CN110656086A - 癌类器官的体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种癌类器官的体外培养方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为1～2mm³，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的；将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为500～1500/10μL；将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞进行培养处理，以便获得癌类器官。根据本发明实施例的方法，提高了癌组织的酶解效率和类器官的传代培养的成功率，能实现类器官长期培养并建立生物样本库。

Description

癌类器官的体外培养方法

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，更具体地，本发明涉及癌类器官的体外培养方法。

背景技术

结肠腺癌是人类主要的恶性肿瘤之一，威胁着人类健康。其成病机理研究发现，WNT、RAS-MAPK、PI3K、TP53、TGF等信号通路的异常对结肠腺癌的发生有关键作用。除此之外，随着结肠腺癌基因组研究的进一步深入发现结直肠癌患者具有微卫星DNA不稳定或者染色体不稳定，与其它癌症相比，结肠腺癌具有更多基因异常多样性，患者常具有多基因突变或者多重基因异常。因此，只通过有限样本的分析无法评估治疗方案对患者的广普疗效。

对于癌的研究与治疗往往都是以来源于病人的细胞系作为对象。细胞系来源于病人，具有癌症患者的遗传信息特征，并能够体现癌症细胞的部分生理特征。但是细胞系在长期培养过程中，由于适应了二维生长的环境，从而丢失了体内原有生理特征和肿瘤的异质性。

而从结肠腺癌病人的肿瘤样本中直接建立细胞系的成功率很低，这大大的限定了所能够获得研究样本的遗传多样性。因此非常有必要建立一种全新的结肠腺样本体外培养系统，为研究和治疗提供新途径。

在体外利用组织存在的干细胞在适宜条件下可以培养获得三维器官结构，此结构被称为类器官(organoid)。类器官由组织分化而来，与组织细胞含有相同的遗传信息特征。由于其三维结构特质，在体外环境下最大限度保留了体内的生理特性。因此，有需要开发一种简便、稳定、成功率高的结肠腺癌类器官的体外培养方法。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人发现，现有类器官的体外培养技术，存在样本容易污染以及酶解效率不高的问题，并且现有类器官的体外培养技术只能在短时间内维持生长，不能长时间传代培养，不能建立类器官生物样本库。

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种癌类器官的体外培养方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为1～2mm³，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的，所述组合消化酶包括胶原酶type I和Dispase酶；将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为500～1500/10μL；将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞进行培养处理，以便获得癌类器官。发明人在实验过程中发现，控制剪切处理后癌组织的大小为1～2mm³，可使癌组织彻底消化；消化过程中采用组合消化酶(胶原酶type I和Dispase酶)进行消化，可进一步提高酶解获得的肿瘤细胞的个数，同时保持细胞的高活力；同时控制癌细胞在基质胶中的浓度为500～1500/10μL，一方面类器官不至于相互接触影响彼此生长，另一方面癌细胞还能通过自分泌维持类器官良好的生长。

根据本发明实施例的方法，提高了癌组织的酶解效率和类器官的传代培养的成功率，能实现类器官长期培养并建立生物样本库。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述组合消化酶是以酶溶液的形式提供的，所述胶原酶type I在所述酶溶液中的浓度为75u/mL，所述Dispase酶在所述酶溶液中的浓度为0.6u/mL。

根据本发明的实施例，所述癌组织与所述酶溶液的体积比为(1～2mL)：(5～6mL)。进而进一步提高酶解效率，提高酶的利用率。

根据本发明的实施例，所述消化处理是通过如下方式进行的：(1)将剪切处理后癌组织与组合消化酶在37℃的条件下进行第一消化处理，所述第一消化处理的时间为13～17分钟；(2)更换组合消化酶，将经过第一消化处理的癌组织与新鲜组合消化酶进行第二消化处理，所述第二消化处理是在37℃的条件下进行13～17分钟；(3)重复步骤(2)2～4次，以便获得癌细胞。通过上述消化处理方式，可将大部分癌组织消化为单细胞，并且不会造成过度消化，有效维持了癌细胞的细胞活力。

根据本发明的实施例，所述消化处理后，重悬处理前，进一步包括将所述癌细胞进行清洗处理。进而可将消化下的除细胞之外的其他成分清洗掉，进一步提高后续酶解效率。

根据本发明的实施例，所述清洗处理是在HBSS缓冲液中进行的。

根据本发明的实施例，利用HBSS缓冲液对所述癌细胞进行3～4遍清洗处理。

根据本发明的实施例，进行点板处理前，进一步包括将点板处理用的枪头进行预冷处。需要说明的是，所述“点板处理”是指用带有枪头的移液枪将细胞接种到细胞培养板中。将枪头进行预冷处理，可使细胞保持在约4℃的低温环境中，保持癌细胞活力。

根据本发明的实施例，所述点板处理是通过如下方式进行的：利用预冷枪头将所述癌细胞悬液点接在24孔板中，每孔点接4滴，每滴10μL；将点接有癌细胞悬液的24孔板置于37℃的培养箱中静置30min。进而可使癌细胞在适当的密度下充分贴壁和生长。

根据本发明的实施例，进一步包括将24孔板中的基质胶更换为细胞培养基，所述细胞培养基预先进行37℃遇热处理。进而可使细胞培养过程中，一直处于37℃的环境下，不会造成细胞预冷收缩，保持细胞状态。

根据本发明的实施例，所述培养处理是在细胞培养基中进行的，所述细胞培养基包括为DMEM/F-12K培养基，所述细胞培养基中含有10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLR-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μMA83-01，5μM SB202190，4mM Nicotinamide，10μM Y27632。根据本发明实施例的培养基可实现癌类器官的快速生长，以及传代，冻存，复苏等过程，建立相关生物样本库。

根据本发明的实施例，所述细胞培养基包括为DMEM/F-12K培养基，所述细胞培养基中含有HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF 50ng/mL，Noggin 100ng/mL，FGF-1010ng/mL，A83-01 0.5μM，Y27632 10μM。发明人发现，根据本发明实施例的培养基不仅大大提高了类器官的传代培养的成功率，而且还可以实现对结肠腺癌，胃癌，直肠癌以及肺癌等癌种样本的普适性培养，这大大降低培养成本。

根据本发明的实施例，将点板处理后的癌细胞进行培养6～7天后，进一步将所获得的癌类组织进行传代、冻存或复苏处理。进而建立相应的生物样本库。

根据本发明的实施例，所述癌组织样本预先经过清洗处理。

根据本发明的实施例，所述清洗处理是通过如下方式进行的：将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织；以及将剔除处理后组织进行第二清洗处理。根据本发明实施例的上述清洗处理方式有效降低了肿瘤样本培养后的微生物污染的概率，提高了肿瘤样本的培养成功率，且方法中选择剔除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织，对剔除标准进行了严格限定，一方面可以去除部分污染，另一方面使得第二清洗更加彻底有效，也大大提高了获得肿瘤细胞含量较多的组织部位，提高了后续酶解效率以及增加了后续肿瘤细胞培养成功的克隆数。

根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是在清洗缓冲液2～4中进行的，所述清洗缓冲液2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液3为包含体积分数为3％的乙酸HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲液。

根据本发明的实施例，所述第一清洗处理是通过如下方式进行的：将所述新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟。

发明人发现，使用清洗缓冲液4清洗新鲜肿瘤样本，可以有效去除和抑制肿瘤样本表面携带的各种细菌和真菌，现有技术中使用的添加了100单位/mL的青霉素和100μg/mL链霉素的双抗的细胞清洗液，用在类器官的培养中，真菌污染导致失败的概率很高，而本申请的方法采用的清洗缓冲液4，增加了两性霉素B来进行抗真菌的处理，同时使用10倍浓度的青霉素以及链霉素，对存在的细菌真菌污染进行冲击法处理，在保证组织细胞活性的前提下，最大限度地降低了类器官的污染概率。

本申请的方法中，发明人创造性的采用了含有乙醇体积分数为75％的HBSS缓冲液2进行组织样本的清洗，有效杀灭了样本携带的细菌真菌，本领域技术人员常规所了解的是，75％乙醇会对细胞的产生伤害作用，因此75％乙醇不会用来处理原代组织，而本申请的发明人发现，采用清洗缓冲液2短时间(2～4分钟)处理肿瘤样本，不仅可以有效的杀灭样本表面的细菌和真菌，同时仍可以保留细胞活性，实现后续的培养。

含有乙酸体积分数为3％的HBSS缓冲溶液3现有技术中主要用于尖锐湿疣、尖锐湿疣亚临床表现或HPV潜伏感染的试验方法。而本申请的发明人发现，使用清洗缓冲液3处理原代肿瘤样本，可以一定程度地抑制真菌的生长，降低样本后续培养发生真菌污染的概率。

根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是在清洗缓冲液1～5中进行的，所述清洗缓冲液1包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲液。

根据本发明的实施例，所述第二清洗处理是通过如下方式进行的：将剔除处理后组织在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。发明人发现，将剔除处理后组织首先在含有青霉素浓度为100单位/mL，链霉素浓度为100μg/mL以及0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液1中进行清洗，可以进一步清洗并抑制样本携带的细菌和真菌，进而陆续在清洗缓冲液2、3、4进行清洗，最后在含有1％FBS的HBSS缓冲液5中进行清洗，可通过多次清洗，降低污染概率，维持细胞活性。

根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在转移缓冲液中，所述转移缓冲液为Advanced DMEM/F-12K培养基，所述转移缓冲液含有包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸，100μM L-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸。根据本发明实施例的转移缓冲液采用了高浓度HEPEs，在保证细胞活性的前提下，有效提高了转移缓冲液的缓冲能力。

根据本发明的实施例，所述新鲜肿瘤样本预先保存在4～8℃的条件下。

发明人发现，采用上述清洗处理方式，可大大降低样本培养过程中的污染概率，可长久保持组织样本的活力。

根据本发明的实施例，所述癌组织样本为结肠腺癌组织样本。根据本发明实施例的癌类器官的体外培养方法，提高了结肠腺癌组织的酶解效率和类器官的传代培养的成功率，能实现结肠腺癌类器官长期培养并建立生物样本库。

附图说明

图1是根据本发明实施例的消化方案探索实验结果图；

图2是根据本发明实施例的在培养1天，4天以及5天后观察P0代类器官生长状态图；

图3是根据本发明实施例的在传代后的第1天，4天以及5天后P1代类器官生长状态图；

图4是根据本发明实施例的长期传代培养过程中的类器官生长状态图；以及

图5是根据本发明实施例的P4代类器官复苏后第1天、第5天和第6天的生长状态图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在结直肠癌类器官培养过程中，根据本发明实施例的方法可以降低肿瘤样本培养的污染概率，提高酶解效率，并实现长期传代培养，建立生物样本库，为药物筛选以及检测提供稳定的生物样本。

根据本发明的实施例，本发明提出的癌类器官的体外培养方法可描述如下：

将肿瘤样本(该肿瘤样本可来自病人手术或者穿刺之后取下的肿瘤样本，属于医疗废弃物)十分钟内转移至含有转移缓冲液(transfer Buffer)的离心管中，放入含有冰盒的生物样本转运箱中(保持温度4～8℃)，同时样本转运箱中的冰盒可长时间维持在4～8℃，在此条件下可以维持样本的生物活性长达4天。

其中，transfer Buffer为包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μM L-丙氨酸，100μML-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸的Advanced DMEM/F-12K培养基。

1、获得样本之后，样本进行以下5步处理，(1)Wash Buffer 4，清洗2遍，每遍5分钟(2)Wash Buffer 2清洗3分钟。(3)Wash Buffer 3清洗3分钟。(4)眼科剪剔除脂肪，血液，坏死以及间质质量分数大于20％的部位(5)Wash Buffer1～5分别清洗。

其中，Wash Buffer 1为包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 3为包含体积分数为3％的乙酸的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲溶液；Wash Buffer 5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲溶液。

以上样本处理过程中采用的5种Wash Buffer分别通过不同的原理去除微生物，降低样本培养污染的概率，同时通过剪刀剔除相关组织部位，一方面可以去除部分污染，使清洗过程更加彻底有效，另一方面剔除间质较多的部位可以缩短酶解时间，提高酶解效率，以获得活性更高的肿瘤细胞。

2、随后，将清洗后的样本剪成1-2mm³大小的组织块，使用75u/mL胶原酶type I和0.6u/mL Dispase酶在37℃条件下消化上述组织块，同时每隔15分钟在镜下观察酶解状态，及时收集并更换新的酶解液，防止过度消化，维持收集后的细胞活力。

3、基质胶和枪头4℃预冷，培养基37℃预热。将收集的细胞使用合适体积的基质胶混悬均匀，使用枪头点板，放置在37℃培养箱中，30分钟后，加入相应的培养基300μL。该培养基是在DMEM/F-12K基础培养基的基础上添加了10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLR-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μMA83-01，5uM SB202190，4mM Nicotinamide以及10μM Y27632，可实现结直肠癌类器官的快速生长，以及传代，冻存，复苏等过程，建立相关生物样本库。

同时，发明人发现如果加入的细胞培养基为含有HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF 50ng/mL，Noggin 100ng/mL，FGF-10 10ng/mL，A83-01 0.5μM，Y27632 10μM的DMEM/F-12K培养基，该培养基不仅大大提高了类器官的传代培养的成功率，而且还可以实现对结肠腺癌，胃癌，直肠癌以及肺癌等癌种样本的普适性培养。

下面将详细描述本发明的具体实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

本实施例旨在探究样本消化的最佳方案，将结肠腺癌样本剪成1～2mm³小块，随机分为3份，对应使用以下3种消化方案进行上述酶解消化过程：

(1)胶原酶type I 75u/mL+Dispase 0.6u/mL；

(2)胶原酶type I 255u/mL+Dispase 0.6u/mL；

(3)胶原酶type I 255u/mL。

消化结束后，按照上述培养过程培养3天，结果发现，方案(2)会导致细胞产生很多空泡，发生凋亡，方案(3)会导致细胞活力下降，解离后的细胞没有发生团聚现象，类器官形成率下降，而只有方案(1)获得较好的细胞活力并能顺利形成类器官。如图1所示。

实施例2

在本次方案中旨在探究样本清洗的最佳方案，各选取10例样本采用不同顺序的清洗缓冲液处理办法。

对照组10例：

1)对新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第二清洗处理，即将鲜肿瘤样本在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟。

2)将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织；

3)将剔除处理后组织进行第一清洗处理。即将剔除处理后组织样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟。

统计培养后的污染概率以及培养成功概率。

实验组10例：清洗过程如前面说明书所述。统计培养后的污染概率以及培养成功概率。

结果：相比于对照组，实验组的培养污染概率低，对组织的损伤更小，成功率更高。

实施例3

在本次方案中旨在探究细胞培养的最佳方案，采用结肠腺癌类器官样本，分别考察了现有技术培养基常见组分对类器官生长的影响。

具体方案如下：将类器官计数，按照每10μL/50个类器官的浓度，使用Matrigel重悬类器官，种96孔板内，10μL/well，种板后分别使用减去不同单一组分的培养基进行培养，培养5天后，记录生长图片以及定量检测不同培养基条件下对类器官生长的影响。

结果发现，完全培养基(包括10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLR-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μM A83-01，5uMSB202190，4mM Nicotinamide以及10μM Y27632的DMEM/F-12K培养基)中，Noggin，A83-01，EGF以及Y27632组分对类器官生长具有促进作用，缺失后明显影响类器官增殖，Wnt-3A，R-spondin 1以及Nicotinamide的缺失基本上没有影响类器官的增殖，SB202190组分的缺失反而促进了类器官的增殖。根据筛选结果可得，包含HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF50ng/mL，Noggin 100ng/mL，FGF-10 10ng/mL，A83-01 0.5μM，Y27632 10μM的DMEM/F-12K培养基大大提高了类器官的传代培养的成功率。

实施例4

样本预处理：本次样本为结肠腺癌手术样本，样本大小约为2cm³。使用上述方法以及清洗液进行样本预处理，去除携带的微生物。

酶解：然后用剪刀剪成1-2mm³的组织块，加入5ml由胶原酶type I 75u/mL和Dispase 0.6u/mL组成的酶解液，处理15分钟后，镜下观察酶解情况，然后收集酶解液并更换新的酶解液，继续酶解过程，重复操作4次，全部组织消化完成，然后将收集到的细胞液离心，HBSS缓冲液清洗3遍，在显微镜下取3个10μl液滴计数，按照计数结果加入200uL基质胶进行重悬，维持细胞浓度在500～1500cells/10μL；

培养：将上述悬液通过预冷的枪头点在24孔细胞培养板中，4滴/well，10μL/滴。点板之后，将培养板放入37℃培养箱中，30分钟后加入相应培养基，300μL/孔。培养过程中，每3天更换培养基，观察类器官生长状态并拍照记录，分别在培养1天，4天以及5天后观察P0代类器官生长状态并拍照记录，结果如图2所示。

传代：培养7天后，单个类器官直径在300μm左右，进行传代操作。去除孔内培养基，加入细胞回收液400μl/孔，4℃条件下放置3小时，镜下观察类器官从基质胶中散落出来，将上述类器官转移至15ml离心管中，1mL移液器反复吹打20次，离心，使用10mL预冷的HBSS吹打清洗2次，离心去除上清，加入37℃预热的5mL TryPLe溶液，37℃处理15分钟，加入5mlHBSS缓冲液吹打清洗，离心收集类器官沉淀，计数，并按照500～1500细胞/10μl的浓度加入相应基质胶进行重悬，按照培养操作，进行种板，放入37℃待基质胶凝固后，加入培养基，每3天更换培养基，观察类器官生长状态并拍照记录，分别在传代后的第1天，4天以及5天后观察P1代类器官生长状态并拍照记录，结果如图3所示。

上述类器官可以长期传代培养(培养时间可超过2个月)，也可在也液氮中长期冻存，复苏，从而建立样本库。样本长期传代培养照片可见图4所示，其中左边第一图为第0代培养第5天的类器官照片，中间图为第3代培养第6天的类器官照片，右边图为第5待培养第6天的类器官照片。

冻存：P4代类器官生长6天后，去除培养基，加入类器官回收液放置在4°条件下3小时，收集散落的类器官，离心，加入类器官冻存液(培养基+10％DMSO+相关添加保护剂)，转移至程序降温盒，-80℃冰箱放置5小时，然后转移至液氮中长期保存。

复苏：上述P4类器官冻存超过2个月，取上述类器官在37℃水浴中快速融化，加入基础培养基吹打20次，离心，沉淀使用适量体积的基质胶重悬，点板，放入培养箱30分钟后，加入完全培养基(包括10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mLR-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μM A83-01，5uM SB202190，4mM Nicotinamide以及10μM Y27632的DMEM/F-12K培养基)，300μL/well。图5为P4代类器官复苏后第1天、第5天和第6天的类器官照片。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种癌类器官的体外培养方法，其特征在于，包括：将癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为1～2mm³，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的，所述组合消化酶包括胶原酶type I和Dispase酶；

将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为500～1500/10μL；

将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞进行培养处理，以便获得癌类器官。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组合消化酶是以酶溶液的形式提供的，所述胶原酶type I在所述酶溶液中的浓度为75u/mL，所述Dispase酶在所述酶溶液中的浓度为0.6u/mL；

优选地，所述癌组织与所述酶溶液的体积比为(1～2mm³)：(5～6mL)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化处理是通过如下方式进行的：

(1)将剪切处理后癌组织与组合消化酶在37℃的条件下进行第一消化处理，所述第一消化处理的时间为13～17分钟；

(2)更换组合消化酶，将经过第一消化处理的癌组织与新鲜组合消化酶进行第二消化处理，所述第二消化处理是在37℃的条件下进行13～17分钟；

(3)重复步骤(2)2～4次，以便获得癌细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化处理后，重悬处理前，进一步包括将所述癌细胞进行清洗处理；

任选地，所述清洗处理是在HBSS缓冲液中进行的；

任选地，利用HBSS缓冲液对所述癌细胞进行3～4遍清洗处理。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行点板处理前，进一步包括将点板处理用的枪头进行预冷处；

任选地，所述点板处理是通过如下方式进行的：

利用预冷枪头将所述癌细胞悬液点接在24孔板中，每孔点接4滴，每滴10μL；

将点接有癌细胞悬液的24孔板置于37℃的培养箱中静置30min。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括将24孔板中的基质胶更换为细胞培养基，所述细胞培养基预先进行37℃遇热处理。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述培养处理是在细胞培养基中进行的，所述细胞培养基为DMEM/F-12K培养基，所述细胞培养基中含有10mM HEPES，2mM L-Glutamine，50ng/mLEGF，100ng/mLNoggin，500ng/mL R-Spondin 1，100ng/mLWNT-3A，10ng/mL FGF-10，0.5μM A83-01，5uM SB202190，4mM Nicotinamide以及10μM Y27632；

优选地，所述细胞培养基中含有HEPES 10mM，L-Glutamine 2mM，EGF 50ng/mL，Noggin100ng/mL，FGF-10 10ng/mL，A83-01 0.5μM，Y27632 10μM。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将点板处理后的癌细胞进行培养6～7天后，进一步将所获得的癌类组织进行传代、冻存或复苏处理。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌组织样本预先经过清洗处理。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述清洗处理是通过如下方式进行的：

将新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液中进行第一清洗处理；

将第一清洗处理后的样本进行剔除处理，以便去除脂肪、血液、坏死以及间质含量大于20％的组织；以及

将剔除处理后组织进行第二清洗处理；

优选地，所述第一清洗处理是在清洗缓冲液2～4中进行的，所述清洗缓冲液2为包含体积分数为75％的无水乙醇的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液3为包含体积分数为3％的乙酸HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液4为包含浓度为1000单位/mL的青霉素、浓度为1000μg/mL的链霉素以及浓度为2.5μg/mL的两性霉素B的HBSS缓冲液；

优选地，所述第一清洗处理是通过如下方式进行的：

将所述新鲜肿瘤样本在清洗缓冲液4中清洗2或3遍，每遍4～6分钟；

将经过清洗缓冲液4清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；

将经过清洗缓冲液2清洗的肿瘤样本在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；

优选地，所述第二清洗处理是在清洗缓冲液1～5中进行的，所述清洗缓冲液1包含浓度为100单位/mL的青霉素，浓度为100μg/mL的链霉素以及浓度为0.25μg/mL两性霉素B的HBSS缓冲液，所述清洗缓冲液5为包含体积分数为1％的FBS的HBSS缓冲液；

优选地，所述第二清洗处理是通过如下方式进行的：

将剔除处理后组织在清洗缓冲液1中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；

将经过清洗缓冲液1清洗的组织在清洗缓冲液2中清洗2～4分钟；

将经过清洗缓冲液2清洗的组织在清洗缓冲液3中清洗2～4分钟；

将经过清洗缓冲液3清洗的组织在清洗缓冲液4中、在4℃的条件下浸泡28～32分钟；以及

将经过清洗缓冲液4浸泡的组织在清洗缓冲液5中清洗5或6遍，每遍4～6分钟；

优选地，所述新鲜肿瘤样本预先保存在转移缓冲液中，所述转移缓冲液为AdvancedDMEM/F-12K培养基，所述转移缓冲液含有包含15mM HEPEs、100μM甘氨酸、100μML-丙氨酸，100μM L-天冬酰胺、100μM L-天冬氨酸、100μM L-谷氨基酸、100μM L-脯氨酸以及100μM L-丝氨酸；

任选地，所述新鲜肿瘤样本预先保存在4～8℃的条件下。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌组织样本为结肠腺癌组织样本。

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