胞群或间充质干细胞(MSCs)群，例如骨髓来源的、脐带组织来源的、血液来源的(包括脐带血来源的)、月经、牙髓来源的、胎盘来源的或脂肪来源的MSCs(Huang et al.,J.Dent.Res.(2009)88(9):792-806；Carvalho et al.,Curr.StemCell Res.Ther.(2011)6(3):221-8；Harris et al.,Curr Stem Cell Res Ther.(2013)8(5):394-9；Li et al.,Ann.N Y Acad.Sci.(2016)1370(1):109-18)。在优选的实施方案中，干细胞是人细胞(例如人ASCs)。在本发明优选的实施方案中，干细胞群是脂肪来源的基质干细胞(ASCs)。用于本文所述的低温保存方法的ASCs可以是扩增的ASCs群体。
用于产生和培养根据本发明的干细胞群的方法是熟知的。
干细胞群可以是基本上纯的。有关干细胞群(例如MSC群体如ASCs群体)的术语“基本上纯的”是指具有至少约75％，通常至少约85％，更通常至少约90％，且最通常至少约95％同质性的干细胞群。可以通过形态学和/或通过细胞表面标志物特征来评估同质性。本文公开了用于评估形态学和细胞表面标志物特征的技术。
多能干细胞
多能干细胞有两种来源。首先，胚胎干细胞(ESCs)来源于胚胎植入前囊胚的内部细胞团，并且多能性受核心转录因子、八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y框2(SOX2)和Nanog同源框(NANOG)的内在调控网络控制。在一个实施方案中，使用胚胎干细胞系。胚胎干细胞系包括由从单个胚胎中收获的一组亲代细胞产生的不断分裂的细胞。本发明中使用的胚胎干细胞系不是通过破坏人胚胎获得的。胚胎干细胞系是可商购获得的，例如从ATCC。胚胎干细胞系的胚胎干细胞在培养过程中不会失去其多能性。特别地，胚胎干细胞系的胚胎干细胞在培养过程中不分化。其次，诱导的多能干细胞(iPSCs)源自四种转录因子OCT4、SOX2、Kruppel样因子4(KLF4)和对体细胞中诱导多能性至关重要的MYC原癌基因(C-MYC)的异位或升高表达。
用于分离稳定的(未分化的)胚胎干细胞，如人胚胎干细胞培养物的技术已经很好地建立起来(例如US 5,843,780；Thomson et al.,Science(1998)282:1145-1147；Turksen&Troy(2006)Human Embryonic Stem Cells.Turksen K.(eds)Human EmbryonicStem Cell Protocols.Methods in Molecular Biology,第331卷,Humana Press；Sevillaet al.,Stem Cell Research(2017)25:217-220；和Mitalipova&Palmarini(2006)Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells.Turksen K.(eds)Human Embryonic Stem Cell Protocols.Methods in Molecular Biology,第331卷,Humana Press)。在一个实施方案中，获得胚胎干细胞的方法不包括破坏一个或多个人胚胎。
自从Yamanaka的团队于2007年发现它们以来，用于产生iPSCs的技术已经很好地建立起来(例如Takahashi et al.,Cell(2007)131(5):861-72)。从那时起，已经开发了用于iPSC生成的新的改进方法，包括非整合和无饲养层方法和自动化高通量衍生化(Paullet al.,Nature Mehtods(2015)12(9):885–892)。
iPSC的特点是表达一系列多能性标志物：NANOG、SOX2、SSEA4、TRA1-81、TRA1-60，并且缺乏谱系特异性标志物。iPSC的多能性通过它们在胚状体测定中分化为三个胚层的能力得到证明，通过免疫组织化学对来自三个胚层的分化标志物Tuj1(外胚层标志物)、SMA(中胚层标志物)和SOX17(内胚层标志物)进行后验分析(Paull et al.,Nature Mehtods(2015)12(9):885–892。
MSCs
“间充质干细胞”(本文也称为“MSCs”)是多能的基质细胞。它们通常来源于结缔组织，并且是非造血细胞。MSCs群体(根据Dominici et al.2006(Cytotherapy 8(4):315-317)，可以：(1)在标准培养条件下粘附到塑料上(例如最小必需培养基加上20％胎牛血清)；(2)表达(即大于或等于MSCs群体的80％)CD105、CD90、CD73和CD44；(3)缺乏CD45、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA DR(HLA II类)的表达(例如小于或等于MSC群体的5％)；(4)能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。
可以使用标准方法从例如骨髓、脐带组织和血液、月经、牙髓、脐带血、胎盘和脂肪组织中获得MSCs。
尽管从不同组织获得的MSCs相似，但它们在表型和功能特征上存在一些差异。例如，细胞表面标志物CD54和CD106的表达水平可能因MSCs的来源/起源而不同。这些可以通过流式细胞术测量。一些基因如SOX2、IL1α、IL1β、IL6和IL8的mRNA水平可能由来自不同组织的MSCs差异化表达，并且可通过常规方法测量。IL6和PGE2分泌在来自不同来源的MSC之间也可能不同，并因此细胞可以具有不同的调节能力(参见，例如Yang et al.PLoS ONE(2013)8(3)e59354)。
骨髓来源的MSCs(BMSCs)
骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)与来自其他组织来源的MSCs相似。然而，与来自其他组织来源的MSCs，如脐带MSCs、胎盘MSCs、牙髓间MSCs和月经MSCs相比，它们在表型和功能特征上存在一些差异。尽管它们的最低表征标准相同，包括它们粘附在塑料、最低表面特征标志物的能力以及分化成骨骼、软骨、肌腱和脂肪组织的能力，但它们都有一些细微的差异。这些特性包括一些表面标志物如CD105的不同表达水平、不同水平的与它们的免疫调节潜力和再生潜力有关的分泌的可溶性因子，以及一般而言，略微不同的功能特性，其可能使每种来源或起源更适合特定的治疗适应症(Miura et al.,Int J Hematology(2016)103(2):122-128；Wuchter et al.,Cytotherapy(2015)17(2):128-139；Wright et al.,StemCells(2011)29(2):169-178)。
脐带来源的和牙髓来源的MSCs
Huang et al.(J.Dent.Res.(2009)88(9):792-806)讨论了来自牙髓的MSCs，并将它们的特征与来自其他来源的MSCs进行比较。Carvalho et al.(Curr Stem Cell ResTher.(2011)6(3):221-228)和Harris et al.(Curr Stem Cell Res Ther.(2013)8(5):394-399)讨论了脐带来源的MSCs、它们的特征(包括表型和分泌组)及其应用。
ASCs
脂肪来源的MSCs(ASCs)通常是从皮下脂肪组织中分离出来的，这使得它们可以大量获得。ASCs以高细胞活性快速增殖，使它们成为获得MSCs的理想来源。
通过“脂肪组织”意指任何脂肪组织。脂肪组织可以是棕色或白色脂肪组织、来源于皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。通常，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。此类细胞可包含原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可以来自任何具有脂肪组织的生物体。通常，脂肪组织是哺乳动物，最通常地，脂肪组织是人。脂肪组织的方便来源是来自吸脂手术，然而，脂肪组织的来源或脂肪组织的分离方法对本发明并不重要。
干细胞群可以是使用实施例1中描述的或本文描述的任何一种方法产生的ASCs群体。
优选的ASCs是产品“Darvadstrocel”(商品名“)中授权的人类同种异体脂肪来源的干细胞(人eASCs)。这些扩增的ASCs表达细胞表面标志物CD29、CD73、CD90和CD105。这些细胞能够表达多种因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)和干扰素-γ(IFN-γ)以及诱导型吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。因此，ASCs群体的特征可以在于至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％或更多表达CD29、CD73、CD90和/或CD105中的一种或多种。ASCs群体的特征可以在于至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群表达CD29、CD73、CD90和CD105中的全部。通常，ASCs群体的特征可以在于至少约80％的细胞群表达CD29、CD73、CD90和CD105中的全部。
根据Bourin et al.(Cytotherapy(2013)15(6):641-648)，ASCs群体可以定义为CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105表达阳性的，以及CD31和CD45表达阴性的。在ASCs群体中，至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群可以表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，并且少于约5％、约4％、约3％或约2％的ASCs群体可以表达CD31和CD45。通常，在ASCs群体中，至少约80％的细胞群可以表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，并且少于约5％的ASCs群体可以表达CD31和CD45。
在标准培养条件下，ASCs可能会粘附在塑料上。
扩增的ASC(eASC)在培养中表现出成纤维细胞样形态。具体来说，这些细胞很大，并且在形态学上的特征是细胞体浅，具有很少的长而细的细胞突起。细胞核大而圆，核仁突出，使细胞核外观清晰。大多数eASCS显示这种纺锤形形态，但通常一些细胞获得多边形形态(Zuk et al.Tissue Eng(2001)7(2):211-228)。
ASCs可能对于表面标志物HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105是阳性的。在一些实施方案中，ASCs群体的特征可能在于至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％；至少约90％或至少约95％的ASCs群体表达表面标志物HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105。通常，至少约80％的eASCs表达表面标志物HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105。
ASCs可能对于表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86是阴性的。在一些实施方案中，ASCs群体的特征可能在于少于约5％的ASCs群体表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。更通常地，少于约4％、3％或2％的ASCs群体表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。在一个实施方案中，少于约1％的ASCs群体表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。
在一些情况下，在ASCs群体中，至少约80％的细胞群体表达CD29、CD73、CD90和CD105中的所有，并且少于约5％的ASCs群体表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。
在一些实施方案中，ASCs群体可以表达HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或七种)。在一些实施方案中，eASCs不表达HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或八种)。在一些实施方案中，eASCs表达HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105中的四种或更多种，并且不表达HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80中的四种或更多种。
CD34的表达可以是阴性的或较低的，例如由0至约30％的ASCs群体表达。因此，在一些情况下，如上所述的ASCs可能以低水平表达CD34，例如在约5％至约30％的群体中。可选地，在其他情况下，所描述的ASCs不表达CD34，例如少于约5％的ASCs群体表达CD34。
在一些实施方案中，ASCs群体(例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群)可以表达标志物CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或者十种或更多种(例如多达13种))。例如，ASCs可以表达标志物CD29、CD59、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种、三种或所有)，例如CD59和/或CD90。
在一些实施方案中，ASCs群体可能不表达标志物因子VIII、α-肌动蛋白、结蛋白、S-100、角蛋白、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD45、STRO-1和CD133中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或者十种或更多种(例如多达15种))，例如ASCs不表达标志物CD45、CD31和CD14中的一种或多种(例如两种、三种或全部)，例如CD31和/或CD45。
在某些实施方案中，如上所述的ASCs(i)不表达对抗原呈递细胞(APCs)特异性的标志物；(ii)不组成性地表达IDO；和/或(iii)不显著地组成性表达MHC II。通常可以通过用IFN-γ刺激来诱导IDO或MHC II的表达。
在某些实施方案中，如上所述的ASCs不表达Oct4。
制备ASCs群体的方法
用于分离和培养ASCs以提供本发明的eASCs和干细胞群的方法，以及包含本发明的干细胞群的群体的组合物是本领域已知的。ASCs通常从脂肪组织的基质部分制备，并通过粘附在合适的表面，例如塑料上进行选择。因此，本文公开的干细胞低温保存的方法可以包括以下初始步骤(在任何一种方法的步骤(a)之前)：(i)从获自患者的脂肪组织的基质级分中分离ASCs群体，以及(ii)培养ASCs群体。可以在步骤(i)中任选地选择ASCs，以粘附到合适的表面，例如塑料。任选地可以在培养步骤(ii)期间和/或之后评估ASCs的表型。
可以通过本领域标准的任何方式获得ASCs。通常将细胞与源组织(例如脂肪抽吸物或脂肪组织)分离来获得所述细胞，通常通过用消化酶如胶原酶处理组织。然后通常将消化的组织物质通过约20微米至1mm的过滤器过滤。然后分离细胞(通常通过离心)并在粘附表面(通常是组织培养板或烧瓶)上培养。这种方法是本领域已知的，并且例如如第6777231号美国专利中所公开的。根据该方法学，脂肪抽吸物是从脂肪组织和由其来源的细胞中获得的。在该方法学的过程中，细胞可能被洗涤以去除污染的碎片和红细胞，优选用PBS。将细胞在PBS中用胶原酶消化(例如，在37℃下30分钟，0.075％胶原酶；I型，Invitrogen，Carlsbad，CA)。为了消除剩余的红细胞，消化后的样品可经洗涤(例如用10％胎牛血清)、用160mmol/L NH4Cl处理，并最后悬浮在DMEM完全培养基(含10％FBS、2mmol/L谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM)。细胞可以通过40μm尼龙网过滤。
根据本发明的某些实施方案的培养的人ASCs在DelaRosa et al.(Tissue EngPart A.(2009)15(10):2795-806),Lopez-Santalla et al.(Stem cells(2015)33:3493–3503)中有描述。在一个实施方案中(如Lopez-Santalla et al.2015中所述)，将来自健康供体的人脂肪组织抽吸物用磷酸盐缓冲盐水经洗涤两次，并用0.075％胶原酶(I型；Invitrogen)消化。将消化后的样品用10％胎牛血清(FBS)洗涤，用160mM NH4Cl处理以消除剩余的红细胞，并悬浮在培养基(杜氏改良Eagle培养基(DMEM)，含10％FBS)中。将细胞(2–3·104个细胞/cm2)接种在组织培养瓶中并培养(37℃，5％CO2)，每3–4天更换培养基。当细胞达到90％汇合时，将细胞转移到新的烧瓶中(103个细胞/cm2)。将细胞扩增到多达12–14次复制并冷冻。在12–14次群体倍增时，用来自两名男性和两名女性成年供体的细胞进行实验。将来自相同冷冻库的ASCs解冻，并在每次实验前接种。根据国际细胞治疗学会的标准定义ASCs：对HLA-I、CD73、CD90和CD105呈阳性，且对CD11b、CD14、CD31、CD34和CD45呈阴性。
在另一个实施方案中(如DelaRosa et al.2009所述)，将从来自健康成人供体的人脂肪组织中获得的脂肪抽吸物用PBS洗涤两次，并在37℃下用于PBS中的18U/mL的I型胶原酶消化30分钟。一个单位的胶原酶在37℃、pH 7.5(Invitrogen,Carlsbad,CA)下于5小时内从胶原中释放1mM L-亮氨酸等价物。将消化后的样品用10％胎牛血清(FBS)洗涤，用160mM NH4Cl处理，悬浮在培养基(含有10％FBS的DMEM)中，并通过40-mm尼龙网过滤。将细胞(2-3x104个细胞/cm2)接种到组织培养瓶上，并在37℃和5％CO2条件下扩增，每7天更换一次培养基。当培养物达到90％汇合时，将细胞转移到新的培养瓶中。细胞的表型特征在于它们分化成软骨、骨和脂肪遗传谱系的能力。另外，通过用特定的表面标志物染色来验证hASCs。hASCs对HLA-I、CD90和CD105呈阳性，且对HLA-II、CD40、CD80、CD86和CD34呈阴性。该研究使用了来自六名健康供体(三男三女，年龄在35-47岁之间)的集合。使用第4–6代的细胞。
将ASCs在合适的组织培养容器中培养，包括适合ASCs粘附的表面，例如塑料。去除非粘附细胞，例如通过在合适的缓冲液中洗涤，以提供分离的粘附基质细胞群(例如ASC)。可以将以这种方式分离的细胞接种(优选2-3x104个细胞/cm2)到组织培养瓶上，并在37℃和5％CO2下扩增，每3-4天更换一次培养基。当培养物达到大约90％的汇合时，优选地将细胞从粘附表面脱离(例如通过胰蛋白酶的方式)，并传递(“传代”)至新的培养瓶(1,000个细胞/cm2)。
ASCs可以培养至少约15天、至少约20天、至少约25天或至少约30天。通常，培养中细胞的扩增提高了群体中细胞表型的同质性，从而获得了基本上纯的群体。
在一些实施方案中，将ASCs在培养中扩增至少三个培养世代或“传代至少3次”。在其他实施方案中，将细胞传代至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。优选将细胞传代超过3次以提高细胞群中细胞表型的同质性。事实上，只要细胞表型的同质性得到改善并且分化能力被维持，细胞就可以在培养中无限地扩增。
在一些实施方案中，将ASC在培养中繁殖至少三次群体倍增，例如，将细胞在培养中扩增至少有四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、15次或20次群体倍增。在一些实施方案中，将细胞在培养中扩增少于七次、八次、九次、十次、15次或20次群体倍增。在某些实施方案中，将细胞在培养中扩增约5-10次群体倍增。在某些实施方案中，将细胞在培养中扩增约10-15次群体倍增。在某些实施方案中，将细胞在培养中扩增约15-20次群体倍增，例如约16次群体倍增。
ASC分离优选在无菌或GMP条件下进行。
干细胞群(例如ASCs)可以是同种异体的，即非分离自将被施用干细胞群作为治疗的对象。
干细胞群体
根据本文公开的方法的用NAC预处理、用NAC解冻后处理或用NAC预处理和解冻后处理的组合可导致以下特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种或者所有四种：相比对照干细胞群增加活细胞数量、增加生长速率、增加线粒体活性和提高恢复速率。对照干细胞群是未经NAC预处理、NAC解冻后处理或NAC预处理和NAC解冻后处理两者，但在其他方面经历相同的条件的同一干细胞群。在另一实施方案中，对照干细胞群来源于与经NAC预处理、NAC解冻后处理或NAC预处理和NAC解冻后处理两者的干细胞群相同的干细胞群，但对照群体未经NAC预处理、NAC解冻后处理或NAC预处理和NAC解冻后处理两者，但在其他方面经历了相同的条件。
还提供了通过本文描述的任何一种方法获得的干细胞群(例如ASCs)，其具有这些特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种，或者所有四种。
相比对照细胞群，对于所述干细胞群，解冻并任选地培养约1天、约2天、约3天、约4天、约7天或约10天或更多天后活细胞的数量可以增加。例如，相比对照干细胞群，解冻并培养1天(和/或4天)后干细胞群中活细胞的数量可以增加至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约2倍或至少约5倍或更多倍。例如，图4A显示了相对于未经处理的细胞，培养1天(～5,000vs～3,000个细胞/cm2)和培养4天(～12,500vs～9,000个细胞/cm2)后，用6mM NAC预处理的ASCs的活细胞的数量增加。在另一个实例中，图6显示了相对于未经处理的细胞，在培养7天(～6,300vs～5,600个细胞/cm2)、11天(～18,700vs～17,500个细胞/cm2)和14天(～18,300vs～15,200个细胞/cm2)用2mM NAC进行解冻后处理增加了活细胞的数量。合适的用于测量活细胞数量的方法如上所述。
相比对照干细胞群，干细胞群的生长速率(即每天活细胞数量/cm2的增加)可以增加。相比对照干细胞群，解冻后(例如解冻后培养第1天至第4天之间)干细胞群的生长速率可以增加至少约1.03倍、约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍或至少约2倍或更多倍。例如，图4A显示了相对于未经处理的细胞，用6mM NAC预处理的ASCs培养第1天至第4天的生长速率增加。具体地，用NAC预处理的细胞第1天至第4天的生长为约2500个细胞/cm2/天，相比对于未经处理的细胞的约2000个细胞/cm2/天，即大约1.25倍的提高。在其他实例中，图6显示了用2mM NAC解冻后处理的ASCs在第7天至第11天的生长速率相对于未经处理的细胞增加，即约3100个细胞/cm2/天，相比对于未经处理的细胞的约3000个细胞/cm2/天。
相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天、约2天、约3天、约4天、约7天或约10天或更多天后细胞的干细胞群的线粒体活性(如例如通过MTS测定测量的)可以增加。相比对照干细胞群，解冻并培养1天(和/或4天)后的干细胞群中线粒体活性可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％或更多。例如，图4B显示了相比未经处理的细胞，在用6mM NAC预处理后的线粒体活性增加超过35％，如解冻后培养24小时后测量的(对于对照，490nm处的MTS测定读数以100％标准化)。在另一个实例中，图4C显示了与未经处理的细胞相比，在用6mM NAC预处理后的线粒体活性增加超过15％，如解冻后培养96小时后测量的。
对于贴壁细胞(如ASCs)，解冻后“恢复”可以定义为在培养过程中贴壁细胞的活细胞数增加超过初始接种密度的点。对于悬浮生长的细胞，解冻后“恢复”可以定义为在培养过程中活细胞数量增加超过初始接种密度时。与对照干细胞群相比，解冻的干细胞群的恢复率，即解冻后细胞恢复所花的时间，可能提高(即缩短)。例如，相比对照干细胞群，解冻后恢复所花的小时数可能减少至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约2倍、至少3倍、至少4倍或至少5倍或更多倍。例如，图4A显示了用6mM NAC预处理的ASCs在1天的解冻后培养后恢复，而未经处理的细胞未恢复。
在如本文公开的优选的方法或干细胞群中，干细胞群具有以下特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或者所有五种：(a)相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天和/或约4天后活细胞的数量增加至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约2倍或至少约5倍或更多倍；(b)相比对照干细胞群，解冻后的干细胞群的生长速率(例如解冻后培养的第1天至第4天)增加至少约1.03倍、约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍或至少约2倍或更多倍；(c)相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天和/或约4天后线粒体活性增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％；(d)相比对照干细胞群，解冻后细胞恢复所花的时间减少；和/或(e)相对于对照干细胞群，解冻后细胞恢复所花的小时数减少至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍
在如本文公开的优选的方法或干细胞群中，ASCs群体具有以下特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种，或者所有六种：(1)相比对照干细胞群，解冻并培养约1天后活细胞的数量增加至少约1.5倍(例如，在用6mM NAC预处理24小时后)；(2)相比对照干细胞群，解冻并培养约4天后活细胞的数量为至少约1.3倍(例如，在用6mM NAC预处理24小时后)；(3)相比对照干细胞群，解冻后培养的第1天至第4天的生长速率增加至少约1.25倍(例如在用6mM NAC预处理24小时后)；(4)相比对照干细胞群，解冻并培养约1天后线粒体活性增加至少约35％(例如在用6mM NAC预处理24小时后)；(5)相比对照干细胞群，解冻并培养约4天后的线粒体活性增加至少约15％(例如在用6mM NAC预处理24小时后)；和/或(6)相比对照干细胞群，解冻后ASCs恢复所花的时间减少(例如在用6mM NAC预处理24小时后)。
在如本文所述的优选的方法或干细胞群中，ASCs群体具有以下特性中的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种，或者所有四种：(a)相比对照干细胞群，在用NAC(例如2mM)解冻后处理7天后活的ASCs的数量增加至少约1.1倍；(b)相比对照干细胞群，在用NAC(例如2mM)解冻后处理11天后活的ASCs数目增加至少约1.05倍；(c)相比对照干细胞群，在用NAC(例如2mM)解冻后处理14天后活的ASCs的数量增加至少约1.2倍；和/或(d)相比对照干细胞群，在培养的第7天至第11天测量时，在用NAC(例如2mM)解冻后处理后的生长速率增加至少约1.03倍。
低温保存组合物
公开了低温保存组合物，其包含通过本文公开的任一种方法制备的干群细胞(例如ASCs)和低温保存培养基。低温保存组合物可被冷冻。低温保存组合物可含有NAC，例如以大约0.5-10mM的浓度范围，例如大约2-8mM或大约4-6mM。在特别优选的实施方案中，低温保存组合物中NAC的浓度为约6mM。
在实践本发明的方法中，预想低温保存过程可能对多种细胞过程产生影响。如上文所讨论的，冷冻过程可能会停止细胞内反应，包括基因转录。这些影响也可能起因于或附加于低温保存培养基的化学组合物(如低温保护剂的代谢作用、离子浓度)或用NAC预处理细胞。而且，在低温保存中，冷冻引起的应力会影响涉及热休克或膜去稳定蛋白的细胞运输过程。
药物组合物
公开了药物组合物，其包含通过本文公开的任何一种方法制备的干细胞群(例如ASCs)和药学上可接受的载体。
本文所用短语“药学上可接受的”是指那些在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物组织接触而不会产生过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的化合物、物质、组合物和/或剂型。
药学上可接受的载体的实例包括药学上可接受的物质、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封物质，涉及从一个器官，或身体的一部分携带或运输主题化合物至另一个器官，或身体的一部分。在与制剂的其他成分相容并且对患者无害的意义上，每种载体必须是“可接受的”。
药物组合物可以是无菌的，不含不需要的病毒、细菌和其他病原体，也不含热原。也就是说，对于人类给药，主题组合物应符合FDA生物制品办公室(FDA Office ofBiologics)标准要求的无菌、致热性以及一般安全性和纯度标准。
由于难以获得足够的自体干细胞，本文公开的干细胞群可能是从同种异体来源获得的。本领域已知骨髓来源的MSCs和ASCs在体外不会引起同种异体淋巴细胞的反应，并因此，这些细胞可用于任何患者，而不管MHC不相容性。因此，药物组合物中的干细胞群(例如骨髓来源的MSCs或ASCs)相对于预期移植宿主可能是同种异体的。
药物组合物可以包含干细胞群在各种溶液或物质中的悬浮液，例如用作药物或生物材料，如下文更详细描述的。药物组合物可以包含在林格氏溶液和HSA中的悬浮细胞干细胞(例如同种异体ASCs)。药物组合物可以包含于无菌缓冲盐水溶液中的干细胞(例如同种异体ASCs)悬浮液。细胞可以在不含防腐剂的一次性小瓶中提供。细胞可以以1.2亿个细胞的剂量(例如以500万个细胞/mL的浓度)给予。细胞(例如ASCs)也可以以大约100万至1000万个细胞/kg给药。
在某些实施方案中，药物组合物是干细胞(例如同种异体ASCs)在诸如聚合物、胶、凝胶等物质中的悬浮液。可以例如通过从培养基中沉淀出干细胞并将它们重新悬浮在所需的溶液或物质中来制备这种悬浮液。可以将细胞从培养基中沉淀和/或更换出，例如通过离心、过滤、超滤等。
含主题脂肪组织来源的基质干细胞的组合物中主题脂肪组织来源的基质干细胞的浓度可以为至少约500万个细胞/mL、至少约1000万个细胞/mL、至少约2000万个细胞/mL、至少约3000万个细胞/mL或至少约4000万个细胞/mL。通常，约100万个细胞/mL至1000万个细胞/mL，例如约约500万个细胞/mL至1000万个细胞/mL的浓度。在某些实施方案中，药物组合物中的细胞密度为大约500万个细胞/mL。
在某些实施方案中，药物组合物包含大约1000万至1.5亿个细胞，优选大约3000万个细胞或大约1.2亿个细胞。
在一些情况下，药物组合物可以包含NAC。在其他情况下，药物组合物可以不包含NAC。
药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散培养基。此类载体和稀释剂的使用是本领域熟知的。该溶液通常是无菌的并且具有发生易注射性程度的流动性。通常，该溶液在制造和储存条件下是稳定的，并且通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物如细菌和真菌的污染作用。可以通过将如本文所述的干细胞群(例如ASCs)悬浮于药学上可接受的载体或稀释剂以及根据需要的上文列出的其他成分中，然后过滤除菌，来制备药物组合物。
可用作药学上可接受的载体的物质和溶液的一些实例包括：(1)糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油类，如花生油、棉籽油、红花油、香油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇类，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)其他通常用于药物制剂的无毒相容物质。
在某些实施方案中，药物组合物还包括粘合剂。粘合剂可以是基于纤维蛋白的粘合剂，如纤维蛋白凝胶或纤维蛋白胶或基于纤维蛋白的聚合物或粘合剂，或其他组织粘合剂或手术胶，诸如例如氰基丙烯酸酯、胶原蛋白、凝血酶和聚乙二醇。可以使用的其他物质包括但不限于海藻酸钙、琼脂糖、I、II、IV型或其他胶原同种型、聚乳酸/聚乙醇酸、透明质酸衍生物或其他物质(Perka et al.J.Biomed.Mater.Res.(2000)49:305-311；Sechriestet al.J.Biomed.Mater.Res.(2000)49:534-541；Chu et al.J.Biomed.Mater.Res.(1995)29:1147-1154；Hendrickson et al.Orthop.Res.(1994)12:485-497)。在其他实施方案中，粘合剂是液体绷带，其中干细胞群(例如ASCs)与液体绷带物质混合。“液体绷带”是包含化合物例如聚合物材料的溶液，其用喷雾或刷子施用于伤口，然后通过蒸发去除溶剂以在伤口上提供保护膜。
药物组合物也可用于涂覆支撑物，例如医疗装置。例如，支撑物可以是缝合线或线。支持物可以本领域技术人员已知的任何方式涂覆有细胞，例如通过浸泡、喷涂、涂刷、压印等。在一个实施方案中，支持物是缝合线、钉书钉、可吸收线、不可吸收线、天然线、合成线、单丝线或复丝线(也称为编织物)。在2005年2月14日提交的第11/056,241号美国专利申请“Biomaterial for Suturing”中公开了制备用于闭合涂覆有脂肪来源的基质干细胞的伤口的缝合线和其他支撑物的优选方法，该申请通过引用整体并入本文中。本文公开的药物组合物代表可与第11/056,241号美国专利申请中公开的方法一起使用的新型组合物。
此外，在任何公开的药物组合物中，可以将至少一种治疗剂掺入组合物中(尽管不是必须的，并且可以任选地排除)。例如，药物组合物可能含有镇痛剂(例如以帮助治疗炎症或疼痛)，或抗感染剂，以防止用组合物处理部位的感染。
更具体地，可包括在本文所述的药物组合物中的有用治疗剂的非限制性实例包括以下治疗类别：镇痛剂，如非甾体抗炎药、阿片激动剂和水杨酸盐；抗感染剂，如驱虫药、抗厌氧药、抗生素、氨基糖苷类抗生素、抗真菌抗生素、头孢菌素类抗生素、大环内酯类抗生素、混杂β-内酰胺类抗生素、青霉素类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、四环素类抗生素、抗分枝杆菌类、抗结核抗分枝杆菌药、抗原生动物药、抗疟疾抗原生动物药、抗病毒剂、抗逆转录病毒剂、抗疥螨药、抗炎剂、皮质类固醇抗炎剂、止痒药/局部麻醉药、局部抗感染药、抗真菌局部抗感染药、抗病毒局部抗感染药；电解质和肾脏制剂，如酸化剂、碱化剂、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂利尿剂、袢利尿剂、渗透性利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂、电解质替代物和促尿酸排泄剂；酶，如胰酶和溶栓酶；胃肠道试剂，如止泻药、止吐药、胃肠道抗炎剂、水杨酸盐胃肠道抗炎剂、抗酸抗溃疡剂、胃酸泵抑制剂抗溃疡剂、胃粘膜抗溃疡剂、H2阻滞剂抗溃疡剂、胆石溶解剂、消化剂、催吐剂、泻药和大便软化剂，以及促动力剂；全身麻醉药，如吸入麻醉药、卤化吸入麻醉药、静脉麻醉药、巴比妥类静脉麻醉药、苯二氮卓类静脉麻醉药和阿片激动剂静脉麻醉药；激素和激素调节剂，如堕胎药、肾上腺试剂、皮质类固醇肾上腺试剂、雄激素、抗雄激素、免疫生物学试剂，如免疫球蛋白、免疫抑制剂、类毒素和疫苗；局部麻醉药，如酰胺局部麻醉药和酯局部麻醉药；肌肉骨骼试剂，如抗痛风抗炎剂、皮质类固醇抗炎剂、金化合物抗炎剂、免疫抑制抗炎剂、非甾体抗炎药(NSAIDs)、水杨酸盐抗炎剂、矿物质；以及维生素，如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K。
来自上述类别的优选的有用治疗剂类别包括：(1)一般镇痛剂，如利多卡因或其衍生物，以及非甾体抗炎药(NSAIDs)镇痛剂，包括双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬和萘普生；(2)阿片激动剂镇痛药，如可待因、芬太尼、氢吗啡酮和吗啡；(3)水杨酸盐镇痛药，如阿司匹林(ASA)(肠溶ASA)；(4)H1阻滞剂抗组胺药，如氯马斯汀和特非那定；(5)抗感染剂，如莫匹罗星；(6)抗厌氧抗感染剂，如氯霉素和克林霉素；(7)抗真菌抗生素抗感染药，如两性霉素b、克霉唑、氟康唑和酮康唑；(8)大环内酯类抗生素抗感染药，如阿奇霉素和红霉素；(9)混杂β-内酰胺类抗生素抗感染药，如氨曲南和亚胺培南；(10)青霉素类抗生素抗感染药，如萘夫西林、苯唑西林、青霉素G和青霉素V；(11)喹诺酮类抗生素抗感染药，如环丙沙星和诺氟沙星；(12)四环素类抗生素抗感染药，如强力霉素、米诺环素和四环素；(13)抗结核抗分支杆菌抗感染药如异烟肼(INH)和利福平；(14)抗原生动物抗感染药，如阿托伐醌和氨苯砜；(15)抗疟疾抗原生动物抗感染药，如氯喹和乙胺嘧啶；(16)抗逆转录病毒抗感染药，如利托那韦和齐多夫定；(17)抗病毒抗感染剂，如阿昔洛韦、更昔洛韦、干扰素α和金刚乙胺；(18)抗真菌外用抗感染药，如两性霉素B、克霉唑、咪康唑和制霉菌素；(19)抗病毒外用抗感染药，如阿昔洛韦；(20)电解质和肾脏试剂，如乳果糖；(21)袢利尿剂，如速尿灵；(22)保钾利尿剂，如氨苯蝶啶；(23)噻嗪类利尿剂，如氢氯噻嗪(HCTZ)；(24)促尿酸排泄剂，如丙磺舒；(25)酶如RNA酶和DNA酶；(26)止吐药，如丙氯拉嗪；(27)水杨酸盐胃肠道抗炎剂，如柳氮磺吡啶；(28)胃酸泵抑制剂抗溃疡剂，如奥美拉唑；(29)H2阻滞剂抗溃疡剂，如西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁和雷尼替丁；(30)消化剂，如胰脂肪酶；(31)促动力剂，如红霉素；(32)酯类局部麻醉剂，如苯佐卡因和普鲁卡因；(33)肌肉骨骼皮质类固醇抗炎剂，如倍氯米松、倍他米松、可的松、地塞米松、氢化可的松和泼尼松；(34)肌肉骨骼抗炎免疫抑制剂，如硫唑嘌呤、环磷酰胺和甲氨蝶呤；(35)肌肉骨骼非甾体抗炎药(NSAIDs)，如双氯芬酸、布洛芬、酮洛芬、酮酪酸和萘普生；(36)矿物质，如铁、钙和镁；(37)维生素B化合物，如氰钴胺(维生素B12)和烟酸(维生素B3)；(38)维生素C化合物，如抗坏血酸；以及(39)维生素D化合物，如骨化三醇。
在某些实施方案中，治疗剂可以是影响细胞分化和/或增殖的生长因子或其他分子。诱导最终分化状态的生长因子是本领域熟知的，并且可以选自已显示诱导最终分化状态的任何此类因子。在某些实施方案中，用于本文所述方法中的生长因子可以是天然存在的生长因子的功能变体或片段。例如，可以通过进行保守的氨基酸改变并使用本领域已知的测定来测试所得的变体以测试生长因子功能来产生变体。
使用和应用
NAC的使用
公开了使用NAC来低温保存干细胞，例如，在本文公开的任何一种方法中。
医疗应用
干细胞正被用于治疗越来越多的疾病和病症。因此，根据本文公开的任何一种方法制成的干细胞群、本文公开的药物组合物或本文公开的低温保存组合物可以用于治疗。术语“治疗”旨在涵盖对患者的疾病、病症或症状的治疗和/或预防。术语“对象”、“受体”和“患者”在本文中可互换使用，并且除非明确说明，否则是指需要治疗的任何人类或非人类动物(例如哺乳动物)。在优选的实施方案中，患者是人。当患者是人时，干细胞群通常是人的。
公开了如本文所述的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物，其用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中。该方法中使用的细胞群可通过本文公开的任何一种用于干细胞低温保存的方法制备。
还公开了如本文所述的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物的用途，其用于制备用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的药物。
还公开了治疗瘘管和/或治疗和/或预防炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括向有需要的对象给予本文公开的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物。
本文所述的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物，特别是当干细胞群是ASCs时，可用于治疗瘘管。术语“瘘管”是指任何异常的通道或连通或连接，通常在两个内部器官之间或从内部器官通向身体表面，例如通常不连通的器官或血管之间的连接或通道。例如，瘘管的类型，以它们发生的身体区域命名，包括肛门直肠瘘或肛瘘或粪便瘘(在直肠或其他肛门直肠区域与皮肤表面之间)、动静脉瘘或AV瘘(动脉和静脉之间)、胆瘘(在胆管到皮肤表面之间，通常由胆囊手术引起)、宫颈瘘(子宫颈异常开口)、颅窦瘘(在颅内间隙和鼻旁窦之间)、肠肠瘘(在肠的两个部分之间)、肠皮瘘(在肠与皮肤表面之间，即来自十二指肠或空肠或回肠)、肠阴道瘘(在肠与阴道之间)、胃瘘(在胃与皮肤表面之间)、子宫腹膜瘘(在子宫和腹腔之间)、外淋巴瘘(中耳和内耳之间的膜之间的撕裂)、肺动静脉瘘(在肺动脉和静脉之间，导致血液分流)、直肠阴道瘘(在直肠和阴道之间)、脐瘘(在脐和肠道之间)、气管食管瘘(在呼吸管和进食管之间)和膀胱阴道瘘(在膀胱和阴道之间)。瘘管的原因包括外伤、来自医疗处理和疾病的并发症。炎性肠病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎，是肛门直肠、肠肠和肠皮肤瘘的主要原因。在某些实施方案中，瘘管是肛周瘘管，例如克罗恩病患者的难治性复杂肛周瘘管。对于病灶内注射，可以以约1.2亿个细胞(例如约500万个细胞/mL)的剂量给予干细胞群(例如同种异体ASCs)。
公开了如本文公开的干细胞群用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中的用途，其中所述方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(d)任选地培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(e)向患者施用干细胞群。
还公开了本文公开的干细胞群用于制备用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的药物中的用途，其中所述方法包括以下步骤：(a)用NAC干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(d)任选地培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(e)向患者施用干细胞群。
还公开了治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；(b)冷冻经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(c)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(d)任选地培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(e)向患者施用干细胞群。
在某些实施方案中，治疗和/或预防的方法还包括在向患者施用干细胞群之前的如本文公开的方法中定义的步骤中的任一个(例如“预处理”)。
公开了如本文所述的干细胞群在治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中的用途，其中所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(d)向患者施用干细胞群。
还公开了如本文所述的干细胞群用于制备用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的药物中的用途，其中所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(d)向患者施用干细胞群。
还公开了治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：(a)冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；(b)解冻冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；(c)在NAC存在下培养解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和(d)向患者施用干细胞群。
在某些实施方案中，治疗和/或预防的方法还包括在向患者施用干细胞群之前的如本文公开的方法中定义的步骤中的任一个(例如“解冻后处理”)。
可以以大约100万至1.5亿个干细胞(例如同种异体ASCs)的剂量给予干细胞群、药物组合物或低温保存组合物。在优选的实施方案中，可以以大约3000万或大约1.2亿个细胞的剂量给予干细胞(例如同种异体ASCs)。
可以通过将细胞注射或植入对象中的靶位点来进行向对象，特别是人类对象施用本文公开的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物。例如，可以使用便于通过注射或植入引入对象中的递送装置。这种递送装置包括用于注射到受体对象体内的管子，例如导管。在优选实施方案中，管子另外具有针，例如注射器，通过该针可以将干细胞群、药物组合物或低温保存组合物在期望的位置处引入对象中。
在优选的实施方案中，干细胞群-包括药物组合物和/或低温保存组合物中的那些-是ASCs。
干细胞可以是同种异体的或自体的。
可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序确定对象化合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50和ED50。显示大治疗指数的组合物是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但应注意设计将试剂靶向所需部位的递送系统以减少副作用。
从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。任何治疗剂或可选地其中任何组分的剂量通常在包括ED50在内的循环浓度范围内，其毒性很小或没有毒性。剂量可在此范围内变化，这取决于所采用的剂型和所利用的给药途径。对于本发明的试剂，可以从细胞培养测定初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，该范围包括在细胞培养中确定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)。此类信息可用于更准确地确定人类中的有用剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱。
试剂盒
公开了低温保存试剂盒，其包含：冷冻小瓶、含有NAC的容器和包含干细胞群的容器。试剂盒可包含使用说明书。公开了低温保存试剂盒，其包含：多个冷冻小瓶、包含NAC的容器和包含干细胞群的容器。干细胞群可在试剂盒中提供为如本文公开的组合物或药物组合物。
一般定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
冠词“a”和“an”指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。通过实例的方式，“一个元素(an element)”意指一个元素或一个以上的元素。
术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”以包括性、开放性含义使用，意指可以包括另外的元素。
一般来说，“包括(comprising)”许多步骤的方法不要求步骤以特定顺序执行。如果方法包括多个按顺序编号或按字母顺序排列的步骤(例如(1)、(2)、(3)或(a)、(b)、(c)等)，这意味着步骤必须以规定的顺序执行，除非另有说明。然而，这种语言并不排除在每个规定的步骤之间执行另外的步骤的可能性。
术语“包括”在本文中用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
实施例
现在对本发明进行一般性描述，其通过参考以下实施例将更容易理解，包括这些实施例仅用于说明本发明的某些方面和实施方案的目的，并不旨在限制本发明。
实施例1–ASC分离和培养
在知情同意的情况下获得人类样本(经西班牙伦理委员会批准的参考组织获取地点；Clínica de la Luz医院，西班牙马德里)。如先前所公开的那样(-Corvo etal.,Frontiers in Immunology(2017),8,462；Menta et al.,Frontiers in Immunology(2014),8,462)获得ASC。简而言之，将来自健康供体的人脂肪组织抽吸物用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并用0.075％胶原酶(I型，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)消化。将消化的样品用10％胎牛血清(FBS)洗涤，用160mM NH4Cl处理以去除剩余的红细胞，并悬浮在培养基(杜氏改良的Eagle培养基(DMEM)，具有10％FBS)中。将细胞接种在组织培养烧瓶中，并扩增(37℃，5％CO2)，每3–4天更换一次培养基。当其达到90％汇合时，将细胞转移到新的烧瓶中。将细胞扩增至复制12–14次，并在具有10％DMSO的FBS中冷冻(当在整个本文所述的所有实例中冷冻ASCs时，将具有10％DMSO的FBS用作冷冻培养基)。用来自三名男性和三名女性成年供体的细胞库进行实验，以12–14次群体倍增。确认扩增的ACSs(eASCs)符合根据国际细胞治疗学会的标准的定义(Dominici et al.,Cytotherapy(2006)8(4):315–317)，对来自Becton Dickinson(Franklin Lakes,NJ,USA)的CD73(AD2)和CD90(5E10)以及来自Biolegend(San Diego,CA,USA)的CD105(43A3)呈阳性，并且对来自Immunotech(Monrovia,CA,USA)的CD14(RM052)、CD19(4G7)、HLA-DR(L243)，以及来自Becton Dickinson的CD34(8G12)和来自Beckman Coulter(Brea,CA,USA)的CD45(J33)呈阴性。
实施例2–评估对解冻后ASC细胞数的各种预处理步骤ASC预处理
通过在37℃水浴中加温小瓶并用新鲜的完全DMEM(DMEM/F-12培养基-GlutaMAXTM-I,Gibco，补充有100μg/mL青霉素/链霉素和10％FBS)稀释含有DMSO的冷冻培养基来解冻来自供体A的ASCs。将细胞于室温下在450g下离心6分钟以消除残留的DMSO，并在完全DMEM中以20.000个细胞/cm2接种在T-175烧瓶中。解冻后24小时，将细胞用合适浓度的下表中所示的化合物处理24小时：
在Milli-Q水(Millipore)中制备600mM NAC(SIGMA)储备液。该储备液用于通过每孔直接添加50μL储备液到5mL培养基中，使终浓度为6mM，来进行预处理和后处理。对于2mM，每孔仅添加16.7μL，并且在12mM的情况下，添加100μL储备液。DMSO用作sc79和LY294的媒介物。
在预处理步骤之后，去除培养基，将细胞用PBS洗涤并使用胰蛋白酶-EDTA 0.25％(ThermoFisher)在37℃下胰蛋白酶消化8分钟。在用完全DMEM使胰蛋白酶灭活后，收获细胞并离心，然后再悬浮在冷冻培养基(具有10％DMSO的FBS)中，并冷冻成每瓶500,000或100万个细胞，并储存在液氮中用于进一步使用。具体而言，将细胞在Cool装置(BioCision)中于-80℃下冷冻24小时，然后转移到液氮储存容器中。所有实验均在培养箱中和37℃、5％CO2下进行。
评估对解冻后细胞数和生长进行的各种预处理步骤
将ASC接种于96孔平底板(每孔1000或2000个ASC)中，培养24小时，然后根据制造商的说明使用MTS测定(CellTiterAqueous One Solution细胞增殖测定；Promega)评估活细胞数。CellTiterAqueous One Solution细胞增殖测定是一种用于确定活细胞数量的比色法。CellTiterAqueous One Solution试剂含有四唑化合物[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑，MTS]和电子偶联试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES)。MTS四唑化合物被细胞生物还原(可能是通过由代谢活性细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH)为可溶于组织培养基中的有色甲臜产物。
简而言之，将40μL试剂加入每孔中的200μL完全DMEM中，并在2-3小时后使用Navision系统(Microsoft)于490nm处测量吸光度。每种条件以6次技术重复进行测量。MTS测定结果以490nm处吸光度相对于未经处理的(NT)细胞的百分比表示。
如通过MTS测定(图2)和细胞密度(图3)评估的，与未经处理的(NT)相比，NAC预处理导致接种后24小时细胞数量的增加。
除了NAC，还评估了艾塞那肽(Exendin-4)、IL6、sc79和LY294预处理。Sc79是PI3K通路的激活剂、增殖和促存活信号(Jo et al.Proceedings of the National Academy ofSciences(2012),109(26):10581–10586,Chen et al.Oncotarget(2017)8(19):31065-31078)，LY294是Zonca et al.,(2012)Tissue Engineering:Part A 18(7-8):852-859和Gharibi et al.,(2014)Stem Cells 32:2256-2266中使用的该相同通路的抑制剂分子。DMSO用作sc79和LY294的媒介物。用除NAC以外的化合物进行预处理对细胞数量没有显示出可重现的影响。
实施例3–进一步评估对解冻后ASC细胞数进行的NAC预处理步骤ASC增殖测定
通过在37℃温浴中加热小瓶并用新鲜的完全DMEM快速稀释含有DMSO(具有10％DMSO的FBS)的冷冻培养基，来对根据实施例2中描述的方法的来自供体A或供体B最终药物物质(FDS)的用NAC预处理的ASCs进行解冻。将细胞在室温下以450g离心6分钟以去除残留的DMSO，并以每孔3000个细胞在每孔5mL完全DMEM中以一式三份接种于P6孔板(Falcon#353046)中。将细胞用1x PBS洗涤，并使用胰蛋白酶-EDTA0.25％(ThermoFisher)于37℃下胰蛋白酶化8分钟。在使用完全DMEM使胰蛋白酶失活后，收获细胞，离心并重悬于新鲜的DMEM中；一式三份的孔被统一为单个样品以用于计数目的。在接种后24小时、96小时和7天，使用Invitrogen Countess自动细胞计数器(Invitrogen)并添加台盼蓝作为活力染色剂以一式三份对细胞进行计数(图4A)。使用每表面单位(cm2)的活ASC(台盼蓝阴性)计数来进行细胞密度计算。
用NAC预处理增加了在24小时和4天时计数的细胞数(12,500个细胞，相比在未经处理的对照中，在解冻后4天时的9,200个细胞/cm2，如图4A中所示)。这些发现得到了并行进行的MTS数据的支持，显示NAC预处理后15％-20％的线粒体活性增加(图4B&C)。ASC生长在第7天之前已达到汇合，因此与第4天相比，此时间点处没有显著生长。
为了再次确认上面讨论的数据，在NAC预处理后用两个不同的ASC供体(供体A(DONA)和供体B(DON B))进行了生长测定。在解冻NAC预经处理或非经处理的细胞后，在解冻经NAC预处理的或未经处理的细胞后第1、4和7天对每个供体的细胞数量进行分析(图5A&B)。来自两个供体的细胞从接种后24小时显示出细胞数量的增加，并且这种增加在培养中维持了一周(图5)。该数据证实了NAC预处理增加了冷冻-解冻恢复后的细胞数量。
实施例4-解冻后用不同浓度的NAC进行解冻后处理对细胞生长的影响
还研究了用不同浓度NAC进行解冻后处理(解冻后NAC处理)对细胞生长的影响。按上文讨论的对ASCs进行冷冻(没有NAC预处理)、解冻，然后在接种前在完全DMEM中用三种不同的NAC浓度(2、6和12mM)处理，并分析第4、11和14天的细胞数。用2mM NAC进行解冻后处理导致细胞数量增加，其在培养中持续长达2周(图6)。用6mM和12mM NAC进行解冻后处理后观察到的细胞密度较低的一种可能解释是，这些NAC浓度可能会影响解冻后(“漂浮”)ASCs对培养板的粘附。
实施例5–NAC预处理不影响解冻和培养后ASCs的特性
四种表面标志物(CD29、CD73、CD90和CD105，符合国际细胞治疗学会的标准(Dominici et al.,Cytotherapy(2006)8(4):315–317)的表达被用于在根据实施例2中描述的方法用浓度为6mM的NAC预处理后确认解冻和扩增的ASCs的特性。
在培养(解冻后)两周后，按照标准方案分析细胞的特性。将收获的细胞用下表中所示的合适浓度的抗体染色(按照制造商的说明稀释)，并使用FACSCalibur细胞计数仪(BD)进行评估。
使用FCS Express软件分析数据。图7显示了细胞表达CD29、CD73、CD90和CD105，并证实在冷冻前用NAC预处理细胞不会改变解冻和培养后ASC特性标志物的表达。
实施例6–NAC预处理不显著影响解冻的ASCs抑制受刺激的淋巴细胞增殖的能力
在显示用NAC预处理ASCs导致体外生长优势后，进行了实验以观察NAC预处理是否影响ACS功能特性。首先，测量了解冻和扩增的ASCs(根据实施例2中的方法用NAC2预处理的)抑制受刺激的淋巴细胞增殖的能力。
如先前发表的免疫抑制测定(-Corvo et al.,Frontiers inImmunology(2017),8,462；Menta et al.,Frontiers in Immunology(2014),8,462)，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)通过密度离心梯度从由马德里自治区的国家输血中心(National Transfusion Centre of the ComunidadAutonoma of Madrid)提供的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMCs)，并从C57/BL6雄性小鼠中获得脾细胞。对于羧基荧光素二乙酸N-琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记，大量洗涤PBMCs或脾细胞以去除FBS，重新悬浮在10μM CFSE(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA)溶液中(每200μl溶液107个PBMC或脾细胞)，并在37℃下持续振荡孵育10min。通过加入冰冷的培养基(RPMI+10％FBS)终止反应，并将细胞用冰冷的PBS洗涤3次。然后将细胞培养过夜，并使用一份等分试样来设置和控制CFSE的FL-1电压。静止过夜后，按照制造商的说明，用泛T细胞激活试剂盒(涂有抗CD3、抗CD2和抗CD28的微珠；Miltenyi Biotec,Auburn,CA,USA)激活CFSE标记的PBMCs。将CFSE标记的脾细胞用抗CD3(Becton Dickinson)和IL-2(Novartis,Basel,Switzerland)激活。在总体积2mL RPMI+10％FBS中，将PBMCs或脾细胞(100万个细胞/孔)于24孔板中单独培养或与eASCs(4×104个细胞/孔；1:25比例的eASC:PBMC或eASC:脾细胞)一起培养。1:75的ASC:PBMC比例允许评估次优条件下样品之间的差异。在PBMCs 5天和脾细胞3天后，收获细胞，用7-AAD和抗CD3抗体标记，并通过流式细胞术根据CFSE信号的损失测定CD3+/7-AAD-群(活的CD3 T淋巴细胞)的细胞增殖。使用FCSExpress 4(De Novo Software,Glendale,CA,USA)和BD CellQuestTM Pro分析(Becton Dickinson)软件分析数据。将CaliBRITE珠子(BD Bioscience,Erembodegem-Aalst,Belgium)用于校准细胞计数仪中的采集事件。
冷冻前用NAC预处理的ASCs的抑制能力与未经处理的细胞相似(图8)(在一个或两个实验中也观察到NAC预处理提高ASC抑制能力的轻微趋势)。
实施例7–NAC预处理对ASC对巨噬细胞和mDC分化和功能的影响的评估
进行的用于评估NAC对ASC的免疫调节能力影响的第二个功能性体外测定是单核细胞分化的调节。图9显示了实验的时间和设置。
血液样品
从马德里自治区的输血中心获得血沉棕黄层。在室温下用PBS稀释约50-60mL的血液，并在15mL室温Ficoll Hypaque Plus顶部于50mL试管之间分配。然后将管在10℃下以2000rpm离心40分钟，无制动或加速。收集PBMCs的白色环，在50mL冷PBS中洗涤，并在10℃下以1800rpm离心15分钟，无制动或加速。在用50mL的冷RPMI完全培养基(RPMIc:RPMI，具有10％FBS、2mM L-Glu和100μg/ml青霉素/链霉素)进行第二次洗涤后，将管在10℃下以1500rpm离心15分钟，带有制动或加速。最后一次洗涤在50mL冷RPMIc中进行，并在10℃下以1200rpm离心15分钟，带有制动或加速。将PBMCs重悬于RPMIc中并计数。在冰冷下将细胞以1亿个细胞/mL重悬，并加入相同体积的补充有10％DMSO的冷RPMIc，即最终浓度为5％DMSO。将PBMCs在液氮中冷冻在5000万个PBMCs的小瓶中。
CD14+单核细胞的分离
将冷冻的PBMCs小瓶解冻，并按照制造商的说明，使用Dynabeads Untouched人单核细胞试剂盒(Dynal#11350D)计数和分离CD14+CD16-单核细胞。
人单核细胞的培养和分化
将分离的CD14+CD16-单核细胞(见上文)在常氧条件下以每6孔150万个细胞(Falcon#353046)接种在5mL RPMIc中。添加了以下因子以在单一培养中分化为非极化M0巨噬细胞或进一步极化为M1、M2巨噬细胞和成熟树突细胞(mDC)群体(基于一些出版物，包括Beyer et al.,PLoS One(2012)7(9):e45466；Erbel et al.,J.Vis.Exp.(2013)76:e50332；Zhou et al,2014；Tarique et al,American Journal of Respiratory Cell andMolecular Biology 2015；53(5):676-688。
未成熟DC(iDC):RPMIc+5ng/mL GM-SCF+10ng/mL IL-4，5天
DC成熟(mDC):在第5天，添加40ng/mL LPS(即，向预先存在的培养基添加补充有400ng/mL LPS的500μL/孔的RPMIc)。
人重组GM-CSF(#100-22B)和IL-4(#200-04)来自Peprotech。LPS(#L8274)来自SIGMA。GM-CSF和IL4的添加介导分化为未成熟的树突细胞(iDC)；添加LPS后5天诱导iDCs成熟为mDCs，并且2天后在ASC的存在或缺失下分析这些成熟DC的表型和功能。
与ASCs的共培养实验
将新鲜分离的人CD14+CD16-单核细胞与来自供体A或供体B的ASCs在聚碳酸酯6孔transwells(Corning#3412小室和Falcon#353046板)中共培养。
将NAC预处理的ASCs(根据实施例2中的方法)或未处理的ASCs解冻，并在共培养设置之前16小时或24小时将150,000个ASCs于1mL的RPMIc培养基中接种于transwell小室上，并将150万个单核细胞于4mL的RPMIc培养基中接种在孔的底部处。使用与单独分化单核细胞相同的因素进行分化(参见上文，即加入GM-CSF和IL4以诱导分化为iDC；5天后加入LPS以诱导iDCs成熟为mDCs，以及2天后，在ASC存在或缺失下分析这些成熟DC的表型和功能)。在分化过程的整个持续时间内，ASCs都保存在transwell小室中。
在mDC与NAC预处理的或未经处理的ASCs共同培养后在板上未形成活化簇，表明ASCs调节了mDCs的活化，并且这种作用没有被NAC预处理破坏(参见显微镜图像2x放大(图10)和20x放大(图11))。
实施例8–NAC预处理未显著改变ASCs调节mDC的金黄色葡萄球菌颗粒吞噬作用的能力
分析了NAC预处理(根据实施例2中的方法)对解冻的ACS调节mDCs的金黄色葡萄球菌颗粒吞噬作用能力的能力的影响。
在体外单培养或共培养分化后(分化条件，包括所用细胞因子、分化浓度和分化次数，提供在实施例7)中，将巨噬细胞和mDC在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA收获10分钟。使用pHRodo Red偶联的金黄色葡萄球菌颗粒(Life Technologies#A10010)按照制造商的说明评估极化的巨噬细胞或mDC的吞噬潜力。简言之，将50,000个mDC转移到96孔U底孔(Corning#3799)中，并将细胞在RPMIc中静置60分钟。使用前，将冻干的pHRodo偶联的颗粒在每瓶1mL的RPMIc中重构，并以20％的振幅对颗粒进行超声处理5分钟。然后，每孔加入50μL pHRodo Zymosan，并将细胞在37℃、常氧下孵育60分钟。然后，在冰上终止吞噬作用，并在Fortessa细胞仪(BD)中进行FACS分析之前，将细胞洗涤并用5μL 7-氨基放线菌素D(7AAD)染色。吞噬作用的阴性对照是不含pHRodo试剂的细胞。结果在FlowJo软件中进行分析。PE通道中的荧光强度与每个细胞吞噬的细菌颗粒量成比例。
图12显示了在非接触条件下ASC的存在(即在transwell板中共同培养mDC和ASC细胞)导致出现在荧光通道中更强烈的新细胞群，即已经吞噬了荧光颗粒的细胞。用NAC对ASC进行NAC预处理并没有改变它们增加mDCs吞噬潜能的能力。
实施例9–NAC预处理对ASC介导的对成熟树突细胞上的表面表达作用的影响。
mDC吞噬细菌的能力与吞噬标志物，如CD209(DC-SIGN)、CD206(甘露糖受体)或CD163(清道夫受体)的表达有关。这些膜受体识别真菌、细菌和寄生虫表面的特定模式，并介导单核细胞、巨噬细胞和DC对它们的吞噬作用。CD163受体还干预组织损伤后从凋亡细胞中清除细胞碎屑，促进伤口愈合过程。
通过流式细胞术测量NAC预处理(根据实施例2)对解冻的ASC介导的对成熟树突细胞吞噬受体CD206(甘露糖受体)和CD163(清道夫受体)的表面表达作用的影响。
表型表征
在体外单培养或共培养分化后(分化条件，包括所用细胞因子、分化浓度和分化次数，提供在实施例7中)，在收集上清液并冷冻以用于将来的细胞因子和/或HPLC分析之后，将巨噬细胞和mDC在37℃下用0.05％胰蛋白酶-EDTA收获10分钟。在mDC计数后，将它们分配到96孔V底板中以用于染色(Nunc#249570)。将细胞于冰上在具有1％人血清的Blue MACS缓冲液中孵育15分钟，以阻断Fcγ受体介导的非特异性抗体结合。随后，将细胞在冰上用以下抗体混合物染色20分钟(在50μL 1:10抗体稀释液中染色；除CD64外，其为1:20稀释)：
key 染色(所有孔都具有7AAD)
1 CD14-APC/HLAII-FITC 1:50/CD86-PE
2 CD14-APC/CD206-PE/CD209-FITC
3 CD14-APC/CD163-PE
4 CD14-APC/CD80-FITC/CD64-PE 1:20
5 CD14-APC/CD1a-PE
所用抗体的细节在下表中列出：
名称 荧光染料 宿主 克隆 分类号 公司
CD1a PE 小鼠 HI149 555807 BD
CD14 APC 小鼠 M5E1 555399 BD
CD64 PE 小鼠 10.1 CD6404 Miltenyi Biotech
CD68 PeCy7 小鼠 27-35 560542 BD
CD80 PE 小鼠 L307.4 557227 BD
CD86 PE 小鼠 IT2.2 555665 BD
CD206 PE 小鼠 19.2 555954 BD
CD209 FITC 小鼠 DCN46 551264 BD
HLA-II PE 小鼠 WR18 MA1-80680 Ebiosciences
通过向每孔加入5μL 7AAD并在冰上染色10分钟来评估细胞活力，并在BDFortessa细胞计数仪中采集样本。结果在FSC Express软件中进行分析。
mDC吞噬细菌的能力与吞噬标志物，如CD209(DC-SIGN)、CD206(甘露糖受体)或CD163(清道夫受体)的表达有关。这些膜受体识别真菌、细菌和寄生虫表面上的特定模式，并介导单核细胞、巨噬细胞和DC对它们的吞噬。CD163受体另外还干预组织损伤后从凋亡细胞中清除细胞碎屑，促进伤口愈合过程。通过流式细胞术测量NAC预处理(根据实施例2)对解冻的ASC介导的对成熟树突细胞吞噬受体CD206(甘露糖受体)和CD163(清道夫受体)的表面表达作用的影响。
ASC上调单核细胞、巨噬细胞和mDC表面上CD206和CD163标志物的表达，并且即使当用NAC预先处理ASC时，这种上调也是完整的(图13和14)。
也通过流式细胞术测量了NAC预处理(根据实施例2)对解冻的ASC介导的对成熟树突细胞上CD14和CD1a表面表达作用的影响。mDC是CD14-CD1a+。CD1a是抗原呈递分子，并介导通过mDC将抗原呈递给免疫系统的其他细胞以激活它们的反应。ASC调节这些mDC的表型，将它们转化为CD14+CD1a-细胞。该群体已被认为具有抗炎和调节特性(Chang et al.,Journal of Immunology,165(7),3584–3591)。
图15显示了NAC预处理ASC不会改变解冻的ASCs诱导该mDC调节群体形成的能力。
编号的实施方案
本发明还提供了以下编号的实施方案：
1.用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；和
b.冷冻所述经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用NAC处理所述干细胞群以获得经处理的干细胞群；
b.冷冻所述经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和
c.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。
3.如实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a.用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；
b.洗涤所述经处理的干细胞群以去除NAC并获得经洗涤的干细胞群，以及冷冻所述经洗涤的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和
c.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。
4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括在冷冻所述干细胞群之前将所述干细胞群用NAC孵育至少约1、2、4、6、8、10、12、16、24或48小时。
5.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括向所述干细胞群添加NAC至大约0.5-10mM的初始浓度。
6.如实施方案5所述的方法，其中所述处理步骤包括一次或多次进一步添加NAC以维持预定水平的NAC浓度。
7.如实施方案2-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
d.培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。
8.如实施方案2-6中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
d.在NAC存在下培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。
9.如实施方案8所述的方法，其中所述培养步骤包括添加NAC至大约0.5-5mM的初始浓度。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述培养步骤包括一次或多次进一步添加NAC以维持预定水平的NAC浓度。
11.如实施方案8-10中任一项所述的方法，其中所述方法还包括洗涤扩增的干细胞群以去除NAC以及获得经洗涤的并扩增的干细胞群的步骤。
12.如实施方案2-11中任一项所述的方法，其中所述方法还包括洗涤解冻的干细胞群或扩增的干细胞群并将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
13.如实施方案7-12中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
e.冷冻所述扩增的干细胞群或所述经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群或冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群。
14.如实施方案7-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
e.冷冻所述扩增的干细胞群或所述经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群或冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群；和
f.解冻所述冷冻的扩增的干细胞群或所述冷冻的、经洗涤的并扩增的干细胞群以获得解冻的扩增的干细胞群。
15.如实施方案14所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
g.洗涤所述解冻的扩增的干细胞群并将细胞重悬于药学上可接受的载体中。
16.用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：
a.冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；
b.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；和
c.在NAC存在下培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。
17.如实施方案16所述的方法，其中所述培养步骤包括添加NAC至大约0.5-5mM的初始浓度。
18.如实施方案17所述的方法，其中所述培养步骤包括一次或多次进一步添加NAC以维持预定水平的NAC浓度。
19.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻步骤包括以约-0.5至约-10℃/分钟的速度将温度降至-70℃至-130°。
20.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述冷冻步骤包括在10-60min内将温度从+4℃降到-100至-180℃。
21.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干细胞群在37℃下解冻。
22.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中冷冻的干细胞群的细胞密度范围为大约100万至大约5000万个细胞/mL，优选地大约2500万个细胞/mL。
23.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干细胞群基本上是纯的。
24.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSCs)。
25.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干细胞是脂肪来源的基质干细胞(ASCs)。
26.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述干细胞是人类细胞。
27.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
28.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法包括在多个冷冻小瓶中冷冻所述干细胞群。
29.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法包括对多个干细胞群重复前述实施方案中任一项的步骤。
30.如实施方案29所述的方法，其中所述方法包括在多个冷冻小瓶中冷冻所述多个干细胞群。
31.如实施方案28或实施方案30所述的方法，其中所述方法包括在液氮存储容器中将所述多个低温保存小瓶存储至少一个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月，或至少1年。
32.液氮存储容器，其含有根据实施方案28或实施方案30所述的方法获得的多个低温保存小瓶。
33.通过实施方案1-31中任一项所述的方法获得的干细胞群。
34.实施方案1-31中任一项所述的方法或实施方案33所述的干细胞群，其中相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天或约4天后活细胞的数量增加。
35.实施方案1-31和34中任一项所述的方法或实施方案33或34所述的干细胞群，其中相比对照干细胞群，解冻后活细胞的数量增加至少约1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约2倍或至少约5倍。
36.实施方案1-31、34或35中任一项所述的方法或实施方案33-35所述的干细胞群，其中相比对照干细胞群，所述干细胞群解冻后的生长速率增加至少约至少约1.03倍、1.05倍、至少约1.1倍、至少约1.15倍、至少约1.2倍、至少约1.25倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍或至少约2倍。
37.实施方案1-31、34-36中任一项所述的方法或实施方案33-36所述的干细胞群，其中相比对照干细胞群，解冻并任选地培养约1天或约4天后线粒体活性增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约35％、至少约40％或至少约50％。
38.实施方案1-31、34-37中任一项所述的方法或实施方案33-37所述的干细胞群，其中相比对照干细胞群，解冻后ASCs恢复所花的时间减少。
39.实施方案1-31、34-38中任一项所述的方法或实施方案33-38所述的干细胞群，其中相对于对照干细胞群，解冻后细胞恢复所花的小时数减少至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.4倍、至少约1.6倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或至少约5倍。
40.低温保存组合物，其包含实施方案33-38中任一项所述的干细胞群和低温保存培养基。
41.如实施方案40所述的低温保存组合物，其中所述组合物被冷冻。
42.如实施方案40或实施方案41所述的低温保存组合物，其中所述组合物含有NAC。
43.药物组合物，其包含实施方案33-38中任一项所述的干细胞群和药学上可接受的载体。
44.如实施方案43所述的药物组合物，其中所述组合物包含大约100万个细胞至大约1.5亿个细胞，优选地大约3000万个细胞或大约1.2亿个细胞。
45.如实施方案43或实施方案44所述的药物组合物，其中所述细胞密度为大约100万-2000万个细胞/mL。
46.NAC用于干细胞的低温保存的用途。
47.根据实施方案46所述的NAC在实施方案1-31和34-39中的任一项的方法中的用途。
48.实施方案33-39中任一项所述的干细胞群、实施方案43-45中任一项所述的药物组合物或实施方案40-42所述的低温保存组合物用于治疗的用途。
49.实施方案33-39中任一项所述的干细胞群、实施方案43-45中任一项所述的药物组合物或实施方案40-42所述的低温保存组合物用于在有需要的患者中治疗瘘管和/或治疗和/或预防炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中的用途。
50.治疗瘘管和/或治疗和/或预防炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括向有需要的对象施用实施方案33-39中任一项所述的干细胞群、实施方案43-45中任一项所述的药物组合物或实施方案40-42所述的低温保存组合物。
51.干细胞群，其用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中的用途，其中所述方法包括以下步骤：
a.用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；
b.冷冻所述经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；
c.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；
d.任选地培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；以及
e.向患者施用所述干细胞群。
52.治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用NAC处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；
b.冷冻所述经处理的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；
c.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；
d.任选地培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；以
e.向患者施用所述干细胞群。
53.根据实施方案51所述用途的干细胞群或实施方案52所述的治疗方法，其中所述方法在向患者施用所述干细胞群之前还包括如实施方案3-14、18-31或34-39中定义的任一步骤。
54.干细胞群，其用于治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法中的用途，其中所述方法包括以下步骤：
a.冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；
b.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；
c.在NAC存在下培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和
d.向患者施用所述干细胞群。
55.治疗瘘管和/或治疗和/或预防有需要的患者的炎性病症、自身免疫性疾病或免疫介导的疾病，如败血症、类风湿性关节炎、过敏症(例如IV型超敏反应)、肠易激病、克罗恩病、溃疡性结肠炎或器官排斥的方法，所述方法包括以下步骤：
a.冷冻干细胞群以获得冷冻的干细胞群；
b.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群；
c.在NAC存在下培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群；和
d.向患者施用所述干细胞群。
56.根据实施方案54所述用途的干细胞群或实施方案55所述的治疗方法，其中所述方法在向患者施用所述干细胞群之前还包括如实施方案15-31或34-39中任一项定义的任一步骤。
57.根据实施方案48、49、51、53、54或56中任一项所述用途的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物，或实施方案50、52、53、55或56中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用大约100万至1.5亿个细胞，优选地大约3000万个干细胞或大约1.2亿个干细胞。
58.根据实施方案48、49、51、53、54、56或57中任一项所述用途的干细胞群、药物组合物或低温保存组合物，或实施方案50、52、53、55-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用大约100万至大约1000万个细胞/kg。
59.根据实施方案48、49、51、53、54、56-58任一项所述用途的干细胞群或药物组合物或低温保存组合物，或实施方案50、52、53、55-58中任一项所述的方法，其中所述方法包括注射实施方案43-45中任一项所述的干细胞群或药物组合物或实施方案40-42中任一项所述的低温保存组合物。
60.根据实施方案48、49、51、53、54、56-59中任一项所述用途的干细胞群或药物组合物或低温保存组合物，或实施方案50、52、53、55-59中任一项所述的方法，其中所述干细胞如实施方案23-26中任一项中所定义的。
61.根据实施方案48、49、51、53、54、56-60中任一项所述用途的干细胞群或药物组合物或低温保存组合物，或实施方案50、52、53、55-60中任一项所述的方法，其中所述干细胞是同种异体的或自体的。
62.低温保存试剂盒，其包含：冷冻小瓶、含有NAC的容器和包含干细胞群的容器。

Claims (9)

1.用于干细胞低温保存的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用6mM N-乙酰半胱氨酸处理干细胞群以获得经处理的干细胞群；
b.洗涤所述经处理的干细胞群以去除所述N-乙酰半胱氨酸和获得经洗涤的干细胞群，以及冷冻所述经洗涤的干细胞群以获得冷冻的干细胞群；和
c.解冻所述冷冻的干细胞群以获得解冻的干细胞群。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤a.包括：
在冷冻所述干细胞群之前，将所述干细胞群用N-乙酰半胱氨酸孵育至少1小时；和
向所述干细胞群添加N-乙酰半胱氨酸至6mM的初始浓度，任选地其中所述步骤a.包括一次或多次另外添加N-乙酰半胱氨酸以维持预定水平的N-乙酰半胱氨酸浓度。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
d.培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
d.在N-乙酰半胱氨酸存在下培养所述解冻的干细胞群以获得扩增的干细胞群，任选地其中：
所述步骤d.包括添加N-乙酰半胱氨酸至0.5-5mM的初始浓度，还任选地其中所述步骤d.包括一次或多次另外添加N-乙酰半胱氨酸以维持预定水平的N-乙酰半胱氨酸浓度；和/或
所述方法还包括洗涤所述扩增的干细胞群的步骤以去除所述N-乙酰半胱氨酸和获得经洗涤的并扩增的干细胞群。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括洗涤所述解冻的干细胞群以及将所述细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述方法还包括洗涤所述扩增的干细胞群以及将所述细胞重悬于药学上可接受的载体中的步骤。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：
e.冷冻所述扩增的干细胞群或所述经洗涤的并扩增的干细胞群以获得冷冻的扩增的干细胞群或冷冻的经洗涤的并扩增的干细胞群；和任选地
f.解冻所述冷冻的扩增的干细胞群或所述冷冻的经洗涤的并扩增的干细胞群以获得解冻的扩增的干细胞群；以及任选地
g.洗涤所述解冻的扩增的干细胞群并将所述细胞重悬于药学上可接受的载体中。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞，和/或其中所述干细胞是脂肪来源的基质干细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中：
相比对照干细胞群，解冻并任选地培养1天和/或4天后活细胞的数量增加；
相比对照干细胞群，解冻后活细胞的数量增加至少1.05倍；
相比对照干细胞群，所述干细胞群中解冻后的生长速率增加至少1.03倍；
相比对照干细胞群，解冻并任选地培养1天和/或4天后线粒体活性增加至少5％；
相比对照干细胞群，所述干细胞群解冻后恢复所花的时间减少；和/或
相对于对照干细胞群，所述细胞解冻后恢复所花的小时数减少至少1.1倍，
其中所述对照干细胞群来源于与用N-乙酰半胱氨酸处理的干细胞群相同的干细胞群，并且未用N-乙酰半胱氨酸处理，但在其他方面经历了相同的条件。
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