CN102228016B - 一种神经干细胞冻存复苏的方法 - Google Patents

一种神经干细胞冻存复苏的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种神经干细胞冻存、复苏的方法，并提供了通过该方法制备的细胞存活率在90％以上的冻存、复苏的神经干细胞溶液。同时，本发明还提供了用于上述神经干细胞冻存复苏方法所用的冻存液和复苏液。

Description

一种神经干细胞冻存复苏的方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法。本发明通过添加EGF和bFGF两种细胞因子，使得神经干细胞冻存复苏率大大提高，由现有技术中的40％左右达到90％以上，本发明对神经干细胞成功地进行了冻存、复苏，对临床择期进行干细胞移植手术和建立“干细胞库”具有重要的意义。
背景技术
神经干细胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成体脑、脊髓等组织中的一种干细胞，是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，可通过不对等的分裂方式分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经组织的各类细胞，也可转分化成血细胞和骨骼肌细胞。在脑、脊髓等所有神经组织中，不同的神经干细胞类型产生的子代细胞种类不同，分布也不同。目前的科学技术已经可以在体外培养扩增神经干细胞，用于生命科学研究、药物筛选测试、临床应用研究等领域。由于神经干细胞冻存后复苏率直接影响着神经干细胞的质和量，为获得来源方便的神经干细胞，改进神经干细胞冻存复苏技术、建立一种能够长期储存干细胞的方法对促进神经干细胞的研究和应用具有重要意义。
目前，神经干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。目前神经干细胞无血清冻存液的主要成分是70％的无血清培养基、20％牛血清白蛋白(BSA)和10％二甲基亚砜(DMSO)。
冻存程序一般是梯度降温的方法，降温速度大约是1℃/分钟。
对冻存的细胞进行复苏时，一般是将冻存管直接置于37℃迅速解冻，然后加入完全生长培养基重悬细胞，离心弃上清后，再加入完全生长培养基继续培养，以供后续的研究或测试使用。
结合上述无血清冻存和复苏技术对神经干细胞进行冻存和复苏，冻存后复苏率仅有40％左右，远低于含血清的冻存技术。
因此，本领域需要新的对神经干细胞进行冻存和复苏的方法，以提高神经干细胞的冻存复苏率，从而获得优质的神经干细胞冻存复苏产品，为以后神经干细胞移植手术和建立“干细胞库”等应用奠定良好的基础。
发明内容
本发明涉及一种神经干细胞冻存复苏的方法，该方法对冻存液、复苏液、冻存程序、复苏程序等进行了改进和优化，使神经干细胞的复苏率相对于现有技术的方法大大提高，从现有技术所获得的40％左右的复苏率提高到90％以上。
具体地，本发明的神经干细胞冻存复苏方法包括以下步骤：冻存步骤、复苏步骤和洗涤步骤，其中冻存步骤包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤；复苏步骤包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤；洗涤步骤包括将复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用。
本发明在传统的冻存液配方中添加了生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。所述EGF在冻存液中的终浓度为0.008-0.04μg/ml、优选0.009-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml；所述bEGF在冻存液中的终浓度为0.008-0.04μg/ml、优选0.009-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml。
在一个具体实施方案中，所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM，丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM，N-乙酰半胱氨酸(NAC)，终浓度0.8-1.2mM，EGF(表皮生长因子)，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，终浓度0.005-0.04μg/ml、优选0.008-0.03μg/ml，最优选0.01-0.02μg/ml，二甲基亚砜(DMSO)，终浓度7-8％(v/v)，牛血清白蛋白(BSA)，终浓度0.08-0.12g/ml。上述DMEM培养液、DMEM/F12培养液、B27添加剂和N2添加剂是培养神经干细胞的常用公知添加剂，购自Invitrogen公司，它们也可以从其它商业渠道购买得到。在配制过程中，将上述B27添加剂(Invitrogen，50倍浓度(50×))、N2添加剂(Invitrogen，100倍浓度(100×))加入DMEM或DMEM/F12培养液(Invitrogen，1倍浓度(1×))中，使B27添加剂、N2添加剂的终浓度分别为0.8×-1.2×浓度，优选Invitrogen公司建议使用的1倍浓度B27添加剂(1×B27添加剂)终浓度和1倍浓度N2添加剂(1×N2添加剂)终浓度。
在具体的实施方案中，前述的DMEM培养液可以用本领域培养细胞常用的其它细胞培养液替代，优选用DMEM/F12培养液代替。DMEM培养液是本领域常用的公知细胞培养液，包含：甘氨酸，0.4mM，L-精氨酸，0.398mM，L-胱氨酸，0.201mM，L-谷氨酰胺，4mM，L-组氨酸，0.2mM，L-异亮氨酸，0.802mM，L-亮氨酸，0.802mM，L-赖氨酸，0.798mM，L-蛋氨酸，0.201mM，L-苯丙氨酸，0.4mM，L-丝氨酸，0.4mM，L-苏氨酸，0.798mM，L-色氨酸，0.0784mM，L-酪氨酸，0.398mM，L-缬氨酸，0.803mM，氯化胆碱，0.0286mM，D-泛酸钙，0.00839mM，叶酸，0.00907mM，烟酰胺，0.0328mM，维生素B6，0.0194mM，核黄素，0.00106mM，盐酸硫胺，0.0119mM，肌醇，0.04mM，氯化钙，1.8mM，硝酸铁，0.000248mM，硫酸镁，0.814mM，氯化钾，5.33mM，碳酸氢钠，44.05mM，氯化钠，81.9mM，磷酸二氢钠，0.906mM，葡萄糖，25mM，羟乙基哌嗪乙磺酸，25.03mM。
DMEM/F 12培养液是本领域常用的公知细胞培养液，包含：甘氨酸，0.25mM，L-丙氨酸，0.05mM，L-精氨酸，0.699mM，L-天冬酰胺，0.05mM，L-天冬氨酸，0.05mM，L-半胱氨酸，0.0998mM，L-胱氨酸，0.1mM，L-谷氨酸，0.05mM，L-谷氨酰胺，2.5mM，L-组氨酸，0.15mM，L-异亮氨酸，0.416mM，L-亮氨酸，0.451mM，L-赖氨酸，0.499mM，L-甲硫氨酸，0.116mM，L-苯丙氨酸，0.215mM，L-脯氨酸，0.15mM，L-丝氨酸，0.25mM，L-苏氨酸，0.449mM，L-色氨酸，0.0442mM，L-酪氨酸，0.214mM，L-缬氨酸，0.452mM，生物素，0.0000143mM，氯化胆碱，0.0641mM，D-泛酸钙，0.0047mM，叶酸，0.00601mM，烟酰胺，0.0166mM，吡哆醇，0.00971mM，核黄素，0.000582mM，盐酸硫胺，0.00644mM，维生素B12，0.000502mM，i-肌醇，0.07mM，氯化钙，1.05mM，硫酸铜，0.0000052mM，硝酸铁，0.000124mM，硫酸铁，0.0015mM，氯化镁，0.301mM，硫酸镁，0.407mM，氯化钾，4.16mM，碳酸氢钠，14.29mM，氯化钠，120.61mM，磷酸氢二钠，0.5mM，磷酸二氢钠，0.453mM，硫酸锌，0.0015mM，葡萄糖，17.51mM，4-羟乙基哌嗪乙磺酸，15.02mM，次黄嘌呤钠，0.015mM，亚油酸，0.00015mM，硫辛酸，0.00051mM，酚红，0.0215mM，腐胺，0.000503mM，丙酮酸钠，0.5mM，胸苷，0.00151mM。
上述B27添加剂包含：生物素，肾上腺皮质酮，孕酮，乙酸维生素A，人重组胰岛素，三碘甲腺原氨酸，维生素E，乙酸维生素E，还原谷胱甘肽，过氧化物歧化酶，盐酸肉碱，盐酸乙醇胺，D-半乳糖，盐酸腐胺，亚油酸，亚麻酸，牛血清白蛋白(无脂肪酸)，人转铁蛋白，亚硒酸钠。上述N2添加剂包含：胰岛素5mg/L，孕酮20nM，腐胺100uM，亚硒酸钠30nM，转铁蛋白100mg/L。
在一个具体的实施方案中，所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，NAC，终浓度1.0mM，EGF，终浓度0.01μg/ml，bFGF，终浓度0.01μg/ml，DMSO，终浓度7.5％(v/v)，BSA，终浓度0.1g/ml。在另一个具体实施方案中，所述冻存液为DMEM或DMEM/F 12培养液中包含：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，NAC，终浓度1.0mM，EGF，终浓度0.02μg/ml，bFGF，终浓度0.02μg/ml，DMSO，终浓度7.5％(v/v)，BSA，终浓度0.1g/ml。
向神经干细胞悬液中加入适量的冻存液，使细胞终浓度在0.8-1.2×10^6个细胞/ml，然后进行降温冻存。以前的降温方法是用程序降温仪以每分钟降1摄氏度的速度对细胞均匀梯度降温，然后保存到液氮中。本发明的方法是将细胞悬液在低温，优选在-15℃至-25℃，更优选在-18℃至-22℃，最优选在-20℃放置一段时间，优选20-40分钟，更优选25-35分钟，最优选30分钟，然后在-65℃至-75℃，优选在-68℃至-72℃，最优选在-70℃放置12-16个小时，然后转入液氮中长期冻存。
传统的神经干细胞冻存复苏方法不用复苏液，而是把冻存的细胞从液氮中取出，直接放到37摄氏度解冻，然后用完全培养基洗涤，再放到完全培养基中培养。本发明的复苏步骤采用了在DMEM或DMEM/F12培养液中包含如下成分的复苏液：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM，丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM，NAC，终浓度0.8-1.2mM和BSA，终浓度0.008-0.012g/ml。在一个具体的实施方案中，所述复苏液在DMEM或DMEM/F12培养液中包含：1×B27添加剂，1×N2添加剂，L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，NAC，终浓度1.0mM和BSA，终浓度0.01g/ml。
上述复苏液中所使用的DMEM培养液、DMEM/F12培养液、B27添加剂和N2添加剂购自Invitrogen公司，它们也可以从其它商业渠道购买得到。在配制过程中，将上述B27添加剂(Invitrogen，50×)、N2添加剂(Invitrogen，100×)加入DMEM或DMEM/F12培养液(Invitrogen，1×)中，使B27添加剂、N2添加剂的终浓度分别为0.8×-1.2×浓度，优选Invitrogen公司建议使用的1×B27添加剂终浓度和1×N2添加剂终浓度。
在具体的实施方案中，本发明的复苏过程中增加了激活的步骤，该激活的温度为35℃至45℃，优选为38℃至42℃，最优选为40℃。传统的复苏方法是将装有冻存的神经干细胞的冻存管从液氮中取出，直接置于37摄氏度，而我们的方法是从液氮中取出后先激活1.5-2.5分钟，再置于37摄氏度。具体地，该复苏过程包括将液氮中的冻存细胞取出，在35℃至45℃，优选在38℃至42℃，最优选在40℃水浴中温育1.5-2.5分钟；加入8-12倍体积的37℃预热的复苏液重悬，离心去上清，再用DMEM或DMEM/F 12培养液洗涤。洗涤时，可加入4-6倍体积的DMEM或DMEM/F12培养液重悬，离心去上清；重复前一步用DMEM或DMEM/F12再次洗涤；加入1-1.5倍体积的Hibernation培养基(该培养基的成分：KCl 2.24g/L、NaOH 0.2g/L、NaH2PO4.2H2O 0.78g/L、MgCl2.6H2O 0.1g/L、丙酮酸钠2.2g/L、葡萄糖1.0g/L和山梨(糖)醇36.4g/L)重悬。所获得的细胞悬液用于之后的研究测试。
通过本发明的冻存复苏方法，活神经干细胞占90％以上，也就是说复苏率在90％以上。这样的神经干细胞是临床应用，例如通过神经干细胞移植治疗神经系统疾病，和建立“干细胞库”所期望的。
附图说明
图1a-b：该图为CountessTM全自动细胞计数仪(CountessTM antomated cellcounter)记录的实验结果。其中，图1a为实施例1的方法获得的实验结果，自动细胞计数仪显示活细胞浓度(Viable cell concentration)9.6×10^5个细胞/ml，与冻存前的1.0×10^6个细胞/ml相比，复苏率达96％。图1b为对比例1的方法获得的实验结果，自动细胞计数仪显示活细胞浓度3.5×10^5个细胞/ml，与冻存前的1.0×10^6个细胞/ml相比，复苏率为35％。
图2a-b：该图为CountessTM全自动细胞计数仪记录的实验结果，其中图2a为实施例2的方法获得的实验结果，自动细胞计数仪显示活细胞浓度9.4×10^5个细胞/ml，与冻存前的1.0×10^6个细胞/ml相比，复苏率达94％。图2b为从对比例2的方法获得的实验结果，自动细胞计数仪显示活细胞浓度4.0×10^5个细胞/ml，与冻存前的1.0×10^6个细胞/ml相比，复苏率为40％。
具体实施方式
实施例1：
获取鼠脑组织皮层神经干细胞1.0×10^6个细胞，加入一定体积的冻存液，使细胞悬液的最终浓度为1.0×10^6个细胞/ml，将细胞悬液在-20℃放置30分钟，在-70℃放置12-16个小时，然后转入液氮中冻存。
1周后将液氮中的冻存细胞取出，在40℃水浴锅中温育2分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬，离心去上清；加入5倍体积的DMEM培养液重悬，再次离心去上清；重复该洗涤步骤；然后加入1倍体积的Hibernation培养基(购自Invitrogen公司)重悬，经自动细胞计数仪计数，获得9.6×10^5个细胞/ml，复苏率为96％(参见图1a)。
本实施例中，冻存液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen)中含有：
1×B27添加剂(Invitrogen)，
1×N2添加剂(Invitrogen)，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，
NAC，终浓度1.0mM，
EGF(购自Invitrogen公司)，终浓度0.01μg/ml，
bFGF(购自Invitrogen公司)，终浓度0.01μg/ml，
DMSO，终浓度7.5％(v/v)，
BSA(购自Invitrogen公司)，终浓度0.1g/ml。
复苏液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen)中含有：
1×B27添加剂(Invitrogen)，
1×N2添加剂(Invitrogen)，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，
NAC，终浓度1.0mM，
BSA，终浓度0.01g/ml。
对比例1：
获取鼠脑组织皮层神经干细胞1.0×10^6个细胞，加入一定体积的冻存液，使细胞悬液的最终浓度为1.0×10^6个细胞/ml，将细胞悬液在程序降温仪中以1℃/分钟的速度降温至-150℃，然后转入液氮中冻存。
1周后将液氮中的冻存细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，加入5倍体积的DMEM培养液重悬，离心去上清；重复该洗涤步骤；然后加入1倍体积的DMEM培养液重悬，经自动细胞计数仪计数，获得3.5×10^5个细胞/ml，复苏率为35％(参见图1b)。
对照方法中，冻存液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen公司产品)中含有：
1×B27添加剂(Invitrogen公司产品)，
1×N2添加剂(Invitrogen公司产品)，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM，
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM，
NAC，终浓度1.0mM，
DMSO，终浓度7.5％(v/v)，
BSA(购自Invitrogen公司)，终浓度0.1g/ml。
实施例2：
获取鼠脑组织皮层神经干细胞1.0×10^6个细胞，加入一定体积的冻存液，使细胞悬液的最终浓度为1.0×10^6个细胞/ml，将细胞悬液在-20℃放置30分钟，在-70℃放置12-16个小时，然后转入液氮中冻存。
1周后将液氮中的冻存细胞取出，在40℃水浴锅中温育2分钟；加入10倍体积的37℃预热的复苏液重悬，离心去上清；加入5倍体积的DMEM培养液重悬，再次离心去上清；重复前一步用DMEM再次洗涤；加入1倍体积的Hibernation培养基(购自Invitrogen公司)重悬，经自动细胞计数仪计数，获得9.4×10^5个细胞/ml，复苏率为94％(参见图2a)。
本实施例中，冻存液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen公司产品)中含有：
0.91×B27添加剂(Invitrogen公司产品)，
0.91×N2添加剂(Invitrogen公司产品)，L-谷氨酰胺，终浓度为1.82mM
丙酮酸钠，终浓度为0.91mM，
NAC，终浓度0.91mM，
EGF(购自Invitrogen公司)，终浓度0.02μg/ml，
bFGF(购自Invitrogen公司)，终浓度0.02μg/ml，
DMSO，终浓度7.5％(v/v)，
BSA(购自Invitrogen公司)，终浓度0.1g/ml。
复苏液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen公司产品)中含有：
0.95×B27添加剂(Invitrogen公司产品)，
0.95×N2添加剂(Invitrogen公司产品)，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.9mM，
丙酮酸钠，终浓度为0.95mM，
NAC，终浓度1.0mM，
BSA，终浓度0.01g/ml。
对比例2：
获取鼠脑组织皮层神经干细胞1.0×10^6个细胞，加入一定体积的冻存液，使细胞悬液的最终浓度为1.0×10^6个细胞/ml，将细胞悬液在程序降温仪中以1℃/分钟的速度降温至-150℃，然后转入液氮中冻存。
1周后将液氮中的冻存细胞取出，在37℃水浴锅中解冻，加入5倍体积的DMEM培养液重悬，离心去上清；重复该洗涤步骤；然后加入1倍体积的DMEM培养液重悬，经自动细胞计数仪计数，获得4.0×10^5个细胞/ml，复苏率为40％(参见图2b)。
对照方法中，冻存液的成分是在DMEM培养液(Invitrogen公司产品)中含有：
0.91×B27添加剂(Invitrogen公司产品)，
0.91×N2添加剂(Invitrogen公司产品)，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.82mM，
丙酮酸钠，终浓度为0.91mM，
NAC  终浓度0.91mM，
DMSO，终浓度7.5％(v/v)，
BSA(购自Invitrogen公司)，终浓度0.1g/ml。

Claims (18)

1.一种神经干细胞冻存复苏的方法，包括以下步骤：
1）冻存步骤：包括向神经干细胞悬液中加入冻存液和在液氮中冻存的步骤；
2）复苏步骤：包括向从液氮中取出的冻存细胞中加入复苏液使细胞复苏的步骤；
3）将复苏的细胞液洗涤后制备成细胞悬液备用，
其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM
丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM
N-乙酰半胱氨酸（NAC），终浓度0.8-1.2mM
EGF，终浓度0.005-0.04μg/ml
bFGF，终浓度0.005-0.04μg/ml
二甲基亚砜（DMSO），终浓度7-8%（v/v）
牛血清白蛋白（BSA），终浓度0.08-0.12g/ml。
2.权利要求1的方法，其中所述EGF终浓度为0.008-0.03μg/ml。
3.权利要求2的方法，其中所述EGF终浓度为0.01-0.02μg/ml。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述bFGF为0.008-0.03μg/ml。
5.权利要求4的方法，其中所述bFGF为0.01-0.02μg/ml。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM
NAC，终浓度1.0mM
EGF，终浓度0.01μg/ml
bFGF，终浓度0.01μg/ml
DMSO，终浓度7.5%（v/v）
BSA，终浓度0.1g/ml。
7.权利要求1-5任一项的方法，其中所述冻存液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM
NAC，终浓度1.0mM
EGF，终浓度0.02μg/ml
bFGF，终浓度0.02μg/ml
DMSO，终浓度7.5%（v/v）
BSA，终浓度0.1g/ml。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述复苏液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM
丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM
NAC，终浓度0.8-1.2mM
BSA，终浓度0.008-0.012g/ml。
9.权利要求8的方法，其中所述复苏液为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM
NAC，终浓度1.0mM
BSA，终浓度0.01g/ml。
10.一种用于神经干细胞冻存复苏的冻存液，其为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM
丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM
N-乙酰半胱氨酸（NAC），终浓度0.8-1.2mM
EGF，终浓度0.005-0.04μg/ml
bFGF，终浓度0.005-0.04μg/ml
二甲基亚砜（DMSO），终浓度7-8%（v/v）
牛血清白蛋白（BSA），终浓度0.08-0.12g/ml。
11.权利要求10的神经干细胞冻存复苏的冻存液，其中EGF的终浓度为0.008-0.03μg/ml。
12.权利要求11的神经干细胞冻存复苏的冻存液，其中EGF的终浓度为0.01-0.02μg/ml EGF。
13.权利要求10-12任一项的神经干细胞冻存复苏的冻存液，其中bFGF的终浓度为0.008-0.03μg/ml。
14.权利要求13的神经干细胞冻存复苏的冻存液，其中bFGF的终浓度为0.01-0.02μg/ml。
15.权利要求10-14任一项的冻存液，其为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM
NAC，终浓度1.0mM
EGF，终浓度0.01μg/ml
bFGF，终浓度0.01μg/ml
DMSO，终浓度7.5%（v/v）
BSA，终浓度0.1g/ml。
16.权利要求10-14任一项的冻存液，其为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2.0mM
丙酮酸钠，终浓度为1.0mM
NAC，终浓度1.0mM
EGF，终浓度0.02μg/ml
bFGF，终浓度0.02μg/ml
DMSO，终浓度7.5%（v/v）
BSA，终浓度0.1g/ml。
17.一种用于神经干细胞冻存复苏的复苏液，其为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为1.6-2.4mM
丙酮酸钠，终浓度为0.8-1.2mM
NAC，终浓度0.8-1.2mM
BSA，终浓度0.008-0.012g/ml。
18.权利要求17的复苏液，其为DMEM或DMEM/F12培养液中包含：
1×B27添加剂，
1×N2添加剂，
L-谷氨酰胺，终浓度为2mM
丙酮酸钠，终浓度为1mM
NAC，终浓度1.0mM
BSA，终浓度0.01g/ml。
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