CN112725279A - 一种基于肿瘤类器官模型的药敏检测和标准建立方法以及微流控芯片结构的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药敏检测技术领域，具体地，本发明涉及一种基于肿瘤类器官模型的药敏检测和标准建立方法以及微流控芯片结构的应用。本发明基于肿瘤类器官培养方法，建立肿瘤药敏检测方法，同时开发了微流控芯片结构，进而优化了高通量药敏检测方法，建立新的PDX体内模型构建方法，来确认肿瘤类器官药敏检测的准确性和参考标准。在体外建立的高通量药敏检测手段将在很短的时间内完成药敏检测，同时保持和体内药敏以及临床结果的高度相关性，可用于肿瘤病人的临床用药指导，提高化疗的有效率。
Description
技术领域
本发明涉及药敏检测技术领域，具体地，本发明涉及一种基于肿瘤类器官模型的药敏检测和标准建立方法以及微流控芯片结构的应用。
背景技术
现有的药敏技术一般采用3种模型，分别为肿瘤细胞系、原代肿瘤细胞及体内PDX模型，检测方法一般采用微孔板检测，具有如下缺陷：
1)肿瘤细胞系经过长期培养传代，遗传信息发生较大改变，不能反映真实的药效，不具备个体化检测的基础，药效和临床相关性较差；
2)原代肿瘤细胞是平面培养细胞，缺少三维立体结构和组织学特征，导致药敏检测和临床相关性不好；
3)PDX(病人来源的移植瘤)模型建模成功率较低，周期长，往往无法匹配病人的治疗周期，同时价格较昂贵；
4)微孔板药敏检测，耗费较多样本数量，同时成本较高，有进一步高通量优化的空间；
5)肿瘤免疫治疗缺少体外评价模型。
因此，亟需开发一种更好的保留遗传特征、保证较好的临床相关性、缩短建模周期的药敏检测和标准建立方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于基于肿瘤类器官培养方法，建立肿瘤药敏检测方法，同时开发了微流控芯片结构，进而优化了高通量药敏检测方法，建立新的PDX体内模型构建方法，来确认肿瘤类器官药敏检测的准确性和参考标准。在体外建立的高通量药敏检测手段将在很短的时间内完成药敏检测，同时保持和体内药敏以及临床结果的高度相关性，可用于肿瘤病人的临床用药指导，提高化疗的有效率。
为此，本发明第一方面提供一种用于体外培养三维肿瘤类器官的培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包含：
Y-27632、A83-01、SB202190以及R-spondin 1或RS-246204。
发明人创造性的发现一种新的用于体外培养三维肿瘤类器官的培养基，能够将癌细胞培养为三维肿瘤类器官，同时保持了与癌细胞来源的癌组织样本较为相似的组织学和遗传学特征。培养获得的三维肿瘤类器官能反映真实的药效，可用于筛选抗肿瘤药物，药敏检测和临床相关性较好。
根据本发明实施例的用于体外培养三维肿瘤类器官的培养基，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述SB202190的浓度为1～20μM。
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述Y-27632的浓度为1～20μM。
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述A83-01的浓度为300～1200nM。
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述R-spondin 1的浓度为200～600ng/mL。
根据本发明的实施例，在所述培养基中，所述RS-246204的浓度为1～100ng/mL。
根据本发明的实施例，所述培养基还包括WNT-3a、Noggin、EGF以及基础培养基Advanced DMEM/F12K。
根据本发明的实施例，所述WNT-3a的浓度为50～200ng/mL。
根据本发明的实施例，所述Noggin的浓度为50～200ng/mL。
根据本发明的实施例，所述EGF的浓度为50～200ng/mL。
本发明第二方面提供一种三维肿瘤类器官的体外构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)将癌组织样本处理为单个癌细胞；
(2)将所述单个癌细胞接种于基质胶中进行重悬处理，获得癌细胞悬液；
(3)将所述癌细胞悬液接种于第一方面所述的培养基中，对所述癌细胞进行培养，以便获得三维肿瘤类器官。
通过上述方法获得的三维肿瘤类器官，可代替肿瘤细胞系和原代肿瘤细胞，更好的保留了遗传特征，用来评价抗肿瘤药物敏感性，保证了较好的临床相关性。
根据本发明实施例的构建方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌组织样本源自癌症患者。
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述癌细胞在所述癌细胞悬液中的浓度为500～1500个细胞/10μL。
所述癌细胞在所述癌细胞悬液中的浓度过高，会导致类器官球之间的相互挤压，影响其正常形态结构，浓度过低会造成细胞自分泌能力下降，生长较差。
本发明第三方面提供一种三维肿瘤类器官。根据本发明的实施例，所述三维肿瘤类器官通过第二方面所述的体外构建方法获得。
所述三维肿瘤类器官保持了与癌细胞来源的癌组织样本较为相似的组织学和遗传学特征。培养获得的三维肿瘤类器官能反映真实的药效，可用于筛选抗肿瘤药物，药敏检测和临床相关性较好。
本发明第四方面提供一种PDX小鼠模型的建立方法。根据本发明的实施例，将第三方面所述的三维肿瘤类器官移植到小鼠体内，以便获得PDX小鼠模型，其中，所述小鼠为免疫缺陷小鼠。
本发明的PDX小鼠模型的建立方法，与现有的建模方法相比，成功率更高，缩短建模周期，且降低了建模成本。
根据本发明实施例的建立方法，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述建立方法进一步包括将所述三维肿瘤类器官接种于基质胶中进行重悬处理，获得所述三维肿瘤类器官的细胞球悬液的浓度为200～100000个细胞球/100μL。
所述三维肿瘤类器官的细胞球悬液的浓度过大，会造成初始形成肿瘤较大，且形状不规则，后期测量不便；浓度过小会导致成瘤时间延长，成瘤率下降。
本发明第五方面提供一种PDX小鼠模型。根据本发明的实施例，所述PDX小鼠模型通过所述的建立方法获得。
本发明第六方面提供一种抗肿瘤药物敏感性检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
1)将第三方面所述的三维肿瘤类器官消化为单个肿瘤细胞；
2)设置不同的待检测抗肿瘤药物的浓度梯度，将所述待检测抗肿瘤药物与所述单个肿瘤细胞在微孔板中孵育，以便获取每个药物浓度下的相对细胞抑制率；
3)根据每个药物浓度下的相对细胞抑制率，获取所述药物的IC50值，以便判断所述三维肿瘤类器官对所述抗肿瘤药物的敏感性。
采用微孔板，利用本发明中三维肿瘤类器官消化成的单个肿瘤细胞进行抗肿瘤药物筛选，相比现有的肿瘤细胞系、原代肿瘤细胞更能够反映真实的药效，药效和临床相关性更好。
本发明第七方面提供一种微流控芯片。根据本发明的实施例，所述微流控芯片包括类器官培养区域以及设置于其两侧的药品进样通路，所述药品进样通路与储液池连接，所述储液池用于存储药品；所述类器官培养区域与所述药品进样通路之间设置微柱，所述微柱用于将类器官限制在所述类器官培养区域，并且药品能够通过所述微柱与所述类器官培养区域内的类器官接触。
发明人创造性的获取一种新的微流控芯片，利用芯片进行药敏检测，大大减小了样本用量，节约了成本；芯片同时可以满足免疫细胞和肿瘤类器官的共培养，建立了一种新的肿瘤免疫治疗药物的体外药效评价模型。
根据本发明实施例的微流控芯片，还可以具有以下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述类器官培养区域设置进样孔，通过所述进样孔能够将所述类器官注入所述类器官培养区域。
本发明第八方面提供一种抗肿瘤药物敏感性检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
a)将第三方面所述的三维肿瘤类器官与第一方面所述的培养基的混合物加入第七方面所述的微流控芯片的类器官培养区域，同时将能够显示所述三维肿瘤类器官中细胞活力的荧光染料注入所述药品进样通路，培养所述微流控芯片中的所述三维肿瘤类器官，统计所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIm；
b)分别将不同浓度的待检测抗肿瘤药物注入所述药品进样通路，将所述待检测抗肿瘤药物与所述三维肿瘤类器官接触，统计不同浓度所述待检测抗肿瘤药物作用后所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIn；
c)依据所述荧光强度FIm和FIn的值，评价所述待检测抗肿瘤药物对于所述三维肿瘤类器官的药效，以便检测所述抗肿瘤药物的敏感性。
利用本发明的微流控芯片进行药敏检测，大大减小了样本用量，节约了成本。
本发明另一方面提供所述的三维肿瘤类器官、所述的PDX小鼠模型、所述的微流控芯片在抗肿瘤药物筛选中的用途。
本发明另一方面提供一种抗肿瘤药物的体外药效评价模型。根据本发明的实施例，所述体外药效评价模型包括：
i)获取所述的PDX小鼠模型的相对肿瘤增殖率(T/C％)；
ⅱ)通过上述利用微孔板或微流控芯片技术获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值，并计算最大血药浓度的抑制率；
ⅲ)综合i)中的T/C％和ⅱ)中的IC50值和抑制率，分别根据体外、体内药敏评价标准评价药物方案的敏感性，对比体内、体外结果吻合度，判断体外三维肿瘤类器官药敏检测的有效性。
具体来讲，若在体外药敏结果中，IC50越小，最大血药浓度的抑制率越大，其体内结果中T/C％越小，代表体内外药敏结果一致。
本发明提供的抗肿瘤药物的体外药效评价模型，所述模型来源于病人本身，并且保留了三维组织结构以及遗传学特征，可以真实的反应病人对药物的反应，药效结果和临床一致性好。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明中抗肿瘤药物的体外药效评价模型的建立过程；
图2显示了在不同的培养基中肿瘤类器官的生长情况；
图3显示了肿瘤类器官和肿瘤组织的HE染色及免疫组化(Ki-67和CK-7)结果；T是指肿瘤组织，O是指肿瘤类器官，Ki67和CK-7是肿瘤组织中常见的免疫组化蛋白marker，CH31、CH33、CH41是指不同的病人编号；
图4显示了本发明肿瘤类器官和肿瘤组织全外显子测序结果，每个样品对应的柱状图由三部分组成(用不同的颜色表示)，自上而下依次为肿瘤类器官和肿瘤组织中基因突变类型以及单核苷酸多态性是一致的、PDO模型特有的、肿瘤组织特有的，CRC+数字代表不同的样品；
图5显示了不同肠癌病人体外药物筛选结果，P+数字代表不同的患者个体；
图6显示了dMMR和pMMR病人对5-Fu单药化疗方案的反应差异；
图7显示了本发明的微流控芯片的具体结构，其中左图白色方框(箭头1所指)中显示的是储液池，右侧显示了微流控芯片的类器官培养区域和药品进样通路的放大图，其中中间区域(箭头3所指)为类器官培养区域，类器官培养区域的两侧为药品进样通路(箭头2和4所指)，类器官培养区域与药品进样通路之间为微柱(空心椭圆)；
图8显示了不同病人来源的移植瘤模型生长状况(n＝5)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
根据本发明的一些具体的实施方案，本发明提供一种用于体外培养三维肿瘤类器官的培养基，所述培养基包含：Y-27632、A83-01、SB202190以及R-spondin 1或RS-246204。
在所述培养基中，所述SB202190的浓度为1～20μM，例如可以是2μM、3μM、5μM、8μM、10μM、15μM、20μM；
所述Y-27632的浓度为1～20μM，例如可以是2μM、5μM、8μM、10μM、15μM、20μM；
所述A83-01的浓度为300～1200nM，例如可以是400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM；
所述R-spondin 1的浓度为200～600ng/mL，例如可以是250ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL；
所述RS-246204的浓度为1～100ng/mL，例如可以是5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL。
所述培养基还包括WNT-3a、Noggin、EGF以及基础培养基Advanced DMEM/F12K，
所述WNT-3a的浓度为50～200ng/mL，例如可以是60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL；
所述Noggin的浓度为50～200ng/mL，例如可以是60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL；
所述EGF的浓度为50～200ng/mL，例如可以是60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL。根据本发明的一些具体的实施方案，所述三维肿瘤类器官是通过以下方式获得的：
将癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为1～2mm3，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的，所述组合消化酶包括胶原酶type I(1mg/mL)和透明质酸酶(10μg/mL)以及DNA酶(0.4μg/mL)；将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶(Matrigel)进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为500～1500个细胞/10μL；将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞接种于培养基中进行培养处理，以便获得癌类器官。
所述组合消化酶是以酶溶液的形式提供的，所述癌组织大小与所述酶溶液的体积比为(1～2mm3)：(5～6mL)。组合消化酶的目的是将癌组织样本消化为单个癌细胞，对于酶的选择并不限于上述的酶，也可选用本领域常规的其他的消化酶，只要能够将组织消化为单个细胞即可，同时要保证不会对单个癌细胞的活性产生影响。对于癌组织大小与酶溶液的体积比可根据需要进行调整。
根据本发明的一些具体的实施方案，培养癌细胞形成类器官的培养基组成：1％～3％(v/v)HEPES、1％～3％L-glutamine、50～200ng/mL Noggin、1～20μM Y-27632、50～200ng/mL EGF、300～1200nM A83-01、0.1～1％(v/v)Normocin，并添加1～5％(v/v)B27、1％～5％(v/v)N2、1～20mM烟酰胺、0.1～10mM N-乙酰半胱氨酸、1～1000nM胃泌素I、1～1000nM前列腺素2、1～20μM SB202190、200～600ng/mL ng/mL R-Spodin1，以及1～500ng/mL FGF-10或1～500ng/mL FGF-basic。
根据本发明的一些具体的实施方案，PDX小鼠模型的建立通过以下方式获得的：
取PDO模型，使用基质胶将肿瘤组织配制成适当浓度的悬液(200～100000个细胞球/100μL)。将免疫缺陷小鼠麻醉后，用碘伏在小鼠腋下部位擦拭消毒，使用注射器皮下注射至小鼠右侧腋下部位，50～200μL/只，定期记录小鼠体重并用游标卡尺记录肿瘤大小。
图1显示了本发明中抗肿瘤药物的体外药效评价模型的建立过程。
根据本发明的一些具体的实施方案，抗肿瘤药物的体外药效评价模型，包括：
i)获取所述的PDX小鼠模型的相对肿瘤增殖率(T/C％)；
ⅱ)通过利用微孔板或微流控芯片技术获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值，并计算最大血药浓度的抑制率；
ⅲ)综合i)中的T/C％和ⅱ)中的IC50值和抑制率，分别根据体外、体内药敏评价标准评价药物方案的敏感性，对比体内、体外结果吻合度，判断体外三维肿瘤类器官药敏检测的有效性。
若在体外药敏结果中，IC50越小，最大血药浓度的抑制率越大，其体内结果中T/C％越小，代表体内外药敏结果一致。
根据本发明的一些具体的实施方案，获取所述的PDX小鼠模型的相对肿瘤增殖率(T/C％)，通过以下方法获得：
对给药和非给药对照组模型小鼠的肿瘤尺寸每天变化情况观察并记录。根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》，小鼠肿瘤体积V的计算公式为：V＝1/2×a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长和宽。小鼠的相对肿瘤体积RTV＝Vt/V0，其中Vt为用药后测量时小鼠肿瘤体积，V0为分笼给药时小鼠肿瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率(T/C％)。T/C％＝TRTV/CRTV×100％，其中TRTV为药物组相对肿瘤体积，CRTV为阴性对照组相对肿瘤体积。疗效的评价标准为：T/C％＞60％为无效；T/C％≤60％且经过统计学分析P＜0.05代表有效。
根据本发明的一些具体的实施方案，利用微孔板技术获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值，通过以下方法获得：
1)将所述的三维肿瘤类器官消化为单个肿瘤细胞；
2)设置不同的待检测抗肿瘤药物的浓度梯度，将检测抗肿瘤药物与所述单个肿瘤细胞在微孔板中孵育，以便获取每个药物浓度下的相对细胞抑制率；
3)根据每个药物浓度下的相对细胞抑制率，获取所述药物的IC50值。
根据本发明的一些具体的实施方案，利用微流控芯片技术获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值，通过以下方法获得：
a)将所述三维肿瘤类器官与所述培养基的混合物加入所述的微流控芯片的类器官培养区域，同时将能够显示所述三维肿瘤类器官中细胞活力的荧光染料注入所述药品进样通路，培养微流控芯片中的所述三维肿瘤类器官，统计所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIm；
b)分别将不同浓度的待检测抗肿瘤药物注入所述药品进样通路，将所述待检测抗肿瘤药物与所述三维肿瘤类器官接触，统计不同浓度所述待检测抗肿瘤药物作用后所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIn；
c)统计所述抗肿瘤药物在加药前后的荧光强度变化，计算每个浓度下的细胞抑制率，获得拟合曲线，以便获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：肿瘤组织酶解种板
PDO模型的构建是通过以下方式进行的：将肠癌组织样本进行剪切和消化处理，所述剪切处理后癌组织的大小为2mm3，所述消化处理是在组合消化酶的作用下进行的，所述组合消化酶包括胶原酶type I(1mg/mL)和透明质酸酶(10μg/mL)以及DNA酶(0.4μg/mL)；将消化处理后获得的癌细胞利用预冷基质胶进行重悬处理，所述癌细胞在所述基质胶中的浓度为1000个细胞/10μL；将癌细胞悬液进行点板处理，并将点板处理后的癌细胞进行培养处理，以便获得癌类器官。
所述组合消化酶是以酶溶液的形式提供的，癌组织与酶溶液的体积比为2mm3：(5～6ml)。
实施例2：肿瘤类器官培养基优化
所述培养基初始配方为表1培养基1所示，针对以上配方增加新的组分2％的B27、1％的N2、4mM烟酰胺、1mM N-乙酰半胱氨酸、10nM胃泌素1、10nM前列腺素2、3μM SB202190、500ng/mL R-Spodin1，并且将100ng/mL FGF-10更换为100ng/mL FGF-basic进一步验证是否提高肿瘤类器官生长效率，结果发现某些组分可以明显提高肿瘤类器官生长效率，而SB202190对肿瘤类器官的形成影响较大。图2显示了在不同的培养基中肿瘤类器官的生长情况。培养基7培养组的生长最快，并且最终的代表活细胞数量的RLU最大，最终优化培养基配方为培养基7所示培养基，在上述点板的孔内加入100μL培养基，每两天更换一次。根据上述结果，对影响较大的组分进一步设计正交实验和单因素分析。
实施例3：普适性肿瘤类器官培养基配方
在实施例2研究的基础上，普适性培养基配方调整为Advanced DMEM/F-12K、重组人WNT-3a蛋白100ng/mL、R-spondin 1 500ng/mL、EGF 50ng/mL、Noggin 100ng/mL、Y-2763210nM、A83-01 0.5μM、XμM SB202190，X是指根据不同的肿瘤类型及个体化差异需要调整的内容。验证实验如下：将上述培养基用于不同类型的肿瘤类器官的培养，并观察不同样本之间最佳生长曲线所需的SB202190浓度，确认SB202190浓度是普适性肿瘤类器官培养基的关键因素。在不同的肿瘤类型中，SB202190浓度范围为1～20μM。
实施例4：培养基中RS-246204小分子代替R-spondin 1重组蛋白研究
将实施例2中的优化后的培养基配方中的R-spondin 1重组蛋白分别用50μM、25μM、12.5μM浓度的RS-246204替代，利用4种培养基进行肿瘤类器官的培养，观察10天后生长倍数差异，可以从结果得知25μM浓度的RS-246204小分子可以取代R-spondin 1重组蛋白，按照常用供应商的价格计算每100mL培养基使用RS246204或者R-spondin 1重组蛋白的费用如表2，大大降低了培养费用。
实施例5：对肿瘤类器官进行了免疫组化鉴定，测序分析
将肿瘤类器官与其对应的亲代肿瘤组织进行固定、脱水、切片、染色等过程，最终显微镜下观察拍照，如附图3所示，发现HE染色结果中，肿瘤类器官保留了细胞学形态以及腺体结构，其表达Ki67以及CK-7的阳性细胞相同，同时收集上述样本进行全外显子测序，分析其基因突变类型以及单核苷酸多态性，结果如附图4所示，表明肿瘤类器官与其对应的亲代肿瘤组织保持高度的一致性。
实施例6：微孔板体外药物筛选
抗肿瘤药物在肠癌PDO模型的IC50数值是通过以下方式获得的：将PDO模型培养一周后，通过消化酶处理成单细胞，计数，按照4000个细胞/5mL基质胶的浓度点板在96孔细胞培养板孔内，加入实施例2中的优化培养基，培养3天后，加入药物，分为阴性对照组和分别为50、25、12.5、6.25、3.125以及1.5625μg/mL的5-FU药物浓度梯度组，药物处理6天，每隔3天更换新鲜药物及培养基，6天后去除培养基，加入ATP检测试剂，通过检测发光值，来计算每个药物浓度下的相对细胞抑制率，实验结果以药物浓度LOG值为x轴，细胞活性为y轴，绘制散点图并进行拟合，计算药物的IC50数值。结果如附图5所示，显示了不同肠癌病人体外药物筛选结果。
实施例7：初步判断5-Fu药物敏感的IC50参考区间
根据肠癌病人免疫组化及上述药物筛选结果，初步判断药敏参考区间，dMMR以及pMMR病人(编号为31和编号为21)5-Fu药物IC50分别为108.9和90.59μM，根据CSCO结直肠癌诊疗指南2019年版内容，dMMR患者不会从5-Fu单药辅助化疗中获益，编号31病人为不敏感，编号21病人为敏感，故设定IC50<25％5-Fu最大血液浓度，即96μM时为药物敏感，反之为不敏感。附图6显示了dMMR和pMMR病人对5-Fu单药化疗方案的反应差异。
实施例8：微流控芯片体外药物筛选
所述的用于体外药物筛选的微流控芯片是按照以下规格进行制作的：中间通路用于类器官培养区域，类器官于上端进样孔进入后，部分停留类器官培养区域，类器官培养区域长3.5厘米，宽0.8厘米，深0.25厘米；两侧通路为药品进样通路，可用于药物进样或检测试剂的进样过程，两侧进样通路连接有圆形储液池(如图7方框内所示)，可用于药物溶液或检测试剂液体的储存，防止通路内干涸，储液池直径4.4厘米，深0.25厘米；药品进样通路长度共12.4厘米，宽1厘米，深0.25厘米。类器官培养区域与药物进样通路之间设置有微柱，如图7中右侧图所示，其作用为防止类器官进入两侧药品进样通路；微柱为椭圆形，长0.4厘米，宽0.2厘米，高0.25厘米，微柱之间垂直距离为25微米。
所述使用微流控芯片获得的体外药物筛选结果是通过以下方式获得的：当孔板内培养的PDO模型达到传代标准后，从孔板中取出肿瘤类器官，取适量培养基与类器官混合均匀后，注入微流控芯片的类器官培养区域。配制适合浓度的Alamar Blue试剂，由两侧药物进样通路注入后，将芯片置于细胞培养箱内5小时。将芯片取出后置于荧光显微镜下观察不同芯片的类器官培养区域的荧光强度并进行记录，每个芯片所记录荧光强度分别为FI0-FI7(设置一个对照组与6个药物浓度组)。分别由每个芯片的药物进样通路注入不同浓度梯度的抗肿瘤药物，空白对照组注入相同体积的培养基。将芯片放入细胞培养箱内培养24小时。药物作用24小时后将芯片取出后置于荧光显微镜下观察不同芯片的类器官培养区域的荧光强度并进行记录，对应加药前设置的组别，实验结果分别记录为FI′0-FI′7。抗肿瘤药物加药前后的荧光强度变化(FI′n-FIn)将作为半定量检测药物对于类器官作用药效的评价方法。
实施例9：微流控芯片实现免疫细胞和肿瘤类器官共培养
实施例8中的微流控芯片结构可以实现免疫细胞和肿瘤类器官的共培养，具体实施如下：将肿瘤类器官重悬在基质胶内，加入芯片孔的中间区域，待凝固后由一侧通道加入肿瘤类器官培养基，另一侧加入含有NK-92细胞的培养基，共培养48小时后，观察NK-92细胞对肿瘤类器官的杀伤作用；所述共培养还包含将NK-92细胞更换为T细胞等免疫细胞类型，加入免疫检查点药物，用来评价PD-1等免疫检查点药物体外药效。
实施例10：PDX模型构建方法
所述PDX模型的建立是通过以下方式进行的：取PDO模型，使用基质胶将肿瘤组织配置成适当浓度的悬液(20000细胞球/100μL)。将小鼠(BALB/c-nude，6周左右雄鼠)麻醉后，用碘伏在小鼠腋下部位擦拭消毒，使用注射器皮下注射至小鼠右侧腋下部位，100μL/只，定期记录小鼠体重并用游标卡尺记录肿瘤大小。比较上述PDX构建方法和传统的PDX构建方法(即，将病人肿瘤组织直接剪成小块埋入免疫缺陷小鼠皮下)在建模周期和成功率方面的差异，证明新方法具有优势。附图8显示了不同病人来源的移植瘤模型生长状况(n＝5)。
实施例11：PDX模型体内药物筛选
上述接种后的小鼠继续放入鼠笼喂养，定期记录小鼠体重并用游标卡尺记录肿瘤大小。当小鼠体内肿瘤大小满足传代要求(体积在1000mm3左右)时，进行传代。将小鼠脊椎处死后，用酒精擦拭小鼠肿瘤生长部位，使用解剖剪剪开肿瘤生长处表皮并将肿瘤取出。在无菌条件下使用双抗溶液清洗肿瘤组织，并用酒精浸泡并高温消毒后的手术剪将肿瘤组织处理为3×3×3mm3的小块。将肿瘤组织接种到新一批小鼠体内，以此类推。一般在传代1次以后，PDX小鼠模型可达到稳定状态，可以进行后续实验。所述PDX模型的相对肿瘤增殖率(T/C％)是通过以下方式获得的：对给药和非给药对照组模型小鼠的肿瘤尺寸(使用游标卡尺测量)每天变化情况观察并记录。根据《抗肿瘤药物药效学指导原则》，小鼠肿瘤体积V的计算公式为：V＝1/2×a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长和宽。小鼠的相对肿瘤体积RTV＝Vt/V0，其中Vt为用药后测量时小鼠肿瘤体积，V0为分笼给药时小鼠肿瘤体积。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增殖率(T/C％)。T/C％＝TRTV/CRTV×100％其中TRTV为药物组相对肿瘤体积，CRTV为阴性对照组相对肿瘤体积。疗效的评价标准为：T/C％＞60％为无效；T/C％≤60％且经过统计学分析P＜0.05代表有效。
实施例12：PDO药敏模型有效性分析
在获得抗肿瘤药物在所述PDO模型中的IC50数值以及所述PDX模型中的T/C％数值后，分别根据体外体内药敏评价标准评价药物方案的敏感性，对比体内外结果吻合情况，判断体外PDO药敏检测的有效性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (16)
1.一种用于体外培养三维肿瘤类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包含：
Y-27632、A83-01、SB202190以及R-spondin 1或RS-246204。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，在所述培养基中，所述SB202190的浓度为1～20μM；
任选地，所述Y-27632的浓度为1～20μM；
任选地，所述A83-01的浓度为300～1200nM；
任选地，所述R-spondin 1的浓度为200～600ng/mL；
任选地，所述RS-246204的浓度为1～100ng/mL。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括WNT-3a、Noggin、EGF以及基础培养基Advanced DMEM/F12K，
任选地，所述WNT-3a的浓度为50～200ng/mL；
任选地，所述Noggin的浓度为50～200ng/mL；
任选地，所述EGF的浓度为50～200ng/mL。
4.一种三维肿瘤类器官的体外构建方法，其特征在于，包括：
(1)将癌组织样本处理为单个癌细胞；
(2)将所述单个癌细胞接种于基质胶中进行重悬处理，获得癌细胞悬液；
(3)将所述癌细胞悬液接种于权利要求1～3中任一项所述的培养基中，对所述癌细胞进行培养，以便获得三维肿瘤类器官。
5.根据权利要求4所述的体外构建方法，其特征在于，所述癌组织样本源自癌症患者。
6.根据权利要求4所述的体外构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述癌细胞在所述癌细胞悬液中的浓度为500～1500个细胞/10μL。
7.一种三维肿瘤类器官，其特征在于，所述三维肿瘤类器官通过权利要求4～6中任一项所述的体外构建方法获得。
8.一种PDX小鼠模型的建立方法，其特征在于，将权利要求7所述的三维肿瘤类器官移植到小鼠体内，以便获得PDX小鼠模型，其中，所述小鼠为免疫缺陷小鼠。
9.根据权利要求8所述的建立方法，其特征在于，所述建立方法进一步包括将所述三维肿瘤类器官接种于基质胶中进行重悬处理，获得所述三维肿瘤类器官的细胞球悬液的浓度为200～100000个细胞球/100μL。
10.一种PDX小鼠模型，其特征在于，所述PDX小鼠模型通过权利要求8或9所述的建立方法获得。
11.一种抗肿瘤药物敏感性检测方法，其特征在于，包括：
1)将权利要求7所述的三维肿瘤类器官消化为单个肿瘤细胞；
2)设置不同的待检测抗肿瘤药物的浓度梯度，将所述待检测抗肿瘤药物与所述单个肿瘤细胞在微孔板中孵育，以便获取每个药物浓度下的相对细胞抑制率；
3)根据每个药物浓度下的相对细胞抑制率，获取所述药物的IC50值，以便判断所述三维肿瘤类器官对所述抗肿瘤药物的敏感性。
12.一种微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括类器官培养区域以及设置于其两侧的药品进样通路，所述药品进样通路与储液池连接，所述储液池用于存储药品；所述类器官培养区域与所述药品进样通路之间设置微柱，所述微柱用于将类器官限制在所述类器官培养区域，并且药品能够通过所述微柱与所述类器官培养区域内的类器官接触。
13.根据权利要求12所述的微流控芯片，其特征在于，所述类器官培养区域设置进样孔，通过所述进样孔能够将所述类器官注入所述类器官培养区域。
14.一种抗肿瘤药物敏感性检测方法，其特征在于，所述方法包括：
a)将权利要求7所述的三维肿瘤类器官与权利要求1～3中任一项所述的培养基的混合物加入权利要求12或13所述的微流控芯片的类器官培养区域，同时将能够显示所述三维肿瘤类器官中细胞活力的荧光染料注入所述药品进样通路，培养所述微流控芯片中的所述三维肿瘤类器官，统计所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIm；
b)分别将不同浓度的待检测抗肿瘤药物注入所述药品进样通路，将所述待检测抗肿瘤药物与所述三维肿瘤类器官接触，统计不同浓度所述待检测抗肿瘤药物作用后所述三维肿瘤类器官的荧光强度FIn；
c)依据所述荧光强度FIm和FIn的值，评价所述待检测抗肿瘤药物对于所述三维肿瘤类器官的药效，以便检测所述抗肿瘤药物的敏感性。
15.权利要求7所述的三维肿瘤类器官、权利要求10所述的PDX小鼠模型、权利要求12或13所述的微流控芯片在抗肿瘤药物筛选中的用途。
16.一种抗肿瘤药物的体外药效评价模型，其特征在于，包括：
i)获取权利要求10所述的PDX小鼠模型的相对肿瘤增殖率(T/C％)；
ⅱ)通过权利要求11所述的方法或权利要求14所述的方法，获得针对所述三维肿瘤类器官的药物的IC50值，并计算最大血药浓度的抑制率；
ⅲ)综合i)中的T/C％和ⅱ)中的IC50值和抑制率，分别根据体外、体内药敏评价标准评价药物方案的敏感性，对比体内、体外结果吻合度，以便判断体外三维肿瘤类器官药敏检测的有效性。
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