CN112690272B - 一种低温保存液及其保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞保存与运输技术领域，具体公开了一种低温保存液及其保存方法。本发明的低温保存液包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES和Penicillin‑Streptomycin。本发明低温保存液低温运输的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，成本较低，培养成功率较高，而且可以在长时间内维持细胞的活性。本发明解决了对硬件要求高、运输程序复杂、成本昂贵、效率低下、经过冻存复苏成功率低、细胞生长情况堪忧等技术问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞保存与运输技术领域，尤其是涉及一种低温保存液及其保存方法。
背景技术
类器官是体外细胞的三维培养物，包含其来源器官的一些关键特性。类器官是将具有成体干细胞潜能的细胞或组织在体外进行3D培养而成的三维微观结构。
目前，有关于类器官的运输并无明确的方法，大多以普通细胞的形式进行运输。现有细胞运输的方法主要有以下两种：(1)液氮或干冰冻存法运输。该方法是将细胞至于盛有干冰或是液氮的塑料泡沫盒中运输，一般可以保存7-8天。(2)活细胞运输。该方法适用于处在对数生长期早期或是中期且生长状态良好的细胞，将成旧的培养基除去，加入新鲜的培养基至培养瓶的瓶颈处，拧紧瓶盖，并用胶带密封，用棉花等做减震处理再进行运输。
但是采用液氮或干冰的冷冻运输法成本过高，且细胞冻存和复苏分别涉及到细胞内外液体结晶和细胞内外晶体化为液体的过程，会不可避免地造成细胞损伤，鉴于类器官的多细胞构成，这种损伤更甚，因此会使得冻存复苏后的活性无法估计。如果细胞复苏后状态不佳，则很难界定是来源的问题还是复苏操作的问题。活细胞运输法只适合短途运输，因为即便运输时培养基中不添加血清，细胞仍会不断增殖，当细胞长满后，细胞的状态会随时间的增加而不断变差；目前细胞运输可维持细胞活性的时间很短，原则上需要不超过2天的即时处理，因此，还有改善的空间。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种低温保存液及其保存方法，利用本发明低温保存液低温运输的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，成本较低，培养成功率较高，而且可以在长时间内维持类器官细胞的活性。本发明解决了对硬件要求高、运输程序复杂、成本昂贵、效率低下、经过冻存复苏成功率低、细胞生长情况堪忧等技术问题。
本发明的第一目的是提供了一种低温保存液，所述低温保存液包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES和Penicillin-Streptomycin。
在本发明的技术方案中，在低温保存液中添加特有的Glutamax取代L-谷氨酰胺，为类器官提供重要的能量来源，可以有效维持类器官的生长活率，促进生长，进而可提高其生产效力。
添加HEPES是一种优良的缓冲剂，能够防止保存液pH波动对细胞生长不利的影响，可以促进类器官的生长。当类器官不再在CO2培养箱内时，碳酸盐缓冲系统就会失效，HEPES的主要作用是在碳酸盐缓冲系统失效后维持类器官体系的pH稳定。
本发明将DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES和Penicillin-Streptomycin等原材料进行复配，使得低温保存的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，培养成功率较高，细胞生长情况较佳，而且可以在长时间内维持细胞的活性。由试验例一观察肝癌患者类器官低温保存72小时后的生长情况，经本发明低温保存液的类器官生长情况较好，细胞数目较多。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述HEPES在所述低温保存液中的摩尔浓度为10-25mM。
在本发明低温保存液中，通过设置HEPES的摩尔浓度为10-25mM，达到稳定维持类器官体系的pH值，避免HEPES浓度过低时缓冲能力不高，HEPES浓度过高时对细胞有害等情况。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述低温保存液还包括胸苷，所述胸苷与HEPES的摩尔浓度比为(1-3):50。
添加胸苷可以有效延缓细胞的有丝分裂，有效延缓类器官状态的衰退，且胸苷的抑制作用是可逆的，当把胸苷去除，细胞即可恢复正常的生长。
本发明将DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、Penicillin-Streptomycin和胸苷等原材料进行复配，使得低温保存的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，培养成功率较高，细胞生长情况较佳。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述Glutamax与HEPES的摩尔浓度比为2:(10-25)。
通过将上述成分设置特定的比例，可增强培养类器官的成功率，有效延缓类器官状态的衰退，有效维持了类器官的生长活性。使用本发明的低温保存液的类器官低温运输后无需复苏，便可快速培养，细胞生长情况较佳，且低温培养液成分简单，成本低，节省了实验成本。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述Glutamax的摩尔浓度为2mM。
本发明人经过数次实验，发现当Glutamax的摩尔浓度为2mM，类器官的生长状况最佳，当低温保存液中不含有Glutamax时，保存的类器官发生解离现象，生长状况差。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述胸苷的摩尔浓度为0.5-1.5mM。更优选地，所述胸苷的摩尔浓度为1mM。
添加胸苷可以有效延缓细胞的有丝分裂，有效延缓类器官状态的衰退，且胸苷的抑制作用是可逆的，当把胸苷去除，细胞即可恢复正常的生长。
本发明添加了胸苷的低温保存液与不添加胸苷的低温保存液相比，当胸苷的摩尔浓度为0.5-1.5mM，可以提高类器官生长数目。
作为本发明所述低温保存液的优选实施方式，所述DMEM高糖培养基为AdvancedDMEM/F12。
本发明的第二目的是提供了一种类器官保存方法，将所述类器官置于上述低温保存液中保存。
作为本发明所述类器官保存方法的优选实施方式，所述类器官保存方法包括以下步骤：
S1.在类器官悬液中加入提前预冷的PBS缓冲液，离心取沉淀；
S2.向沉淀中加入提前预冷如上述的低温保存液，混匀，得类器官保存液；
S3.将冰袋与上述类器官保存液一起放置运输。
本发明采用低温运输，避免了类器官冻存和复苏这一复杂过程，而且低温环境可以有效抑制细胞的新陈代谢，从而能延长运输时间。并且本发明采用冰袋运输，相较于干冰和液氮，极大地降低了运输成本、简化了运输步骤。
本发明的第三目的是提供了上述的低温保存液或类器官保存方法在细胞保存和/或运输中的应用。
本发明解决类器官不能长期稳定运输的问题，提供了一种适用于类器官不需冻存且能长途运输的方法，可以避免类器官冻存后复苏这一复杂的过程，低温运输还可以有效降低类器官的新陈代谢，有效地延缓了细胞状态的衰退。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了一种低温保存液，低温保存的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，而且培养成功率较高，细胞生长情况较佳；
2、本发明提供了一种类器官保存方法，操作简单，对硬件要求低、运输程序便捷、成本低、效率高，类器官经过冻存复苏成功率较高，细胞生长状况好。
附图说明
图1为类器官经过实施例1的低温保存液保存72小时后接种入24孔板内6天内的生长情况图；
图2为类器官经过实施例2的低温保存液保存72小时后接种入24孔板内6天内的生长情况图；
图3为类器官经过实施例3的低温保存液保存72小时后接种入24孔板内6天内的生长情况图；
图4为类器官经过实施例7的低温保存液保存72小时后接种入24孔板内6天内的生长情况图；
图5为类器官经过实施例1的低温保存液模拟低温运输实验6天内的细胞生长情况图；
图6为类器官经过实施例4的低温保存液模拟低温运输实验6天内的细胞生长情况图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中，实验前提前一天预冷Matrigel基质和低温保存液，当天预热类器官培养基、24孔板和PBS缓冲液。
在以下实施例和对比例中，低温保存液中组分的来源及型号如表1所示。
表1
在以下实施例中，类器官培养基的配方为表2所示：
表2
| 成分 | 来源 | 型号 | 浓度 |
| Advanced DEME/F12 | Life Technologies | 12634-010 | 1X |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | 1X |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | 10mM |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 1X |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | 1X |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | 1X |
| N-乙酰-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | A9165 | 1mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10mM |
| [Leu15]-gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145 | 10nM |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50ng/ml |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | 100ng/ml |
| HGF | Peprotech | 100-39 | 25ng/ml |
| Forskolin | SelleckChem | S2449 | 10μM |
| A83-01 | sigma-Aldrich | SML0788 | 5μM |
| R-spondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500ng/ml |
实施例1-7、本发明的低温保存液
本发明实施例1-7低温保存液的配方如下表3和表4所示。
表3
表4
实施例8、一种类器官保存方法
一种类器官保存方法，包括以下步骤：
(1)在生物安全柜内将24孔板中类器官的培养基吸弃，每孔加入900μl提前预冷的PBS缓冲液；
(2)在24孔板中用1ml移液枪吸取预冷的PBS缓冲液将含类器官的基质胶吹散，每2孔转移至一个15ml离心管中，加入预冷的PBS缓冲液至总体积为10ml；
(3)将步骤(2)的离心管置于333g，温度为0℃的条件下离心5分钟；
(4)吸弃上层清液，分别用移液枪吸取实施例1-7的制备的低温保存液反复吹打沉淀，直至类器官吹散成碎片；
(5)加入实施例1-7预冷的低温保存液至13ml，盖上盖子后上下倒转混匀；
(6)取出在保存72小时后的离心管在333g，0℃，离心5分钟；
(7)用吸引器完全吸出上清液，只留细胞沉淀；
(8)吸弃上清液，每个离心管加入40μl的Matrigel基质吹打沉淀混匀，在预37℃预热的24孔板上，在每个所需孔的中心以液滴形式接种40μl Matrigel；
(9)置于培养箱正置5分钟，倒置20分钟，每孔加入500μl预热培养基。
(10)每天观察，每隔3-4天更换一次培养基，并根据需要每隔7天重复步骤来传代类器官。
试验例一、类器官低温保存72h后的活性检测
采用实施例8的保存方法将类器官置于在上述实施例1-7制备的低温保存液中低温保存72小时后接种于24孔板内培养6天，采用显微镜观察每天类器官的生长情况。结果见表5和表6。
表5
表6
根据表5和表6的数据可知，经过本发明实施例1-6低温保存液的类器官生长情况较佳，类器官数目较多，含有较多粒径大于＞200μm的类器官，尤其是经过添加了胸苷的低温保存液的类器官数目大于没有添加胸苷的类器官数目，其中以实施例4为最佳实施例。
当Glutamx浓度为2mM、HEPES浓度为25mM时，经过实施例4低温保存液的类器官数量较多，且粒径较大。
而实施例7低温保存液保存的类器官发生解离现象，参照图4，经过5天，实施例7保存的类器官全部凋亡。
根据表4，实施例1低温保存液中不含有胸苷(参考图1)，其类器官的数目不及实施例4的低温保存液。
当实施例2中的胸苷浓度为0.5mM，实施例3中的胸苷浓度为1.5mM时，经过第6天培养，实施例2(参考图2)和实施例3(参考图3)保存的类器官经过培养6天后的数目不及实施例4保存的类器官经过培养6天后的数目。
与实施例1相比，经过实施例5及实施例6低温保存液的类器官经过第5天培养后的数目不及实施例1低温保存液的类器官经过第5天培养后的数目。
试验例二、模拟低温运输实验
材料：Matrigel，低温保存液，类器官培养基、24孔板、PBS缓冲液。
实验步骤：
1)在生物安全柜内将24孔板中类器官的旧培养基吸弃，每孔加入900μl提前预冷的PBS；
2)在孔板中用1ml移液枪吸取预冷的PBS将含类器官的基质胶吹散，每2孔转移至一个15ml离心管中，加入预冷的PBS至总体积为10ml；
3)将步骤2)的离心管置于333g，温度为0℃的条件下离心5分钟；
4)吸弃上层清液，用移液枪分别吸取900μl实施例1和实施例4的低温保存液反复吹打沉淀，直至类器官吹散成碎片；
5)分布加入预冷的实施例1和实施例4的低温保存液至13ml，盖上盖子后上下倒转混匀；
6)将15ml离心管置于4℃摇床上，以40rpm的速度摇72小时模拟运输过程；
7)取出在摇床摇动72小时的离心管在333g，0℃，离心5分钟；
8)用吸引器完全吸出上清液,只留细胞沉淀；
9)用移液枪往离心管中加入160μl预冷的Matrigel，反复吹打直到类器官重悬；
10)在37℃预热的24孔板上，在每个所需孔的中心以液滴形式接种20μlMatrigel；
11)在每孔中加入500μl预热的足够覆盖的类器官培养基；
12)每天观察，每隔3天更换一次培养基，并根据需要每隔7天重复步骤来传代类器官。
结果见表7。
表7
见表7及图5所示，经过实施例1低温保存液培养的类器官数目也较多。
参考图6，添加胸苷的低温保存液，低温保存后类器官生长速度更快，生长情况更好。本发明的低温保存液延长了细胞的保存时间，并且细胞可以经过较长时间、较远距离运输，其类器官的的活性仍然满足实验的要求。本发明的低温保存液，低温保存的类器官无需复苏，不仅可以快速培养，而且培养成功率较高，细胞生长情况较佳；并且本发明提供的类器官保存方法，操作简单，对硬件要求低、运输程序便捷、成本低、效率高，类器官经过冻存复苏成功率较高，细胞生长状况好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.一种低温保存液，其特征在于，所述低温保存液包括DMEM高糖培养基、Glutamax、HEPES、胸苷和Penicillin-Streptomycin；
所述HEPES在所述低温保存液中的摩尔浓度为10-25mM；
所述Glutamax的摩尔浓度为2 mM；
所述胸苷的摩尔浓度为0.5-1.5 mM。
2.如权利要求1所述的低温保存液，其特征在于，所述DMEM高糖培养基为AdvancedDMEM/F12。
3.一种类器官保存方法，其特征在于，将所述类器官置于权利要求1或2所述的低温保存液中保存。
4.如权利要求3所述的类器官保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.在类器官悬液中加入提前预冷的PBS缓冲液，离心取沉淀；
S2.向沉淀中加入提前预冷的如权利要求1或2所述的低温保存液，混匀，得类器官保存液；
S3.将冰袋与上述类器官保存液一起放置运输。
5.如权利要求1或2所述的低温保存液或权利要求3或4所述的类器官保存方法在细胞保存和/或运输中的应用。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
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| GB201721820D0 (en) * | 2017-12-22 | 2018-02-07 | Asymptote Ltd | Method and system relating to cooling conditions for a biological sample |
| CN111808816A (zh) * | 2019-04-11 | 2020-10-23 | 北京基石生命科技有限公司 | 一种用于培养胃癌实体瘤原代细胞的培养基 |
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