BR112021015887A2 - Método para criopreservação de célula-tronco, população de células-tronco, composição de criopreservação, uso de nac, e kit de criopreservação - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULA-TRONCO, POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, COMPOSIÇÃO DE CRIOPRESERVAÇÃO, USO DE NAC, E KIT DE CRIOPRESERVAÇÃO. A invenção se refere a métodos para a criopreservação de uma população de células-tronco, incluindo células-tronco mesenquimais (MSCs), como células-tronco estromais derivadas de adipose (ASCs). Mais particularmente, a invenção se refere ao uso de N-acetilcisteína (NAC) em métodos de criopreservação, populações de células obtidas dos ditos métodos, composições compreendendo as ditas células e usos das mesmas.

Description

MÉTODO PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULA-TRONCO, POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, COMPOSIÇÃO DE CRIOPRESERVAÇÃO, USO DE NAC, E KIT DE CRIOPRESERVAÇÃO CAMPO DA TÉCNICA

[001] A invenção se refere a métodos para a criopreservação de uma população de células-tronco, incluindo células-tronco mesenquimais (MSCs), como células-tronco estromais derivadas de adipose (ASCs). Mais particularmente, a invenção se refere ao uso de N-acetilcisteína (NAC) em métodos de criopreservação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O mercado global de medicina reparadora e regenerativa exige que a viabilidade e a função das células terapêuticas sejam mantidas, permitindo o transporte de células do local de fabricação ao paciente, a conclusão de testes de controle de qualidade e segurança e a formação de bancos de células. As células são criopreservadas ou mantidas hipotermicamente antes de retornar às temperaturas normotérmicas antes ou durante a utilização. O sucesso dessas terapias depende, pelo menos em parte, da capacidade de preservar não apenas a estrutura, mas também a função das células.

[003] O objetivo da preservação celular, independentemente do tipo, é interromper o tempo biológico por um determinado período, seguido pelo retorno sob demanda da viabilidade, estrutura e função celular. Idealmente, a célula/tecido que é criopreservado deve ter as mesmas propriedades após o descongelamento. O alcance deste objetivo está longe de ser realizado em muitos casos. Os resultados de preservação são frequentemente caracterizados pela retenção de um alto grau de viabilidade celular medida imediatamente após o armazenamento, seguido por um declínio subsequente ao longo de 24 a 48 horas, juntamente com uma diminuição na capacidade de resposta celular, função e capacidade reprodutiva. Para preservação hipotérmica, os intervalos de armazenamento são normalmente limitados a 1 a 3 dias para a maioria dos sistemas celulares.

[004] Muitos estudos observaram que as propriedades celulares (por exemplo, atividade celular, sobrevivência, potencial de proliferação) são afetadas pelo processo de congelamento e descongelamento. O processo de preservação coloca uma série de tensões nas células como resultado do desacoplamento dependente da temperatura dos processos metabólicos e bioquímicos. Esses incluem, entre outros, a produção de radicais livres pela interrupção da respiração oxidativa, que são prejudiciais às células devido aos efeitos a jusante da peroxidação lipídica, danos de DNA e RNA, alterações de componentes estruturais do citoesqueleto. As alterações na estrutura, fluidez e organização da membrana celular também podem ativar receptores de membrana, iniciando uma cascata de eventos intracelulares, incluindo estimulação de vias de resposta ao estresse e apoptose. A desregulação do equilíbrio iônico celular por meio do desligamento das bombas de Na+/K+ ligadas à membrana e dos canais de íons Ca2+ ativa os mecanismos de resposta ao -estresse, incluindo a liberação de cálcio dos depósitos intracelulares, influxo osmótico e inchaço celular. Uma série de mecanismos adicionais de resposta ao estresse também podem ser ativados por meio do armazenamento em baixa temperatura em detrimento das células.

[005] Os crioprotetores como dimetilsulfóxido

(DMSO), glicerol ou soro de origem animal são comumente adicionados ao meio de criopreservação para minimizar esses efeitos negativos. No entanto, permanece uma necessidade de melhorar os métodos de criopreservação de célula-tronco. BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO:

[006] A presente invenção é resumida como fornecendo métodos e composições relacionados à criopreservação de célula-tronco, incluindo células-tronco mesenquimais (MSCs), como células-tronco estromais derivadas de adipose (ASCs), e usos das ditas composições. Em particular, para facilitar os estudos de pesquisa e aplicações clínicas das células-tronco, os inventores desenvolveram uma nova abordagem de criopreservação que envolve o tratamento de células com N-acetilcisteína (NAC), que resulta em aumento do número de células viáveis pós-descongelamento, aumento da taxa de crescimento, aumento da atividade mitocondrial e/ou melhora recuperação, mantendo as propriedades estruturais e/ou funcionais das células, tais como as necessárias para o seu uso terapêutico.

[007] A invenção fornece um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com N-acetilcisteína (NAC) para obter uma população de células- tronco tratada; e (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada. Em algumas modalidades, o método compreende as etapas de: (a) tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células- tronco congelada; e (c) descongelar a população de células-

tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

Em algumas modalidades, o método compreende as etapas de: (a) tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b) lavar a população de células-tronco tratada para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada, e congelar a população de células-tronco lavada para obter uma população de células-tronco congelada; e (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células- tronco descongelada.

Em qualquer um dos métodos, a etapa de tratamento pode compreender incubar a população de células- tronco com NAC por pelo menos cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24 ou 48 horas antes de congelar a população de células- tronco.

A etapa de tratamento pode compreender adicionar NAC à população de células-tronco a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 10 mM.

A etapa de tratamento pode compreender uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de: (d) cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de: (d) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida.

A etapa de cultivo pode compreender adicionar NAC a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 5 mM.

A etapa de cultivo pode compreender uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado.

Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco expandida para remover a NAC e para obter a população de células-tronco lavada e expandida. Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco descongelada ou a população de células-tronco expandida e ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de: (e) congelar a população de células-tronco expandida ou lavada e expandida para obter uma população de células-tronco expandida congelada ou uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida. Em algumas modalidades, o método compreende ainda as etapas de: (e) congelar a população de células-tronco lavada e expandida ou expandida para obter uma população de células- tronco expandida congelada ou uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida; e (f) descongelar a população de células-tronco congelada, lavada e expandida ou expandida congelada para obter uma população de células-tronco expandida descongelada. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de: (g) lavar a população de células-tronco expandida descongelada e ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

[008] A invenção também fornece um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; e (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida. A etapa de cultivo pode compreender adicionar NAC a uma concentração inicial de cerca de 0,5 a 5 mM. Em algumas modalidades, a etapa de cultivo compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado.

[009] Em qualquer um dos métodos da invenção, a etapa de congelamento pode compreender reduzir a temperatura para entre -70 ºC e -130 ºC a uma taxa entre cerca de -0,5 a cerca de -10 ºC/minuto. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento compreende reduzir a temperatura de +4 ºC para entre -100 e -180 ºC em 10 a 60 min.

[010] Em qualquer um dos métodos da invenção, a população de células-tronco pode ser descongelada a 37 ºC. A densidade celular da população de células-tronco congelada pode estar na faixa de cerca de 1 milhão a cerca de 50 milhões de células/ml, preferencialmente cerca de 25 milhões de células/ml.

[011] Em algumas modalidades, a população de células-tronco é substancialmente pura. Em algumas modalidades, as células-tronco são células-tronco mesenquimais (MSCs). Em algumas modalidades, as células-tronco são células- tronco estromais derivadas de adipose (ASCs). Em algumas modalidades, as células-tronco são células humanas. Em modalidades preferenciais, as células-tronco são ASCs humanas.

[012] Em qualquer um dos métodos da invenção, o método pode ainda compreender a etapa de ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável. O método pode compreender congelar a população de células-tronco em uma pluralidade de criotubos.

[013] Em algumas modalidades, o método compreende repetir as etapas de qualquer um dos métodos da invenção para uma pluralidade de populações de células-tronco. O método pode compreender congelar a pluralidade de populações de células-tronco em uma pluralidade de criotubos. O método pode compreender ainda armazenar a pluralidade de frascos de criopreservação em um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido por pelo menos um mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses ou pelo menos 1 ano.

[014] A invenção fornece ainda um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido contendo uma pluralidade de frascos de criopreservação obtidos de acordo com um método da invenção.

[015] A invenção fornece uma população de células-tronco obtida por um método da invenção.

[016] Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células-tronco da invenção, o número de células viáveis após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias pode ser aumentado em comparação com uma população de células-tronco de controle. Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células- tronco da invenção, o número de células viáveis após o descongelamento pode ser aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em comparação com uma população de células-tronco de controle. Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células-tronco da invenção, a taxa de crescimento após o descongelamento pode ser aumentada pelo menos cerca de pelo menos cerca de 1,03 vez, 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,25 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes na população de células-tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle. Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células-tronco da invenção, a atividade mitocondrial após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias pode ser aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% em comparação com uma população de células-tronco de controle. Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células-tronco da invenção, o tempo decorrido após o descongelamento para as ASCs se recuperarem pode ser reduzido em comparação com uma população de células- tronco de controle. Em qualquer um dos métodos da invenção ou população de células-tronco da invenção, o número de horas necessárias para as células se recuperarem após o descongelamento pode ser reduzido pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em relação a uma população de células-tronco de controle.

[017] A invenção fornece uma composição de criopreservação que compreende a população de células-tronco da invenção e um meio de criopreservação. A composição pode ser congelada. Em algumas modalidades, a composição contém NAC.

[018] A invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende a população de células-tronco da invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. A composição pode compreender cerca de 1 milhão de células a cerca de 150 milhões de células, preferencialmente cerca de 30 milhões de células ou cerca de 120 milhões de células. Em algumas modalidades, a densidade celular é cerca de 1 a 20 milhões de células/ml.

[019] A invenção fornece o uso de NAC para a criopreservação de células-tronco, por exemplo, em um método da invenção.

[020] A invenção também fornece uma população de células-tronco da invenção, composição farmacêutica da invenção ou composição de criopreservação da invenção para uso em terapia.

[021] A invenção fornece ainda a população de células-tronco da invenção, composição farmacêutica da invenção ou composição de criopreservação da invenção para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão em um paciente com essa necessidade.

[022] A invenção fornece um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em que o método compreende administrar a população de células-tronco da invenção, composição farmacêutica da invenção ou composição de criopreservação da invenção a um indivíduo com essa necessidade.

[023] A invenção também fornece uma população de células-tronco para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (d) opcionalmente cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e (e) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[024] A invenção fornece ainda um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células- tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (d) opcionalmente cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e (e) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[025] A invenção fornece uma população de células-tronco para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e (d) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[026] A invenção também fornece um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células- tronco descongelada; (c) cultivar a população de células- tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e (d) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[027] Em algumas modalidades, a população de células-tronco para uso de acordo com a invenção ou método de tratamento de acordo com a invenção compreende ainda qualquer uma das etapas dos métodos de criopreservação de célula-tronco descritos no presente documento antes da administração da população de células-tronco ao paciente.

[028] Em algumas modalidades da população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso de acordo com a invenção, ou método de tratamento da invenção, em que o método compreende administrar cerca de 1 milhão a 150 milhões de células, preferencialmente cerca de 30 milhões de células-tronco ou cerca de 120 milhões de células-tronco. O método pode compreender administrar cerca de 1 milhão a cerca de 10 milhões de células/kg. O método pode compreender injetar a população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação da invenção. As células-tronco podem ser como definidas no presente documento. Em algumas modalidades, as células-tronco são alogênicas ou autólogas. Em modalidades preferenciais, as células-tronco são ASCs humanas, alogênicas.

[029] A invenção fornece um kit de criopreservação que compreende: um criotubo, um recipiente contendo NAC e um recipiente que compreende uma população de células-tronco.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[030] Figura 1: Fluxograma que ilustra os ensaios exemplificados.

[031] Figura 2: Ensaio MTS 24 horas após a semeadura pós-descongelamento de ASCs que foram tratadas com vários compostos antes do congelamento (NAC; LY294.002, sc-79 ou exendina-4), em comparação com células não tratadas (NT). Os dados representativos de um único experimento em seis repetições técnicas para MTS.

[032] Figura 3: O número de células 24 horas após a semeadura pós-descongelamento de ASCs que foram tratadas antes do congelamento com 6 mM de NAC (NAC), em comparação com células não tratadas (NT). Dados representativos de um único experimento em triplicados técnicos.

[033] Figura 4: Densidade celular em 1, 4 e 7 dias (A) e ensaio MTS em 24 horas (B) e 96 horas (C), após semeadura pós-descongelamento de ASCs que foram tratadas antes do congelamento com NAC 6 mM (NAC), em comparação com células não tratadas (NT). Os resultados de MTS são apresentados como porcentagem de absorbância a 490 nm em relação às células não tratadas. Dados representativos de um único experimento em triplicado para contagens de células e em 6 repetições técnicas para MTS. O ponto de tempo do dia 0 na Figura 4A mostra a densidade de semeadura de células, em vez do número de células aderentes viáveis, como mostrado para os outros pontos de tempo.

[034] Figura 5: Gráfico mostrando as densidades celulares de ASCs de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B) aos 1, 4 e 7 dias após a semeadura pós-

descongelamento. ASCs foram pré-tratadas com 6 mM de NAC e comparadas com células não tratadas. Dados representativos de um experimento em triplicados técnicos.

[035] Figura 6: Gráfico que mostra as densidades celulares aos 7, 11 e 14 dias após a semeadura de ASC descongeladas com tratamento pós-descongelamento com 2, 6 ou 12 mM de NAC adicionados ao meio de plaqueamento. Dados representativos de dois experimentos em triplicados técnicos.

[036] Figura 7: Ensaio de identidade ASC por citometria de fluxo. ASCs (do doador A e tratadas antes do congelamento com NAC 6 mM) foram analisadas duas semanas após o descongelamento e comparadas com células não-tratadas para CD29, CD73, CD90 e CD105. As porcentagens de células positivas são mostradas na figura. Experimentado executado em triplicados técnicos.

[037] Figura 8: Ensaio de proliferação de linfócitos usando ASCs descongeladas do doador A pré-tratadas com 6 mM de NAC e em comparação com células não tratadas. A análise foi executada em 96 horas usando uma razão para ASC: PBMC de 1:75. (A) Sobreposições entre a proliferação máxima de PBMCs ativadas e as PBMCs na presença de ASC. (B) Comparação entre ASCs tratadas com NAC e não tratadas após o descongelamento na linfoproliferação. Os resultados são quantificados no painel direito inferior.

[038] Figura 9: Diagrama que mostra o planejamento e o tempo de coculturas de ASC e monócitos, e a análise realizada para avaliar o efeito de ASC na diferenciação e função de macrófagos e mDC.

[039] Figura 10: Imagens microscópicas em 2x de culturas de DC maduras sozinhas ou na presença de ASCs descongeladas de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) pré-tratadas com NAC ou não tratadas.

[040] Figura 11: Imagens microscópicas em 20x de culturas de DC maduras sozinhas ou na presença de ASCs descongeladas de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) pré-tratadas com NAC ou não tratadas.

[041] Figura 12: Histogramas que representam a fagocitose de partículas de Staphylococcus aureus por mDC na ausência ou presença de ASCs de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) com ou sem pré-tratamento de NAC, medido por citometria de fluxo.

[042] Figura 13: Expressão de superfície do receptor fagocítico CD206 (receptor de manose) por mDC na ausência ou presença de ASCs de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) com ou sem pré-tratamento de NAC, medido por fluxo citometria. ASC induz a expressão de CD14, CD206 e CD163 em mDC. Pré-tratamento com NAC de ASC não alterou esses efeitos.

[043] Figura 14: Expressão de superfície do receptor fagocítico CD163 (receptor de sequestrador) por mDC na ausência ou presença de ASCs de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) com ou sem pré-tratamento de NAC, medido por fluxo citometria. ASC induz a expressão de CD14, CD206 e CD163 em mDC. Pré-tratamento com NAC de ASC não alterou esses efeitos.

[044] Figura 15: Gráficos de pontos que representam a expressão de superfície de CD14 e CD1a (molécula de apresentação de antígeno) por mDC na ausência ou presença de ASCs de dois doadores diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)) com ou sem pré-tratamento de NAC, medido por citometria de fluxo. mDC são CD14-CD1a+, mas a presença de ASC gera uma nova população DC modulatória CD14+CD1a-. Pré- tratamento com NAC de ASC não modificou esse efeito.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[045] A presente invenção se refere a métodos e composições para criopreservação de célula-tronco, em que uma população de células-tronco é tratada com N-acetilcisteína (NAC) antes do congelamento (“pré-tratamento de NAC”) e/ou após as células-tronco são descongeladas (“tratamento pós- descongelamento”).

[046] Os inventores testaram uma série de compostos que são conhecidos por modular insultos apoptóticos em células (como hipóxia, privação de soro, estresse oxidativo (por exemplo, causado por tratamento com peróxido de hidrogênio), morte induzida por ligante Fas, etc.) com o objetivo de melhorar a resistência de células para o processo de congelamento e descongelamento. Verificou-se que a NAC confere uma vantagem às células-tronco após o descongelamento em termos de aumento do número de células viáveis, aumento da taxa de crescimento, aumento da atividade mitocondrial e/ou melhora da recuperação em relação às células de controle não tratadas. O aumento do número de células viáveis disponíveis imediatamente após o descongelamento é útil, por exemplo, para tratamento agudo. Esses benefícios ajudarão a facilitar o armazenamento, transporte e manuseio de estoques de célula- tronco e linhagens celulares, e a preparação e transporte de terapias baseadas em células, por exemplo, diminuindo o tempo necessário para recuperar e/ou expandir células criopreservadas em cultura após descongelamento. N-Acetilcisteína

[047] N-Acetilcisteína (NAC), também conhecida como N-acetil-L-cisteína, é o nome não proprietário do derivado N-acetil do aminoácido de ocorrência natural, L-cisteína. É um antioxidante com peso molecular de 163,2 gmol-1 e a seguinte estrutura química:

[048] NAC é comercializada sob os nomes comerciais de Acetadote®, Mucomyst®, Parvolex®, Fluimucil® e outros. É aprovada para várias indicações, incluindo o tratamento de overdose de paracetamol (acetaminofeno) (como um agente injetável e oral) e como um mucolítico para soltar o muco espesso em indivíduos com fibrose cística ou doença pulmonar obstrutiva crônica (administrado por via intravenosa, por via oral ou inalado como névoa). NAC também está sendo usada ou investigada para tratar outras indicações, incluindo insuficiência hepática, vários tipos de câncer, envenenamento por metacrilonitrila, redução da nefropatia induzida por contraste de rádio e redução da lesão de reperfusão durante a cirurgia de revascularização do miocárdio. PRÉ-TRATAMENTO COM NAC

[049] É divulgado aqui um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende o tratamento de uma população de células-tronco com NAC antes do congelamento, ou seja, “pré-tratamento” de uma população de células-tronco. Assim, “células pré-tratadas com NAC” se referem a células que foram tratadas com NAC e depois congeladas.

[050] O método para criopreservação de células- tronco pode compreender as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco (como ASCs) com N-acetilcisteína para obter uma população de células-tronco tratada; e (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada.

[051] O tratamento da população de células- tronco com NAC (o “tratamento” ou “etapa de tratamento”) é normalmente realizado pela adição de NAC a um meio de cultura de células adequado para a população de células-tronco. Uma solução estoque de NAC pode ser preparada, por exemplo, em água, e então a NAC pode ser diluída para a concentração necessária no meio de cultura.

[052] O especialista estará ciente dos meios de cultura de células adequados para apoiar o crescimento de tipos de células particulares. Os meios de cultura de células podem estar na forma líquida ou sólida, incluindo meios gelatinosos, como ágar, agarose, gelatina e matrizes de colágeno. Um meio pode ser um “meio definido” que é feito de componentes quimicamente definidos (geralmente purificados) e que não contêm extratos biológicos mal caracterizados, como extrato de levedura e caldo de carne. Um meio pode ser um “meio basal” que promove o crescimento de muitos tipos de micro-organismos que não requerem nenhum suplemento nutricional especial. A maioria dos meios basais geralmente compreende quatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carboidratos, sais inorgânicos e vitaminas. Um meio basal geralmente serve como base para um meio mais complexo, ao qual são adicionados suplementos, como soro, tampões, fatores de crescimento, lipídios e semelhantes. Exemplos de meios basais incluem, mas não estão limitados a, meio basal de Eagle, meio essencial mínimo, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio 199, misturas de nutrientes F-10 Ham e F-12 Ham, 5A de McCoy, MEM/F-12 Dulbecco, meio essencial mínimo alfa modificado (alfaMEM), meio 1640 de Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) e meio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM). Tipicamente, 0 a 20% de soro bovino fetal (FBS) ou 1 a 20% de soro equino serão adicionados ao meio acima a fim de suportar o crescimento de MSCs. Entretanto, um meio definido pode ser usado se os fatores de crescimento, citocinas e hormônios necessários em FBS para MSCs forem identificados e fornecidos em concentrações apropriadas no meio de crescimento. Os antibióticos que podem ser incluídos no meio de cultura incluem, mas não estão limitados à penicilina e estreptomicina. A concentração de penicilina no meio de cultura quimicamente definido é de cerca de 10 a cerca de 200 unidades por ml. A concentração de estreptomicina no meio de cultura quimicamente definido é de cerca de 10 a cerca de 200 µg/ml. Por exemplo, um meio de cultura de células adequado para ASCs é DMEM completo (meio DMEM⁄F-12 - GlutaMAX™-I, Gibco, suplementado com 100 µg/ml de penicilina/estreptomicina e 10% de FBS).

[053] A etapa de tratamento pode incluir a adição de NAC à população de células-tronco a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 10 mM de NAC, por exemplo, cerca de 2 a 8 mM ou cerca de 4 a 6 mM. Uma concentração inicial de 0,5 a 20 mM de NAC também pode ser usada, por exemplo, cerca de 3 a 15 mM de NAC, 0,5 a 12 mM ou 4 a 12 mM de NAC. Em uma modalidade particularmente preferencial, a concentração inicial de NAC é de cerca de 6 mM. A “concentração inicial” se refere à concentração de NAC quando adicionada à população de células-tronco. Entretanto, será entendido que após a adição às células, a concentração inicial de NAC provavelmente diminuirá, por exemplo, com NAC sendo degradada ou metabolizada. Assim, a etapa de tratamento pode compreender uma ou mais adições de NAC adicionais, por exemplo, para manter a concentração de NAC na qual a população de células-tronco é exposta. Desse modo, a “etapa de tratamento” pode compreender tratar a população de células-tronco com uma concentração inicial de NAC, opcionalmente monitorando o nível de NAC durante a etapa de tratamento, e adicionando uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC a concentração inicial ou um nível pré-selecionado (por exemplo, uma concentração de NAC descrita acima).

[054] A etapa de tratamento pode compreender incubar a população de células-tronco com NAC por pelo menos cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24 ou 48 horas antes do congelamento da população de células-tronco. Por exemplo, a incubação da população de células-tronco com NAC pode ser realizada por entre cerca de 1 e cerca de 48 horas, entre cerca de 2 e 24 horas, ou entre cerca de 6 e 24 horas antes do congelamento da população de células-tronco. A incubação pode ser realizada em quaisquer condições adequadas (por exemplo, onde a população de células-tronco é estável). Em modalidades preferenciais, a incubação é realizada em condições de cultura para o tipo de célula particular. Por exemplo, ASCs podem ser incubadas com NAC em DMEM completo (meio DMEM⁄F-12 - GlutaMAX™- I, Gibco, suplementado com 100 µg/ml de penicilina/estreptomicina e 10% de FBS) e incubados a 37 ºC a

5% de CO2. Em uma modalidade, a população de células-tronco não é incubada com NAC durante todo o período de cultura. O período de cultura é o período entre a semeadura da população de células-tronco em um recipiente de cultura de células e o congelamento da população de células-tronco. Em uma modalidade, a população de células-tronco é incubada em um meio de cultura sem NAC adicionada por um primeiro período e, em seguida, incubada em um meio de cultura com NAC adicionado por um segundo período.

[055] Uma população de células-tronco que foi submetida a uma “etapa de tratamento” do NAC, conforme divulgado neste documento, é referida como uma “população de células-tronco tratada”.

[056] Após a etapa de tratamento, a população de células tronco tratada é congelada. Uma população de células- tronco congelada que foi submetida a congelamento (uma “etapa de congelamento”), conforme divulgada neste documento, é referida como “uma população de células-tronco congelada”. Uma população de células-tronco que foi submetida a descongelamento (uma “etapa de descongelamento”) como revelado no presente documento é referida como “una população de células-tronco descongelada”. Desse modo, o método pode compreender as etapas de: (a) tratar a população de células- tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; e (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

[057] Antes que a população de células-tronco tratada seja congelada, a NAC pode ser removida (ou seja, para que as células não fiquem mais expostas à NAC extracelular). Normalmente, isso pode ser realizado lavando a população de células-tronco, por exemplo, com (1) um meio de cultura de células (por exemplo, como usado na etapa de tratamento) que não contenha NAC; (2) solução salina tamponada com fosfato (PBS); e/ou (3) um meio de congelamento. Uma população de células-tronco que foi submetida à lavagem (uma “etapa de lavagem”), conforme divulgada neste documento, é referida como “uma população de células-tronco lavada”. A lavagem também pode ser usada como uma etapa de troca de meio para que as células possam ser congeladas em um meio diferente, como o meio de congelamento. Desse modo, o método pode compreender as etapas de: (a) tratar a população de células-tronco com N-acetilcisteína para obter uma população de células-tronco tratada; (b) lavar a população de células-tronco tratada para remover a N-acetilcisteína e para obter uma população de células-tronco lavada, e congelar a população de células- tronco lavada para obter uma população de células-tronco congelada; e (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

[058] A lavagem da população de células-tronco tratada pode ser realizada por qualquer método adequado. Para células aderentes, a solução contendo NAC (por exemplo, meio) pode ser trocada por uma diferente (por exemplo, que não contém NAC e/ou é um meio de congelamento) por pipetagem simples. Para células em suspensão (incluindo células aderentes tripsinizadas), as células podem ser peletizadas, por exemplo, usando uma centrífuga, o sobrenadante removido, opcionalmente lavado (por exemplo, com um meio de cultura ou PBS) e então ressuspensas no meio necessário (por exemplo, um meio de cultura ou meio de congelamento). Filtração, ultrafiltração ou diálise também podem ser usadas para lavar as células. Métodos para tripsinizar células aderentes são conhecidos na técnica e um método adequado é exemplificado nos exemplos.

[059] Após o congelamento-descongelamento, as células podem ser cultivadas (“cultivo" ou uma “etapa de cultivo”), por exemplo, para permitir que as células se recuperem e/ou para aumentar o número de células. As células resultantes são chamadas de uma “população de células-tronco expandida”. O termo “expandido”, conforme usado neste documento, quando se refere a células, deve ser considerado como tendo seu significado usual na técnica, a saber, células que foram proliferadas in vitro. “Proliferação” se refere a um aumento em número de células. “Proliferar” e “proliferação” se referem a células submetidas à mitose. Assim, o método pode compreender ainda a etapa de: (d) cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida.

[060] “Cultivar” como usado no presente documento se refere ao termo como reconhecido na técnica, ou seja, qualquer método para atingir o crescimento celular em um meio adequado. As células podem ser cultivadas por qualquer técnica conhecida na técnica de cultivo de células-tronco. A etapa de cultivo pode ser em pequena, média ou grande escala. Uma cultura pode ser considerada em pequena escala se o volume total da cultura for inferior a cerca de 100 ml. Uma cultura pode ser considerada em escala média se o volume total de cultura estiver entre cerca de 100 ml e cerca de 5 l. Uma cultura pode ser considerada em grande escala se o volume total de cultura (por exemplo, em um biorreator) for maior do que cerca de 5 l, e pode ser maior que 10 l, 100 l, 500 l ou 1000 l.

[061] Uma “cultura celular” se refere a um crescimento de células in vitro. Em tal cultura, as células proliferam, mas não se organizam em tecido por si só. Uma “cultura de tecido” se refere à manutenção ou crescimento de tecido, por exemplo, explantes de órgão primordial ou de órgão adulto in vitro, de modo a preservar sua arquitetura e função. Uma “cultura em monocamada” se refere a uma cultura na qual as células se multiplicam em um meio adequado, enquanto principalmente ligadas umas às outras e a um substrato. Além disso, uma “cultura em suspensão” se refere a uma cultura na qual as células se multiplicam enquanto suspensas em um meio adequado. Da mesma forma, uma “cultura de fluxo contínuo” se refere ao cultivo de células ou explantes em um fluxo contínuo de meio fresco para manter o crescimento celular, por exemplo, a viabilidade. Uma “cultura confluente” é uma cultura de células em que todas as células estão em contato e, portanto, toda a superfície do recipiente de cultura é coberta, e implica que as células também atingiram sua densidade máxima, embora a confluência não signifique necessariamente que a divisão será cessar ou que a população não aumentará de tamanho.

[062] Uma discussão de várias técnicas de cultura, bem como sua ampliação, pode ser encontrada em Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 7a Edição, Wiley- Blackwell, janeiro de 2016. A etapa de cultivo pode ser realizada em qualquer tipo de recipiente (para uma revisão da fabricação de MSCs, incluindo uma discussão sobre diferentes tipos de recipiente, ver Mizukami et al. “Mesenchymal Stromal Cells: From Discovery to Manufacturing and Commercialization” Stem Cells International (2018) ID do artigo 4083921, 1-13 https://doi.org/10.1155/2018/4083921). Exemplos de vasos que podem ser usados nos métodos aqui divulgados incluem cultura em monocamada ou frascos bidimensionais planos, que consistem em um único compartimento ou fábricas de células de vasos de múltiplas camadas, como Nunc Cell Factories and Corning Cell Stacks.

Como uma alternativa aos frascos, garrafas de rolo podem ser usadas, isto é, garrafas cilíndricas colocadas em um aparelho rotativo no qual as células podem formar uma monocamada em torno da superfície interna da garrafa.

Os biorreatores adequados para a expansão em grande escala de células, incluindo MSCs (como ASCs), estão comercialmente disponíveis e podem incluir biorreatores de expansão 2D (isto é, substancialmente planos) e 3D.

Exemplos de tais biorreatores que podem ser usados nos métodos aqui divulgados incluem, mas não estão limitados a um biorreator de fluxo em pistão, um biorreator de perfusão, um biorreator de tanque agitado contínuo ou um biorreator de leito estacionário.

O biorreator pode ser operado em modo de batelada, alimentado por batelada ou modo de perfusão.

Devido à natureza dependente-da ancoragem das MSCs, a cultura em biorreatores requer o uso de um microcarreador, que geralmente são pequenos grânulos (100 a 200 µm no diâmetro) que são facilmente mantidos em suspensão e fornecem uma superfície para as células se fixarem e crescerem.

Exemplos de microcarreadores incluem o microcarreador Cytodex-3 (GE Healthcare). As células são normalmente cultivadas em temperaturas entre 31 ºC a 37 ºC em um ambiente umidificado.

Assim, em algumas modalidades, a cultura da população de células-tronco descongelada (por exemplo, MSCs, como ASCs) para obter uma população de células-tronco expandida é realizada em um biorreator de grande escala usando um microcarreador.

[063] A cultura da população de células-tronco descongelada pode ser realizada na presença de NAC, por exemplo, para melhorar a recuperação e/ou para aumentar o número de células. Em outras palavras, após o descongelamento o tratamento com NAC pode ser usado além do pré-tratamento com NAC. Assim, o método pode compreender ainda a etapa de: (d) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de N-acetilcisteína para obter uma população de células-tronco expandida. O cultivo da população de células- tronco descongelada pode compreender a adição de NAC a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 5 mM de NAC, como cerca de 0,5 a 4 mM ou cerca de 1 a 2 mM, de preferência cerca de 2 mM, sob cultura de células adequada condições para o tipo de célula. Outras adições de NAC podem ser necessárias para manter a concentração de NAC no meio de cultura de células (por exemplo, devido à NAC ser degradada ou metabolizada). Assim, a etapa de cultivo pode compreender a adição de uma concentração inicial de NAC no meio de cultura, seguida de outras adições ao NAC para manter a concentração inicial de NAC ou para manter a concentração de NAC em um nível pré- selecionado (por exemplo, a concentração de NAC conforme descrito acima). Outras adições podem ser adicionadas como um bolus de NAC sozinha ou em combinação com outros nutrientes (por exemplo, em cultura descontínua). A “etapa de cultivo” pode compreender ainda o monitoramento do nível de NAC e a adição de uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração inicial ou um nível pré-selecionado. Alternativamente, NAC pode ser continuamente suplementada, por exemplo, no meio fresco durante a cultura de perfusão.

[064] A NAC pode ser removida antes de qualquer uso a jusante da população de células-tronco, se necessário. Assim, o método pode compreender ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco expandida para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada e expandida. A etapa de lavagem pode permitir a troca do meio por exemplo, por um carreador farmaceuticamente aceitável, uma solução/meio que não contenha NAC ou meio de congelamento. A lavagem pode ser realizada por qualquer método adequado, incluindo centrifugação, filtração, ultrafiltração ou diálise. Para células aderentes, a solução contendo NAC (por exemplo, meio) pode ser trocada por uma diferente por simples pipetagem. Para células em suspensão (incluindo células aderentes tripsinizadas), as células podem ser peletizadas (por exemplo, usando uma centrífuga), o sobrenadante removido, opcionalmente lavado (por exemplo, com meio de cultura ou PBS) e então ressuspensas na solução necessária (por exemplo, um meio de cultura, um meio de congelamento ou um carreador farmaceuticamente aceitável). Assim, o método pode compreender ainda uma etapa de lavagem da descongelada ou população de células-tronco expandida (por exemplo, da etapa (c) ou (d)) e ressuspender as células (por exemplo, células em suspensão ou células aderentes tripsinizadas) em um carreador farmaceuticamente aceitável.

[065] A população de células-tronco expandida pode ser congelada, por exemplo, para armazenamento como estoque de células e/ou para envio. O método pode compreender ainda a etapa de: (e) congelar a população de células-tronco expandida (por exemplo, da etapa (d)) para obter uma população de células-tronco expandida congelada. O método pode compreender ainda as etapas de: (e) congelar a população de células-tronco expandida para obter uma população de células- tronco expandida congelada; e (f) descongelar a população de células-tronco expandida congelada para obter uma população de células-tronco expandida descongelada. O método pode compreender a etapa de: (e) congelar a população de células- tronco lavada e expandida para obter uma população de células- tronco congelada, lavada e expandida. O método pode compreender ainda as etapas de: (e) congelar a população de células-tronco lavada e expandida para obter uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida; e (f) descongelar a população de células-tronco congelada, lavada e expandida para obter uma população de células-tronco expandida descongelada. Como a “etapa de cultivo” da etapa (d) pode ser realizada na presença de NAC como discutido acima, nesses casos, a população de células-tronco expandida pode ser considerada “pré-tratada” com NAC antes do congelamento. A NAC pode ser removida por lavagem, se necessário, antes do congelamento e/ou a lavagem pode ser usada para troca de meio, por exemplo, para um meio de congelamento. Opcionalmente, o método pode compreender ainda a etapa de: (g) lavar a população de células-tronco expandida descongelada e ressuspender as células (por exemplo, a suspensão ou células aderentes tripinizadas) em um carreador farmaceuticamente aceitável.

[066] A população de células-tronco congelada (por exemplo, ASCs) obtida a partir dos métodos discutidos acima formam um estoque mestre de células. Por exemplo, a população de células-tronco pode ser aliquotada em uma pluralidade de criotubos, por exemplo, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 50, cerca de 100, cerca de 1000, cerca de 2000, cerca de 5000 ou mais criotubos e armazenados criogenicamente (por exemplo, em um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido). Os criotubos individuais podem ser descongelados separadamente para uso posterior. A população de células-tronco expandida ou descongelada (por exemplo, ASCs) obtida a partir dos métodos discutidos acima pode ser uma população célula-tronco terapêutica. Por exemplo, a população de células-tronco descongelada ou expandida (por exemplo, ASCs) pode estar em uma formulação adequada (por exemplo, uma composição farmacêutica contendo um carreador farmaceuticamente aceitável) para administração a um paciente com essa necessidade.

[067] O método pode compreender ainda a etapa de ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável. TRATAMENTO DE NAC PÓS-DESCONGELAMENTO

[068] É aqui divulgado um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco (como ASCs) para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; e (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida. Cultivar a população de células-

tronco descongelada na presença de NAC (isto é, após o tratamento de NAC pós-descongelamento) pode aprimorar a recuperação e/ou aumentar o número celular viável.

[069] O cultivo da população de células-tronco descongelada pode compreender a adição de NAC a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 5 mM de NAC, como cerca de 0,5 a 4 mM ou cerca de 1-2 mM, de preferência cerca de 2 mM, sob cultura de células adequada condições para o tipo de célula. Outras adições de NAC podem ser necessárias para manter a concentração de NAC no meio de cultura de células (por exemplo, devido à NAC ser degradada ou metabolizada). Assim, a etapa de cultivo pode compreender a adição de uma concentração inicial de NAC no meio de cultura, seguida de outras adições ao NAC para manter a concentração inicial de NAC ou para manter a concentração de NAC em um nível pré- selecionado (por exemplo, uma concentração de NAC para tratamento pós-descongelamento conforme descrito acima). Outras adições podem ser adicionadas como um bolus, opcionalmente em combinação com outros nutrientes (por exemplo, em cultura alimentada por batelada). A “etapa de cultivo” pode compreender ainda o monitoramento do nível de NAC e a adição de uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração inicial ou um nível pré-selecionado. Alternativamente, NAC pode ser continuamente suplementada, por exemplo, no meio fresco fornecido durante a cultura de perfusão.

[070] O método pode compreender ainda a etapa de ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

CRIOPRESERVAÇÃO

[071] Aqui, o termo “criopreservação” é usado para descrever o armazenamento de células em ambientes de baixa temperatura, ou seja, -70 ºC a -196 ºC. Essas temperaturas são adequadas para armazenamento a longo prazo (meses a anos). O uso dos termos “congelamento”, “congelar” e “congelado” no contexto das células-tronco, conforme aqui discutido, refere- se ao ato de expor as células a, e as células que foram submetidas a tais baixas temperaturas.

[072] Normalmente, após o resfriamento, conforme o meio externo congela, as células se equilibram perdendo água, aumentando assim a concentração de soluto intracelular. Abaixo de cerca de -10 a -15 ºC, ocorrerá congelamento intracelular. Tanto o congelamento intracelular quanto os efeitos da solução são responsáveis pela lesão celular. O dano físico pelo gelo extracelular é em grande parte resultado de lesão da membrana plasmática resultante da desidratação osmótica da célula.

[073] Nem todos os processos biológicos param quando um sistema é congelado. Durante o congelamento, as células permanecem em um estado de descongelamento ativo bioquimicamente enquanto encerradas em uma matriz de gelo congelada. Não até que as temperaturas caiam abaixo do ponto de transição do vidro (Tg) da mistura de crioprotetor/solução celular (normalmente abaixo de -100 ºC) as células entrarão em um estado vítreo, no qual a atividade bioquímica e biomolecular cessará.

[074] Durante o congelamento e subsequente descongelamento, quando as temperaturas estão acima da Tg, ocorre um conjunto significativo de eventos moleculares e bioquímicos dentro de cada célula que influencia drasticamente sua viabilidade e função após o descongelamento. Nessa faixa de temperatura (em torno de +15 ºC a -99,9 ºC) podem ser observadas várias semelhanças nos mecanismos de resposta celular entre criopreservação e armazenamento hipotérmico. Tais eventos incluem a formação de radicais livres, desacoplamento de vias bioquímicas, acúmulo de resíduos intracelulares, interrupção do gradiente de íons, desnaturação e degradação de proteínas e clivagem e ativação de enzimas. Esses e outros eventos podem ativar vias de morte celular apoptótica e/ou necrótica, que podem resultar no fenômeno de morte celular de início retardado. Isso pode ser observado como uma desconexão entre a medida de viabilidade imediatamente após o armazenamento e a verdadeira sobrevivência 24 a 48 horas depois.

MEIO DE CRIOPRESERVAÇÃO

[075] A população de células-tronco (como ASCs) pode ser congelada em um meio de criopreservação (um “meio de congelamento”). O meio pode preservar (até certo ponto) uma ou mais das propriedades das células (por exemplo, viabilidade) após o congelamento-descongelamento e/ou pode ajudar na recuperação. O meio de criopreservação pode conter NAC, por exemplo, a uma concentração entre cerca de 0,5 a 10 mM. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC. Um meio de criopreservação geralmente contém um ou mais agentes de criopreservação como DMSO, PVP, sericina ou metilcelulose e/ou pode conter uma solução de criopreservação disponível comercialmente. O um ou mais agentes de criopreservação ou solução de criopreservação podem ser adicionados ao meio de cultura célula-tronco, como DMEM, para produzir um meio de criopreservação. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém nenhum fator de crescimento adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém nenhum EGF e bFGF adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém selenito de sódio adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC e não contém nenhum fator de crescimento adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC e não contém nenhum EGF e bFGF adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC e não contém nenhum selenito de sódio adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC e não contém nenhum fator de crescimento adicionado e não contém nenhum selenito de sódio adicionado. Em uma modalidade, o meio de criopreservação não contém NAC e não contém EGF e bFGF e não contém nenhum selenito de sódio adicionado.

[076] Um agente de criopreservação (ou crioprotetor) é idealmente não tóxico, protege as células durante o congelamento, substitui a água e/ou tem uma alta temperatura de transição vítrea. Sem desejar ser limitado pela teoria, crioprotetores são hipotetizados para proteger as células do congelamento através, entre outros, dos seguintes mecanismos: contrabalançar a pressão osmótica externa, estabilizar biomoléculas por exclusão preferencial, formar um vidro protetor em torno de moléculas biológicas e prevenir transições de fase prejudiciais em membranas lipídicas.

[077] Historicamente, DMSO, glicerol e soro animal têm sido usados como crioprotetores.

[078] DMSO é tipicamente adicionado a um meio de criopreservação na faixa de 1 a 20% (v/v), tal como 5 a 15%, ou seja, cerca de 1%, 2%, 5%, 10% ou 20%. Uma concentração final de cerca de 10% é particularmente preferencial.

[079] O DMSO pode ser usado em combinação com soro, ou seja, soro fetal de bezerro/bovino (FCS/FBS) ou soro humano. Por exemplo, o meio de criopreservação pode conter 20-95% de soro (humano ou FCS) e 5 a 15% de DMSO. Um meio de criopreservação particularmente preferido (por exemplo, para MSCs, como ASCs) usado em qualquer um dos métodos aqui descritos contém cerca de 10% de DMSO e cerca de 90% de FCS (ou FBS). Por exemplo, o meio de criopreservação para uma população de MSCs, como ASCs humanas pode conter entre 5 a 15% de DMSO em FBS. O meio de congelamento para uma população de células-tronco embrionárias humanas pode conter 10% de DMSO, 30% de FBS e 60% de meio HES condicionado.

[080] DMSO pode ser usado em combinação com albumina de soro humano. Por exemplo, o meio de criopreservação pode conter entre cerca de 2 a 10% de albumina de soro humano e entre cerca de 5-15% de DMSO. Um meio de criopreservação particularmente preferido contém cerca de 10% de DMSO e cerca de 5% de albumina de soro humano.

[081] Outras moléculas, como glicerol, etilenoglicol, hidroxicelulose ou os dissacarídeos sacarose, maltose e trealose mostraram aumentar a viabilidade celular quando combinadas com DMSO em um meio de congelamento.

[082] A trealose é um dissacarídeo encontrado em altas concentrações em uma ampla variedade de organismos que são capazes de sobreviver à desidratação quase completa e que estabiliza certas células durante o congelamento. Acredita-se que a trealose mantenha a estabilidade termodinâmica das membranas, preservando o espaçamento do grupo de cabeças de fosfolipídios e inibindo as transições de fase lipídica e a separação durante o congelamento. A trealose é que ela não penetra facilmente nas bicamadas lipídicas e deve ser carregada nas células por meio de endocitose ou outros métodos que rompem temporariamente a membrana celular. Por exemplo, o meio de criopreservação para ASCs pode conter trealose a uma concentração entre cerca de 50 a 200 mM, tal como cerca de 100 mM. A trealose pode ser usada para reduzir a toxicidade potencial associada a outros crioprotetores, por exemplo, quando usada em combinação com DMSO nas concentrações discutidas acima (ver, por exemplo, Buchanan et al. Cell Preservation Technology (2005) 3(4): 212 a 222).

[083] Polivinilpirrolidona (PVP), sericina e maltose, e metilcelulose (MC) são agentes alternativos de criopreservação. Esses compostos foram testados como soluções de criopreservação, por exemplo, de ASCs, como alternativas ao DMSO ou ao soro de origem animal (Miyagi-Shiohira et al. Cell Medicine (2015) 8: 3 a 7).

[084] O PVP, que é um polímero macromolecular, diminui o ponto de congelamento e inibe o aumento da concentração de sal extracelular, estabilizando assim a membrana celular durante o processo de congelamento- descongelamento. O PVP pode ser adicionado ao meio de criopreservação em níveis entre cerca de 1% e 40%, como entre cerca de 8 e 25%, por exemplo, cerca de 1%, 5%, 10%, 20% ou 40%. O meio de criopreservação também pode conter soro humano, opcionalmente entre cerca de 5-20% (por exemplo, 10% de soro humano) além de PVP. Por exemplo, o meio de criopreservação para ASCs pode conter 10% de PVP e 10% de soro humano.

[085] MC é um polímero macromolecular que pode substituir o soro de origem animal em soluções de criopreservação, embora a presença de DMSO (ou outro agente de criopreservação) seja essencial para reter a atividade celular após o processo de congelamento-descongelamento. Um meio de criopreservação pode conter entre cerca de 0,5% e 2% p/v de MC, por exemplo, cerca de 1% p/v, em combinação com uma concentração adequada de DMSO como discutido acima. Por exemplo, o meio de criopreservação pode conter cerca de 1% de MC e cerca de 10% de DMSO.

[086] A sericina é uma proteína derivada do casulo, que também pode substituir o soro de origem animal em soluções de criopreservação. Um meio de criopreservação pode conter entre cerca de 0,5% e 2% p/v sericina, por exemplo, cerca de 1% p/v. A sericina pode ser usada em combinação com maltose (por exemplo, maltose 50 a 200 mM) e/ou uma concentração adequada de DMSO como discutido acima. Por exemplo, o meio de criopreservação pode conter cerca de 1% de sericina, 100 mM de maltose e 10% de DMSO.

[087] Existem várias soluções de criopreservação disponíveis comercialmente, por exemplo: FM-1 (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd, Tóquio, Japão), a série de crioprotetores do banco de células (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd., Fukushima, Japão); CryoStor (Stem Cell Technologies); meio de criopreservação Synth-a-Freeze (Thermo Fisher Scientific) e meio de congelamento MesenCult™-ACF (Stem Cell Technologies).

[088] A série de crioprotetores do banco de células permite uma rápida criopreservação celular a -80 ºC e seu uso está associado a uma melhor sobrevida após o congelamento e descongelamento. Os bancos de células contendo -soro 1 e 1+ podem ser usados para criopreservação de quase todas as células de mamíferos. Além disso, o banco de células 2 do tipo não- sérico permite a criopreservação de células em condições de cultura livre de soro. STEMCELLBANKER (banco de células 3), por outro lado, é uma solução de criopreservação celular quimicamente definida, isenta de xeno (ou seja, não contém produtos de origem animal não humanos) e otimiza o desempenho de preservação das células-tronco, como células-tronco somáticas e pluripotentes induzidas.

[089] A linha CryoStor® (BioLife Solutions, Inc.) é um meio de criopreservação definido sem soro, sem componentes animais e contendo várias concentrações de DMSO (CS10 10% de DMSO; CS5 5% de DMSO; CS2 2% de DMSO). CryoStor® CS10 tem sido utilizado para a criopreservação de MSCs (incluindo ASCs), caule embrionário (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). O meio de criopreservação Synth-a-Freeze (Thermo Fisher Scientific) tem sido usado para criopreservar células-tronco pluripotentes induzidas (iPS).

[090] Os meios de criopreservação específicos para células também estão disponíveis, como mFreSR™ e FreSR™- S.

[091] O meio de criopreservação para células ES e iPS, meio de congelamento MesenCult™-ACF para MSCs e meio de congelamento de progenitor neural STEMdiff™ para células progenitoras neurais derivadas de células ES/iPS. Por exemplo, as MSCs podem ser criopreservadas em meio de congelamento MesenCult™-ACF (Stem Cell Technologies), que pode ser usado após a cultura de MSC em meio MesenCult™-ACF Plus ou MesenCult™ (Stem Cell Technologies) para criopreservar MSCs.

[092] Meio de criopreservação exemplificador e crioprotetores usados para vários tipos de célula-tronco são mostrados na tabela abaixo:

Meio de Tipo de célula- Protocolo de criopreservação Referência tronco congelamento ou crioprotetor usado 20% de DMSO, 20% de etileno glicol (EG) e Li et al. 0,5 mol/l de Fertil Vitrificação sacarose (após Steril. Células-tronco equilíbrio a uma (2010) 93(3): embrionárias concentração 999 humanas inferior de DMSO e EG) Ha et al. Congelamento 5% de DMSO, 10% Hum. Reprod. lento a -80 ºC de EG e 50% de (2005) 20: a 1 ºC/min FBS 1779 a 1785 Carvalho et Meio de cultura Congelamento al. suplementado com lento a -80 ºC Transplant 10% de FCS e 5% a 1 ºC/min Proc. (2008) de DMSO 40: 839 a 841 Soluções parentais (por Pal et al. J exemplo, solução Congelamento Tissue Eng. salina, lento a -80 ºC Regen. Med. Plasmalyte A) a 1 ºC/min (2008) 2: 436 suplementado com a 444 5% de HSA e 10% de DMSO Células-tronco mesenquimais Haack- (derivadas da sørensen et medula óssea) al. Methods Congelamento in Molecular lento a -80 ºC 5% de DMSO Biology, a 1 ºC/min Humana Press, Totowa, NJ, 2011, páginas 161 a 174. Xu et al. J. Congelamento Tissue Eng. lento a -80 ºC 10% de DMSO Regen. Med. 8 a 1 ºC/min (2014) 664 a

672. 4 ºC por 10 Banco de células Kotobuki et

Meio de Tipo de célula- Protocolo de criopreservação Referência tronco congelamento ou crioprotetor usado min; -30 ºC por (à base de DMSO al. Tissue 1 h; -80 ºC por comercial) Eng. 11 2 a 3 h (2005) 663 a

673. Moon et al. 40% de EG, 18% Hum de Ficoll 70 e Vitrificação Reprod.(2008) 0,3 M de 23: 1760 a sacarose 1770 Células-tronco mesenquimais Não controlado (derivadas de (-20 ºC por 20 DMSO ou glicerol Janz et al. amnião humano) min; -80 ºC por (5 ou 10%); J. Biomed. 12 a 16 h) ou sacarose (30 ou Biotechnol. controlado (1 60 mM); trealose (2012) ºC/min a -60 (60 ou 100 mM) 649353. ºC; 3 ºC/min a -100 ºC) Todorov et Células-tronco 20% de DMSO, 20% al. Cell mesenquimais Vitrificação de EG, 0,5 M de Biol. Int. 34 (fígado fetal sacarose (2010) 455 a humano)

462. Células-tronco Barcia et al. mesenquimais Congelamento Cytotherapy, (derivadas de 10% de DMSO, 90% lento a -150 ºC (2017); tecido de de FBS a 1 ºC/min 19(3): 360 a cordão 370 umbilical) Liu et al. Congelamento Cryobiology 10% de DMSO lento (2008) 57(1): 18-24 Células-tronco 80% de FCS ou Congelamento mesenquimais soro humano e lento (derivadas de 10% de DMSO Thirumala et adipose) al. Stem Congelamento 10% de PVP e 10% Cells Dev. lento de soro humano (2010) 19(4): 1% de metil 513-522 Congelamento celulose e 10% lento de DMSO

Meio de Tipo de célula- Protocolo de criopreservação Referência tronco congelamento ou crioprotetor usado Miyamoto et 10% de DMSO, 1% al. Cell Congelamento de sericina e Transplant. lento 0,1 mol/l de (2012) 21(2- maltose 3): 617 a 622 De Rosa et al. Tissue -20 ºC por 30 4% de DMSO, 6% Eng. Part C min; -80 ºC por de trealose Methods 15 1 h (2009) 660 a

667. 4 ºC por 1 h; - Ding et al. Células-tronco 20 ºC por 2 h; 10% de DMSO ou J. Cell. mesenquimais -80 ºC de um 10% de glicerol Physiol. 223 (dentes dia para o ou 10% de EG (2010) 415 a humanos) outro 422. Células-tronco ~1 ºC/min em Woodset al. 0,5/1/1,5 M de mesenquimais recipiente de Cryobiology EG ou propileno (polpa dentária congelamento a 59 (2009) 150 glicol ou DMSO humana) -85 ºC por 24 h a 157. Berz et al. Congelamento Células-tronco Am J Hematol. lento a -80 ºC 10% de DMSO hematopoiéticas (2007) 82: a 1 ºC/min 463 a 472

[093] Mais detalhes sobre a criopreservação de MSCs são fornecidos, por exemplo, Marquez-Curtis et al. (Cryobiology (2015) 71(2): 181 a 197) e Francois et al. (Cytotherapy (2012) 14(2): 147 a 152).

PROTOCOLO DE CONGELAMENTO E CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO

[094] A taxa de congelamento deve ser rápida o suficiente para evitar desequilíbrios de soluto e eletrólito que causam desidratação e dano celular, e lenta o suficiente para evitar a formação de cristal de gelo extracelular e intracelular. Os crioprotetores reduzem o ponto de congelamento do meio, portanto a mistura de células, e meio de criopreservação contendo um crioprotetor, é um sistema eutético, pois o ponto de congelamento combinado é inferior ao dos componentes individuais. Durante o processo de congelamento, os fluidos se movem de baixas concentrações de soluto em células não congeladas para meio parcialmente congelado, enquanto a membrana plasmática impede a entrada de cristais de gelo extracelulares. O congelamento lento permite que os fluidos saiam das células a uma taxa que resulta em pressão osmótica equilibrada entre a célula e o meio no momento em que o meio congela. Se a taxa for muito lenta, as células são fatalmente desidratadas ou suas membranas plasmáticas são irreversivelmente danificadas. Se a taxa for muito alta, há migração de fluido insuficiente e as células retêm altos níveis de água congelável durante o processo de criopreservação, o que resulta em dano letal do gelo intracelular.

[095] Um congelador mecânico ou de taxa controlada pode ser usado para congelar a população de células- tronco nos métodos aqui descritos. Um congelador de taxa controlada pode ser programado para resfriar as células a cerca de -80 ºC a uma taxa específica. Uma taxa de congelamento típica para criopreservação da maioria das células (incluindo MSCs) a -80 ºC é -1 ºC/minuto. Essa taxa de congelamento pode ser obtida isolando a população de células-tronco antes de colocá-los em um congelador mecânico de -80 ºC, usando, por exemplo, um recipiente de espuma de polietileno de célula fechada (por exemplo, CoolCell®; BioCision), um recipiente de isopor ou um recipiente cheio de isopropanol (IPA) (por exemplo, Mr. Frosty™ (Thermo Scientific)). CoolCell® e Mr.

Frosty™ têm uma taxa de congelamento declarada de -1 ºC/minuto. O protocolo de congelamento pode exigir otimização para um determinado tipo de célula ou linha, no entanto, para atingir a viabilidade máxima e manutenção da função após o descongelamento. Nos métodos aqui descritos, a (s) etapa (s) de congelamento (s) pode (m) ser realizada (s) a uma taxa na faixa de cerca de -0,5 a cerca de -10 ºC/minuto, de preferência cerca de -3 a cerca de -5 ºC/minuto, por exemplo, cerca de -1, -2, -3, -4, -5 ou -10 ºC/minuto. A temperatura de congelamento final pode estar entre cerca de -70 ºC a cerca de -130 ºC. Assim, nos métodos divulgados, a etapa de congelamento (s) pode compreender a redução da temperatura para entre -70 ºC e -130 ºC a uma taxa entre cerca de -0,5 a cerca de -10 ºC/minuto. A temperatura pode ser reduzida de +4 ºC para entre -100 a -180 ºC em 10 a 60 min.

[096] A população de células-tronco pode ser congelada em qualquer densidade celular. Uma densidade celular preferida da população de células-tronco congelada é uma faixa de cerca de 1 a cerca de 50 milhões de células/ml, de preferência cerca de 25 milhões de células/ml.

[097] Após o congelamento, a população congelada de células pode ser armazenada em nitrogênio líquido a -196 ºC até que seja necessária. Os processos metabólicos termicamente dependentes não ocorrem tipicamente abaixo de -100 ºC, então células-tronco estão em estase metabólica em nitrogênio líquido. Para temperaturas acima de -100 ºC, onde as tensões mecânicas de baixa temperatura são menos severas, uma variedade de recipientes pode ser usada. No entanto, ao armazenar material em temperaturas de nitrogênio líquido, recipientes especificamente projetados para resistir a temperaturas criogênicas (ou seja, "criotubos") devem ser usados. Uma variedade de recipientes especificamente projetados para uso criogênico está disponível comercialmente, incluindo criotubos de plástico (por exemplo, com tampas de rosca) ou ampolas de vidro (que podem ser seladas à chama). Os tamanhos comumente usados são criotubos de 1,2, 2,0, 4, 5, 10 e 15 ml (ver, por exemplo, frascos Nalgene® e TruCool®). Geralmente, 0,5 a 1,0 ml da suspensão de células é colocado em um frasco de 1,2 ou 2,0 ml. Vários tamanhos e tipos de recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido estão disponíveis comercialmente (consulte, por exemplo, os sistemas Thermo Scientific™ Locator™ Plus e os sistemas de armazenamento criogênico CryoExtra™ High-Efficiency).

[098] Em uma modalidade preferencial, a população de células (por exemplo, ASCs) são congeladas em um meio de criopreservação (por exemplo, 10% de DMSO em FBS) em um ou mais criotubo a -80 ºC e, em seguida, transferidas para um recipiente de bloco de nitrogênio líquido.

[099] Os métodos de criopreservação de célula- tronco aqui descritos podem incluir o congelamento de uma população de células-tronco, como ASCs, em uma pluralidade de criotubos. A população de células-tronco em cada uma da pluralidade de criotubos pode ser idêntica, ou seja, alíquotas de uma única população de células-tronco obtidas de qualquer um dos métodos aqui divulgados. Em alguns casos, o método pode compreender ainda a repetição das etapas de qualquer um dos métodos de criopreservação de célula-tronco aqui descritos para uma pluralidade de populações de células-tronco. As etapas repetidas podem ser realizadas em série, ou seja, na sequência do método etapas anterior. Em alternativa, as etapas repetidas podem ser efetuadas em paralelo, ou seja, as etapas de método são efetuadas para a pluralidade de populações de células- tronco ao mesmo tempo.

Cada repetição pode compreender as mesmas etapas de método ou pode compreender etapas de método diferentes, conforme descrito neste documento.

A pluralidade de populações de células-tronco pode compreender populações de células-tronco (por exemplo, ASCs) obtidas do mesmo doador (por exemplo, onde diferentes populações são obtidas usando as mesmas etapas de métodos aqui descritas em um procedimento (s) separado (s), ou usando um método (s) diferente (s) conforme descrito (s) aqui). A pluralidade de populações de células- tronco pode ser populações de células-tronco (por exemplo, ASCs) obtidas de diferentes doadores.

Alternativamente, a pluralidade de populações de células-tronco pode compreender diferentes tipos de MSCs.

Por exemplo, a pluralidade de populações de células-tronco pode compreender uma ou mais, duas ou mais, três ou mais das seguintes MSCs: MSCs derivadas de medula óssea, cordão umbilical, polpa dentária, sangue (por exemplo, periférico, cordão ou menstrual), placenta e tecido adiposo.

Esses métodos também podem compreender o congelamento da pluralidade de populações de células-tronco em uma pluralidade de criotubos.

Os métodos podem compreender ainda o armazenamento da pluralidade de criotubos em um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido por pelo menos um mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses ou pelo menos 1 ano.

Os criotubos podem ser congelados a -80 ºC e então transferidos para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido.

A pluralidade de criotubos é mais do que um criotubo, por exemplo, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 50, cerca de 100, cerca de

1000, cerca de 2000 ou cerca de 5000 ou mais criotubos.

[100] Também é fornecido neste documento um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido contendo a pluralidade de frascos de criopreservação obtidos de acordo com os métodos descritos neste documento.

[101] A vitrificação é outra forma de resfriamento que envolve o resfriamento extremamente rápido (> -1000 ºC/segundo) de células imersas em um meio de criopreservação dentro de um recipiente de armazenamento aberto. O congelamento rápido pode ser alcançado mergulhando a amostra em um criotubo em nitrogênio líquido. Esse processo inibe a formação de gelo, embora requeira concentrações potencialmente citotóxicas de crioprotetores e o uso de um recipiente aberto apresenta risco de contaminação. A vitrificação tem sido um sucesso na criopreservação de células- tronco humanas (hESCs). Demonstrou-se que a vitrificação capilar de células-tronco embrionárias humanas em criopreservação de mídia contendo DMSO e etilenoglicol aumenta a sobrevida de células criopreservadas em mais de uma ordem de magnitude em comparação aos métodos de congelamento lento e descongelamento rápido. Resumidamente, colônias de hEScs (100 a 400 células) são colocadas em um meio de criopreservação compreendendo 20% de DMSO, 20% de etilenoglicol e 0,5 M de sacarose, após equilíbrio em uma solução inferior de DMSO e EG. As colônias são colocadas em palhas e mergulhadas em nitrogênio líquido.

PROTOCOLO DE DESCONGELAMENTO

[102] Normalmente, as células são descongeladas à temperatura de crescimento ou próximo da mesma, por exemplo, ~37 ºC. Assim, nos métodos aqui divulgados, a população de células-tronco pode ser descongelada a 37 ºC.

[103] As células passam por uma temperatura de formação de cristais de gelo, -15 ºC a -60 ºC, durante o congelamento e descongelamento. O descongelamento rápido em torno de 90 a 100 ºC/minuto por imersão em um banho de água a 37 ºC é frequentemente empregado para prevenir a formação de cristais de gelo. No entanto, o descongelamento a uma temperatura mais baixa ou a uma taxa mais lenta pode reduzir certos tipos de danos, como o estresse oxidativo detectado por sinalização mediada por adesão, enquanto permite que as membranas selem quaisquer poros formados pela cristalização de gelo. Nos métodos aqui descritos, a população de células-tronco é tipicamente descongelada a 37 ºC. Essa etapa de descongelamento rápido pode ser alcançada mergulhando as células em um criotubo em um banho-maria a 37 ºC. O protocolo de descongelamento pode exigir otimização para um determinado tipo de célula ou linha, no entanto, para atingir a viabilidade máxima e/ou manutenção da função celular.

[104] As células descongeladas podem ser lavadas para remoção do meio de criopreservação, antes do cultivo. Os exemplos de métodos de lavagem discutidos acima (por exemplo, em relação à remoção de NAC e/ou troca de meio) também são adequados para esta finalidade. AVALIAÇÃO PÓS-DESCONGELAMENTO

[105] A avaliação pós-descongelamento da população de células-tronco (por exemplo, para verificar o impacto do pré-tratamento de NAC ou após o descongelamento) pode incluir um ou mais (ou todos) dos seguintes testes: viabilidade celular, morfologia, marcador de superfície celular avaliação, ensaios de diferenciação e análise de outras propriedades funcionais. Avaliações exemplificativas são fornecidas nos exemplos.

VIABILIDADE

[106] Tal como aqui utilizado, o termo "viabilidade" ou "viável" refere-se a uma célula que é capaz de crescimento e desenvolvimento normal após ter sido criopreservada e descongelada. Assim, a avaliação da viabilidade da população de células-tronco em relação a uma população de células-tronco semelhante que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, após o descongelamento com NAC, ou ambos, pode ser usada para confirmar que as células são não afetado negativamente (ou seja, diminuição da viabilidade) como resultado do pré-tratamento e/ou após o descongelamento com NAC (pré-tratamento e/ou após o descongelamento com NAC pode, no entanto, ter um efeito positivo no número de células viáveis, taxa de crescimento e taxa de recuperação, etc., conforme discutido mais abaixo).

[107] Exemplos de experimentos que podem ser usados nos métodos divulgados para determinar o nível de viabilidade celular incluem coloração com azul de tripano e ensaios MTS, conforme discutido nos exemplos. O ensaio MTS é uma medida da viabilidade funcional (ou seja, metabolismo), enquanto o ensaio do azul de tripano mede a viabilidade estrutural (ou seja, integridade da membrana). Outros métodos conhecidos pelos versados na técnica, tais como ensaios de azul de alamar, também podem ser usados para medições de viabilidade celular.

[108] O ensaio MTS é um método colorimétrico para determinar o número de células viáveis em ensaios de proliferação ou citotoxicidade. Por exemplo, o reagente

CellTiter 96® AQueous One Solution contém um novo composto de tetrazólio[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, sal interno; MTS(a)] e um reagente de acoplamento de elétrons (etossulfato de fenazina; PES). PES tem estabilidade química melhorada, o que permite que seja combinado com MTS para formar uma solução estável. Esse formato conveniente de “One Solution” é uma melhoria em relação à primeira versão do Ensaio CellTiter 96® AQueous, onde o metossulfato de fenazina (PMS) é usado como o reagente de acoplamento de elétrons, e a solução PMS e a solução MTS são fornecidas separadamente. O composto de tetrazólio MTS (reagente de Owen) é biorreduzido por células metabolicamente ativas em um produto formazano colorido que é solúvel em meio de cultura de tecido. Os ensaios podem ser realizados adicionando uma pequena quantidade do reagente CellTiter 96® AQueous One Solution diretamente aos poços de cultura, incubando por 1 a 4 horas e, em seguida, registrando a absorbância a 490 nm com um leitor de placa de 96 poços.

CAPACIDADE DE DIFERENCIAÇÃO

[109] Após a criopreservação, para que as células-tronco sejam aplicáveis para uma variedade de aplicações terapêuticas, as células devem permanecer viáveis, ser mantidas em um estado indiferenciado e manter sua capacidade de diferenciação. Qualquer diferenciação limitará seu uso em aplicações a jusante. Assim, a avaliação da capacidade de diferenciação da população de células-tronco em relação a uma população de células-tronco semelhante que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, após o descongelamento com NAC, ou ambos, pode ser usada para confirmar que a identidade das células não é afetada pelo pré-tratamento e/ou após o descongelamento do tratamento com NAC.

[110] Aqui, o termo “diferenciação” ou “diferenciar” se refere a um processo durante o qual células- tronco pluripotentes ou multipotentes (não especializadas) se transformam em um tipo de célula mais especializado.

[111] Uma forma de determinar o potencial de diferenciação ou pluripotência em células-tronco embrionárias ou induzidas é medir o nível de marcadores de superfície como OCT4 e SSEA-4, por exemplo, por microscopia de imunofluorescência (Xu, C., et al., (2001) Nat Biotechnol. 19: 971 a 974). OCT4 e SSEA-4 são marcadores de células-tronco indiferenciadas (ou seja, que têm o potencial de se diferenciar de outras linhagens). O OCT4 é um fator de transcrição do gene embrionário que desempenha um papel no controle da pluripotência do desenvolvimento, de modo que quando a atividade do gene OCT4 é reprimida na diferenciação das células-tronco pluripotentes, ocorre a diferenciação. A expressão de SSEA4 também pode ser determinada por citometria de fluxo.

[112] As MSCs têm a capacidade de se diferenciar em diferentes tecidos, como osso, cartilagem, tendão e tecido adiposo. São consideradas células progenitoras adultas multipotentes, pois seu potencial de diferenciação é mais restrito que o das células-tronco pluripotentes/totipotentes, como as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas, que têm potencial para se diferenciar em todos os tecidos adultos (Jiang et al., (2002) Nature 418 (6893): 41 a 49). Métodos para testar o potencial diferencial de MSCs em diferentes tecidos são conhecidos na técnica anterior (por exemplo, Guilak et al., J Cell Physiol. (2006) 206(1): 229 a

237; Zuk et al., Mol Biol Cell. (2002) 13(12): 4279-4295). MORFOLOGIA E/OU TAMANHO CELULAR

[113] O fenótipo da população de células-tronco pode ser avaliado pela morfologia e/ou tamanho. O termo "fenótipo" refere-se às características observáveis de uma célula, como tamanho, morfologia, expressão de proteínas, incluindo marcadores de superfície celular, etc. Assim, avaliando a morfologia celular e/ou tamanho da população de células-tronco em relação a uma Povoação de células-tronco semelhante que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, após o descongelamento com NAC, ou ambos, pode ser usada para confirmar que a identidade das células não é afetada pelo pré- tratamento e/ou após o descongelamento com NAC.

[114] A morfologia celular e/ou tamanho podem ser visualizados e fotografados usando um microscópio de cultura invertida.

[115] iPSC e ESC humanas compartilham características semelhantes, incluindo morfologia, proliferação, marcadores de superfície, expressão gênica, capacidade de diferenciação in vitro e formação de teratoma (ver, por exemplo, Thomson et al. Science (1998) 282(5391): 1145 a 1147; Xu et al. Nat. Biotechnol. (2001) 19(10): 971 a 974; Takahashi et al. Cell (2007) 131(5): 861 a 872; Courtot et al. Biores. Open Access (2014) 3(5): 206 a 216; Kato et al. Scientific Reports (2016) 6: 34009).

[116] Dependendo do tecido de origem, as MSCs são morfologicamente e imunofenotipicamente semelhantes, mas não idênticas (Colter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA (2000) 97(7): 3.213 a 3.218; Kern et al., Stem Cells (2006) 24(5): 1294-1301; Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792 a

806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221 a 228; Harris et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2013) 8(5): 394 a 399; Li et al., Ann N Y Acad Sci. (2016) 1370(1): 109 a 118).

CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES DE SUPERFÍCIE CELULAR

[117] A caracterização fenotípica de uma população célula-tronco pode ser realizada através da análise de um ou mais marcadores de superfície celular. Assim, a avaliação da expressão de um ou mais marcadores de superfície celular na população de células-tronco em relação a uma população de células-tronco semelhante que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, após o descongelamento com NAC, ou ambos, pode ser usado para confirmar que a identidade das células não é afetada pelo pré-tratamento e/ou após o descongelamento do tratamento com NAC.

[118] A presença ou ausência de ligação de anticorpo a um marcador de superfície celular de interesse pode ser determinada por diferentes métodos que incluem, mas não estão limitados à microscopia de imunofluorescência, radiografia e citometria de fluxo. A determinação do perfil de expressão de marcadores de superfície por anticorpos pode ser direta, usando um anticorpo marcado, ou pode ser indireta, usando um segundo anticorpo marcado contra um anticorpo específico primário para o marcador celular de interesse, alcançando assim a amplificação do sinal. Na citometria de fluxo, ao usar um anticorpo marcado, o nível de fluorocromo pode ser correlacionado com a quantidade de marcador de superfície celular ligado especificamente ao anticorpo. A expressão diferencial de um ou mais marcadores de superfície celular em uma população célula-tronco permite a identificação e/ou isolamento dessa população, por exemplo, utilizando FACS (Classificação Celular Ativada por Fluorescência).

[119] Por exemplo, de acordo com a International Society for Cellular Therapy, os critérios mínimos para definir MSCs podem ser a expressão de CD105, CD73, CD44 e CD90 e a falta de expressão de CD45, CD14 ou CD11b, CD79alpha ou CD19 e HLA classe II (Dominici et al., Cytotherapy. (2006) 8(4): 315 a 317). Exemplos de anticorpos que podem ser usados para avaliar os marcadores CD73, CD90 e CD105 são fornecidos no Exemplo 5. Os anticorpos que podem ser usados para avaliar os outros marcadores estão disponíveis comercialmente, por exemplo, de Beckton Dickinson, cujos exemplos estão listados abaixo. Fonte de Marcador Fluorocromo Anticorpos IgG1k de CD45 FITC camundongo IgG1 de CD34 APC camundongo IgG2ak de CD14 APC camundongo IgG1k de CD11b PE camundongo IgG1k de CD79alpha PE camundongo IgG1 de CD19 APC camundongo IgG1 de HLA classe II APC camundongo

[120] Por exemplo, a avaliação pós- descongelamento de uma população de ASCs pode ser realizada verificando a expressão de CD29, CD73, CD90 e CD105 (por exemplo, como no Exemplo 5). Tal análise pode ser usada para confirmar que a identidade das células não é afetada pelo pré- tratamento ou tratamento pós-descongelamento com NAC.

[121] Os marcadores de superfície celular associados a um determinado tipo de célula-tronco são conhecidos e exemplificados a seguir.

OUTRAS PROPRIEDADES FUNCIONAIS

[122] A avaliação de outras propriedades funcionais da população de células tronco (em relação a uma população de células tronco semelhante que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, tratamento pós-descongelamento com NAC ou ambos) pode ser usada para confirmar que a identidade das células não é afetada pelo pré-tratamento e/ou tratamento pós-descongelamento com NAC. Por exemplo, para ASCs, outras propriedades funcionais que podem ser avaliadas incluem: a capacidade das ASCs para inibir a proliferação de linfócitos estimulados (por exemplo, como no Exemplo 6); a capacidade imunomoduladora de ASCs, por exemplo, na diferenciação de monócitos (por exemplo, como no Exemplo 7); a capacidade das ASCs em modular a fagocitose, por exemplo, de partículas de Staphylococcus aureus, por células dendríticas maduras (mDCs); a regulação positiva mediada por ASC de um ou ambos de CD206 e CD163 na superfície da célula de mDCs (por exemplo, como no Exemplo 9); e/ou a modulação mediada por ASC de mDCs CD14- CD1a+ para mDCs CD14+CD1a- (por exemplo, como no Exemplo 9).

[123] Assim, em qualquer um dos métodos aqui divulgados, a população descongelada de ASCs pode ser avaliada para um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou todas as sete das seguintes propriedades: (1) viabilidade celular; (2) expressão de marcadores de superfície celular CD29, CD73, CD90 e CD105; (3) capacidade de inibir a proliferação de linfócitos estimulados; (4) efeito imunomodulador na diferenciação de monócitos; (5) capacidade de modular a fagocitose por células dendríticas maduras, por exemplo, de partículas de Staphylococcus aureus; (6) capacidade de regulação positiva de um ou ambos de CD206 e CD163 na superfície celular de mDCs; e (7) modulação de mDCs CD14-CD1a+ para mDCs CD14+CD1a-. Para cada propriedade, a avaliação pode ser realizada em relação a uma população semelhante de ASCs que não foi submetida a pré-tratamento com NAC, tratamento pós-descongelamento com NAC ou ambos, permitindo a confirmação de que a identidade das células não é afetada e/ou que a viabilidade celular não é afetada negativamente (ou seja, viabilidade celular diminuída) pelo pré-tratamento e/ou tratamento pós-descongelamento com NAC. Da mesma forma, também é divulgada uma população de ASCs obtida por qualquer um dos métodos descritos neste documento que possui um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou todas as sete dessas propriedades (por exemplo, conforme avaliado em relação a uma população semelhante de ASCs que não foi submetida a pré- tratamento com NAC, tratamento pós-descongelamento com NAC ou ambos, conforme discutido acima). TIPOS DE CÉLULAS-TRONCO

[124] A população de células-tronco pode ser uma população de células-tronco pluripotentes ou uma população de células-tronco mesenquimais (MSCs), por exemplo, derivadas da medula óssea, tecido do cordão umbilical, derivadas do sangue (incluindo derivadas do sangue do cordão), menstruais, MSCs derivadas da polpa dentária, derivadas da placenta ou derivadas do tecido adiposo (Huang et al., J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792 a 806; Carvalho et al., Curr. Stem Cell Res. Ther. (2011) 6(3): 221-228; Harris et al., Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394 a 399; Li et al., Ann. N Y Acad. Sci. (2016) 1370(1): 109 a 118). Em uma modalidade preferencial, as células-tronco são células humanas (por exemplo, ASCs humanas). Em modalidades preferenciais da invenção, a população de células-tronco são células-tronco estromais derivadas de adipose (ASCs). As ASCs usadas nos métodos de criopreservação aqui descritos podem ser uma população de ASCs expandida.

[125] Métodos de produção e cultivo de populações de células-tronco de acordo com a invenção são bem conhecidos.

[126] A população de células-tronco pode ser substancialmente pura. O termo “substancialmente pura” em relação a uma população de células-tronco (por exemplo, uma população de MSC como uma população de ASCs) se refere a uma população de células-tronco que é pelo menos cerca de 75%, tipicamente pelo menos cerca de 85%, mais tipicamente pelo menos cerca de 90%, e mais tipicamente pelo menos cerca de 95% homogênea. A homogeneidade pode ser avaliada pela morfologia e/ou pelo perfil do marcador de superfície celular. As técnicas para avaliar a morfologia e o perfil do marcador de superfície celular são aqui divulgadas. CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES

[127] Existem duas fontes de células-tronco pluripotentes. Em primeiro lugar, células-tronco embrionárias (ESCs) são derivadas da massa celular interna de um blastocisto pré-implantação e a pluripotência é controlada por uma rede regulatória intrínseca de fatores de transcrição centrais,

fator de transcrição de ligação a octâmero 4 (OCT4), região determinante de sexo Y-box 2 (SOX2) e Nanog homeobox (NANOG). Em uma modalidade, uma linhagem de célula-tronco embrionária é usada. Uma linha de célula-tronco embrionária compreende células em divisão constante produzidas a partir de um grupo de células parentais que foram colhidas de um único embrião. A linha de célula-tronco embrionária utilizada na presente invenção não é obtida pela destruição de um embrião humano. As linhas de célula-tronco embrionárias estão disponíveis comercialmente, por exemplo, da ATCC. As células-tronco embrionárias da linha de célula-tronco embrionária não perdem sua pluripotência enquanto estão em cultura. Em particular, as células-tronco embrionárias da linha de célula-tronco embrionária não se diferenciam enquanto estão em cultura. Em segundo lugar, as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são derivadas pela expressão ectópica ou elevada de quatro fatores de transcrição, OCT4, SOX2, fator 4 semelhante a Kruppel (KLF4) e proto-oncogene MYC (C-MYC) essencial para a indução de pluripotência em células somáticas.

[128] As técnicas para isolar culturas estáveis (indiferenciadas) de células-tronco embrionárias, como células-tronco embrionárias humanas, estão bem estabelecidas (por exemplo, US 5.843.780; Thomson et al., Science (1998) 282: 1145 a 1147; Turksen & Troy (2006) Human Embryonic Stem Cells. In: Turksen K. (eds) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in Molecular Biology, volume 331, Humana Press; Sevilla et al., Stem Cell Research (2017) 25: 217-220; e Mitalipova & Palmarini (2006) Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells. In: Turksen K. (eds) Human Embryonic Stem Cell Protocols. Methods in

Molecular Biology, volume 331, Humana Press). Em uma modalidade, o método de obtenção de células-tronco embrionárias não inclui a destruição de um ou mais embriões humanos.

[129] As técnicas de produção de iPSCs estão bem estabelecidas desde sua descoberta em 2007 pelo grupo de Yamanaka (por exemplo, Takahashi et al., Cell (2007) 131(5): 861 a 872). Desde então, novos métodos aprimorados para a geração de iPSC foram desenvolvidos, incluindo metodologias livres de alimentador e não integração e derivação automatizada de alto rendimento (Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885 a 892).

[130] iPSC são caracterizadas pela expressão de uma bateria de marcadores de pluripotência: NANOG, SOX2, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, e a falta de marcadores específicos de linhagem. A pluripotência do iPSC é demonstrada por sua capacidade de se diferenciar nas três camadas germinativas no ensaio do corpo embrioide, com análise posterior dos marcadores de diferenciação das três camadas germinativas Tuj1 (marcador ectoderma), SMA (marcador mesoderma) e SOX17 (marcador endoderme) por imuno-histoquímica (Paull et al., Nature Methods (2015) 12(9): 885 a 892.

MSCS

[131] “Células-tronco mesenquimais” (também aqui referidas como “MSCs”) são células estromais multipotentes. Elas são derivadas típicas do tecido conjuntivo e são células não hematopoiéticas. A população de MSCs (de acordo com Dominici et al. 2006 (Cytotherapy 8(4): 315 a 317), pode: (1) aderir ao plástico em condições de cultura padrão (por exemplo, um meio essencial mínimo mais 20% de soro fetal de bovino);

(2) expressam (isto é, maior ou igual a 80% da população de MSCs) CD105, CD90, CD73 e CD44; (3) falta de expressão (por exemplo, menor ou igual a 5% da população de MSC) de CD45, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR (HLA Classe II); (4) ser capaz de se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos.

[132] As MSCs podem ser obtidas usando métodos padrão de, por exemplo, medula óssea, tecido e sangue do cordão umbilical, menstrual, polpa dentária, sangue do cordão umbilical, placentário e tecidos adiposos.

[133] Embora as MSCs obtidas de diferentes tecidos sejam semelhantes, elas apresentam algumas diferenças nas características fenotípicas e funcionais. Por exemplo, os níveis de expressão dos marcadores de superfície celular CD54 e CD106 podem diferir dependendo da fonte/origem das MSCs. Esses podem ser medidos por citometria de fluxo. Os níveis de mRNA de alguns genes, como SOX2, IL1alfa, IL1beta, IL6 e IL8, podem ser expressos diferencialmente por MSCs de diferentes tecidos e podem ser medidos por métodos de rotina. A secreção de IL6 e PGE2 também pode ser diferente entre as MSC de origens diferentes e, portanto, as células podem ter capacidade modulatória diferente (ver, por exemplo, Yang et al. PLoS ONE (2013) 8(3) e59354). MSCS DERIVADAS DE MEDULA ÓSSEA (BMSCS)

[134] As células-tronco mesenquimais de medula óssea (BM-MSCs) são similares a MSCs de outras fontes de tecido. No entanto, elas têm algumas diferenças nas características fenotípicas e funcionais em comparação com MSCs de outras origens de tecido, como MSCs do cordão umbilical, MSCs da placenta, MSCs da polpa dentária e MSCs menstruais. Embora seus critérios mínimos de caracterização sejam comuns, incluindo sua capacidade de aderir ao plástico, marcadores mínimos de identidade de superfície e capacidade de se diferenciar em osso, cartilagem, tendão e tecido adiposo, todos eles têm algumas pequenas diferenças. Essas peculiaridades incluem diferentes níveis de expressão de alguns marcadores de superfície, como CD105, diferentes níveis de fatores solúveis secretados implicados em seu potencial imunomodulador e potencial regenerativo e, em geral, propriedades funcionais ligeiramente diferentes que podem tornar cada fonte ou origem mais adequada para terapêuticas específicas indicações (Miura et al., Int J Hematology (2016) 103(2): 122 a 128; Wuchter et al., Cytotherapy (2015) 17(2): 128-139; Wright et al., Stem Cells (2011) 29(2): 169 a 178).

MSCS DERIVADAS DE CORDÃO UMBILICAL E DERIVADAS DE POLPA DENTÁRIA

[135] Huang et al. (J. Dent. Res. (2009) 88(9): 792 a 806) discute MSCs da polpa dentária e compara suas características com MSCs de outras fontes. Carvalho et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2011) 6(3): 221-228) e Harris et al. (Curr Stem Cell Res Ther. (2013) 8(5): 394 a 399) discutir MSCs derivadas do cordão umbilical, sua caracterização (incluindo fenótipo e secretoma) e suas aplicações.

ASCS

[136] As MSCs derivadas do tecido adiposo (ASCs) são normalmente isoladas do tecido adiposo subcutâneo, o que permite que sejam adquiridas em grande número. As ASCs proliferam rapidamente com uma alta atividade celular, tornando-os uma fonte ideal para a obtenção de MSCs.

[137] Por "tecido adiposo" entende-se qualquer tecido adiposo. O tecido adiposo pode ser tecido adiposo marrom ou branco, derivado do local do tecido adiposo subcutâneo, omental/visceral, mamário, gonadal ou outro local. Normalmente, o tecido adiposo é tecido adiposo branco subcutâneo. Essas células podem compreender uma cultura de células primárias ou uma linha de células imortalizadas. O tecido adiposo pode ser de qualquer organismo com tecido adiposo. Normalmente, o tecido adiposo é de mamífero, mais tipicamente o tecido adiposo é humano. Uma fonte conveniente de tecido adiposo é a cirurgia de lipoaspiração, no entanto, a fonte de tecido adiposo ou o método de isolamento de tecido adiposo não é crítico para a invenção.

[138] A população de células-tronco pode ser uma população de ASCs produzida usando os métodos descritos no Exemplo 1, ou qualquer um dos métodos aqui descritos.

[139] As ASCs preferenciais são células-tronco humanas alogênicas derivadas de tecido adiposo (eASCs humanas) autorizadas no produto “Darvadstrocel” (nome comercial “Alofisel®). Essas ASCs expandidas expressam os marcadores de superfície celular CD29, CD73, CD90 e CD105. As células são capazes de expressar fatores como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento transformador-beta 1 (TGF-β1), interleucina 6 (IL-6), inibidor de metaloproteinase de matriz-1 (TIMP-1) e interferon-gama (IFN-γ) e indoleamina 2,3-dioxigenase induzível (IDO). Assim, a população de ASCs pode ser caracterizada por pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% ou mais expressarem um ou mais dos CD29, CD73, CD90 e/ou CD105. A população de ASCs pode ser caracterizada por pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da população de células expressarem totalmente CD29, CD73, CD90 e CD105. Tipicamente, a população de ASCs pode ser caracterizada por pelo menos cerca de 80% da população de células expressar todos os CD29, CD73, CD90 e CD105.

[140] De acordo com Bourin et al. (Cytotherapy (2013) 15(6): 641 a 648), uma população de ASCs pode ser definida como sendo positiva para expressão de CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, e negativa para expressão de CD31 e CD45. Na população de ASCs, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da população de células pode expressar CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, e menos que cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3% ou cerca de 2% da população de ASCs pode expressar CD31 e CD45. Normalmente, na população de ASCs, pelo menos cerca de 80% da população de células pode expressar CD13, CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105, e menos do que cerca de 5% da população de ASCs pode expressar CD31 e CD45.

[141] As ASCs podem ser aderentes ao plástico sob condições de cultura padrão.

[142] ASC expandida (eASC) exibe uma morfologia semelhante a fibroblastos em cultura. Especificamente, essas células são grandes e morfologicamente caracterizadas por um corpo celular raso com poucas projeções celulares que são longas e finas. O núcleo é grande e redondo com nucléolo proeminente, dando ao núcleo uma aparência clara. A maioria das eASCS exibe esta morfologia fusiforme, mas é comum que algumas das células adquiram morfologias poligonais (Zuk et al. Tissue Eng (2001) 7(2): 211 a 228).

[143] As ASCs podem ser positivas para os marcadores de superfície HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 e CD105. Em algumas modalidades, a população de ASCs pode ser caracterizada por pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da população de ASCs expressarem os marcadores de superfície HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 e CD105. Normalmente, pelo menos cerca de 80% das eASCs expressam os marcadores de superfície HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 e CD105.

[144] As ASCs podem ser negativas para os marcadores de superfície HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 e CD86. Em algumas modalidades, a população de ASCs pode ser caracterizada por menos de cerca de 5% da população de ASCs expressarem os marcadores de superfície HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 e CD86. Mais tipicamente, menos de cerca de 4%, 3% ou 2% da população de ASCs expressa os marcadores de superfície HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 e CD86. Em uma modalidade, menos do que cerca de 1% da população de ASCs expressa os marcadores de superfície HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 e CD86.

[145] Em alguns casos, em uma população de ASCs pelo menos cerca de 80% da população de células expressam todos os CD29, CD73, CD90 e CD105 e menos do que cerca de 5% da população de ASCs expressam os marcadores de superfície HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80 e CD86.

[146] Em algumas modalidades, a população de

ASCs pode expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou sete) de HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 e CD105. Em algumas modalidades, as eASCs não podem expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou oito) de HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80. Em algumas modalidades, as eASCs expressam quatro ou mais de HLA I, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 e CD105 e não expressam quatro ou mais de HLAII, CD11b, CD11c, CD14, CD45, CD31, CD80.

[147] A expressão de CD34 pode ser negativa ou baixa, por exemplo, expressa por 0 a cerca de 30% da população de ASCs. Assim, em alguns casos, as ASCs conforme descrito acima podem expressar CD34 em níveis baixos, por exemplo, em cerca de 5 a cerca de 30% da população. Alternativamente, em outros casos, as ASCs conforme descrito não expressam CD34, por exemplo, menos do que cerca de 5% da população de ASCs expressa CD34.

[148] Em algumas modalidades, a população de ASCs (por exemplo, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95% da população de células) pode expressar uma ou mais (por exemplo, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 13)) dos marcadores CD9, CD10, CD13, CD29, CD44, CD49A, CD51, CD54, CD55, CD58, CD59, CD90 e CD105. Por exemplo, as ASCs podem expressar um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD29, CD59, CD90 e CD105, por exemplo, CD59 e/ou CD90.

[149] Em algumas modalidades, a população de ASCs não pode expressar um ou mais (por exemplo, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, ou dez ou mais (por exemplo, até 15)) dos marcadores Fator VIII, alfa-actina, desmina, S-100, queratina, CD11b, CD11c, CD14, CD45, HLAII, CD31, CD45, STRO-1 e CD133, por exemplo, as ASCs não expressam um ou mais (por exemplo, dois, três ou todos) dos marcadores CD45, CD31 e CD14, por exemplo, CD31 e/ou CD45.

[150] Em certas modalidades, as ASCs conforme descrito acima (i) não expressam marcadores específicos para células de apresentação de antígeno (APCs); (ii) não expressam IDO constitutivamente; e/ou (iii) não expressam significativamente MHC II constitutivamente. Normalmente, a expressão de IDO ou MHC II pode ser induzida por estimulação com IFN-γ.

[151] Em certas modalidades, as ASCs como descrito acima não expressam Oct4.

MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE POPULAÇÕES DE ASCS

[152] Métodos para o isolamento e cultura de ASCs para fornecer eASCs e população de células-tronco da invenção, e composições compreendendo populações de células-tronco da invenção são conhecidos na técnica. ASCs são tipicamente preparadas a partir da fração estromal de tecido adiposo e são selecionadas por aderência a uma superfície adequada, por exemplo, plástico. Assim, os métodos de criopreservação de célula-tronco aqui divulgados podem compreender uma etapa inicial (antes da etapa (a) de qualquer um dos métodos) de: (i) isolar uma população de ASCs da fração estromal de tecido adiposo obtido de um paciente, e (ii) cultivar a população de

ASCs. As ASCs podem ser opcionalmente selecionadas na etapa (i) para aderência a uma superfície adequada, por exemplo, plástico. Opcionalmente, o fenótipo dos ASCs pode ser avaliado durante e/ou subsequente à etapa de cultivo (ii).

[153] As ASCs podem ser obtidas por qualquer meio padrão na técnica. Normalmente, as ditas células são obtidas dissociando as células do tecido de origem (por exemplo, lipoaspirato ou tecido adiposo), normalmente tratando o tecido com uma enzima digestiva, como a colagenase. A matéria do tecido digerido é então tipicamente filtrada através de um filtro de cerca de 20 mícrons a 1 mm. As células são então isoladas (normalmente por centrifugação) e cultivadas em uma superfície aderente (normalmente placas de cultura de tecidos ou frascos). Tais métodos são conhecidos na técnica e, por exemplo, como divulgados no documento de patente nº US 6777231. De acordo com essa metodologia, os lipoaspirados são obtidos do tecido adiposo e as células derivadas dos mesmos. No decurso desta metodologia, as células podem ser lavadas para remover resíduos contaminantes e glóbulos vermelhos, de preferência com PBS. As células são digeridas com colagenase (por exemplo, a 37 ºC por 30 minutos, 0,075% de colagenase; Tipo I, Invitrogen, Carlsbad, CA) em PBS. Para eliminar os glóbulos vermelhos remanescentes, a amostra digerida pode ser lavada (por exemplo, com 10% de soro fetal bovino), tratada com 160 mmol/l de NH4Cl e finalmente suspensa em meio DMEM completo (DMEM contendo 10% de FBS, 2 mmol/l glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina). As células podem ser filtradas através de uma malha de náilon de 40 µm.

[154] As ASCs humanas cultivadas de acordo com certas modalidades da invenção são descritas em DelaRosa et al. (Tissue Eng Part A. (2009) 15(10): 2795 a 2806), Lopez- Santalla et al. (Stem cells (2015) 33: 3493 a 3503). Em uma modalidade (como descrito em Lopez-Santalla et al. 2015), aspirados de tecido adiposo humano de doadores saudáveis foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e digeridos com colagenase a 0,075% (Tipo I; Invitrogen). A amostra digerida foi lavada com 10% de soro fetal bovino (FBS), tratada com 160 mM de NH4Cl para eliminar os eritrócitos restantes e suspensa em meio de cultura (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS). As células foram semeadas (2 a 3 x 104 células/cm2) em frascos de cultura de tecidos e cultivadas (37 ºC, 5% de CO2) com mudança do meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células foram transferidas para um novo frasco (103 células/cm2) quando atingiram 90% de confluência. As células foram expandidas até a duplicação 12 a 14 e congeladas. Os experimentos foram realizados com células de dois doadores adultos do sexo masculino e dois doadores do sexo feminino em duplicações populacionais 12 a 14. As ASCs foram descongeladas dos mesmos criobancos e semeadas antes de cada experimento. As ASCs foram definidas de acordo com os critérios da International Society for Cellular Therapy: ser positivo para HLA-I, CD73, CD90 e CD105 e negativo para CD11b, CD14, CD31, CD34 e CD45.

[155] Em outra modalidade (como descrito por DelaRosa et al. 2009), lipoaspirados obtidos de tecido adiposo humano de doadores adultos saudáveis foram lavados duas vezes com PBS e digeridos a 37 ºC por 30 minutos com 18 U/ml de colagenase tipo I em PBS. Uma unidade de colagenase libera 1 mM de equivalentes de L-leucina do colágeno em 5 horas a 37 ºC, pH 7,5 (Invitrogen, Carlsbad, CA). A amostra digerida foi lavada com 10% de soro fetal bovino (FBS), tratada com 160 mM de NH4Cl, suspensa em meio de cultura (DMEM contendo 10% de FBS) e filtrada através de uma malha de náilon de 40 mm. As células foram semeadas (2 a 3x104 células/cm2) em frascos de cultura de tecidos e expandidas a 37 ºC e 5% de CO2, mudando o meio de cultura a cada 7 dias. As células foram passadas para um novo frasco de cultura quando as culturas atingiram 90% de confluência. As células foram fenotipicamente caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar em linhagens condro, osteo e adipogênicas. Além disso, as hASCs foram verificadas por coloração com marcadores de superfície específicos. As hASCs foram positivas para HLA-I, CD90 e CD105 e negativas para HLA- II, CD40, CD80, CD86 e CD34. Um pool de seis doadores saudáveis (três homens e três mulheres, com idades entre 35 e 47) foi usado no estudo. As células foram usadas nas passagens 4 a 6.

[156] As ASCs são cultivadas em um recipiente de cultura de tecidos adequado, compreendendo uma superfície adequada para a aderência de ASCs, por exemplo, plástico. As células não aderentes são removidas por exemplo, por lavagem em um tampão adequado, para fornecer uma população isolada de células estromais aderentes (por exemplo, ASC). As células isoladas desta forma podem ser semeadas (de preferência 2 a 3x104 células/cm2) em frascos de cultura de tecidos e expandidas a 37 ºC e 5% de CO2, mudando o meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células são preferencialmente removidas da superfície aderente (por exemplo, por meio de tripsina) e passadas ("passadas") para um novo frasco de cultura (1000 células/cm2) quando as culturas atingem cerca de 90% de confluência.

[157] As ASCs podem ser cultivadas por pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20 dias, pelo menos cerca de 25 dias ou pelo menos cerca de 30 dias. Normalmente, a expansão das células em cultura melhora a homogeneidade do fenótipo celular na população, de modo que uma população substancialmente pura seja obtida.

[158] Em algumas modalidades, as ASCs são expandidas em cultura por pelo menos três passagens de cultura ou "passadas pelo menos três vezes”. Em outras modalidades, as células são passadas pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes ou pelo menos dez vezes. É preferível que as células sejam passadas mais de três vezes para melhorar a homogeneidade do fenótipo celular na população de células. Na verdade, as células podem ser expandidas em cultura indefinidamente, desde que a homogeneidade do fenótipo celular seja melhorada e a capacidade diferencial seja mantida.

[159] Em algumas modalidades, as ASC são multiplicadas em cultura por pelo menos três duplicações de população, por exemplo, as células são expandidas em cultura por pelo menos quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 15 ou 20 duplicações de população. Em algumas modalidades, as células são expandidas em cultura para menos de sete, oito, nove, dez, 15 ou 20 duplicações de população. Em certas modalidades, as células são expandidas em cultura para cerca de 5 a 10 duplicações da população. Em certas modalidades, as células são expandidas em cultura para cerca de 10 a 15 duplicações da população. Em certas modalidades, as células são expandidas em cultura para cerca de 15 a 20 duplicações de população, por exemplo, cerca de 16 duplicações de população.

[160] O isolamento de ASC é preferencialmente realizado em condições estéreis ou GMP.

[161] A população de células-tronco (por exemplo, ASCs) pode ser alogênica, ou seja, não isolada do sujeito no qual a população de células-tronco será administrada como terapia. POPULAÇÕES DE CÉLULAS-TRONCO

[162] O pré-tratamento com NAC, tratamento pós- descongelamento com NAC ou uma combinação de pré-tratamento e tratamento pós-descongelamento com NAC, de acordo com os métodos aqui divulgados, pode resultar em uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou todas as quatro das seguintes propriedades: aumento do número de células viáveis, aumento da taxa de crescimento, aumento da atividade mitocondrial e taxa de recuperação melhorada, em comparação com uma população de células-tronco de controle. Uma população de células-tronco de controle é a mesma população de células-tronco que não foi pré-tratada com NAC, tratada pós-descongelamento com NAC ou ambos, mas foi submetida a condições idênticas. Em outra modalidade, a população de células-tronco de controle é derivada da mesma população de células-tronco que a população de células-tronco pré-tratada com NAC, tratado pós- descongelamento com NAC ou ambos, mas a população de controle não foi pré-tratada com NAC, tratada pós-descongelamento com NAC ou ambos, mas foi submetida a condições idênticas.

[163] Também é fornecida uma população de células-tronco (por exemplo, ASCs) obtida por qualquer um dos métodos aqui descritos que possua uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou todas as quatro dessas propriedades.

[164] O número de células viáveis após o descongelamento, e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia,

cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 7 dias ou cerca de 10 dias ou mais, pode ser aumentado para a população de células-tronco em comparação com uma população de células de controle. Por exemplo, o número de células viáveis após descongelamento e cultivo por 1 dia (e/ou 4 dias) pode ser aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes ou mais na população de células- tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle. Por exemplo, a Figura 4A mostra que o número de células viáveis é aumentado para ASCs pré-tratadas com 6 mM de NAC em relação a células não tratadas após 1 dia de cultura (~5000 versus ~3000 células/cm2) e 4 dias de cultura (~12500 versus ~9000 células/cm2). Em outro exemplo, a Figura 6 mostra que o tratamento pós-descongelamento com 2 mM de NAC aumenta o número de células viáveis em relação a células não tratadas em 7 (~6300 versus ~5600 células/cm2), 11 (~18700 versus ~17500 células/cm2) e 14 dias (~18300 versus ~15200 células/cm2) de cultura. Os métodos adequados para medir o número de células viáveis são descritos acima.

[165] A taxa de crescimento da população de células-tronco (ou seja, o aumento no número de células viáveis/cm2 por dia) pode ser aumentada em comparação com uma população de células-tronco de controle. A taxa de crescimento após o descongelamento (por exemplo, entre os dias 1 e 4 de cultura pós-descongelamento) pode ser aumentada pelo menos cerca de 1,03 vez, cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,25 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes ou mais na população de células-tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle. Por exemplo, a Figura 4A mostra que a taxa de crescimento entre os dias 1 e 4 de cultura para ASCs pré-tratadas com 6 mM de NAC é aumentada em relação a células não tratadas. Especificamente, o crescimento entre os dias 1 e 4 para as células pré-tratadas com NAC é de aproximadamente 2500 células/cm2/dia, em comparação com aproximadamente 2000 células/cm2/dia para células não tratadas, ou seja, uma melhoria de cerca de 1,25-vez. Em outro exemplo, a Figura 6 mostra que a taxa de crescimento entre os dias 7 e 11 para ASCs pós-descongelamento tratadas com 2 mM de NAC é aumentada em relação a células não tratadas, ou seja, aproximadamente 3100 células/cm2/dia, em comparação com aproximadamente 3000 células/cm2/dia for células não tratadas.

[166] A atividade mitocondrial da população de células-tronco (conforme medida, por exemplo, por ensaio de MTS) das células após o descongelamento, e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 4 dias, cerca de 7 dias ou cerca de 10 dias ou mais, pode ser aumentada em comparação com uma população de células- tronco de controle. A atividade mitocondrial após descongelamento e cultura por 1 dia (e/ou 4 dias) pode ser aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% ou mais na população de células- tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle. Por exemplo, a Figura 4B mostra um aumento superior a 35% na atividade mitocondrial após pré-tratamento com 6 mM de NAC em comparação com células não tratadas medido após 24 horas de cultura após o descongelamento (leitura do ensaio MTS em 490 nm foi normalizada em 100% para o controle). Em outro exemplo, a Figura 4C mostra um aumento superior a 15% na atividade mitocondrial após pré-tratamento com 6 mM de NAC em comparação com células não tratadas medidas após 96 horas de cultura pós-descongelamento.

[167] Para células aderentes (como ASCs), a “recuperação” pós-descongelamento pode ser definida como o ponto em que o número de células viáveis de células aderidas aumenta em relação à densidade de semeadura inicial durante a cultura. Para células que crescem em suspensão, a “recuperação” pós-descongelamento pode ser definida como quando o número de células viáveis aumenta em relação à densidade de semeadura inicial durante a cultura. A taxa de recuperação da população de células-tronco descongelada, ou seja, o tempo decorrido após o descongelamento para as células se recuperarem, pode ser melhorada (ou seja, reduzida) em comparação com uma população de células-tronco de controle. Por exemplo, o número de horas necessárias para se recuperarem após o descongelamento pode ser reduzido pelo menos cerca de 1,1-vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes ou mais em comparação com uma população de células-tronco de controle. Por exemplo, a Figura 4A mostra que ASCs pré-tratadas com 6 mM de NAC são recuperadas após 1 dia de cultura pós-descongelamento, enquanto que as células não tratadas não são.

[168] Em métodos ou populações de células-tronco preferenciais como aqui divulgados, a população de células- tronco possui uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou todas as cinco das seguintes propriedades: (a) o número de células viáveis após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias é aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1-vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes ou mais em comparação com uma população de células-tronco de controle; (b) a taxa de crescimento (por exemplo, entre os dias 1 e 4 de cultura pós- descongelamento) após o descongelamento é aumentada pelo menos cerca de 1,03 vez, cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2-vez, pelo menos cerca de 1,25-vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes ou mais na população de células-tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle; (c) a atividade mitocondrial após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias é aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% em comparação com uma população de células-tronco de controle; (d) o tempo decorrido pós--descongelamento para as células se recuperarem é reduzido em comparação com uma população de células-tronco de controle; e/ou (e) o número de horas necessárias para as células se recuperarem após o descongelamento é reduzido pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em relação a uma população de células-tronco de controle.

[169] Em métodos ou populações de células-tronco preferidos como aqui divulgados, a população de ASCs possui um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou todas as seis das seguintes propriedades: (1) o número de células viáveis após o descongelamento e cultura por cerca de 1 dia é aumentado pelo menos cerca de 1,5 vez em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas); (2) o número de células viáveis após o descongelamento e cultura por cerca de 4 dias pelo menos cerca de 1,3-vez em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas); (3) a taxa de crescimento entre os dias 1 e 4 de cultura pós-descongelamento é aumentada pelo menos cerca de 1,25-vez em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas); (4) a atividade mitocondrial após o descongelamento e cultura por cerca de 1 dia é aumentada pelo menos cerca de 35% em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas); (5) a atividade mitocondrial após o descongelamento e cultura por cerca de 4 dias é aumentada pelo menos cerca de 15% em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas); e/ou (6) o tempo decorrido após o descongelamento para as ASCs se recuperarem é aumentado em comparação com uma população de células-tronco de controle (por exemplo, após pré-tratamento com 6 mM de NAC por 24 horas).

[170] Em métodos ou populações de células-tronco preferidos como aqui descritos, a população de ASCs possui uma ou mais, duas ou mais, três ou mais ou todas as quatro das seguintes propriedades: (a) o número de ASCs viáveis após tratamento pós-descongelamento com NAC (por exemplo, 2 mM) por 7 dias é aumentado pelo menos cerca de 1,1 vez em comparação com uma população de células-tronco de controle; (b) o número de ASCs viáveis após tratamento pós-descongelamento com NAC (por exemplo, 2 mM) por 11 dias é aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez em comparação com uma população de células-tronco de controle; (c) o número de ASCs viáveis após o tratamento pós-descongelamento com NAC (por exemplo, 2 mM) por 14 dias é aumentado pelo menos cerca de 1,2 vez em comparação com uma população de células-tronco de controle; e/ou (d) a taxa de crescimento após o tratamento pós-descongelamento com NAC (por exemplo, 2 mM) é aumentada pelo menos cerca de 1,03 vez em comparação com uma população de células-tronco de controle quando medida entre os dias 7 e 11 de cultura.

COMPOSIÇÕES DE CRIOPRESERVAÇÃO

[171] É revelada uma composição de criopreservação que compreende a população de células-tronco (por exemplo, ASCs) feita por qualquer um dos métodos aqui divulgados e um meio de criopreservação. A composição de criopreservação pode ser congelada. A composição de criopreservação pode conter NAC, por exemplo, a uma concentração na faixa de cerca de 0,5 a 10 mM, por exemplo, cerca de 2 a 8 mM ou cerca de 4 a 6 mM. Em uma modalidade particularmente preferencial, a concentração de NAC na composição de criopreservação é de cerca de 6 mM.

[172] Na prática dos métodos da invenção, prevê- se que o processo de criopreservação possa afetar uma variedade de processos celulares. Conforme discutido acima, o processo de congelamento pode interromper as reações intracelulares, incluindo a transcrição do gene. Esses efeitos também podem resultar da, ou em adição à composição química do meio de criopreservação (tais como efeitos metabólicos do crioprotetor, concentrações de íons) ou do pré-tratamento das células com NAC. Além disso, na criopreservação, os estresses induzidos pelo congelamento afetam os processos de transporte celular envolvendo choque térmico ou proteínas de desestabilização da membrana.

COMPOSIÇÕES DE FARMACÊUTICAS

[173] É divulgada uma composição farmacêutica que compreende a população de células-tronco (por exemplo, ASCs) feita por qualquer um dos métodos aqui divulgados e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[174] O sintagma “farmaceuticamente aceitável” é empregado no presente documento para se referir àqueles compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo do julgamento médico do parecer, adequados para o uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem excesso de toxicidade, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação comensurável com uma razão benefício/risco razoável.

[175] Exemplos de um carreador farmaceuticamente aceitável incluem um material farmaceuticamente aceitável, composição ou veículo, tal como um líquido ou sólido de enchimento, diluente, excipiente ou material de encapsulamento de solvente, envolvido no transporte ou transporte do composto em questão de um órgão ou porção do corpo, para outro órgão, ou porção do corpo. Cada carreador deve ser "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial ao paciente.

[176] A composição farmacêutica pode ser estéril, livre da presença de vírus indesejados, bactérias e outros patógenos, bem como livre de pirógenos. Ou seja, para administração humana, as composições em questão devem atender aos padrões de esterilidade, pirogenicidade, bem como segurança geral e pureza, conforme exigido pelos padrões do FDA Office of Biologics.

[177] Devido às dificuldades na obtenção de células-tronco autólogas suficientes, a população de células- tronco aqui divulgada pode ser obtida de uma fonte alogênica. É conhecido na técnica que MSCs e ASCs derivadas de medula óssea não provocam uma resposta de linfócitos alogênicos in vitro e, consequentemente, essas células podem ser usadas para qualquer paciente, independentemente da incompatibilidade de MHC. Assim, a população de células-tronco (por exemplo, as MSCs ou ASCs derivadas da medula óssea) na composição farmacêutica pode ser alogênica em relação ao hospedeiro de transplante pretendido.

[178] A composição farmacêutica pode compreender uma suspensão da população de células-tronco em várias soluções ou materiais, por exemplo, para uso como produtos farmacêuticos ou biomateriais, conforme descrito em mais detalhes abaixo. A composição farmacêutica pode compreender uma suspensão de células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas) em solução de Ringer e HSA. A composição farmacêutica pode compreender uma suspensão das células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas) em solução salina tamponada asséptica. As células podem ser fornecidas em frascos descartáveis sem agentes conservantes. As células podem ser administradas na dose de 120 milhões de células (por exemplo, em uma concentração de 5 milhões de células/ml). As células (por exemplo, ASCs) também podem ser administradas a cerca de 1 milhão a 10 milhões de células/kg.

[179] Em certas modalidades, a composição farmacêutica é uma suspensão das células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas) em um material, como um polímero, cola, gel, etc. Essas suspensões podem ser preparadas, por exemplo, por sedimentação do células-tronco do meio de cultura e ressuspendendo-as na solução ou material desejado. As células podem ser sedimentadas e/ou trocadas do meio de cultura, por exemplo, por centrifugação, filtração, ultrafiltração, etc.

[180] A concentração das células-tronco estromais derivadas do tecido adiposo em questão nas composições contendo células-tronco estromais derivadas de tecido adiposo em questão pode ser de pelo menos cerca de 5 milhões de células/ml, pelo menos cerca de 10 milhões de células/ml, pelo menos cerca de 20 milhões de células/ml, pelo menos cerca de 30 milhões de células/ml ou pelo menos cerca de 40 milhões de células/ml. Tipicamente, a concentração entre cerca de 1 milhão de células/ml e 10 milhões de células/ml, por exemplo, entre cerca de 5 milhões de células/ml e 10 milhões de células/ml. Em determinadas modalidades, a densidade celular é de cerca de 5 milhões de células/ml na composição farmacêutica.

[181] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende cerca de 1 milhão a 150 milhões de células, de preferências cerca de 30 milhões de células ou cerca de 120 milhões de células.

[182] Em alguns casos, a composição farmacêutica pode compreender NAC. Em outros casos, a composição farmacêutica pode não compreender NAC.

[183] Os carreadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina, soluções tampão aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. O uso de tais carreadores e diluentes é bem conhecido na técnica. A solução é normalmente estéril e fluida na medida em que existe fácil seringabilidade. Normalmente, a solução é estável nas condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos, por meio do uso de, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. A composição farmacêutica pode ser preparada suspendendo a população de células-tronco (por exemplo, ASCs) como descrito neste documento em um carreador farmaceuticamente aceitável ou diluente e, conforme necessário, outros ingredientes enumerados acima, seguido por esterilização por filtração.

[184] Alguns exemplos de materiais e soluções que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e derivados dos mesmos, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7)

talco; (8) excipientes, como manteiga de cacau e ceras de supositório; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de cártamo, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tais como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções de tampão de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; e (22) outras substâncias compatível não tóxicas tipicamente empregadas em formulações farmacêuticas.

[185] Em determinadas modalidades, a composição farmacêutica compreende ainda um adesivo. O adesivo pode ser um adesivo à base de fibrina, tal como um gel de fibrina ou cola de fibrina ou polímero ou adesivo à base de fibrina, ou outro adesivo de tecido ou cola cirúrgica, tal como, por exemplo, cianoacrilato, colágeno, trombina e polietilenoglicol. Outros materiais que podem ser usados incluem, mas não estão limitados a alginato de cálcio, agarose, tipos I, II, IV ou outra isoforma de colágeno, ácido polilático/poliglicólico, derivados de hialuronato ou outros materiais (Perka et al. J. Biomed. Mater. Res. (2000) 49: 305 a 311; Sechriest et al. J. Biomed. Mater. Res. (2000) 49: 534 a 541; Chu et al. J. Biomed. Mater. Res. (1995) 29:1147 a 1154; Hendrickson et al. Orthop. Res. (1994) 12: 485 a 497). Em outras modalidades, o adesivo é um curativo líquido, em que a população de células-tronco (por exemplo, ASCs) é misturada com o material líquido do curativo. Um “curativo líquido” é uma solução que compreende um composto, por exemplo, um material polimérico, que é aplicado a uma ferida com um spray ou pincel, seguido pela remoção do solvente por vaporização para fornecer uma película protetora na ferida.

[186] A composição farmacêutica também pode ser usada para revestir um suporte, por exemplo, um dispositivo médico. Por exemplo, o suporte pode ser uma sutura ou fio. O suporte pode ser revestido com células de qualquer forma conhecida por um versado na técnica, por exemplo, por imersão, pulverização, pintura, impressão, etc. Em uma modalidade, o suporte é uma sutura, grampo, fio absorvível, fio não absorvível, fio natural, fio sintético, fio monofilamento ou fio multifilamento (também chamado de tranças). Os métodos preferenciais de preparação de suturas e outros suportes usados para fechar feridas revestidas com células-tronco do estroma derivado do tecido adiposo são divulgados no Pedido de Patente nº US 11/056.241, “Biomaterial for Suturing”, depositado em 14 de fevereiro de 2005, cujo pedido é incorporado por referência em sua totalidade. A composição farmacêutica divulgada no presente documento representa composições inovadoras que podem ser usadas com os métodos divulgados no Pedido de Patente nº US 11/056.241.

[187] Além disso, em qualquer uma das composições farmacêuticas divulgadas, pelo menos um agente terapêutico pode ser incorporado na composição (embora não seja necessário e possa ser opcionalmente excluído). Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter um analgésico (por exemplo, para ajudar no tratamento da inflamação ou dor), ou um agente anti-infeccioso para prevenir a infecção do local tratado com a composição.

[188] Mais especificamente, exemplos não limitativos de agentes terapêuticos úteis que podem ser incluídos na composição farmacêutica descrita no presente documento incluem as categorias terapêuticas a seguir: analgésicos, como anti-inflamatórios não esteroides, agonistas opiáceos e salicilatos; agentes anti-infecciosos, como anti- helmínticos, antianaeróbios, antibióticos, antibióticos aminoglicosídeos, antibióticos antifúngicos, antibióticos cefalosporina, antibióticos macrolídeos, diversos antibióticos ß-lactâmicos, antibióticos penicilina, antibióticos quinolona, antibióticos sulfonamida, antibióticos tetraciclínicos, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculose, antiprotozoários, antiprotozoários antimaláricos, agentes antivirais, agentes antirretrovirais, agentes anti- inflamatórios escabicoides, agentes anti- inflamatórios/corticosteroides locais, agentes anti- inflamatórios/corticosteroides locais-infecciosos, anti- infecciosos tópicos antifúngicos, anti-infecciosos tópicos antivirais; agentes eletrolíticos e renais, tais como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inibidores da anidrase carbônica, diuréticos de alça, diuréticos osmóticos, diuréticos poupadores de potássio, diuréticos tiazídicos, substituições de eletrólitos e agentes uricosúricos; enzimas, tais como enzimas pancreáticas e enzimas trombolíticas; agentes gastrointestinais, tais como antidiarreicos, antieméticos, agentes anti-inflamatórios gastrointestinais, agentes anti-inflamatórios gastrointestinais salicilato, agentes antiúlcera antiácido, agentes antiúlcera inibidores da bomba de ácido gástrico, agentes antiúlcera da mucosa gástrica, agentes antiúlcera bloqueadores H2, agentes colelitolíticos, digestivos, eméticos, laxantes e amaciantes de fezes e agentes procinéticos; anestésicos gerais, tais como anestésicos de inalação, anestésicos de inalação halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos com barbitúricos, anestésicos intravenosos de benzodiazepina e anestésicos intravenosos agonistas opiáceos; hormônios e modificadores de hormônios, tais como abortivos, agentes adrenais, agentes adrenais corticosteroides, andrógenos, antiandrógenos, agentes imunobiológicos, tais como imunoglobulinas, imunossupressores, toxoides e vacinas; anestésicos locais, tais como anestésicos locais de amida e anestésicos locais de éster; agentes musculoesqueléticos, como agentes anti-inflamatórios antigota, agentes anti-inflamatórios corticosteroides, agentes anti- inflamatórios compostos de ouro, agentes anti-inflamatórios imunossupressores, anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), agentes anti-inflamatórios salicilatos, minerais; e vitaminas, como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E e vitamina K.

[189] As classes preferenciais de agentes terapêuticos úteis das categorias acima incluem: (1) analgésicos em geral, tais como lidocaína ou seus derivados, e analgésicos anti-inflamatórios não esteroides (AINEs), incluindo diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno e na próxeno; (2) analgésicos agonistas opiáceos, tais como codeína, fentanil, hidromorfona e morfina; (3) analgésicos de salicilato, como aspirina (ASA) (ASA com revestimento entérico); (4) anti-histamínicos bloqueadores de H1, tais como clemastina e terfenadina; (5) agentes anti-infecciosos, como mupirocina; (6) anti-infecciosos antianaeróbicos, como cloranfenicol e clindamicina; (7) anti-infecciosos antibióticos antifúngicos, como anfotericina b, clotrimazol, fluconazol e cetoconazol; (8) anti-infecciosos antibióticos macrólidos, tais como azitromicina e eritromicina; (9) diversos anti-infecciosos antibióticos ß-lactâmicos, como aztreonam e imipenem; (10) anti-infecciosos antibióticos penicilina, tais como nafcilina, oxacilina, penicilina G e penicilina V; (11) anti-infecciosos antibióticos de quinolona, tais como ciprofloxacina e norfloxacina; (12) anti-infecciosos antibióticos de tetraciclina, tais como doxiciclina, minociclina e tetraciclina; (13) anti-infecciosos antituberculose, antimicobacterianos, tais como isoniazida (INH) e rifampicina; (14) anti-infecciosos antiprotozoários, como atovaquona e dapsona; (15) anti-infecciosos antiprotozoários antimaláricos, tais como cloroquina e pirimetamina; (16) anti-infecciosos antirretrovirais, como ritonavir e zidovudina; (17) agentes anti-infecciosos antivirais, como aciclovir, ganciclovir, interferon alfa e rimantadina; (18) anti-infecciosos tópicos antifúngicos, como anfotericina B, clotrimazol, miconazol e nistatina; (19) anti- infecciosos tópicos antivirais, como o aciclovir; (20) agentes eletrolíticos e renais, como lactulose; (21) diuréticos de alça, como furosemida; (22) diuréticos poupadores de potássio, como triantereno; (23) diuréticos tiazídicos, como hidroclorotiazida (HCTZ); (24) agentes uricosúricos, como probenecida; (25) enzimas como RNase e DNase; (26) antieméticos, como proclorperazina; (27) agentes anti- inflamatórios gastrointestinais salicilatos, tais como sulfassalazina; (28) agentes antiúlcera inibidores da bomba de ácido gástrico, tais como omeprazol; (29) agentes antiúlcera bloqueadores de H2, tais como cimetidina, famotidina, nizatidina e ranitidina; (30) digestivos, tais como pancrelipase; (31) agentes procinéticos, como eritromicina; (32) anestésicos locais de éster, como benzocaína e procaína; (33) anti-inflamatórios corticosteroides musculoesqueléticos, como beclometasona, betametasona, cortisona, dexametasona, hidrocortisona e prednisona; (34) imunossupressores anti- inflamatórios musculoesqueléticos, tais como azatioprina, ciclofosfamida e metotrexato; (35) anti-inflamatórios não esteroides musculoesqueléticos (AINEs), como diclofenaco, ibuprofeno, cetoprofeno, cetorlaco e naproxeno; (36) minerais, como ferro, cálcio e magnésio; (37) compostos de vitamina B, como cianocobalamina (vitamina B12) e niacina (vitamina B3); (38) compostos de vitamina C, como ácido ascórbico; e (39) compostos de vitamina D, como calcitriol.

[190] Em determinadas modalidades, o agente terapêutico pode ser um fator de crescimento ou outra molécula que afeta a diferenciação e/ou proliferação celular. Os fatores de crescimento que induzem estados finais de diferenciação são bem conhecidos na técnica e podem ser selecionados a partir de qualquer fator que tenha demonstrado induzir um estado final de diferenciação. Fatores de crescimento para uso em métodos aqui descritos podem, em certas modalidades, ser variantes funcionais ou fragmentos de um fator de crescimento de ocorrência natural. Por exemplo, uma variante pode ser gerada fazendo mudanças conservativas de aminoácidos e testando a variante resultante testando a função do fator de crescimento usando um ensaio conhecido na técnica.

USOS E APLICAÇÕES USO DE NAC

[191] É divulgada a utilização de NAC para a criopreservação de células-tronco, por exemplo, em qualquer um dos métodos aqui divulgados.

APLICAÇÕES MÉDICAS

[192] As células-tronco estão sendo usadas para tratar um número crescente de doenças e distúrbios. Assim, a população de células-tronco feita de acordo com qualquer um dos métodos aqui divulgados, a composição farmacêutica conforme divulgada neste documento ou uma composição de criopreservação conforme divulgada neste documento pode ser usada na terapia. O termo “terapia” destina-se a cobrir o tratamento e/ou prevenção de uma doença, distúrbio ou sintoma em um paciente. Os termos “sujeito”, “receptor” e “paciente” são usados indistintamente neste documento e referem-se, a menos que explicitamente declarado a qualquer animal humano ou não humano (por exemplo, um mamífero) em necessidade de terapia. Em modalidades preferenciais, o paciente é um ser humano. Quando o paciente é humano, a população de células tronco é geralmente humana.

[193] É divulgada uma população de células- tronco, uma composição farmacêutica ou uma composição de criopreservação, conforme descrito neste documento, para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de distúrbio inflamatório, doença autoimune ou doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão em um paciente com essa necessidade. A população de células usada no método pode ser feita por qualquer um dos métodos de criopreservação de célula-tronco aqui divulgados.

[194] Também é divulgado o uso de uma população de células-tronco, uma composição farmacêutica ou uma composição de criopreservação conforme descrito neste documento para a fabricação de um medicamento para o tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de distúrbio inflamatório, doença autoimune ou doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição do órgão em um paciente com essa necessidade.

[195] É ainda divulgado um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de distúrbio inflamatório, doença autoimune ou doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, o método compreende a administração de uma composição de células-tronco, uma composição farmacêutica ou uma composição de criopreservação conforme divulgado neste documento a um indivíduo com essa necessidade.

[196] A população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação, conforme descrito neste documento, em particular quando a população de células-tronco são ASCs, pode ser usada para tratar fístula. O termo “fístula” se refere a qualquer passagem ou comunicação ou conexão anormal, geralmente entre dois órgãos internos ou conduzindo de um órgão interno para a superfície do corpo, por exemplo, uma conexão ou passagem entre órgãos ou vasos que normalmente não se conectam. Por exemplo, tipos de fístulas,

denominadas de acordo com as áreas do corpo em que ocorrem, incluem fístula anorretal ou fístula anal ou fístula fecal (entre o reto ou outra área anorretal e a superfície da pele), fístula arteriovenosa ou fístula AV (entre um artéria e veia), fístula biliar (entre os dutos biliares na superfície da pele, muitas vezes causada por cirurgia da vesícula biliar), fístula cervical (abertura anormal no colo do útero), fístula crânio sinusal (entre o espaço intracraniano e um seio paranasal), fístula enteroenteral (entre duas partes do intestino), fístula enterocutânea (entre o intestino e a superfície da pele, ou seja, do duodeno ou jejuno ou íleo), fístula enterovaginal (entre o intestino e a vagina), fístula gástrica (entre o estômago e o superfície da pele), fístula metroperitoneal (entre o útero e a cavidade peritoneal), fístula perilinfa (uma ruptura entre as membranas entre os ouvidos médio e interno), fístula arteriovenosa pulmonar (entre uma artéria e veia dos pulmões, resultando em desvio de sangue), fístula retovaginal (entre o reto e a vagina), fístula umbilical (entre o umbigo e intestino), fístula traqueoesofágica (entre a respiração e os tubos de alimentação) e fístula vesicovaginal (entre a bexiga e a vagina). As causas das fístulas incluem trauma, complicações de tratamento médico e doenças.

Doenças inflamatórias intestinais, como doença de Crohn e colite ulcerosa, são as principais causas de fístulas anorretais, enteroenteral e enterocutâneas.

Em determinadas modalidades, a fístula é uma fístula perianal, por exemplo, fístulas perianais complexas refratárias em pacientes com doença de Crohn.

A população de células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas) pode ser administrada em uma dose de cerca de 120 milhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células/ml) para injeção intralesional.

[197] É divulgada uma população de células- tronco, conforme divulgado no presente documento, para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (d) opcionalmente cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e (e) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[198] É também divulgado o uso de uma população de células-tronco, conforme divulgado no presente documento, para a fabricação de um medicamento para tratar fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; (b)

congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (d) opcionalmente cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e (e) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[199] É adicionalmente revelado um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células- tronco tratada; (b) congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; (c) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (d) opcionalmente cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e (e) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[200] Em determinadas modalidades, o método de tratamento e/ou prevenção compreende ainda qualquer uma das etapas, como definido nos métodos revelados no presente documento, (por exemplo, “pré-tratamento”) antes da administração da população de células-tronco ao paciente.

[201] É divulgada uma população de células-

tronco, conforme descrito no presente documento, para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e (d) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[202] É também divulgado o uso de uma população de células-tronco, conforme descrito no presente documento, para a fabricação de um medicamento para tratar fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou doenças imunologicamente mediadas, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e (d)

administrar a população de células-tronco ao paciente.

[203] É adicionalmente revelado um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma intercutâneas doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: (a) congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; (b) descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; (c) cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e (d) administrar a população de células-tronco ao paciente.

[204] Em determinadas modalidades, o método de tratamento e/ou prevenção compreende ainda qualquer uma das etapas definidas nos métodos aqui divulgados (por exemplo, “tratamento pós-descongelamento”) antes da administração da população de células-tronco ao paciente.

[205] A população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação pode ser administrada em uma dose entre cerca de 1 e 150 milhões de células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas). Em modalidades preferenciais, as células-tronco (por exemplo, ASCs alogênicas) podem ser administradas em uma dose de cerca de 30 milhões ou cerca de 120 milhões de células.

[206] A administração da população de células- tronco, composições farmacêuticas ou composições de criopreservação, conforme divulgado neste documento, a indivíduos, particularmente indivíduos humanos, pode ser realizada por injeção ou implantação das células em locais- alvo nos indivíduos. Por exemplo, um dispositivo de entrega que facilita a introdução, injeção ou implantação, no sujeito pode ser usado. Tais dispositivos de distribuição incluem tubos, por exemplo, cateteres, para injetar no corpo de um sujeito receptor. Em uma modalidade preferida, os tubos possuem adicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual a população de células-tronco, composições farmacêuticas ou composições de criopreservação podem ser introduzidas no sujeito em um local desejado.

[207] As modalidades preferenciais, a população de células-tronco - incluindo aquelas nas composições farmacêuticas e/ou criopreservações - são ASCs.

[208] As células-tronco podem ser alogênicas ou autólogas.

[209] A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos em questão podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 e a ED50. As composições que exibem grandes índices terapêuticos são preferenciais. Embora os compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser usados, deve-se ter cuidado ao projetar um sistema de entrega que direcione os agentes ao local desejado, a fim de reduzir os efeitos colaterais.

[210] Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de células e estudos em animais podem ser usados na formulação de uma gama de dosagem para uso em humanos. A dosagem de qualquer agente terapêutico ou alternativamente de quaisquer componentes nele, encontra-se tipicamente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para agentes da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC50 (ou seja, a concentração do composto de teste que atinge metade da inibição máxima dos sintomas), conforme determinado em cultura de células. Essas informações podem ser usadas para determinar com mais precisão as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatógrafo líquido de alto desempenho.

KITS

[211] É divulgado um kit de criopreservação que compreende: um criotubo, um recipiente contendo NAC e um recipiente contendo uma população de células-tronco. O kit pode compreender instruções para seu uso. É divulgado um kit de criopreservação que compreende: a pluralidade de criotubos, um recipiente contendo NAC e um recipiente contendo uma população de células-tronco. A população de células-tronco pode ser fornecida no kit como uma composição ou composições farmacêuticas, conforme divulgado neste documento.

DEFINIÇÕES GERAIS

[212] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado, conforme entendido comumente a um elemento ordinariamente versado na técnica à qual esta invenção pertence.

[213] Os artigos “um” e “uma” se referem a um ou mais de um (ou seja, a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um elemento ou mais de um elemento.

[214] Os termos “compreende” e “compreendendo” são usados no sentido aberto inclusivo, significando que elementos adicionais podem ser incluídos.

[215] Em geral, os métodos “que compreendem” uma série de etapas não exigem que as etapas sejam realizadas em uma ordem específica. Quando um método compreende várias etapas numeradas sequencialmente ou alfabéticas (por exemplo, (1), (2), (3) ou (a), (b), (c) etc.), isso implica que as etapas devem ser realizadas na ordem prescrita, salvo indicação em contrário. Essa linguagem não exclui, no entanto, a possibilidade de etapas adicionais serem realizadas entre cada uma das etapas prescritas.

[216] O termo “incluindo” é usado neste documento para significar “incluindo, mas não se limitando a”. “Incluindo” e “inclui, mas sem limitação a” são usados alternadamente.

EXEMPLOS

[217] A invenção agora sendo geralmente descrita, será mais facilmente compreendida por referência aos seguintes exemplos, que são incluídos meramente para fins de ilustração de certos aspectos e modalidades da presente invenção, e não se destinam a limitar a invenção. EXEMPLO 1 - ISOLAMENTO E CULTURA DE ASC

[218] As amostras humanas foram obtidas com consentimento informado (conforme aprovado pelo Comitê de

Ética da Espanha de referência para o local de obtenção de tecido; Hospital Clínica de la Luz, Madrid, Espanha). As ASCs foram obtidas como previamente publicado (Mancheño-Corvo et al., Frontiers in Immunology (2017), 8, 462; Menta et al., Frontiers in Immunology (2014), 8, 462). Resumidamente, aspirados de tecido adiposo humano de doadores saudáveis foram lavados duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e digeridos com 0,075% de colagenase (Tipo I, Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A amostra digerida foi lavada com 10% de soro fetal bovino (FBS), tratada com 160 mM de NH4Cl para eliminar os eritrócitos restantes e suspensa em meio de cultura (meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), com 10% de FBS). As células foram semeadas em frascos de cultura de tecidos e expandidas (37 ºC, 5% de CO2) com mudança de meio de cultura a cada 3 a 4 dias. As células foram transferidas para um novo frasco, quando elas atingiram 90% de confluência. As células foram expandidas até a duplicação 12 a 14 e congeladas em FBS com 10% de DMSO (FBS com 10% de DMSO foi usado como meio de congelamento ao congelar as ASCs em todos os exemplos aqui descritos). Os experimentos foram realizados com um pool de células de três doadores adultos do sexo masculino e três doadores do sexo feminino em duplicações populacionais 12 a

14. As ACSs expandidas (eASCs) foram confirmadas para atender à definição de acordo com os critérios da International Society for Cellular Therapy (Dominici et al., Cytotherapy (2006) 8(4): 315 a 317), sendo positivas para CD73 (AD2) e CD90 (5E10) da Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, EUA) e CD105 (43A3) da Biolegend (San Diego, CA, EUA) e negativas para CD14 (RM052) da Immunotech (Monrovia, CA, EUA), CD19 (4G7), HLA-DR (L243), e CD34 (8G12) da Becton Dickinson e CD45 (J33) da Beckman

Coulter (Brea, CA, EUA). EXEMPLO 2 – AVALIAÇÃO DE VÁRIAS ETAPAS DE PRÉ- TRATAMENTO EM NÚMERO DE CÉLULAS ASC PÓS-DESCONGELAMENTO PRÉ-TRATAMENTO DE ASC

[219] As ASCs do doador A foram descongeladas aquecendo os frascos em um banho de 37 ºC e diluindo o meio de congelamento contendo DMSO com DMEM completo fresco (meio DMEM⁄F-12 - GlutaMAX™-I, Gibco, suplementado com 100 µg/ml de penicilina/estreptomicina e 10% de FBS). As células foram centrifugadas a 450 g por 6 minutos em temperatura ambiente para eliminar o DMSO restante e plaqueadas em frascos T-175 a 20000 células/cm2 em DMEM completo. 24 horas pós-descongelamento, as células foram tratadas com as concentrações adequadas dos compostos indicados na tabela abaixo por 24 horas: Concentração usada Composto no presente Referência documento Li et al., Scientific NAC 6 mM Reports (2015) 5: 9819 Gharibi et al., LY294 10 µM Stem Cells (2014) 32: 2256 a 2266 Chen et al. Oncotarget (2017) sc79 10 µM 8(19): 31065 a 31078 Zhou et al. Scientific Reports (2015) 5: Exendina-4 20 nM 12898 & Zhou et al. Free Radical Biology and

Concentração usada Composto no presente Referência documento Medicine (2014) 77: 363 a 375

[220] Um estoque de 600 mM de NAC (SIGMA) foi preparado em água Milli-Q (Millipore). Esse estoque foi utilizado para pré-tratamento e pós-tratamento pela adição direta de 50 µl de solução estoque por poço em 5 ml de meio, perfazendo uma concentração final de 6 mM. Para 2 mM, apenas 16,7 µl foram adicionados por poço, e no caso de 12 mM, 100 µl de estoque foram adicionados. DMSO foi usado como o veículo para sc79 e LY294.

[221] Após a etapa de pré-tratamento, o meio foi removido, as células foram lavadas com PBS e tripsinizadas com tripsina-EDTA a 0,25% (ThermoFisher) por 8 minutos a 37 ºC. Após a inativação da tripsina com DMEM completo, as células foram colhidas e centrifugadas antes da ressuspensão em meio de congelamento (FBS com 10% de DMSO) e congeladas em 500000 ou 1 milhão de células por frasco e armazenadas em nitrogênio líquido para uso posterior. Especificamente, as células foram congeladas a -80 ºC por 24 horas em um dispositivo Cool Cell® (BioCision) e então transferidas para um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido. Todos os experimentos foram realizados em incubadoras a 37 ºC, 5% de CO2. AVALIAÇÃO DE VÁRIAS ETAPAS PRÉ-TRATAMENTO NO NÚMERO DE CÉLULAS PÓS-DESCONGELAMENTO E CRESCIMENTO

[222] ASCs foram semeadas em placas de fundo plano de 96 poços (1000 ou 2000 ASCs por poço), cultivadas por 24 horas e, em seguida, o número de células viáveis foi avaliado usando o ensaio MTS (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega) seguindo as instruções do fabricante. O ensaio de proliferação celular CellTiter 96® Aqueous One Solution é um método colorimétrico para determinar o número de células viáveis. O reagente CellTiter 96® Aqueous One Solution contém um composto de tetrazólio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio, MTS] e um reagente de acoplamento de elétrons (etossulfato de fenazina; PES). O composto de tetrazólio MTS é biorreduzido por células - presumivelmente por NADPH ou NADH produzido por enzimas desidrogenase em células metabolicamente ativas - em um produto de formazano colorido que é solúvel em meio de cultura de tecidos.

[223] Resumidamente, 40 µl do reagente foram adicionados a 200 µl de DMEM completo em cada poço e a absorbância foi medida após 2 a 3 horas a 490 nm usando um sistema Navision (Microsoft). Cada condição foi medida em 6 repetições técnicas. Os resultados do ensaio MTS são apresentados como porcentagem de absorbância a 490 nm em relação às células não tratadas (NT).

[224] O pré-tratamento com NAC resultou em aumento do número de células 24 horas após a semeadura em comparação ao não- tratado (NT), conforme avaliado pelo ensaio MTS (Figura 2) e pela densidade celular (Figura 3).

[225] Além de NAC, pré-tratamentos com Exendina- 4, IL6, sc79 e LY294 foram avaliados. Sc79 é um ativador de trajetória de PI3K, um sinal de proliferação e pró- sobrevivência (Jo et al. Proceedings of the National Academy of Sciences (2012), 109(26): 10581 a 10586, Chen et al.

Oncotarget (2017) 8(19): 31065 a 31078), e LY294 é uma molécula inibidora desta mesma via usada em Zonca et al., (2012) Tissue Engineering: Part A 18(7-8): 852 a 859 e Gharibi et al., (2014) Stem Cells 32: 2256 a 2266. DMSO foi usado como o veículo para sc79 e LY294. O pré-tratamento com compostos diferentes de NAC não mostrou efeitos reproduzíveis no número de células. EXEMPLO 3 – AVALIAÇÃO ADICIONAL DE ETAPAS DE PRÉ- TRATAMENTO COM NAC EM NÚMERO DE CÉLULAS ASC PÓS-DESCONGELAMENTO

ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE ASC

[226] As ASCs pré-tratadas com NAC de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2 da substância de fármaco final do doador A ou do doador B (FDS) foram descongeladas aquecendo os frascos em um banho de 37 ºC e diluindo rapidamente o meio de congelamento contendo DMSO (FBS com 10% DMSO) com DMEM completo fresco. As células foram centrifugadas a 450 g por 6 minutos à temperatura ambiente para eliminar o DMSO restante e plaqueadas em placas de P6 poços (Falcon nº 353046) em triplicado a 3000 células por poço em 5 ml de DMEM completo por poço. As células foram lavadas com 1x PBS e tripsinizadas usando tripsina-EDTA 0,25% (ThermoFisher) por 8 minutos a 37 ºC. Após a inativação com tripsina usando DMEM completo, as células foram colhidas, centrifugadas e ressuspensas em DMEM fresco; poços triplicados foram unificados como uma única amostra para fins de contagem. As células foram contadas em triplicado em 24 horas, 96 horas e 7 dias após o plaqueamento usando um Contador de células automatizado Invitrogen Countess (Invitrogen) e adição de azul de tripano como uma coloração de viabilidade (Figura 4A). O cálculo da densidade celular foi feito usando a contagem de ASCs viáveis (negativas para azul tripano) por unidade de superfície (cm2).

[227] O pré-tratamento com NAC aumentou o número de células contadas em 24 horas e 4 dias (12500 células em comparação com 9200 células/cm2 no controle não tratado em 4 dias pós-descongelamento, conforme mostrado na Figura 4A). Esses achados foram corroborados por dados de MTS realizados em paralelo, mostrando um aumento de 15 a 20% da atividade mitocondrial após pré-tratamento com NAC (Figuras 4B & C). O crescimento de ASC atingiu a confluência antes do dia 7, portanto, não há crescimento significativo neste ponto de tempo, em comparação com o dia 4.

[228] Para reconfirmar os dados discutidos acima, os ensaios de crescimento foram realizados após pré- tratamento com NAC com dois doadores de ASC diferentes (doador A (DON A) e doador B (DON B)). Os números de células foram analisados nos dias 1, 4 e 7 após células não tratadas ou pré- tratadas com NAC pós-descongelamento para cada doador (Figuras 5A & B). As células de ambos os doadores mostraram um aumento no número de células 24 horas após a semeadura e esse aumento foi mantido por uma semana em cultura (Figura 5). Esses dados confirmam que o pré-tratamento com NAC aumenta o número de células após a recuperação de congelamento-descongelamento. EXEMPLO 4 - EFEITO DE TRATAMENTO PÓS-DESCONGELAMENTO

COM CONCENTRAÇÕES DIFERENTES DE NAC EM CRESCIMENTO CELULAR APÓS DESCONGELAMENTO

[229] O efeito de tratamento pós-descongelamento com diferentes concentrações de NAC (tratamento com NAC pós- descongelamento) em crescimento celular também foi estudado. ASCs foram congeladas (sem pré-tratamento com NAC), descongeladas como discutido acima e, em seguida, tratadas com três concentrações diferentes de NAC (2, 6 e 12 mM) em DMEM completo antes do plaqueamento e os números de células nos dias 4, 11 e 14 foram analisados. O tratamento pós- descongelamento com 2 mM de NAC resultou em um aumento no número de células que foi sustentado por até 2 semanas em cultura (Figura 6). Uma possível explicação para as menores densidades celulares observadas após o tratamento pós- descongelamento com 6 mM e 12 mM de NAC é que essas concentrações de NAC podem impactar na aderência das ASCs após o descongelamento (“flutuantes”) à placa. EXEMPLO 5 – PRÉ-TRATAMENTO COM NAC NÃO AFETA A

IDENTIDADE DE ASCS APÓS DESCONGELAMENTO E CULTURA

[230] A expressão de quatro marcadores de superfície (CD29, CD73, CD90 e CD105, consistente com os critérios da International Society for Cellular Therapy (Dominici et al., Cytotherapy (2006) 8(4): 315 a 317) foi usada para confirmar a identidade de ASCs descongeladas e expandidas após o pré-tratamento com NAC a uma concentração de 6 mM de acordo com os métodos descritos no Exemplo 2.

[231] A identidade das células foi analisada seguindo protocolos padrão, após duas semanas em cultura (pós- descongelamento). As células colhidas foram coradas com concentrações adequadas dos anticorpos indicados na tabela abaixo (diluídas de acordo com as instruções do fabricante) e avaliadas usando um citômetro FACSCalibur (BD). Marcador Anticorpo Fonte de Anticorpos CD29 MAR4 Becton Dickinson (Franklin Lakes, CD73 AD2 NJ, EUA) CD90 5E10 CD105 43A3 Biolegend (San

Marcador Anticorpo Fonte de Anticorpos Diego, CA, EUA)

[232] Os dados foram analisados usando o software FCS Express. A Figura 7 mostra que as células expressam CD29, CD73, CD90 e CD105, e confirma que pré- tratamento com NAC de células antes do congelamento não altera a expressão de marcadores de identidade de ASC após descongelamento e cultura. EXEMPLO 6 – PRÉ-TRATAMENTO COM NAC NÃO AFETA

SIGNIFICATIVAMENTE A CAPACIDADE DAS ASCS DESCONGELADAS DE INIBIR A PROLIFERAÇÃO DE LINFÓCITOS ESTIMULADOS

[233] Após demonstrar que o pré-tratamento de ASCs com NAC resultou em uma vantagem de crescimento in vitro, experimentos foram conduzidos para verificar se o pré- tratamento de NAC afetava as propriedades funcionais de ACS. Primeiro, a capacidade de ASCs descongeladas e expandidas (pré- tratadas com NAC de acordo com os métodos no Exemplo 2) para inibir a proliferação de linfócitos estimulados foi medida.

[234] Conforme publicado anteriormente para ensaios de imunossupressão (Mancheño-Corvo et al., Frontiers in Immunology (2017), 8, 462; Menta et al., Frontiers in Immunology (2014), 8, 462), células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas por gradiente de centrifugação de densidade usando Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia) a partir de camadas leucoplaquetárias fornecidas pelo National Transfusion Center da Comunidad Autonoma de Madrid, e esplenócitos foram obtidos de camundongos machos C57/BL6. Para marcação de éster N- succinimidil de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE), PBMCs ou esplenócitos foram lavados extensivamente para remover FBS, ressuspensos em uma solução CFSE de 10 μM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA) (107 PBMC ou esplenócitos por 200 μl de solução) e incubados sob agitação constante a 37 ºC por 10 min. A reação foi interrompida pela adição de meio gelado (RPMI + 10% FBS), e as células foram lavadas três vezes com PBS gelado. As células foram então cultivadas durante a noite, e uma alíquota foi usada para configurar e controlar a voltagem FL-1 para CFSE. Depois de descansar durante a noite, PBMCs marcados com CFSE foram ativados com o kit Pan T Cell Activation (microesferas revestidas com anti-CD3, anti-CD2 e anti-CD28; Miltenyi Biotec, Auburn, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Esplenócitos marcados com CFSE foram ativados com anti-CD3 (Becton Dickinson) e IL-2 (Novartis, Basel, Suíça). PBMCs ou esplenócitos (1 milhão células/poço) foram cultivados em placas de 24 poços sozinhos ou com eASCs (4 × 104 células/poço; razão 1:25 de eASC:PBMC ou eASC:esplenócitos) em um volume total de 2 ml de RPMI + 10% FBS. A razão ASC:PBMC de 1:75 permitiu a avaliação das diferenças entre as amostras em condições subideais. Após 5 dias para PBMCs e 3 dias para esplenócitos, as células foram colhidas, marcadas com 7-AAD e anticorpo anti-CD3 e a proliferação celular da população CD3+/7-AAD− (linfócitos T CD3 viáveis) foi determinada por citometria de fluxo, de acordo com a perda de sinal CFSE. Os dados foram analisados usando o software de análise FCSExpress 4 (De Novo Software, Glendale, CA, EUA) e BD CellQuest™ Pro (Becton Dickinson). As esferas CaliBRITE (BD Bioscience, Erembodegem-Aalst, Bélgica) foram usadas para calibrar os eventos de aquisição no citômetro.

[235] A capacidade inibitória das ASCs pré-

tratadas com NAC antes do congelamento foi semelhante às células não tratadas (Figura 8) (uma ligeira tendência do pré- tratamento com NAC para aumentar a capacidade inibitória das ASC também foi observada em um ou dois experimentos). EXEMPLO 7 – AVALIAÇÃO DE PRÉ-TRATAMENTO COM NAC NO

EFEITO DE ASC EM DIFERENCIAÇÃO E FUNÇÃO DE MACRÓFAGO E MDC

[236] Um segundo ensaio funcional in vitro que foi realizado para avaliar o efeito de NAC na capacidade imunomoduladora de ASC foi a modulação da diferenciação de monócitos. A Figura 9 mostra o tempo e a configuração dos experimentos.

AMOSTRAS SANGUÍNEAS

[237] As camadas leucoplaquetárias foram obtidas junto ao Transfusions Center em Comunidad de Madrid. Cerca de 50 a 60 ml de sangue foram diluídos com PBS à temperatura ambiente e distribuídos entre tubos de 50 ml em cima de 15 ml de Ficoll Hypaque Plus a temperatura ambiente. Em seguida, os tubos foram centrifugados por 40 minutos a 2000 rpm a 10 ºC sem freio ou aceleração. O anel branco de PBMCs foi coletado, lavado em 50 ml de PBS frio e centrifugado por 15 minutos a 1800 rpm a 10 ºC sem freio ou aceleração. Após uma segunda lavagem com 50 ml de meio completo RPMI frio (RPMIc: RPMI com 10% de FBS, 2 mM de L-Glu e 100 µg/ml de Pen/Strep), os tubos foram centrifugados por 15 minutos a 1500 rpm a 10 ºC com freio e aceleração. Uma última lavagem foi feita em 50 ml de RPMIc frio e centrifugado por 15 minutos a 1200 rpm a 10 ºC com freio e aceleração. PBMCs foram ressuspensas em RPMIc e contadas. As células foram ressuspensas em 100 milhões de células/ml a frio e o mesmo volume de RPMIc frio suplementado com 10% de DMSO foi adicionado, ou seja, concentração final de 5% de DMSO. As

PBMCs foram congeladas em nitrogênio líquido em frascos de 50 milhões de PBMCs. ISOLAMENTO DE MONÓCITOS CD14+

[238] Frascos congelados de PBMCs foram descongelados, contados e os monócitos CD14+ CD16- foram isolados usando o kit Dynabeads Untouched Human Monocytes (Dynal nº 11350D), seguindo as instruções do fabricante.

CULTURA E DIFERENCIAÇÃO DE MONÓCITOS HUMANOS

[239] Os monócitos CD14+ CD16- isolados (ver acima) foram plaqueados em 5 ml de RPMIc a 1,5 milhão de células por 6 poços (Falcon nº 353046), em normoxia. Os seguintes fatores foram adicionados para diferenciação em macrófagos M0 não polarizados ou polarização adicional em macrófagos M1, M2 e populações de células dendríticas maduras (mDC) em monoculturas (com base em várias publicações, incluindo Beyer et al., PLoS One (2012) 7(9): e45466; Erbel et al., J. Vis. Exp. (2013) 76: e50332; Zhou et al, 2014; Tarique et al, American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2015;53(5):676 a 688.

[240] DC imatura (iDC): RPMIc + 5 ng/ml de GM- SCF + 10 ng/ml de IL-4 por 5 dias

[241] Maturação de DC (mDC): no dia 5, adicionar 40 ng/ml de LPS (ou seja, adicionar 500 μl/poço de RPMIc suplementado com 400 ng/ml de LPS para o meio pré-existente).

[242] GM-CSF humano recombinante (nº 100-22B) e IL-4 (nº 200-04) eram da Peprotech. LPS (nº L8274) era da SIGMA. A adição de GM-CSF e IL4 medeia a diferenciação em células dendríticas imaturas (iDC); 5 dias mais tarde, a adição de LPS induz a maturação de iDCs em mDCs e, após 2 dias, o fenótipo e a função dessas DC maduras foram analisados na presença ou ausência de ASC.

EXPERIMENTOS DE COCULTURA COM ASCS

[243] Monócitos CD14+ CD16- humanos isolados de fresco foram cocultivados com ASCs do doador A ou doador B em transcavidades de 6 poços de policarbonato (inserções Corning nº 3412 e placas Falcon nº 353046).

[244] ASCs pré-tratadas com NAC (de acordo com os métodos no Exemplo 2), ou não tratadas, ASCs foram descongeladas e 150000 ASCs foram semeadas nas inserções transcavidade 16 horas ou 24 horas antes da configuração de cocultura em 1 ml de meio RPMIc, e 1,5 milhão de monócitos foram colocados no fundo do poço em 4 ml de meio RPMIc. A diferenciação foi realizada usando os mesmos fatores que na diferenciação de monócitos sozinhos (ver acima, nomeadamente a adição de GM-CSF e IL4 para induzir a diferenciação para iDC; 5 dias depois da adição de LPS para induzir a maturação de iDCs para mDCs, e após 2 dias, o fenótipo e a função dessas DC maduras foram analisados na presença ou ausência de ASC). ASCs foram mantidas na inserção transcavidade por toda a duração do processo de diferenciação.

[245] Os clusters de ativação não se formaram nas placas após a cocultura da mDC com ASCs pré-tratadas com NAC ou não tratadas, indicando que as ASCs modulam a ativação das mDCs e esse efeito não é interrompido pelo pré-tratamento com NAC (ver imagens de microscopia como ampliação 2x (Figura 10) e ampliação de 20x (Figura 11)). EXEMPLO 8 – PRÉ-TRATAMENTO DE NAC NÃO ALTERA

SIGNIFICATIVAMENTE A CAPACIDADE DE ASCS PARA MODULAR UMA FAGOCITOSE DE PARTÍCULAS STAPHYLOCOCCUS AUREUS POR MDC

[246] Foi analisado o efeito do NAC pré-

tratamento (de acordo com os métodos do Exemplo 2) sobre a capacidade dos ACS descongelados de modular a capacidade dos mDCs de fagocitar partículas de Staphylococcus aureus.

[247] Após a diferenciação em monocultura ou cocultura in vitro (as condições de diferenciação, incluindo as citocinas utilizadas, concentrações e tempos de diferenciação, são fornecidas no Exemplo 7), macrófagos e mDC foram colhidos usando 0,05% de Tripsina-EDTA por 10 minutos a 37 ºC. O potencial fagocítico de macrófagos polarizados ou mDC foi avaliado usando partículas de S. aureus conjugadas com pHRodo Red (Life Technologies nº A10010) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 50000 mDCs foram transferidas para poços de fundo em U de 96 poços (Corning nº 3799) e as células foram colocadas em repouso por 60 minutos em RPMIc. As partículas liofilizadas pHRodo conjugadas foram reconstituídas em 1 ml de RPMIc por frasco antes do uso, e as partículas foram sonicadas por 5 minutos em 20% de amplitude. Em seguida, 50 µl de pHRodo Zymosan foram adicionados por poço e as células foram incubadas por 60 minutos em normóxia a 37 ºC. Posteriormente, a fagocitose foi interrompida em gelo e as células foram lavadas e coradas com 5 μl de 7-aminoactinomicina D (7AAD) antes da análise FACS no citômetro Fortessa (BD). Os controles negativos para fagocitose foram células sem reagente pHRodo. Os resultados foram analisados no software FlowJo. A intensidade da fluorescência no canal PE é proporcional à quantidade de partículas bacterianas fagocitadas por célula.

[248] A Figura 12 mostra que a presença de ASC em condições sem contato (ou seja, as células mDC e ASC foram cocultivadas em placas transcavidade) resulta no aparecimento de uma nova população de células que é mais intensa no canal de fluorescência, ou seja, células que têm partículas fluorescentes fagocitadas. O pré-tratamento NAC de ASC com NAC não alterou sua capacidade de aumentar o potencial de fagocitose de mDCs. EXEMPLO 9 – EFEITO DE PRÉ-TRATAMENTO NAC EM EFEITOS

MEDIADOS POR ASC SOBRE A EXPRESSÃO DE SUPERFÍCIE EM CÉLULAS DENDRÍTICAS MADURAS.

[249] A capacidade de mDC para fagocitar bactérias está ligada à expressão de marcadores fagocíticos, como CD209 (DC-SIGN), CD206 (receptor de manose) ou CD163 (receptor de eliminação). Esses receptores de membrana reconhecem padrões específicos na superfície de fungos, bactérias e parasitas e medeiam sua fagocitose por monócitos, macrófagos e DC. O receptor CD163 intervém adicionalmente na eliminação de restos celulares de células apoptóticas após lesão tecidual, contribuindo para o processo de cicatrização de feridas.

[250] O efeito do pré-tratamento NAC (de acordo com o Exemplo 2) nos efeitos mediados por ASC descongelada na expressão de superfície dos receptores fagocíticos CD206 (receptor de manose) e CD163 (receptor de limpeza) por células dendríticas maduras foi medido por citometria de fluxo.

CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA

[251] Após a diferenciação em monocultura ou cocultura in vitro (as condições de diferenciação, incluindo as citocinas utilizadas, concentrações e tempos de diferenciação, são fornecidas no Exemplo 7), os macrófagos e mDC foram colhidos usando 0,05% de tripsina-EDTA por 10 minutos a 37 ºC, depois que os sobrenadantes foram coletados e congelados para análise futura de citocinas e/ou HPLC. Após a contagem de mDC, eles foram distribuídos em placas de fundo em V de 96 poços para coloração (Nunc nº 249570). As células foram incubadas em tampão Blue MACS com 1% de soro humano por 15 minutos em gelo, para bloquear a ligação do anticorpo não específico mediada pelo receptor Fcγ. Posteriormente, as células foram coradas por 20 minutos em gelo com as seguintes misturas de anticorpos (coloração em 50 µl de diluição de anticorpo 1:10; exceto para CD64, que foi diluição 1:20): chave Manchamento (TODOS OS POÇOS COM 7AAD) 1 CD14-APC/HLAII-FITC 1:50/CD86-PE 2 CD14-APC+ CD206-PE/CD209-FITC 3 CD14-APC/CD163-PE 4 CD14-APC/CD80-FITC/CD64-PE 1:20 5 CD14-APC/CD1a-PE

[252] Os detalhes dos anticorpos usados são listados na tabela a seguir: HOSPED CAT.

NOME FLUOROCROMO CLONE EMPRESA EIRO NÚMERO

CAMUND CD1a PE HI149 555807 BD

ONGO

CAMUND CD14 APC M5E1 555399 BD

ONGO CAMUND Miltenyi CD64 PE 10,1 CD6404 ONGO Biotech

CAMUND CD68 PeCy7 27-35 560542 BD

ONGO

CAMUND CD80 PE L307.4 557227 BD

ONGO

CAMUND CD86 PE IT2.2 555665 BD

ONGO

CAMUND CD206 PE 19.2 555954 BD

ONGO HOSPED CAT. NOME FLUOROCROMO CLONE EMPRESA EIRO NÚMERO

CAMUND CD209 FITC DCN46 551264 BD

ONGO CAMUND Ebioscience HLA-II PE WR18 MA1-80680 ONGO s

[253] A viabilidade celular foi avaliada pela adição de 5 μl de 7AAD por poço e coloração por 10 minutos em gelo, e as amostras foram adquiridas em um citômetro BD Fortessa. Os resultados foram analisados no software FSC Express.

[254] A capacidade de mDC para fagocitar bactérias está ligada à expressão de marcadores fagocíticos, como CD209 (DC-SIGN), CD206 (receptor de manose) ou CD163 (receptor de eliminação). Esses receptores de membrana reconhecem padrões específicos na superfície de fungos, bactérias e parasitas e medeiam sua fagocitose por monócitos, macrófagos e DC. O receptor CD163 intervém adicionalmente na eliminação de restos celulares de células apoptóticas após lesão tecidual, contribuindo para o processo de cicatrização de feridas. O efeito do pré-tratamento NAC (de acordo com o Exemplo 2) nos efeitos mediados por ASC descongelada na expressão de superfície dos receptores fagocíticos CD206 (receptor de manose) e CD163 (receptor de limpeza) por células dendríticas maduras foi medido por citometria de fluxo.

[255] ASC regula positivamente a expressão de marcadores CD206 e CD163 na superfície de monócitos, macrófagos e mDC, e essa regulação positiva estava intacta mesmo quando ASC foi pré-tratada com NAC (Figuras 13 e 14).

[256] O efeito do pré-tratamento com NAC (de acordo com o Exemplo 2) nos efeitos mediados por ASC descongelada na expressão de superfície de CD14 e CD1a em células dendríticas maduras também foi medido por citometria de fluxo. As mDCs são CD14-CD1a+. CD1a é a molécula apresentadora de antígeno e medeia a apresentação de antígenos por mDC para outras células do sistema imunológico para ativar sua resposta. ASCs modulam o fenótipo dessas mDCs, transformando-as em células CD14+CD1a-. A essa população foram atribuídas propriedades anti-inflamatórias e regulatórias (Chang et al., Journal of Immunology, 165(7), 3584 a 3591).

[257] A Figura 15 mostra que pré-tratamento com NAC de ASC não altera a capacidade das ASCs descongeladas de induzir a formação desta população reguladora de mDC.

MODALIDADES NUMERADAS

[258] A invenção também fornece as modalidades numeradas a seguir:

1. Um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende as etapas de: a. tratar uma população de células-tronco com N- acetilcisteína (NAC) para obter uma população de células- tronco tratada; e b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada.

2. O método, de acordo com a modalidade 1, em que o método compreende as etapas de: a. tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; e c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

3. O método, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o método compreende as etapas de: a. tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. lavar a população de células-tronco tratada para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada, e congelar a população de células-tronco lavada para obter uma população de células-tronco congelada; e c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

4. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de tratamento compreende incubar a população de células-tronco com NAC por pelo menos cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24 ou 48 horas antes do congelamento da população de células-tronco.

5. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de tratamento compreende adicionar NAC à população de células-tronco a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 10 mM.

6. O método, de acordo com a modalidade 5, em que a etapa de tratamento compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré- selecionado.

7. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 6, em que o método compreende ainda a etapa de: d. cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida.

8. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 6, em que o método compreende ainda a etapa de: d. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida.

9. O método, de acordo com a modalidade 8, em que a etapa de cultivo compreende adicionar NAC a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 5 mM.

10. O método, de acordo com a modalidade 9, em que a etapa de cultivo compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré- selecionado.

11. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 8 a 10, em que o método compreende ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco expandida para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada e expandida.

12. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 2 a 11, em que o método compreende ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco descongelada ou da população de células-tronco expandida e ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

13. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 12, em que o método compreende ainda a etapa de: e. congelar a população de células-tronco expandida ou lavada e expandida para obter uma população de células-

tronco expandida congelada ou uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida.

14. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 7 a 13, em que o método compreende ainda as etapas de: e. congelar a população de células-tronco expandida ou lavada e expandida para obter uma população de células- tronco expandida congelada ou uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida; e f. descongelar a população de células-tronco congelada expandida ou congelada, lavada e expandida para obter a população de células-tronco expandida descongelada.

15. O método, de acordo com a modalidade 14, em que o método compreende ainda a etapa de: g. lavar a população de células-tronco expandida descongelada e ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

16. Um método para criopreservação de célula-tronco, em que o método compreende as etapas de: a. congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; b. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; e c. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida.

17. O método, de acordo com a modalidade 16, em que a etapa de cultivo compreende adicionar NAC a uma concentração inicial de cerca de 0,5 a 5 mM.

18. O método, de acordo com a modalidade 17, em que a etapa de cultivo compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré- selecionado.

19. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de congelamento compreende reduzir a temperatura para entre -70 ºC e -130 ºC a uma taxa entre cerca de -0,5 a cerca de -10 ºC/minuto.

20. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a etapa de congelamento compreende reduzir a temperatura de +4 ºC para entre -100 e -180 ºC em 10-60 min.

21. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a população de células-tronco é descongelada a 37 ºC.

22. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a densidade celular da população de células-tronco congelada está na faixa de cerca de 1 milhão a cerca de 50 milhões de células/ml, preferencialmente cerca de 25 milhões de células/ml.

23. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a população de células-tronco é substancialmente pura.

24. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células-tronco são células- tronco mesenquimais (MSCs).

25. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células-tronco são células- tronco estromais derivadas de adipose (ASCs).

26. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que as células-tronco são células humanas.

27. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende ainda a etapa de ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

28. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende congelar a população de células-tronco em uma pluralidade de criotubos.

29. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o método compreende repetir as etapas de qualquer uma das modalidades anteriores para uma pluralidade de populações de células-tronco.

30. O método, de acordo com a modalidade 29, em que o método compreende congelar a pluralidade de populações de células-tronco em uma pluralidade de criotubos.

31. O método, de acordo com a modalidade 28 ou 30, em que o método compreende armazenar a pluralidade de frascos de criopreservação em um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido por pelo menos um mês, pelo menos 2 meses, pelo menos 3 meses, pelo menos 6 meses ou pelo menos 1 ano.

32. Um recipiente de armazenamento de nitrogênio líquido contendo a pluralidade de frascos de criopreservação obtidos de acordo com o método, de acordo com a modalidade 28 ou 30.

33. Uma população de células-tronco obtida pelo método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31.

34. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31, ou a população de células-tronco, de acordo com a modalidade 33, em que o número de células viáveis após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia ou cerca de 4 dias é aumentado em comparação com uma população de células-tronco de controle.

35. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 34, ou a população de células-tronco, de acordo com a modalidade 33 ou 34, em que o número de células viáveis após o descongelamento é aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em comparação com uma população de células-tronco de controle.

36. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31, 34 ou 35, ou a população de células-tronco, de acordo com as modalidades 33 a 35, em que a taxa de crescimento após o descongelamento é aumentada pelo menos cerca de pelo menos cerca de 1,03 vez, 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,25 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes na população de células-tronco em comparação com uma população de células-tronco de controle.

37. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31, 34 a 36, ou a população de células-tronco, de acordo com as modalidades 33 a 36, em que a atividade mitocondrial após o descongelamento e opcionalmente cultivo por cerca de 1 dia ou cerca de 4 dias é aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de

50% em comparação com uma população de células-tronco de controle.

38. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31, 34 a 37, ou a população de células-tronco, de acordo com as modalidades 33 a 37, em que o tempo decorrido após o descongelamento para as ASCs se recuperarem é reduzido em comparação com uma população de células-tronco de controle.

39. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1a 31, 34 a 38, ou a população de células-tronco, de acordo com as modalidades 33 a 38, em que o número de horas necessárias para as células se recuperarem após o descongelamento é reduzido pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em relação a uma população de células-tronco de controle.

40. Uma composição de criopreservação que compreende a população de células-tronco, de acordo com qualquer uma das modalidades 33 a 38, e um meio de criopreservação.

41. A composição de criopreservação, de acordo com a modalidade 40, em que a composição é congelada.

42. A composição de criopreservação, de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que a composição contém NAC.

43. A composição farmacêutica que compreende a população de células-tronco, de acordo com qualquer uma das modalidades 33-38, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

44. A composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 43, em que a composição compreende em torno de 1 milhão de células a cerca de 150 milhões de células,

preferencialmente 30 milhões de células ou cerca de 120 milhões de células.

45. A composição farmacêutica, de acordo com a modalidade 43 ou 44, em que a densidade celular é de cerca de 1 a 20 milhões de células/ml.

46. Uso de NAC para a criopreservação de células- tronco.

47. O uso de NAC, de acordo com a modalidade 46, no método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 31 e 34 a 39.

48. A população de células-tronco, de acordo com qualquer uma das modalidades 33 a 39, composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 43 a 45, ou composição de criopreservação, de acordo com as modalidades 40 a 42, para uso em terapia.

49. A população de células-tronco, de acordo com qualquer uma das modalidades 33 a 39, composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 43 a 45, ou composição de criopreservação, de acordo com as modalidades 40 a 42, para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão em um paciente com essa necessidade.

50. Um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em que o método compreende administrar a população de células-tronco, de acordo com qualquer uma das modalidades 33 a 39, composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 43 a 45, ou composição de criopreservação, de acordo com as modalidades 40 a 42, a um indivíduo com essa necessidade.

51. Uma população de células-tronco para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: a. tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; d. opcionalmente cultivar a população de células- tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e e. administrar a população de células-tronco ao paciente.

52. Um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: a. tratar uma população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; d. opcionalmente cultivar a população de células- tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida; e e. administrar a população de células-tronco ao paciente.

53. A população de células-tronco para uso, de acordo com a modalidade 51, ou método de tratamento, de acordo com a modalidade 52, em que o método compreende ainda qualquer uma das etapas, conforme definido nas modalidades 3 a 14, 18 a 31 ou 34 a 39, antes da administração da população de células- tronco ao paciente.

54. Uma população de células-tronco para uso em um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: a. congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; b. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; c. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e d. administrar a população de células-tronco ao paciente.

55. Um método de tratamento de fístula e/ou tratamento e/ou prevenção de um distúrbio inflamatório, uma doença autoimune ou uma doença imunologicamente mediada, como sepse, artrite reumatoide, alergias (por exemplo, reações de hipersensibilidade tipo IV), doença do intestino irritável, doença de Crohn, colite ulcerosa ou rejeição de órgão, em um paciente com essa necessidade, em que o método compreende as etapas de: a. congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; b. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; c. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida; e d. administrar a população de células-tronco ao paciente.

56. A população de células-tronco para uso, de acordo com a modalidade 54, ou método de tratamento, de acordo com a modalidade 55, em que o método compreende ainda qualquer uma das etapas, conforme definido em qualquer uma das modalidades 15-31 ou 34 a 39, antes da administração da população de células-tronco ao paciente.

57. A população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 48, 49, 51, 53, 54 ou 56, ou o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 50, 52, 53, 55 ou 56, em que o método compreende administrar cerca de 1 milhão a 150 milhões de células, preferencialmente 30 milhões de células-tronco ou cerca de 120 milhões de células-tronco.

58. A população de células-tronco, composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 48, 49, 51, 53, 54, 56 ou 57, ou o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 50, 52, 53, 55 a 57, em que o método compreende administrar cerca de 1 milhão a cerca de 10 milhões de células/kg.

59. A população de células-tronco ou composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 48, 49, 51, 53, 54, 56-58, ou o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 50, 52, 53, 55 a 58, em que o método compreende injetar a população de células-tronco ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades 43 a 45, ou composição de criopreservação, de acordo com qualquer uma das modalidades 40 a 42.

60. A população de células-tronco ou composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 48, 49, 51, 53, 54, 56 a 59, ou o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 50, 52, 53, 55 a 59, em que as células-tronco são conforme definido em qualquer uma das modalidades 23 a 26.

61. A população de células-tronco ou composição farmacêutica ou composição de criopreservação para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 48, 49, 51, 53, 54, 56 a 60, ou o método, de acordo com qualquer uma das modalidades 50, 52, 53, 55 a 60, em que as células-tronco são alogênicas ou autólogas.

62. Um kit de criopreservação que compreende: um criotubo, um recipiente contendo NAC e um recipiente que compreende uma a população de células-tronco.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULA-TRONCO, caracterizado por compreender as etapas de: a. tratar uma população de células-tronco com N- acetilcisteína (NAC) para obter uma população de células- tronco tratada; e b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de: a. tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. congelar a população de células-tronco tratada para obter uma população de células-tronco congelada; e c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender as etapas de: a. tratar a população de células-tronco com NAC para obter uma população de células-tronco tratada; b. lavar a população de células-tronco tratada para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada, e congelar a população de células-tronco lavada para obter uma população de células-tronco congelada; e c. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela etapa de tratamento compreender: incubar a população de células-tronco com NAC por pelo menos cerca de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 24 ou 48 horas antes de congelar a população de células-tronco; e/ou adicionar NAC à população de células-tronco a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 10 mM, opcionalmente em que a etapa de tratamento compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por compreender ainda a etapa de: d. cultivar a população de células-tronco descongelada para obter uma população de células-tronco expandida.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por compreender ainda a etapa de: d. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida, opcionalmente em que: a etapa de cultivo compreende adicionar NAC a uma concentração inicial na faixa de cerca de 0,5 a 5 mM, ainda opcionalmente em que a etapa de cultivo compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado; e/ou o método compreende ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco expandida para remover a NAC e para obter uma população de células-tronco lavada e expandida.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado por compreender ainda uma etapa de lavagem da população de células-tronco descongelada ou da população de células-tronco expandida e ressuspensão das células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado por compreender ainda a etapa de: e. congelar a população de células-tronco expandida ou lavada e expandida para obter uma população de células- tronco expandida congelada ou uma população de células-tronco congelada, lavada e expandida; e opcionalmente f. descongelar a população de células-tronco congelada expandida ou congelada, lavada e expandida para obter uma população de células-tronco expandida descongelada; e ainda opcionalmente g. lavar a população de células-tronco expandida descongelada e ressuspender as células em um carreador farmaceuticamente aceitável.

9. MÉTODO PARA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULA-TRONCO, caracterizado por compreender as etapas de: a. congelar uma população de células-tronco para obter uma população de células-tronco congelada; b. descongelar a população de células-tronco congelada para obter uma população de células-tronco descongelada; e c. cultivar a população de células-tronco descongelada na presença de NAC para obter uma população de células-tronco expandida, opcionalmente em que a etapa de cultivo compreende adicionar NAC a uma concentração inicial de cerca de 0,5 a 5 mM, ainda opcionalmente em que a etapa de cultivo compreende uma ou mais adições de NAC adicionais para manter a concentração de NAC em um nível pré-selecionado.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelas células-tronco serem células-tronco mesenquimais (MSCs) e/ou em que as células- tronco são células-tronco estromais derivadas de adipose (ASCs).

11. POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, caracterizada por ser obtida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. POPULAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por: o número de células viáveis após descongelamento e, opcionalmente, cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias, ser aumentado em comparação a uma população de células-tronco de controle; o número de células viáveis após descongelamento ser aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em comparação com uma população de células-tronco de controle; a taxa de crescimento após descongelamento ser aumentada pelo menos cerca de 1,03 vez, 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,25 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes na população de células-tronco em comparação com uma população de células- tronco de controle; atividade mitocondrial após descongelamento e, opcionalmente, cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias ser aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% em comparação com uma população de células-tronco de controle; o tempo decorrido após o descongelamento para as ASCs se recuperarem ser reduzido em comparação com a população de células-tronco de controle; e/ou o número de horas necessário para as células se recuperarem após o descongelamento ser diminuído pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em relação a uma população de células-tronco de controle, em que a população de células-tronco de controle é derivada da mesma população de células-tronco que a população de células-tronco tratada com NAC e não foi tratada com NAC, mas, de outro modo, foi submetida a condições idênticas.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por: o número de células viáveis após descongelamento e, opcionalmente, cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias ser aumentado em comparação a uma população de células-tronco de controle; o número de células viáveis após descongelamento ser aumentado pelo menos cerca de 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,5 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em comparação com uma população de células-tronco de controle; a taxa de crescimento após descongelamento ser aumentada pelo menos cerca de 1,03 vez, 1,05 vez, pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,15 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,25 vez, pelo menos cerca de 1,3 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez ou pelo menos cerca de 2 vezes na população de células-tronco em comparação com uma população de células- tronco de controle; por atividade mitocondrial após descongelamento e, opcionalmente, cultivo por cerca de 1 dia e/ou cerca de 4 dias ser aumentada pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40% ou pelo menos cerca de 50% em comparação com uma população de células-tronco de controle; o tempo decorrido após o descongelamento para as ASCs se recuperarem ser reduzido em comparação com a população de células-tronco de controle; e/ou o número de horas necessário para as células se recuperarem após o descongelamento ser diminuído pelo menos cerca de 1,1 vez, pelo menos cerca de 1,2 vez, pelo menos cerca de 1,4 vez, pelo menos cerca de 1,6 vez, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes ou pelo menos cerca de 5 vezes em relação a uma população de células-tronco de controle.

14. COMPOSIÇÃO DE CRIOPRESERVAÇÃO, caracterizada por compreender a população de células-tronco conforme definida em qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, e um meio de criopreservação, opcionalmente em que a composição é congelada e/ou opcionalmente em que a composição contém NAC.

15. USO DE NAC, caracterizado por ser para a criopreservação de células-tronco.

16. KIT DE CRIOPRESERVAÇÃO, caracterizado por compreender: um criotubo, um recipiente contendo NAC e um recipiente que compreende uma população de células-tronco.