CN108823145B - 一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，包括以下步骤：配制成人脑微血管内皮细胞悬液和人脑星形胶质细胞悬液，配制纤维蛋白原母液和凝血酶母液；将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液；将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，恒温孵育至凝胶化后，向所述微流控芯片中加入内皮细胞生长培养基，构建成3D细胞培养芯片；对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障。本发明提供的技术方案，成功建立了血脑屏障的体外模型，更清楚、准确地反应了血脑屏障的特性。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法。
背景技术
血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止有害物质由血液进入脑组织，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学作用。因此研究血脑屏障的形成对于研究相关疾病具有重要意义。
目前二维(2D)血脑屏障(blood brain barrier,BBB)模型大多由单一培养脑微血管内皮细胞组成，或者由神经胶质细胞或星形胶质细胞在微流体平台内开发形成。虽然这些现有的2D模型可能模拟神经和微血管功能的一些重要方面，有利于我们对细胞功能基础和生物学机制研究，但它们未能呈现出体内至关重要的三维(3D)细胞组织结构。而且一般2D血脑屏障模型大多数来自动物模型。目前虽然动物模型已被广泛用于各项疾病的研究，但近年来有学者认识到动物模型和人类仍然存在巨大差异，即使与人类非常相似的动物，也不能直接用于预测人类。最近细胞生物学领域已经开始认识到这些平坦表面细胞生长外环境与3D细胞体内生长的复杂环境之间的不相似性，所以2D模型很难如实获取体内细胞的生理行为。
三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture,TDCC)，也称3D细胞培养，是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物的方法。3D细胞培养能更好地模拟体内正常细胞的生长环境，重现复杂的组织结构和体内形态，充分反映分化等细胞活动和细胞间反应，从而有着更加真实的细胞生物学表现和功能，可以更好地预测病程和药物反应，建立更准确的靶组织模型。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，旨在提供一种准确性高的血脑屏障的体外构建方法。
为实现上述目的，本发明提出一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，包括以下步骤：
将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；
向预热后的DPBS中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液；
将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入内皮细胞生长培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，每天更换培养基，构建成3D细胞培养芯片；
对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障。
优选地，将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液的步骤中：
所述原代人脑微血管内皮细胞使用绿色荧光蛋白GFP标记，所述原代人脑星形胶质细胞使用mCherry蛋白标记。
优选地，将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液的步骤，具体包括：
将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞分别使用内皮细胞生长培养基和星形胶质细胞培养基进行复苏培养，培养至细胞融合度达80～90％时，分别收集人脑微血管内皮细胞悬液和人脑星形胶质细胞悬液，对应获得内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；其中，
所述复苏培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％；
所述人脑微血管内皮细胞悬液和人脑星形胶质细胞悬液中的细胞浓度均为1×106cell/mL。
优选地，向预热后的DPBS中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液的步骤，具体包括：
将DPBS预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为15mg/mL的纤维蛋白原母液。
优选地，将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液的步骤中：
所述凝血酶母液中每毫升含有100单位的凝血酶。
优选地，将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液的步骤中：
所述内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液的体积比为50:10:19:20:1。
优选地，将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液的步骤，包括：
将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基和纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；
向第一混合液中加入凝血酶母液，进行第二次混合，制得混合细胞凝胶溶液；
其中，所述第一次混合和第二次混合均在冰上进行。
优选地，将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入内皮细胞生长培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，每天更换培养基，构建成3D细胞培养芯片的步骤中：
所述混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中的注入量为10μL/孔；
所述恒温孵育的孵育温度为37℃、孵育时间为1h；
所述微流控芯片的上室和下室中加入内皮细胞生长培养基的添加量差值为20μL。
优选地，对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障的步骤中：
所述连续培养的培养时间为4天，培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％，并每天更换培养基。
本发明提供的技术方案中，以原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞的混合细胞为模型细胞，配制成混合细胞凝胶溶液后注入到微流控芯片中进行3D细胞培养，从而构建血脑屏障的体外模型，一方面，采用人源性细胞原代培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得微血管内皮细胞与星形胶质细胞有了更加类似人体生理学的组织环境，与人体大脑内的环境相似，允许细胞在体外各个方向上生长，使细胞组织更加完善的表达，模拟脑部微血管与星形胶质细胞之间的作用，更清楚、准确的反应了体内血脑屏障的特性；同时，使用微流控芯片培养还具有模拟血脑屏障的完整性的优点，而且可以减少样品用量、降低试验成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法的一实施例中所采用的微流控芯片的结构示意图；
图2为图1提供的微流控芯片在注入混合细胞凝胶溶液1h后局部区域D处的细胞状态示意图；
图3为图2中的细胞连续培养4天后形成3D细胞混合体系的状态示意图；
图4为实施例2中细胞在微流控芯片上生长1天时的3D荧光图像；
图5为实施例2中细胞在微流控芯片上生长2天时的3D荧光图像；
图6为实施例2中细胞在微流控芯片上生长3天时的3D荧光图像；
图7为实施例2中细胞在微流控芯片上生长4天时形成血管小管样的3D荧光图像；
图8为实施例2中细胞在微流控芯片上生长4天时形成脑部微血管网络的3D荧光图像；
图9为实施例3中载入微粒在脑部微血管网络中的运行轨迹图。
附图标号说明：
| 标号 | 名称 | 标号 | 名称 |
| 1 | 上室 | 21 | 下室培养基注入口 |
| 11 | 上室培养基注入口 | 22 | 下室培养基出液口 |
| 12 | 上室培养基出液口 | 3 | 细胞注入口 |
| 2 | 下室 |
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提出一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，包括以下步骤：
步骤S10、将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；
原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞(有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养)。其中，人脑微血管内皮细胞(Human BrainMicrovascular Endothelial Cells,HBVEC)是血脑屏障的主要组成成分，具有以下特点：(1)脑微血管内皮细胞存在许多细胞间紧密连接，产生很高的跨内皮阻抗，延迟细胞旁的通量；(2)脑微血管内皮细胞缺乏内皮细胞的窗孔结构，其液相物质胞饮水平较低，(3)脑微血管内皮细胞具有不对称定位酶和载体介导转运系统，从而产生“两极分化”的表现型，能够限制可溶性物质和细胞等从血液进入大脑。人脑星形胶质细胞(Human Astrocyte,HA)是人类血脑屏障外周重要组成部分，与脑部微血管和神经元紧密相连，星形胶质细胞为神经元提供结构、营养和代谢上的支持并调节突触活动，此外，星形胶质细胞可提示许多神经疾病的病理过程，例如，脑损伤后，通过神经突生长、突触可塑性和神经元再生的长期恢复过程受星形胶质细胞表面分子的表达和营养因子释放的影响。本方案中以原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞作为模型细胞，进行混合培养，随着混合培养时间，人脑微血管内皮细胞经过移行、增殖、管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤，最终以小管样结构形成网络体系，此外，更有许多星形胶质细胞的终足把人脑微血管内皮细胞约85％的表面包围起来，这样就形成了人脑微血管内皮细胞的多层膜性结构，构成了脑组织的防护性屏障，即血脑屏障。
作为一种优选的方案，所述原代人脑微血管内皮细胞使用绿色荧光蛋白GFP标记，记为GFP-HBVEC细胞，所述原代人脑星形胶质细胞使用mCherry蛋白标记，记为mCherry-HA细胞。其中，绿色荧光蛋白GFP(Green Fluorescent Protein,GFP)在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，常用于分子标记等生物技术；而mCherry蛋白是一种被广泛用于生物技术作为示踪剂的红色荧光染料，如此，则便于在3D细胞培养过程中对HBVEC细胞和HA细胞的细胞形态变化进行跟踪和鉴定，以判断当前生成血脑屏障的状态和进程。
在本实施例中，步骤S10具体包括：将GFP-HBVEC细胞和mCherry-HA细胞分别使用内皮细胞生长培养基(EGM)和星形胶质细胞培养基(AM)进行复苏培养，培养至细胞融合度达80～90％时，分别收集GFP-HBVEC细胞悬液和mCherry-HA细胞悬液，对应获得内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；其中，所述复苏培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％；所述GFP-HBVEC细胞悬液和mCherry-HA细胞悬液中的细胞浓度均为1×106cell/mL。
细胞复苏培养是指将冻存在液氮或者-80℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程，培养过程一般包括：(1)从液氮容器或冰箱中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；(2)从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加入到离心管中并滴加10倍以上培养液，混匀后，以1000rpm的转速离心，5min；(3)弃去上清液后，向离心管中加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，然后接种至培养瓶中，将培养瓶置于37℃的培养箱中静置培养(每隔一天更换一次培养液)。在本实施例中，步骤(3)中优选为调整细胞密度为1×106cell/mL；步骤(4)中静置培养的培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％；培养至细胞融合度达80～90％时，即可收集细胞悬液。
其中，所述内皮细胞生长培养基(EGM)和星形胶质细胞培养基(AM)可以通过人工配制而成，也可以直接购买，本实施例中所选用的内皮细胞生长培养基(EGM)为购自Lonza公司的EGM-2培养基，所选用的星形胶质细胞培养基(AM)购自Science cell(USA)公司。
步骤S20、向预热后的DPBS中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
在本实施例中，步骤20具体包括：将DPBS(指不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液PBS)预热至37℃后，加入15μg牛血纤维蛋白原，配制成浓度为15mg/mL的纤维蛋白原母液。
步骤S30、将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
在步骤S30中：所述凝血酶母液中每毫升含有100单位的凝血酶。
需要说明的是，上述步骤S10至步骤S30的先后顺序不仅限于此，也可以任意调整配制所述细胞悬液、纤维蛋白母液和凝血酶母液的先后顺序，只需要在步骤S40之前，分别配制成所述细胞悬液、纤维蛋白母液和凝血酶母液即可。
步骤S40、将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液；
其中：所述内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液的体积比为50:10:19:20:1。
先将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基和纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；然后，向第一混合液中加入凝血酶母液，避免凝血酶溶液接触到血清而导致整个系统凝胶成为固体，进行第二次混合，制得混合细胞凝胶溶液；其中，所述第一次混合和第二次混合均在冰上进行，所制得的混合细胞凝胶溶液中含有GFP-HBVEC细胞和mCherry-HA细胞两者的混合细胞。
步骤S50、将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入内皮细胞生长培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，每天更换培养基，构建成3D细胞培养芯片；
以微流控芯片作为载体，对混合细胞进行3D培养，在本实施例中，所采用的微流控芯片由AIM Biotech(Singapore)公司定制，具有以下功能：模块化平台，可以共同培养不同的细胞类型并形成3D结构；可以兼容多种凝胶基质，包括胶原蛋白、Matrigel、纤维蛋白；应用化学梯度和流动(通透性)为研究、药物开发和临床研究开发自己的器官型模型；芯片材料结构合理有利于荧光和共焦显微镜成像。
其结构参阅图1所示，所述微流控芯片包括上室1和下室2，所述上室1和下室2之间设有细胞注入口3，用于向所述微流控芯片中注入混合细胞，所述上室1的一侧设有上室培养基注入口11，所述下室2的一侧设有下室培养基注入口21，所述上室培养基注入口11和下室培养基注入口21用以分别向上室1和下室2中注入细胞培养基，且所述上室1和下室2中的培养基应定时每天进行更换。优选地，为了便于更换培养基，还可以在所述上室1和下室2的另一侧对应设置上室培养基出液口12和下室培养基出液口22，在更换培养基时，应分别从上室培养基出液口12和下室培养基出液口22谨慎地吸取出全部的培养基，然后分别向上室1和下室2中加入新鲜的培养基。
配制完所述混合细胞凝胶溶液后，迅速将新制的混合细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到所述微流控芯片的细胞注入口3中，然后将所述微流控芯片置于温度为37℃的培养箱中孵育1h，待注入的所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，此时，所述混合细胞凝胶溶液中的混合细胞固定在所述微流控芯片中，且处于分散状态，如图2所示(图2中，A为GFP-HBVEC细胞，B为mCherry-HA细胞)；然后通过所述上室培养基注入口11和下室培养基注入口21分别向所述微流控芯片的上室1和下室2中注入内皮细胞生长培养基EGM，并保持所述上室1和下室2之间存在有培养基落差，例如，在上室1和下室2中分别加入70μL和50μL的培养基，保持所述上室1和所述下室之间存在有20μL的培养基落差，使所述微流控芯片形成有培养基高势能区(a)和培养基低势能区(b)，进而使得培养基在一定时间内由于存在势能差而保持流动性，并保持每天更换新鲜的培养基，即构建成3D细胞培养芯片。
步骤S60、对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障。
对所构建的3D细胞培养芯片进行连续培养4天，培养条件设置为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％，并每天更换培养基。4天后，内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长并形成3D混合细胞体系，混合细胞进一步延展并形成脑部微血管网络结构，如图3所示(图3中，A为GFP-HBVEC细胞，B为mCherry-HA细胞)，即对应生成模拟血脑屏障。在所述连续培养期间，可以采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集3D荧光图像进行细胞形态鉴定，根据所述3D细胞培养芯片中的混合细胞在所述连续培养期间的细胞形态变化，也即，所述混合细胞在所述微流控芯片上的生长期间发生的细胞形态变化，判断所述人脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞在生成血脑屏障过程中发生的移行、增殖、管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等状态变化。其中，GFP绿色荧光以488nm激发，以509nm发射光成像；mCherry红色荧光以587nm激发，以610nm发射光成像。
通过细胞形态变化，可以模拟脑部微血管细胞与星形胶质细胞之间的作用，以及模拟血脑屏障的形成过程，准确、清楚地反应了血脑屏障的特性。进一步地，为了确认所生成的脑部微血管网络结构的完整性，还可以通过培养基注入口向形成有脑部微血管网络结构的3D细胞培养芯片中载入微粒(Fluorescent Microparticles，FITC labeled，SIGMA)形成血管结构以后，用于验证血管通透性。载入的微粒由于液体压力而渗入到由内皮细胞和星形胶质细胞形成的微血管网络中并持续流动，同样可以通过断层扫描观测载入微粒在所述脑部微血管网络结构中的运行轨迹，验证所生成的脑部微血管网络结构是否具有正常脑部微血管网络结构所具有的结构完整性和血管通透性。
本发明提供的技术方案中，以原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞的混合细胞为模型细胞，在微流控芯片中进行3D细胞培养，从而构建血脑屏障的体外模型，一方面，采用人源性细胞原代培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得内皮微血管细胞与星形胶质细胞有了更加类似人体生理学的组织环境，与人体大脑内的环境相似，允许细胞在体外各个方向上生长，使细胞组织更加完善的表达，模拟脑部微血管与星形胶质细胞之间的作用，更清楚、准确的反应了体内血脑屏障的特性；同时，使用微流控芯片培养还具有模拟血脑屏障的完整性的优点，而且可以减少样品用量、降低试验成本，适用于进行更准确的药代动力学和毒物学研究。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 3D细胞培养芯片制备和培养
(1)细胞溶液配制：将原代GFP-HBVEC细胞(购自Science cell,USA)和原代mCherry-HA细胞(购自Science cell,USA)分别使用内皮细胞生长培养基EGM-2(购自Lonza)和星形胶质细胞培养基AM(购自Science cell,USA)进行复苏培养，培养至细胞融合度达80～90％时，分别收集GFP-HBVEC细胞悬液和mCherry-HA细胞悬液各1mL，对应获得内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液，备用；其中，所述复苏培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％；所述GFP-HBVEC细胞悬液和mCherry-HA细胞悬液中的细胞浓度均为1×106cell/mL。
(2)纤维蛋白原母液配制：将DPBS(购自Gibco,USA)预热至37℃后，加入15μg牛血纤维蛋白原(购自Sigma,USA)，配制成浓度为15mg/mL的纤维蛋白原母液，备用。
(3)凝血酶母液配制：取1mL DPBS(购自Gibco,USA)，然后将凝血酶(100U，购自Sigma,USA)溶解于其中，配制成100U/mL的凝血酶母液，备用。
(4)混合细胞凝胶溶液配制：将GFP-HBVEC细胞悬液、mCherry-HA细胞悬液、DMEM培养基(购自Gibco,USA)、纤维蛋白原母液和凝血酶母液按照50:10:19:20:1的体积比配制成100μL的混合细胞凝胶溶液，其中，凝血酶母液最后加入，且所有的混合操作均在冰上进行。
(5)3D细胞培养芯片制备：迅速将上述配制的混合细胞凝胶溶液以10μL/孔的量加入到微流控芯片(由AIM Biotech,Singapore定制)的细胞注入口中，然后将微流控芯片置于37℃的培养箱中孵育1h，再向微流控芯片的上室培养基注入口和下室培养基注入口中均加入EMG-2，并保持上室和下室之间存在20μL的培养基落差，即制备成3D细胞培养芯片，保持每天更换新鲜的培养基。
(6)3D细胞培养芯片的培养：将3D细胞培养芯片放入温度37℃、湿度95％、CO2浓度5％的培养箱中连续培养4天，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障。
实施例2 3D细胞培养模型的形态表征
在上述实施例1的步骤(6)中的连续培养期间，采用激光共聚焦显微镜对所述3D细胞培养芯片进行断层扫描，采集3D荧光图像进行细胞形态鉴定(GFP绿色荧光以488nm激发，以509nm发射光成像；mCherry红色荧光以587nm激发，以610nm发射光成像)，3D荧光图像采集结果如图4至图8所示，图4至图6分别为细胞在微流控芯片中生长1天、2天和3天时采集的3D荧光图像，图7至图8为细胞在微流控芯片中生长4天时采集的3D荧光图像，图7为细胞在微流控芯片中生长4天示形成血管小管样结构的结果图，图8为细胞在微流控芯片中生长4天时形成脑部微血管网络的结果图。
由图4可知，当混合细胞在所述微流控芯片中生长1天后，观测到GFP-HBVEC细胞(即绿色荧光，图4中A所指的亮度较高的点)开始延展，mCherry-HA细胞(即红色荧光，图4中虚线三角形区域B所指的亮度较低的点，需要说明的是，在图4中，使用虚线三角形红色荧光对应的亮度较低的点画出，只是为了便于区分绿色荧光和红色荧光对应的点，而并非3D荧光图像实际观察到的结果)包裹在GFP-HBVEC细胞周围同时延伸。
由图5可知，培养2天后，明显观测到GFP-HBVEC细胞(即绿色荧光，图5中A所指的亮度较高的点)大量增殖并开始移行，mCherry-HA细胞(即红色荧光，同样为图5中虚线三角形区域B所指的亮度较低的点)同时继续延展包裹形成血脑屏障外部结构。
由图7可知，培养3天后，观测到GFP-HBVEC细胞(即绿色荧光，图6中A处所示)管道化分支形成血管环。
由图7至图8可知，培养4天后，观测到血管小管样结构(如图7中示)和脑部微血管网路(如图8中示)基本形成，至此，内皮细胞和星形胶质细胞在3D细胞培养芯片上生长至成功形成了血脑屏障。
实施例3 3D细胞培养模型的功能流动性验证
在上述实施例1的步骤(6)之后，向形成有脑部微血管网络结构的3D细胞培养芯片中载入微粒，通过断层扫描观测载入的微粒在微血管网络中的运行轨迹，观测到微粒在微血管网络中移动并随着流体流动，通过血管而迁移，其部分运行轨迹监测结果如图9所示(图9中C处所示的颗粒状物质为部分载入微粒，均匀分布在形成的血管网络中)，说明由内皮细胞和星形胶质细胞生成的脑部微血管网络表现出很好的结构完整性和血管通透性。
综上所述，本发明以原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞的混合细胞为模型细胞，在微流控芯片中进行3D细胞培养，从而构建血脑屏障的体外模型，一方面，采用人源性细胞原代培养，避免了采用动物细胞培养导致试验结果不准确的问题，另一方面，3D细胞培养使得内皮微血管细胞与星形胶质细胞有了更加类似人体生理学的组织环境，与人体大脑内的环境相似，允许细胞在体外各个方向上生长，使细胞组织更加完善的表达，模拟脑部微血管与星形胶质细胞之间的作用，更清楚、准确的反应了体内血脑屏障的特性；同时，使用微流控芯片培养还具有模拟血脑屏障的完整性的优点，而且可以减少样品用量、降低试验成本，适用于进行更准确的药代动力学和毒物学研究。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；
向预热后的DPBS中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液；
将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液；
将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液；
将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入内皮细胞生长培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，每天更换培养基，构建成3D细胞培养芯片；
对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障；
其中，所述原代人脑微血管内皮细胞使用绿色荧光蛋白GFP标记，所述原代人脑星形胶质细胞使用mCherry蛋白标记；
所述微流控芯片的上室和下室中加入内皮细胞生长培养基的添加量差值为20μL。
2.如权利要求1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞对应配制成内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液的步骤，具体包括：
将原代人脑微血管内皮细胞和原代人脑星形胶质细胞分别使用内皮细胞生长培养基和星形胶质细胞培养基进行复苏培养，培养至细胞融合度达80～90％时，分别收集人脑微血管内皮细胞悬液和人脑星形胶质细胞悬液，对应获得内皮细胞悬液和星形胶质细胞悬液；其中，
所述复苏培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％；
所述人脑微血管内皮细胞悬液和人脑星形胶质细胞悬液中的细胞浓度均为1×106cell/mL。
3.如权利要求1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，向预热后的DPBS中加入牛血纤维蛋白原，配制成纤维蛋白原母液的步骤，具体包括：
将DPBS预热至37℃后，加入牛血纤维蛋白原，配制成牛血纤维蛋白原浓度为15mg/mL的纤维蛋白原母液。
4.如权利要1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，将凝血酶溶解于DPBS中，配制成凝血酶母液的步骤中：
所述凝血酶母液中每毫升含有100单位的凝血酶。
5.如权利要求1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液的步骤中：
所述内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液的体积比为50:10:19:20:1。
6.如权利要求1或5所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基、纤维蛋白原母液和凝血酶母液混合，配制成混合细胞凝胶溶液的步骤，包括：
将内皮细胞悬液、星形胶质细胞悬液、DMEM培养基和纤维蛋白原母液进行第一次混合，制得第一混合液；
向第一混合液中加入凝血酶母液，进行第二次混合，制得混合细胞凝胶溶液；
其中，所述第一次混合和第二次混合均在冰上进行。
7.如权利要求1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，将混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中，经过恒温孵育至所述混合细胞凝胶溶液凝胶化后，向所述微流控芯片的上室和下室中均加入内皮细胞生长培养基，并保持所述微流控芯片的上室和下室之间存在有培养基落差，每天更换培养基，构建成3D细胞培养芯片的步骤中：
所述混合细胞凝胶溶液注入到微流控芯片中的注入量为10μL/孔；
所述恒温孵育的孵育温度为37℃、孵育时间为1h。
8.如权利要求1所述的人脑微血管生成模拟血脑屏障的体外构建方法，其特征在于，对所述3D细胞培养芯片进行连续培养，以使内皮细胞和星形胶质细胞在所述3D细胞培养芯片上生长至形成脑部微血管网络结构，即对应生成模拟血脑屏障的步骤中：
所述连续培养的培养时间为4天，培养条件为：培养温度37℃、培养湿度95％、CO2浓度5％，并每天更换培养基。
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