CN113287599B - 一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。所述冻存液组合物包括：低级脂肪醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、ROCK抑制剂、原代细胞抗生素。冻存液按照终浓度的组成包括：低级脂肪醇，10‑50％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.01‑0.5g/ml；白蛋白，0.01‑0.2g/ml；ROCK抑制剂，0.1‑10μM；原代细胞抗生素，0.2‑20mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。类器官冻存方法包括：将培养得到的类器官去掉原培养基后加入细胞回收液反应5‑10min；在体系中进一步加入无菌Hank’s平衡盐溶液混匀，离心后保留沉淀；在沉淀中加入上述类器官冻存液后程序性降温。采用本发明的冻存液及方法对类器官进行冻存，在冻存复苏条件下能维持类器官原始细胞干性，有效保留类器官的冻存前的分化特征。

Description

一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法

技术领域

本发明涉及类器官冻存技术领域，具体涉及一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。

背景技术

类器官是一种体外培育而成的具备三维结构的细胞复合体。类器官与体内高度相似的遗传学背景及组织学特征，拥有类似真实器官的复杂结构，并能部分模拟来源组织器官的生理功能。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，类器官显示出巨大的应用前景。

类器官技术应用具有广泛前景，而类器官的冻存复苏是整个技术应用中的重要环节。类器官的冻存需要使用保护剂，防止细胞在冻存和复苏过程中受到冰晶损伤、脱水和吸水损伤。同时，与常规细胞冻存相比，类器官冻存除了需要维持细胞活性外，还要维持类器官部分结构和类器官的干性。常规细胞冻存方法常用的冻存液是二甲基亚砜(DMSO)加上胎牛血清(FBS)。然而，DMSO存在一定的毒性作用，会与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，并且具有血管毒性和肝肾毒性，存在潜在的致癌风险。FBS则成分复杂，存在多种影响类器官干性的生长因子或抑制剂，其含量如果控制不当会导致冻存复苏后的类器官丧失原有类器官细胞特性，影响冻存后的复苏成功率。因此，有必要开发适用于类器官的冻存液及冻存方法以提高类器官冻存的保存效果和冻存复苏的成功率。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种冻存液组合物、冻存液及类器官冻存方法。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种冻存液组合物，包括：低级脂肪醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、ROCK抑制剂、原代细胞抗生素。

进一步地，所述低级脂肪醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种。

进一步地，所述ROCK抑制剂包括Y-27632dihydrochloride、Thiazovivin、SB-772077B dihydrochloride、Y-33075、K-115、Azaindole1中的至少一种。

优选地，所述组合物包括：乙二醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、Y-33075、Primocin。

可选地，所述组合物还包括：海藻糖、不含维生素A的B27和儿茶素中的至少一种。

第二个方面，本发明提供一种类器官冻存液，按照终浓度的组成包括：低级脂肪醇，10-50％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.01-0.5g/ml；白蛋白，0.01-0.2g/ml；ROCK抑制剂，0.1-10μM；原代细胞抗生素，0.2-20mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

优选地，所述类器官冻存液按照终浓度的组成包括：乙二醇，15-40％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.05-0.2g/ml；白蛋白，0.02-0.1g/ml；Y-33075，0.1-5μM；Primocin，0.5-5mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

可选的，所述类器官冻存液按照终浓度的组成还包括：海藻糖，0.05-0.2g/ml、不含维生素A的B27，0.5-2×；儿茶素，0.001-0.01g/ml。

进一步地，所述类器官冻存液的制备方法包括：按照终浓度的组成配料，将所有组分用Advanced DMEM/F12溶解，即得。

第三个方面，本发明提供一种类器官冻存方法，包括以下步骤：

步骤1：将培养得到的类器官去掉原培养基后加入细胞回收液反应5-10min；

步骤2：在体系中进一步加入无菌Hank’s平衡盐溶液混匀，离心后保留沉淀；

步骤3：在沉淀中加入上述类器官冻存液后程序性降温，先将温度降至2-8℃放置4-12h，再降至-20℃放置8-24h，最后于-80℃或液氮中存储。

本发明的有益效果在于：

①本发明的冻存液中同时加入渗透性和非渗透性保护剂，不同于以往的保护剂只加入渗透性保护剂，经实验证明同时加入渗透性和非渗透性保护剂能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率。

②本发明的冻存液不含DMSO等毒性成分，减少冻存液对细胞毒性，有效提高类器官冻存复苏的成功率。

③本发明的冻存液无需添加胎牛血清(FBS)，从而降低了血清的细胞毒性以及血清中的特异性因子引起的类器官细胞分化。

④采用本发明的冻存液及方法对类器官进行冻存，在冻存复苏条件下能维持类器官原始细胞干性，有效保留类器官的冻存前的分化特征。

附图说明

图1为本发明实施例9中肺癌类器官光学显微镜图。

图2为本发明实施例10中小鼠肝类器官光学显微镜图。

图3为本发明实施例11中肠癌类器官组织形态结构图。

图4为本发明实施例12中小鼠肺泡类器官组织形态结构图。

图5为本发明实施例13中肺癌类器官光学显微镜图。

图6为本发明实施例14中小鼠肝类器官光学显微镜图。

图7为本发明实施例15中肠癌类器官组织形态结构图。

图8为本发明实施例16中小鼠肺泡类器官组织形态结构图。

图9为本发明对比例1中肺癌类器官光学显微镜图。

图10为本发明对比例2中肺癌类器官光学显微镜图。

图11为本发明对比例3中肺癌类器官光学显微镜图。

图12为本发明对比例4中肺癌类器官光学显微镜图。

具体实施方式

本发明实施例采用的低级脂肪醇、白蛋白购自上海生工公司。

本发明实施例采用的低聚异麦芽糖购自上海麦克林生化科技有限公司。

本发明实施例采用的ROCK抑制剂购自MedChemExpress公司。

本发明实施例采用的原代细胞抗生素购自Invivogen公司。

本发明实施例采用的Advanced DMEM/F12培养基购自赛默飞世尔科技有限公司。

本发明实施例采用的细胞回收液购自美国corning公司。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种冻存液组合物，包括乙二醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、Y-33075、Primocin。

实施例2

本实施例提供一种冻存液组合物，包括丙二醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、Y-27632dihydrochloride、两性霉素和庆大霉素。

实施例3

本实施例提供一种冻存液组合物，包括丙三醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、SB-772077B dihydrochloride、青霉素-链霉素、海藻糖。

实施例4

本实施例提供一种冻存液组合物，包括乙二醇、低聚异麦芽糖、白蛋白、Y-33075、Primocin、海藻糖、不含维生素A的B27和儿茶素。

实施例5

本实施例提供一种冻存液，按照终浓度的组成为：乙二醇，30％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.1g/ml；白蛋白，0.05g/ml；Y-33075，2μM；Primocin，1mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

实施例6

本实施例提供一种冻存液，按照终浓度的组成为：丙二醇，20％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.2g/ml；白蛋白，0.1g/ml；Y-27632dihydrochloride，1μM；两性霉素和庆大霉素，2.5mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

实施例7

本实施例提供一种冻存液，按照终浓度的组成为：丙三醇，15％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.4g/ml；白蛋白，0.2g/ml；SB-772077B dihydrochloride，0.5μM；青霉素-链霉素，4mg/ml；海藻糖，0.1g/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

实施例8

本实施例提供一种冻存液，按照终浓度的组成为：乙二醇，40％(v/v)；低聚异麦芽糖，0.05g/ml；白蛋白，0.02g/ml；Y-33075，5μM；Primocin，5mg/ml；海藻糖，0.05g/ml；不含维生素A的B27，1×；儿茶素，0.005g/ml。

实施例9

本实施例提供一种肺癌类器官冻存方法，采用的是实施例5的冻存液，具体包括以下步骤：

1.肺癌类器官培养完成后(光镜图如图1所示)，用移液器吸走原有培养基，加入2ml细胞回收液，常温消化含类器官的胶滴，反应10min，用移液器将胶滴轻轻吹散；

2.加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液终止消化，转移所有液体至15ml离心管，1000rpm离心5min；

3.弃去上清液，加入2ml实施例5的类器官冻存液重悬细胞，转移至冻存管中。

4.进行程序性降温，5℃放置10小时后，转入-20℃冰箱放置24小时，最终于液氮或-80℃冰箱中储存3个月。

实施例10

本实施例提供一种小鼠肝类器官冻存方法，采用的是实施例6的冻存液，具体包括以下步骤：

1.小鼠肝类器官培养完成后(光镜图如图2所示)，用移液器吸走原有培养基，加入1ml细胞回收液，常温消化含类器官的胶滴，反应6min，用移液器将胶滴轻轻吹散；

2.加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液终止消化，转移所有液体至15ml离心管，1000rpm离心5min；

3.弃去上清液，加入2ml实施例6的类器官冻存液重悬细胞，转移至冻存管中。

4.进行程序性降温，2℃放置4小时后，转入-20℃冰箱放置10小时，最终于液氮或-80℃冰箱中储存2个月。

实施例11

本实施例提供一种肠癌类器官冻存方法，采用的是实施例7的冻存液，具体包括以下步骤：

1.肠癌类器官培养完成后(光镜图如图3所示)，用移液器吸走原有培养基，加入2ml细胞回收液，常温消化含类器官的胶滴，反应10min，用移液器将胶滴轻轻吹散；

2.加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液终止消化，转移所有液体至15ml离心管，1000rpm离心5min；

3.弃去上清液，加入2ml实施例7的类器官冻存液重悬细胞，转移至冻存管中。

4.进行程序性降温，8℃放置10小时后，转入-20℃冰箱放置15小时，最终于液氮或-80℃冰箱中储存1个月。

实施例12

本实施例提供一种小鼠肺泡类器官冻存方法，采用的是实施例8的冻存液，具体包括以下步骤：

1.小鼠肺泡类器官培养完成后(光镜图如图4所示)，用移液器吸走原有培养基，加入2ml细胞回收液，常温消化含类器官的胶滴，反应5min，用移液器将胶滴轻轻吹散；

2.加入10ml无菌Hank’s平衡盐溶液终止消化，转移所有液体至15ml离心管，1000rpm离心5min；

3.弃去上清液，加入2ml实施例8的类器官冻存液重悬细胞，转移至冻存管中。

4.进行程序性降温，4℃放置8小时后，转入-20℃冰箱放置16小时，最终于液氮或-80℃冰箱中储存3个月。

实施例13

本实施例提供实施例9的冻存肺癌类器官复苏测试，具体包括以下步骤：

1.取出冻存管，直接浸入37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液转移至15或50ml离心管。

3.加入10倍体积的肺癌类器官培养液，混匀后1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl肺癌类器官培养液重悬类器官，加入150μlMatrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补3ml肺癌类器官培养液，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。培养5天后复苏完成，图5为复苏后的肺癌类器官光镜图，通过图5可以观察到细胞数量较多，活力较高，与冻存前图1所示的类器官形态类似，因此本实施例的冻存液能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率。

实施例14

本实施例提供实施例10的冻存小鼠肝类器官复苏测试，具体包括以下步骤：

1.取出冻存管，直接浸入37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液转移至15或50ml离心管。

3.加入10倍体积的小鼠肝类器官培养液，混匀后1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl小鼠肝类器官培养液重悬类器官，加入150μlMatrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补4ml小鼠肝类器官培养液，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。培养5天后复苏完成，图6为复苏后的小鼠肝类器官光镜图，通过图6可以观察到类器官规则有活力且数量较多，与冻存前图2所示的类器官形态类似，因此本实施例的冻存液能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率。

实施例15

本实施例提供实施例11的冻存肠癌类器官复苏测试，具体包括以下步骤：

1.取出冻存管，直接浸入37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液转移至15或50ml离心管

3.加入10倍体积的肠癌类器官培养液，混匀后1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl肺癌类器官培养液重悬类器官，加入150μlMatrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补2-4ml肠癌类器官培养液，37℃培养箱静置培养。

5.次日更换一次培养液，继续培养。培养4天后复苏完成，图7为复苏后的肠癌类器官光镜图，通过图7可以观察到类器官形态规则有活力，与冻存前图3所示的类器官形态类似，因此本实施例的冻存液能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率。

实施例16

本实施例提供实施例12的冻存小鼠肺泡类器官复苏测试，具体包括以下步骤：

1.取出冻存管，直接浸入37℃水浴锅中，并不时摇动令其尽快融化。

2.从37℃水浴中取出冻存管，移至生物安全柜，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液转移至15或50ml离心管

3.加入10倍体积的小鼠肺泡类器官培养液，混匀后1000rpm离心3min。

4.弃去上清液，加入120μl小鼠肺泡类器官培养液重悬类器官，加入150μlMatrigel混匀，滴至35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补2-4ml小鼠肺泡类器官培养液，37℃培养箱静置培养。5.次日更换一次培养液，继续培养。培养3-5天后复苏完成，图4为复苏后的小鼠肺泡类器官光镜图，通过图8可以观察到类器官规则有活力，数量较多，与冻存前图4所示的类器官形态类似，因此本实施例的冻存液能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率。

对比例1

本对比例提供一种现有的冻存液，按照体积百分比的组成为：20％DMSO和80％FBS。采用该冻存液进行肺癌类器官冻存，具体过程同实施例9。再将冻存的肺癌类器官进行复苏测试，具体过程同实施例13，图9为复苏后的肺癌类器官光镜图。显然，和图1相比，培养的肺癌类器官数量较少，说明本发明冻存复苏效果比现有冻存液效果好。

对比例2

本对比例提供一种现有的冻存液，与实施例5的区别在于：无乙二醇。采用该冻存液进行肺癌类器官冻存，具体过程同实施例9。再将冻存的肺癌类器官进行复苏测试，具体过程同实施例13，图10为复苏后的肺癌类器官光镜图。显然，和图1相比，无乙二醇的保存液保存后的肺癌类器官无法复苏成功，基本无法观察到类器官结构，这说明低级脂肪醇对类器官保存特别重要。

对比例3

本对比例提供一种现有的冻存液，与实施例5的区别在于：将低聚异麦芽糖替换成蔗糖。采用该冻存液进行肺癌类器官冻存，具体过程同实施例9。再将冻存的肺癌类器官进行复苏测试，具体过程同实施例13，图11为复苏后的肺癌类器官光镜图。显然，和图1相比，培养的肺癌类器官数量较少，活性较差。

对比例4

本对比例提供一种现有的冻存液，与实施例5的区别在于：将Advanced DMEM/F12培养基替换成高糖DMEM培养基。采用该冻存液进行肺癌类器官冻存，具体过程同实施例9。再将冻存的肺癌类器官进行复苏测试，具体过程同实施例13，图12为复苏后的肺癌类器官光镜图。显然，和图1相比，对比例4培养的肺癌类器数量较少且活性较差。

综上，采用本发明的冻存液及方法对类器官进行冻存，能够有效保护类器官冻存导致的低温损伤，提高细胞活率，在冻存复苏条件下能维持类器官原始细胞干性，有效保留类器官的冻存前的分化特征。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种类器官冻存液，其特征在于：按照终浓度的组成包括：低级脂肪醇，10-50% v/v；低聚异麦芽糖，0.01-0.5 g/ml；白蛋白，0.01-0.2g/ml；ROCK抑制剂，0.1-10μM；原代细胞抗生素，0.2-20mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基；所述低级脂肪醇包括乙二醇、丙二醇、丙三醇中的至少一种；所述ROCK抑制剂包括Y-27632 dihydrochloride、Thiazovivin、SB-772077B dihydrochloride、Y-33075、K-115、Azaindole1中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种类器官冻存液，其特征在于：所述类器官冻存液按照终浓度的组成包括：乙二醇，15-40% v/v；低聚异麦芽糖，0.05-0.2 g/ml；白蛋白，0.02-0.1g/ml；Y-33075，0.1-5μM；Primocin，0.5-5mg/ml；溶剂为Advanced DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1或2所述的一种类器官冻存液，其特征在于：所述类器官冻存液还包括：海藻糖、不含维生素A的B27和儿茶素中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的一种类器官冻存液，其特征在于：所述类器官冻存液的制备方法包括：按照终浓度的组成配料，将所有组分用Advanced DMEM/F12溶解，即得。

5.一种类器官冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：将培养得到的类器官去掉原培养基后加入细胞回收液反应5-10min；

步骤2：在体系中进一步加入无菌Hank’s平衡盐溶液混匀，离心后保留沉淀；

步骤3：在沉淀中加入权利要求1~4任意一项所述的类器官冻存液后程序性降温，先将温度降至2-8℃放置4-12h，再降至-20℃放置8-24h，最后于-80℃或液氮中存储。

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