CN114276983A - 一种3d共培养4种细胞体外建立人血脑屏障模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞模型领域，尤其涉及一种3D共培养4种细胞体外建立人血脑屏障模型的方法。本发明的健康血脑屏障细胞模型为将4种细胞共培养得到；所述4种细胞为：人原代微血管内皮细胞hpBEC、人原代周细胞hpPs(有或无下调PDGFRβ基因)、人原代星形胶质细胞hpA和人神经母细胞瘤细胞系SH‑SY5Y；所述共培养为通过RAFT 3D细胞培养系统进行共培养。本发明的细胞模型可真实的模拟细胞生长于组织中而不是只存在于液体中，更好的模拟人体内细胞生长环境及人体内血脑屏障细胞排列顺序，因此用于研究血脑屏障功能及其破坏较传统细胞模型有很大突破。
Description
技术领域
本发明涉及细胞模型领域，尤其涉及一种3D共培养4种细胞体外建立人血脑屏障模型的方法。
背景技术
Transwell模型：最传统的用于研究血脑屏障的模型，其中内皮细胞在带有小孔的滤芯上生长，以便研究两个腔室之间的渗透性。在共培养条件下，正常生长在滤膜另一侧的周细胞可能允许一些细胞-细胞通过孔相互作用，星形胶质细胞在下腔室的底部生长，从而可能通过分泌因子影响其他细胞。缺点：最多只能共培养3种细胞，细胞生长环境为2D平面，共培养生长受限。极易造成细胞污染及死亡。而事实上人体血脑屏障至少由4种细胞组成，生长于组织中而不是只存在于液体中，因此该模型不能真实的模拟人体内细胞生长环境且无法模拟人体内血脑屏障细胞排列顺序，因此用于研究血脑屏障功能上很受限。
Matrigel模型(基质胶)：将细胞接种在凝胶结构中以便于迁移和聚集。在此模型中，内皮细胞可形成管状结构，周细胞优先附着在管状结构上，而星形胶质细胞则更松散地附着在细胞连接处。缺点：细胞生长环境为2D平面，生长受限，体外共培养时细胞极易由于生长空间不足，生长过快而导致挤死或营养不良饿死。且细胞间接触不均匀，实验易造成误差。
Spheroidol(球形)模型：此模型可根据每种细胞类型的固有特性，细胞可以自由生长。神经血管单位的三种关键细胞类型自发形成球状结构。内皮细胞形成代表管腔侧的外部细胞单层。星形胶质细胞聚集在可被视为实质空间的球体的核心。最后，周细胞在它们之间排列以介导三个细胞层排列，再现了BBB中不同细胞类型的形态排列。缺点：细胞自由生长在液体环境中，无组织样结构，且后期针对某种单个细胞的研究不好处理和干预，同样无法真实的模拟人体内环境血脑屏障的建立。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种3D共培养4种细胞体外建立人血脑屏障模型的方法。
本发明真实模拟人体内环境血脑屏障结构及神经血管单元的建立，且收集共培养细胞非常方便以利于后续实验顺利进行，为帕金森病和糖尿病破坏血脑屏障及今后如何保护血脑屏障的研究提供了有利保障。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种健康血脑屏障细胞模型，所述细胞模型为将4种细胞共培养得到；
所述4种细胞为：人原代微血管内皮细胞hpBEC、人原代周细胞hpPs、人原代星形胶质细胞hpA和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y；
所述共培养为通过RAFT 3D细胞培养系统进行共培养。
作为本发明所述NVU血脑屏障细胞模型的优选实施方式，所述人原代周细胞为有或无下调了PDGFRβ基因的人原代周细胞。
作为本发明所述健康血脑屏障细胞模型的优选实施方式，所述人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在改良的Eagle培养基+F12细胞培养基中生长，辅以15％胎牛血清，1％青霉素/链霉素；
所述HpBECs在补充了生长因子和0.4％胎牛血清的内皮基底培养基(EGM-2)中生长；
所述HpPs在周细胞生长补充培养基中生长；
所述hpA在星形细胞生长补充培养基中生长。
作为本发明所述健康血脑屏障细胞模型的优选实施方式，所述HpBECs、hpPs和hpA用于第2到第4代之间的实验。
作为本发明所述健康血脑屏障细胞模型的优选实施方式，所述共培养中细胞在补充了2％人血清和50ng/ml rhVEGF的EBM-2中生长。
本发明同时提供一种PD的血脑屏障细胞模型，所述PD的血脑屏障细胞模型为在所述健康血脑屏障细胞模型的基础上，向培养基中加入50μmol/L的6-OHDA，共培养24h后建立得到。
本发明同时提供一种DM的血脑屏障细胞模型，所述DM的血脑屏障细胞模型为在所述健康血脑屏障细胞模型的基础上，用30mmol/L高糖培养基培养8天后建立得到。
本发明同时提供一种PD-DM的血脑屏障细胞模型，在所述PD的血脑屏障细胞模型基础上，用30mmol/L高糖培养基培养8天后建立得到。
本发明还提供所述健康的NVU血脑屏障细胞模型在证明PD和/或DM中BBB破坏程度并进一步探讨周细胞对维持血脑屏障完整性的重要作用中的应用。
本发明的有益效果：
本发明能共培养4种不同细胞，细胞生长环境为3D平面，细胞生长数量可达106-108，共培养生长较传统模型空间扩大很多。不易因生长空间不足，生长过快而导致挤死或营养不良饿死。体外共培养时细胞接触均匀，实验误差小。后期针对某种单个细胞的研究能更好的处理和干预。该模型可真实的模拟细胞生长于组织中而不是只存在于液体中，更好的模拟人体内细胞生长环境及人体内血脑屏障细胞排列顺序，因此用于研究血脑屏障功能较传统细胞模型有很大突破。
附图说明
图1为将传统血脑屏障模型(transwell，matrigel和spheroidal)和本发明的3D帕金森合并糖尿病血脑屏障模型进行比较；其中，(A)通过传统细胞共培养系统(trans-well,matrigel and spheroidal)使用三种细胞类型(内皮细胞、周细胞和星型胶质细胞)建立BBB；(B)通过RAFT 3D细胞培养系统使用四种细胞类型(内皮细胞、周细胞、星型胶质细胞和SH-5Y细胞)建立NVU(有或无下调PDGFRβ基因)、PD、DM、PD-DM的BBB细胞模型(有或无6-OHDA和(或)葡萄糖)。这些模型可以很好地模拟体内血脑屏障细胞从内到外按内皮细胞、周细胞、星型胶质细胞和SH-SY5Y细胞的顺序排列。RAFT-组织的真实架构；hpBECs-原代人脑微血管内皮细胞；hpPs-原代人周细胞；hpAs-原代人脑星型胶质细胞；MVU-微血管单元；NVU-神经血管单元；BBB-血脑屏障；PD-帕金森病；DM-糖尿病。
图2比较了不同培养时间不同BBB细胞模型中荧光素钠渗透性的特征(2h和24h)；其中，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。PD-DM模型中荧光素钠的渗透性高于PD或DM模型。四种细胞的正常BBB模型的荧光素钠渗透性最低，可作为正常对照。E-人类原代脑内皮细胞；P-人类原代周细胞；A-人类原代星形胶质细胞；S-SH-SY5Y细胞；G-葡萄糖；6-6-OHDA。PC-阳性对照，无任何细胞类型。
图3为免疫细胞化学显微镜(×50)下观察通过RAFT 3D细胞培养系统建立的NVUBBB细胞模型的特征。hpBECs，hpPs，hpAs和SH-SY5Y细胞共培养6天后，神经血管单元形成了相对完整的血管样结构，血管中心为SH-SY5Y多巴胺能神经元。E-人类原代脑内皮细胞；P-人类原代周细胞；A-人类原代星形胶质细胞；S-SH-SY5Y细胞；NVU-神经血管单元。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
血脑屏障的定义：血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，这些屏障能够阻止某些物质(多半是有害的)由血液进入脑组织。血液中多种溶质从脑毛细血管进入脑组织，有难有易；有些很快通过，有些较慢，有些则完全不能通过，这种有选择性的通透现象使人们设想可能有限制溶质透过的某种结构存在，这种结构可使脑组织少受甚至不受循环血液中有害物质的损害，从而保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义。
血脑屏障的组成：由大脑微血管的三种细胞成分(内皮细胞，星形胶质细胞和周细胞)组成。在大脑内皮细胞之间表达的紧密连接(TJs)形成的弥散屏障也是血脑屏障非常重要的组成部分。
神经血管单元：神经元细胞、血脑屏障(内皮细胞，星型胶质细胞，周细胞)、细胞外基质、小胶质细胞等构成的脑功能作用基本功能结构单元。
实施例1细胞培养和处理
人原代脑微血管内皮细胞(hpBEC)购自美国Angio-Proteomie。人原代脑血管周细胞(hpPs)和人原代脑星形胶质细胞(hpA)购自美国ScienCell。
人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(美国典型培养物保藏中心)在改良的Eagle培养基+F12细胞培养基(1：1)(PAA Laboratories，Pasching，奥地利)中生长，辅以15％胎牛血清，1％青霉素/链霉素。HpBECs在补充了生长因子和0.4％胎牛血清的内皮基底培养基(EGM-2)(英国Lonza)中生长。HpPs在周细胞生长补充培养基(ScienCell，美国)中生长，而hpA在星形细胞生长补充培养基(ScienCell，美国)中生长。HpBECs，hpPs和hpA用于第2到第4代之间的实验。通过RAFT 3D细胞培养系统(英国伦敦，Lonza)进行共培养，细胞在补充了2％人血清和50ng/ml rhVEGF(Preprotech)的EBM-2中生长(Blood Bank，瑞士，巴塞尔)。
为了追踪不同的活细胞类型，根据Invitrogen公司的要求，根据制造商的使用说明分别使用Invitrogen公司的黄色(hpBEC)，蓝色(hpPs)，绿色(hpA)，红色(SH-SY5Y)荧光的长效细胞示踪剂来标记它们。尤其是当通过RAFT3D细胞培养系统将细胞一起培养时(图1)。根据说明书要求将胶原蛋白溶液(英国，伦敦，Lonza)涂覆于24孔板(德国，Greiner)和transwell过滤器(德国，Greiner)(孔径0.4mm，高密度孔)中。将细胞在培养箱中于37℃，5％CO2、95％新鲜空气的饱和湿度下培养。
本发明还使用短链RNA(shRNA)慢病毒载体(中国上海中桥新洲生物科技有限公司)将hpPs的PDGFRβ基因下调30％和89％，并通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)验证了下调的基因。
实施例2使用4种不同细胞类型共培养有或没有6-OHDA和(或)葡萄糖以建立NVU，PD，DM，PD-DM及下调了PDGFRβ基因的BBB细胞模型
本发明首先在体外建立了由hpBEC，hpP，hpA和多巴胺能(DAergic)神经元细胞(SH-5Y)组成的神经血管单位(NVU)模型的3D细胞培养系统(英国，Lonza)(共培养6天)。本发明的模型可以很好地模拟体内血脑屏障细胞从里到外按照hpBEC，hpP，hpAs和SH-SY5Y细胞的顺序排列(图1)。
将SH-SY5Y细胞以1.0×105细胞/ml的密度接种在24孔板中24小时。SH-SY5Y细胞在不同的时间点(0,8,24,48h)接受不同浓度的6-OHDA(0,50,100,150μmol/L)。选择6-OHDA浓度为50μmol/L，共培养24h(台盼蓝细胞染色检测SH-SY5Y细胞存活率为60％)，建立PD的BBB模型。
本发明还选择了30mmol/L的葡萄糖浓度共培养8天(通过台盼蓝细胞染色测试hpBEC和hpP的存活率超过50％)来建立DM和PD-DM细胞模型的BBB。
此外，本发明还建立了具有下调30％或89％PDGFRβ基因的周细胞的NVU的BBB模型(即将模型中的正常周细胞用下调了PDGFRβ基因的周细胞替代)。
实施例3荧光素钠(Na-FLU)渗透性测量
体外BBB细胞模型完成后，用无血清EBM-2培养基将模型的内部和外部洗涤2至3次，然后向每个孔的内部添加200μL浓度为100mg/L的Na-FLU。在外部添加1.2mL EBM-2培养基。2小时和24小时后，从池外取出100μL培养基。使用酶标仪在激发波长为460nm，发射波长为515nm的条件下测量BBB模型中Na-FLU的量(图2)。
本实施例的有益效果是：可以很好地模拟体内血脑屏障，细胞排列顺序与体内血脑屏障排列顺序一致，以便于更好的研究帕金森和糖尿病对血脑屏障的破坏以及日后如何保护人类血脑屏障进行研究。健康NVU血脑屏障模型荧光素钠渗透性最低(图2)，并形成了完整的血管样结构(图3)。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种健康的NVU血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为将4种细胞共培养得到；
所述4种细胞为：人原代微血管内皮细胞hpBEC、人原代周细胞hpPs、人原代星形胶质细胞hpA和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y；
所述共培养为通过RAFT 3D细胞培养系统进行共培养。
2.根据权利要求1所述NVU血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述人原代周细胞为有或无下调了PDGFRβ基因的人原代周细胞。
3.根据权利要求1所述健康的NVU血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述人类神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y在改良的Eagle培养基+F12细胞培养基中生长(1:1)，辅以15％胎牛血清，1％青霉素/链霉素；
所述HpBECs在补充了生长因子和0.4％胎牛血清的内皮基底培养基(EGM-2)中生长；
所述HpPs在周细胞生长补充培养基中生长；
所述hpA在星形细胞生长补充培养基中生长。
4.根据权利要求1所述健康的NVU血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述hpBECs、hpPs和hpA用于第2到第4代之间的实验。
5.根据权利要求1所述健康的NVU血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述共培养模型中细胞在补充了2％人血清和50ng/ml rhVEGF的EBM-2中生长。
6.一种PD的血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述PD的血脑屏障细胞模型为在权利要求1所述健康血脑屏障细胞模型的基础上，向培养基中加入50μmol/L的6-OHDA，共培养24h后建立得到。
7.一种DM的血脑屏障细胞模型，其特征在于，所述DM的血脑屏障细胞模型为在权利要求1所述健康血脑屏障细胞模型的基础上，用30mmol/L高糖培养基培养8天后建立得到。
8.一种PD-DM的血脑屏障细胞模型，其特征在于，在权利要求6所述PD的血脑屏障细胞模型基础上，用30mmol/L高糖培养基培养8天后建立得到。
9.权利要求1-5所述健康的NVU血脑屏障细胞模型在证明PD和/或DM中BBB破坏程度并进一步探讨周细胞对维持血脑屏障完整性的重要作用中的应用。
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