JPWO2016143808A1 - スフェロイドの作製方法及び該方法に用いる培地 - Google Patents

Abstract

本発明は、簡易な方法で、良質なスフェロイドを大量に作製できる方法を提供することを目的とする。本発明はまた、成長因子や接着因子、または細胞間マトリックス、あるいは特殊な培養システムを用いることなく、容易にスフェロイドを作製できる方法を提供することを目的とする。本発明により、グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地を用いて細胞を培養することを特徴とするスフェロイドの作製方法が提供された。また、成長因子、接着因子、および細胞間マトリックスを添加しない培地にて、立体的な支持体を用いない培養系でスフェロイドを作製する方法が提供された。

Description

本発明は、スフェロイド（機能細胞集合体）を作製するのに適した培養方法に関する。本発明はまた、該培養方法に適した培地に関する。

市販の培養ディッシュやマルチウェルプレート等の一般的培養容器を使用して、細胞を二次元的に単層で培養すると、細胞の生体内での機能のいくつかは十分発現しない場合がある。これに対して、細胞を３次元的に増殖させ、球形や卵形等の立体的形態をとらせるスフェロイド培養法は、栄養素や酸素、あるいは二酸化炭素等の代謝産物や老廃物の生理学的勾配がスフェロイド内に生じていると考えられ、より生体内環境に存在する細胞に近い細胞状態を出現させることができ、薬効評価等の創薬スクリーニングや腫瘍評価、細胞産生物の生産等の機能発現に有効な方法として急速に使用が広がっている。

スフェロイドを形成させる方法として、これまでハンギングドロップ培養法（非特許文献１）やゲル中での培養（非特許文献２）、低接着性容器を用いた培養（非特許文献３）、ナノインプリンティング精密加工技術により足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を作製した特殊ディッシュを利用する培養（非特許文献４）、成長因子やマトリゲルの添加（非特許文献５）等、様々な方法が提案されてきた。

しかしこれらの方法は、再現性が低かったり、特殊な装置や高価な容器を必要とする、あるいは、容器の形状によりそのままでは細胞観察に支障をきたす場合や、成長因子や接着因子、成分が明らかにされていない培地等の添加が必要であるなどの問題がある。

具体的な培養法として以下のようなものが提案されている。
ハンギングドロップ培養法は、表面張力を利用した培養液の液滴の中に細胞懸濁液をスポットして培養する方法である（非特許文献１）。この方法により、大きさが均一なスフェロイドが形成されるが、培地交換ができないため、長期培養が困難となる問題があり、また大量のスフェロイド生成に向かない、という問題がある。

低接着性ディッシュを用いたスフェロイド培養は、細胞がディッシュ表面に接着することを防ぐことによりスフェロイドを形成させる培養方法であるが、いったん形成されたスフェロイド同士が次第に融合しやすく、安定性に問題がある（非特許文献６)。

Ｕ−Ｓｈａｐｅディッシュ等の使用による培養法は、スフェロイド同士の融合を回避し、シングルスフェロイドの形成を可能にすることができる。そして、Ｕ底やＶ底の特殊容器を用いる方法が考案され、市販されている。この方法は、サイズの均一なスフェロイドが形成されるが、細胞間が疎になりがちで、形も球形または楕円形にならずお椀型になりやすい欠点がある。緻密なスフェロイドとするためには、培地に成長因子等の添加を行うが、なおスフェロイドとしての性質は不十分となりがちである。

回転培養によるスフェロイド培養法では、回転培養に特殊な装置を必要とする上、スフェロイドのサイズや形状が不均一で、スフェロイド実験の再現性に影響を及ぼす（非特許文献１)。

微細な特殊加工を施した特殊容器によるスフェロイド培養法として、ディッシュ底面に、狭い面積の細胞接着表面と広い面積の細胞非接着表面とを並べることで、細胞のディッシュ底面への接着を不安定にすることによりスフェロイド形成を起こす方法や、ディッシュ底面にナノサイズの格子状構造を微細加工して細胞接着を抑制することによりスフェロイドを形成させる方法等が提案され、市販されている。これらの方法を用いれば、均一な形状を有するスフェロイドが形成される。しかし、特殊加工を施したディッシュが極めて高価である上、マトリゲルや推奨されている成分未公開の特殊添加物等を加えても、なお生体内での状態を模した緻密なスフェロイドの形成は不十分となりがちである。更にまた顕微鏡観察においては、これらの特殊ディッシュ底面の加工が邪魔になる場合があるなどの短所がある（非特許文献４)。

生体内で異常細胞が増殖して、がん細胞に至る過程や、未分化の細胞が分化していく過程などでは、互いに近接した細胞であっても形態や機能が一様でない状態が知られている。従来のスフェロイドの作製方法を用いても、直径およそ１００μｍ以上のスフェロイドでは、周辺部に増殖する細胞、中心部に壊死細胞を呈する典型的なスフェロイド様細胞集塊は形成される。しかしながら、上記したような生体内での状態を模した細胞間が緻密なスフェロイドを、多量に、再現性よく、安定にin vitroで形成させることは困難であった。

従来のスフェロイド培養法では、培養日数の経過と共にスフェロイドが急速に崩れるため、良質なスフェロイドを使用できるタイミングが非常に短かく、使いにくいという欠点があった。また、スフェロイドが崩れない培養方法の場合には、細胞間が疎となっており、良質なスフェロイドが形成されにくかった。

スフェロイドの作製・培養法においては、細胞集塊が３次元構造を形成することにより、より生体内に近い状態を出現させ、細胞の特異的な機能を発揮できると考えられている。また、薬効評価等の創薬スクリーニングや腫瘍評価、細胞産生物の生産等の機能発現の評価等においては、生体内での細胞と類似の特異的機能を発揮する細胞からなる細胞集塊が安定に作製されることが望ましい。その際、できるだけ簡易な方法で、良質なスフェロイドを大量に作製することが望まれている。

これまでに発明者らは、自然界にないＬ−グルコースを蛍光で標識した誘導体２−ＮＢＤＬＧ（２−［Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｄｅｏｘｙ−Ｌ−ｇｌｕｃｏｓｅ；特許文献１）を、ヒトから摘出した生きたがん組織やがん細胞に適用すると、がん細胞が選択的に２−ＮＢＤＬＧを取り込んで蛍光を発し、非がん細胞と識別可能であることを見出した（特願２０１４−０１５７３５、および特願２０１４−１９３４２４）。

また発明者らは、培養がん細胞を用いた場合は、大小不同の異常核様態を呈する細胞群を含むスフェロイド中に２−ＮＢＤＬＧを取り込む細胞を認めることを報告している（特許文献２）。すなわち、生体由来の細胞と同様に、培養がん細胞においてもスフェロイドを形成させた場合は２−ＮＢＤＬＧを取り込むことを報告している。しかし、このようなスフェロイドを再現性よく多量に形成させることは従来法ではマトリゲル等の添加によってもなお困難であった。

ＷＯ２０１０／０１６５８７号公報 ＷＯ２０１２／１３３６８８号公報

J. Friedrich, et. al., Int. J. Radiat. Biol. 83: 849-871, 2007 Martin C., et al., Br. J. Cancer 89: 1581-1589, 2003 Kamoshima Y. et al., J. Med. Sci. 83: 23-27. 2008 Yoshii Y. Biomaterials 32: 6052-6058, 2011 Addla SK., et al., Am. J. Physiol. Ren. Physiol. 295: F680-687, 2008 R.Z. Lin, et. al., Biotechnol. J. 3: 1172-1184, 2008

本発明は、簡易な方法で、良質なスフェロイドを大量に作製できる方法を提供することを目的とする。
本発明は加えて、インビトロにおいてスフェロイドを評価等の目的に用いる場合は、良質なスフェロイドを大量に作製できる方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、グルコースとして、Ｄ−グルコースではなくＬ−グルコースを添加した培地（以下、Ｌ−グルコース培地と言う場合がある）で培養した場合に、Ｌ−グルコース培地に置き換わってから一定日数（例えば、細胞により３日から１０日）経過するとスフェロイドが出来はじめ、その後は細胞間が緻密なスフェロイドが再現性よく次々と形成されることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下を含むものである。
（１）グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地を用いて細胞を培養することを特徴とするスフェロイドの作製方法。
（２）Ｌ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である上記（１）に記載の方法。
（３）前記細胞が、がん細胞由来の細胞である上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記培地での培養が３日以上である上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載に記載の方法。
（５）前記培地が、成長因子および／または接着因子を添加しない培地である、上記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の方法。
（６）前記培地が、細胞間マトリックスを添加しない培地である、上記（１）〜（５）のいずれか一つに記載の方法。
（７）前記培養が立体的な構造を有する細胞支持体を用いない培養である上記（１）〜（６）のいずれか一つに記載の方法。
（８）以下の工程：
（ａ）Ｄ−グルコースを含有する培地にて細胞を培養する工程、
（ｂ）培地中のＤ−グルコースをＬ−グルコースに置き換える工程、
（ｃ）グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地を用いて細胞を培養する工程、
を含む、スフェロイドの作製方法。
（９）前記工程（ｂ）が、培地中のＤ−グルコース濃度を段階的に下げるとともに、Ｌ−グルコース濃度を段階的に上げて細胞を培養する工程である、上記（８）に記載の方法。
（１０）工程（ｃ）におけるグルコース含有培地中のＬ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である上記（８）または（９）に記載の方法。
（１１）前記工程（ｃ）における培養が３日以上である、上記（８）〜（１０）のいずれか一つに記載の方法。
（１２）前記細胞が、がん細胞由来の細胞である上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の方法。
（１３）前記工程（ｃ）の培地が、成長因子および／または接着因子を添加しない培地である、上記（８）〜（１２）のいずれか一つに記載の方法。
（１４）前記工程（ｃ）の培地が、細胞間マトリックスを添加しない培地である、上記（８）〜（１３）のいずれか一つに記載の方法。
（１５）前記工程（ａ）〜（ｃ）の培地が、成長因子、接着因子、細胞間マトリックスのいずれも添加しない培地である、上記（８）〜（１４）のいずれか一つに記載の方法。
（１６）前記培養が立体的な構造を有する細胞支持体を用いない培養である上記（８）〜（１５）のいずれか一つに記載の方法。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれか一つに記載の方法により作製されたスフェロイド。
（１８）前記スフェロイドが細胞間が緻密な状態なスフェロイドである上記（１７）に記載のスフェロイド。
（１９）グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成されるスフェロイド培養培地。
（２０）Ｌ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である上記（１９）に記載の培地。
（２１）前記培地が成長因子および／または接着因子を添加していない培地である、上記（１９）または（２０）に記載の培地。
（２２）前記培地が細胞間マトリックスを添加していない培地である、上記（１９）〜（２１）のいずれか一つに記載の培地。

本発明により、細胞間が緻密なスフェロイドが再現性良く作製できる方法が提供される。また、本発明により、そのようなスフェロイドを作製するための培地が提供される。

実施例１で観察されたＭＩＮ６細胞スフェロイドの形成過程を示す図である。Ｌ−グルコース培養開始後１３日目の写真（ｘ４の対物レンズで撮影した位相差像）である。図は、同一プラスチックディッシュ上で培養した代表的な１０か所の視野を示しおり、スフェロイドが多数形成されている様子が観察された。スケールバーは、２００μｍである。 実施例２においておこなった、ガラスボトムディッシュ上に形成させたＭＩＮ６細胞スフェロイドを示す写真である。Ｌ−グルコース培養開始後１１日目の写真（ｘ４の対物レンズで撮影した位相差像）である。同一ディッシュ上の二つの視野を示したものである。中心部に壊死領域をもつスフェロイドが形成され始めている様子がわかる。スケールバーは、２００μｍである。 実施例２においておこなった、Ｌ−グルコース培養開始後１４日目の写真で、スフェロイドが安定に形成されている様子が観察される。スケールバーは、２００μｍである。 実施例２においておこなった、Ｌ−グルコース培養開始後２１日目の写真である。同一ディッシュ上の二つの視野を示したものである。中心部に壊死領域をもつ良質のスフェロイドが引き続き形成され続けている様子がわかる。スケールバーは、２００μｍである。 実施例２における、ガラスボトムディッシュにてＬ−グルコース培地で１４日間培養したＭＩＮ６スフェロイドに２−ＮＢＤＬＧ／２−ＴＲＬＧ混合液を適用した結果である。写真は、同一ディッシュ上の代表的な８か所の視野を示しおり、２−ＮＢＤＬＧの蛍光波長である緑チャンネルでの検出結果を上段に、２−ＴＲＬＧの蛍光波長である赤チャンネルでの検出結果を下段に示す。スフェロイドの中心部は壊死を起こし、細胞膜不透過性の２−ＴＲＬＧを取り込んでおり、その周囲に２−ＮＢＤＬＧを取り込む細胞の存在が認められる。スケールバーは、１００μｍである。 実施例３においておこなった、ＭＩＮ６細胞スフェロイドのカバースリップ上における形成を示す写真である。図６Ａならびに６ＢはＬ−グルコース培養開始後１１日目のそれぞれｘ４倍ならびにｘ２０倍の位相差顕微鏡写真で、スフェロイドがカバースリップ上にも形成される様子が観察される。スケールバーは、２００μｍである。 実施例３でカバースリップ上に形成させたＭＩＮ６細胞スフェロイドにおける２−ＮＢＤＬＧならびに２−ＴＲＬＧの取り込みの様子を示した写真である。（Ａ），（Ｃ）が２−ＮＢＤＬＧ及び２−ＴＲＬＧの投与前、（Ｂ），（Ｄ）は、投与を終了後に洗い流しを開始してから１６分後のイメージを示している。上段は、２−ＮＢＤＬＧの蛍光波長である緑チャンネルでの検出結果を、下段は、２−ＴＲＬＧの蛍光波長である赤チャンネルでの検出結果を示している。スケールバーは、１００μｍである。 実施例３で、カバースリップ上に形成させたＭＩＮ６細胞スフェロイドにおける２−ＮＢＤＬＧ（ＡとＢ）ならびに２−ＴＲＬＧ（ＣとＤ）の取込みの結果（蛍光グルコースの洗い流し開始より１６分後）の共焦点顕微鏡像である。Ａ，Ｃはカバーガラスに接している面において撮影した、それぞれ、２−ＮＢＤＬＧの取り込みを検出する緑チャネル、および２−ＴＲＬＧの取り込みを検出する赤チャネルの蛍光イメージを示す。スフェロイド中心部は、細胞膜不透過性の２−ＴＲＬＧが取り込まれており、壊死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を起こして細胞膜透過性が高まっている様子がわかる。Ｂ，Ｄはカバーガラスと接している面から上方に１５ミクロン離れた断面における断層写真である。従来のＤ−グルコース含有培地を用いて形成されたスフェロイドでは２−ＮＢＤＬＧを取り込む細胞はスフェロイドの一部に認められるだけであるが、本発明のＬ−グルコース培地を用いた培養方法によれば、ＡとＢのいずれの焦点面においても、セントラルコアの周辺領域の多数の細胞において２−ＮＢＤＬＧの取り込みが認められる。スケールバーは、１００μｍである。 本発明の実施例３と同様にして、カバースリップ上に形成したＭＩＮ６スフェロイドの推移を観察した結果である。Ｌ−グルコース培地を用いた培養開始後、（Ａ）が１１日目、（Ｂ）が１５日目、（Ｃ）が１７日目に観察した結果を示している。培養１３日目以降も良質なスフェロイドが形成されていることが判る。スケールバーは、１００μｍである。 従来の方法であるナノインプリンティングディッシュ上に通常培養法にて形成されたスフェロイドの推移を観察した結果である。Ａは、培養１１日目の様子を示したもので、左側のスフェロイドは二つが融合しており、右側の細胞塊はスフェロイド中心部が決壊して外部に向かって開口している。Ｂは培養１５日目に至り、スフェロイドが崩壊している様子を示している。Ｃは、通常のＤ−グルコース含有培地を用いてカバーガラス上に形成させたＭＩＮ６細胞スフェロイドが、培養１４日目に完全に崩壊している様子を示している。 実施例５で例示したＨＴ−２９ヒト結腸腺がん細胞がスフェロイドを形成する様子を観察した結果である。Ａは、Ｌ−グルコース培養開始後３日目の顕微鏡写真（位相差像、ｘ４の対物レンズ使用）である（培養開始後通算６日目）。中心部に顕著な壊死領域を示すスフェロイド形成を認めた。Ｂは、Ｌ−グルコース培地を用いず、Ｄ−グルコース培地のみを用いて培養を開始後６日目の写真である。Ｌ−グルコース培地による培養（Ａ）と比較すると成長が速いが、中心部の壊死部分は認められず、疎に細胞が集合した３次元細胞集塊（Sparsely-packed three dimensional cell cluster）を形成している。Ｃは、Ｌ−グルコース培養開始後５日目の顕微鏡写真（培養開始後通算８日目）。大きさが２００μｍを超え、密に細胞が集合した３次元細胞集塊（Tightly-packed three dimensional cell cluster）を形成している。スケールバーは、１００μｍである。 実施例５で示した培養方法によりスフェロイドを形成したＨＴ２９細胞をＬ−グルコース培養開始後１０日目（培養開始後通算１３日目）において、カバースリップ上に移して１日かけて定着させたもの、つまりＬ−グルコース培養開始後１１日目（培養開始後通算１４日目）における２−ＮＢＤＬＧならびに２−ＴＲＬＧの取込みの様子を示した写真である。（Ａ），（Ｃ）が２−ＮＢＤＬＧ及び２−ＴＲＬＧの投与前、（Ｂ），（Ｄ）は投与終了後６分後のイメージを示している。上段は２−ＮＢＤＬＧの蛍光波長である緑チャンネルでの検出結果を、下段は２−ＴＲＬＧの蛍光波長である赤チャンネルでの検出結果を示している。スケールバーは１００μｍである。

以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明するが、本発明は以下に記載に実施態様に限定されるものではない。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。

本発明においては、グルコースとしてＤ−グルコースではなくＬ−グルコースを添加した培地を用いて細胞を培養してスフェロイドを形成させることを特徴とする。ここで、Ｌ−グルコース培地とは、グルコースとしてＬ−グルコースを添加し一方Ｄ−グルコースを積極的に添加しない培地、すなわち、グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地をいう。例えば、血清含有培地を用いる場合には、血清中に少量のＤ−グルコースが含まれる（典型的なＨｙｃｌｏｎｅ社のＤｅｆｉｎｅｄ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍを培地に１０％加えると、Ｄ−グルコース濃度が約１００ｍｇ／Ｌ以下となる）ため、培地中に血清由来の少量のＤ−グルコースが含まれる場合があるが、これらの培地においても、培地中のグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される限り、本発明のＬ−グルコース培地に含まれる。本発明のＬ−グルコース培地とは、グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される、好ましくは、グルコースの９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上がＬ−グルコースである培地を言う。
本発明で用いるＬ−グルコース培地中のグルコース濃度は、特に制限がないが、例えば、通常の培養においてグルコースとしてＤ−グルコースを用いた場合のグルコース濃度を用いることができる。これに限定されないが、例えば、０．５ｍＭ〜５０ｍＭ、好ましくは１．０ｍＭ〜２５ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭである。

Ｌ−グルコース培地は、グルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地であれば、通常の細胞の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧｊＢ培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ培地、ＩｍｐｒｏｖｅｄＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅｓ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地等をあげることができるが、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。好ましくは、ＤＭＥＭ培地である。これらの培地は市販されており入手可能である。

本発明で用いられる培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。本発明で用いられる培地が血清含有培地である場合はウシ胎児血清などの哺乳動物の血清が使用できる。培地は、好ましくは無血清培地、さらに好ましくは化学的に定義されていない成分を含まない無血清培地である。
本発明で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント（ＫＳＲ）、２−メルカプトエタノール、モノチオグリセロール、またはこれらの均等物が挙げられる。これらの血清代替物は、市販されている。
本発明で用いられる培地はまた、他の添加物、例えば、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）または抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）等を含有してもよい。
本発明で用いられる培地はまた、スフェロイドの形成に寄与する他の添加物、例えば、成長因子や接着因子を含んでもよく、また、細胞間マトリックスを含んでもよい。成長因子としては、例えば、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ＥＰＯ等をあげることができる。接着因子としては、例えば、インテグリン、カドヘリン、ラミニン、免疫グロブリンスーパーファミリー等をあげることができる。細胞間マトリックスとしては、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ネトリン、プロテオグリカン類等をあげることができる。また、成長因子や細胞間マトリックス等を複合的に含むＣｏｒｎｉｎｇ社のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）や、Ｓｃｉｖａｘ社のＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等をあげることができる。しかし、本発明においては、培地中にこれらのスフェロイド形成寄与物質を添加しなくても、良質なスフェロイドが形成できる。
本発明で用いられる培地は、特に好ましくは、無血清培地であり、かつ、化学的に定義された原材料のみを含む培地であり、成長因子や接着因子、あるいは細胞間マトリックスを添加しない培地である。これに限定されないが、例えば、添加されたグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成されるＤＭＥＭ培地をあげることができる。

本発明の一つの態様において、培地からＤ−グルコースを除き、代わりに培養細胞をＬ−グルコース培地で培養することにより、スフェロイドを形成させることを特徴とする。Ｄ−グルコース培地からＬ−グルコース培地に変更するにあたり、細胞に応じて適切な培養日数からＬ−グルコース培地への置換を開始することが重要となる。Ｌ−グルコース培地への置換の方法は細胞に応じて適宜変更することが可能であり、例えば、Ｄ−グルコース培地をＬ−グルコース培地に置き換える方法、全グルコース中のＬ−グルコースの割合を段階的に上げていく方法などをあげることができる。具体的には、これに限定されないが、例えば、グルコースとしてＬ−グルコースを添加した培地で半量交換を適切な回数実施することで、Ｄ−グルコースの濃度を段階的に減らし、かつＬ−グルコースの濃度を容易に増やすことができる。半量交換は、これに限定されないが、例えば、Ｄ−グルコース培養開始後６日目、８日目に行うことができる。さらに１０日目には培養培地を全量捨てて、Ｌ−グルコース培地を用いてＷＡＳＨすることで可能な限りＤ−グルコースを取り除き最終的に１００％Ｌ−グルコース培地にする。１００％Ｌ−グルコース培地になった後、これに限定されないが、例えば、１日ないし２日にわたり６時間おきに半量交換を行う。以降の培地交換は、細胞数は少ない場合は数日ごとに、細胞数が多い場合は毎日行う。

本発明の一つの態様において、細胞を、グルコースとして１００％のＬ−グルコース添加（０％のＤ−グルコース添加）培地に置き換わってから一定日数以上培養することを特徴とする。「一定日数以上の培養」は、用いる細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、３−１０の日数を上げることができ、一般には、例えば、３日以上、好ましくは１０日以上、より好ましくは１１日以上、さらに好ましくは１３日以上培養する。それにより、その後は、細胞間が緻密なスフェロイドが再現性よく次々と形成され続ける。そして、少なくとも数日以上、好ましくは少なくとも１週間以上、より好ましくは少なくとも２週間以上に渡り、多量にスフェロイドを供給でき、例えば、３週間目においてもスフェロイドを供給できる。

本発明の方法を適用できる細胞は、特に制限されず、スフェロイドを形成する能力を有する細胞であればいずれの細胞にも用いることができる。例えば、本発明の実施例で用いているようながん由来の細胞、生体から採取した細胞、例えばこれに限定されないが、肝細胞、腎細胞、または膵臓細胞、種々の腺組織の細胞、その他スフェロイドを形成できる細胞、例えばこれに限定されないが、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を含む種々の幹細胞、をあげることができる。

本発明を用いてスフェロイドを作製すると、細胞間が緻密なスフェロイドが形成できる。加えて、通常の培養方法を用いた場合にしばしば認められる、隣り合うスフェロイドが水平方向に次々とつながり大きな山脈状の構造を形成する現象が起きにくい。本発明の方法によれば、それぞれのスフェロイドは互いに一定の距離を保ちながら、それぞれが立体的に増殖する傾向があるため、スフェロイド同志の間隔が広く保たれた、良質なスフェロイドが形成される。本発明を用いて作製されたスフェロイドは、細胞間が緻密な、直径が１００μｍ以上、好ましくは１５０μｍ以上、さらに好ましくは２００μｍ以上のスフェロイドである
また、本発明を用いて作成されたスフェロイドは、従来の方法で作成したスフェロイドに比べ、立体構造がより安定に維持され、長期間にわたり随時良質なスフェロイドを得ることができる。

本発明の方法を用いたスフェロイドの培養は、立体的または３次元的な支持体、例えば、Ｕ−ＳｈａｐｅやＶ−Ｓｈａｐｅの底を有する培養容器、格子状構造等の立体的な加工が底面に施された培養容器などを用いなくても良質のスフェロイドを形成させることができる。ただし、そのような支持体を含む培養容器を使用して本発明の方法を用いてスフェロイドを作製することもでき、それも本発明に含まれる。

このように、本発明の方法は、特殊な装置や容器、成長因子や接着因子、細胞間マトリックス等の添加を必要とせずにスフェロイドを作製できるという特徴を有する。さらには、本発明の方法によると、通常の培養容器を用いてスフェロイドの形成や培養が可能であり、その状態で顕微鏡観察も容易であるという特徴を有する。
さらに、本発明によると、形成されるスフェロイドの培養には特別な装置、特殊容器や高価な添加物を用いることが必要でなく一般的な容器例えばプラスチックディッシュやカバースリップ等を用いることができ、また使用する培地は一般的なＤＭＥＭ培地を基本として実施できるうえ、培養操作においても特別な手技や熟練の技巧を必要としないため、誰もが簡便にスフェロイドを作成できる優位性を持っている。
しかしながら、本発明の方法を、特殊な装置や容器、成長因子や接着因子、細胞間マトリックス等の添加というスフェロイド作製のための技術のいずれかまたは複数と、あるいはそれらの全てと組み合わせて用いることもでき、そのような組合せにより、より効率良く、良質なスフェロイドを大量に作製することも期待できる。このような組合せは、本発明の教示に基づいて、当業者が適宜、選択できるものであり、それらも本発明の一部である。

本発明の方法を用いて、例えば、直径４ｃｍのガラス底ディッシュで培養すると、数十個以上、好ましくは、おおよそ９０個以上のスフェロイドが形成される。このことにより、微量な解析の際に必要となる大量のスフェロイドが、一つのディッシュで安定的かつ継続的に作製できる。これは、三次元培養プラットフォーム等のマルチプレートを使用したスフェロイド形成と比べて操作性やその後の細胞の回収の点で大きなメリットとなる。本発明によると、このように大量のスフェロイドを、安定的に継続して形成させることが可能である。

また、スフェロイド形成に成長因子などの添加物を用いる場合、その後の顕微鏡による観察や光学的な解析において添加物が妨げになることがある。さらに細胞そのものにも生化学的および生理学的に添加物に固有の影響を及ぼすことも懸念される。しかしながら、本発明によると、スフェロイドの形成には上記したような添加物を必要としないためそのような弊害がなく、実験に好適なスフェロイドが提供できる。

また、本発明の方法により、マウスインスリノーマであるＭＩＮ６細胞を用いて作製されたスフェロイドは、がん細胞内に選択的に取り込まれる２−ＮＢＤＬＧを良好に取り込む性質をもつという特徴がある。例えば、本発明を用いて作製されたスフェロイドのおよそ７０％が、２−ＮＢＤＬＧを細胞内に取り込む良質なスフェロイドである。こうしたスフェロイドは、培地が１００％Ｌ−グルコース培地となってから数えて１１日目から少なくとも３週間目まで、多量に供給できる。

グルコースには、互いに鏡像関係にある二つの異性体、すなわちＤ−グルコースとＬ−グルコースが考え得るが、自然界には専らＤ−グルコースのみが存在する。生物は、このＤ−グルコースを細胞内に選択的に取り込み、基本的なエネルギー源として細胞内で代謝する。一方、自然界にないＬ−グルコースは、正常細胞が利用できない。
発明者は、Ｄ−グルコースの第二位に蛍光基ＮＢＤを導入した分子２−［Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２−ＮＢＤＧ）が、グルコーストランスポーターを介して哺乳動物細胞内に濃度、時間、温度依存的に、放射性標識グルコース誘導体に類似したキネティクスで取り込まれること、および、その対照分子であるＬ−グルコースの第二位に蛍光基ＮＢＤを導入した分子２−［Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｄｅｏｘｙ−Ｌ−ｇｌｕｃｏｓｅ（２−ＮＢＤＬＧ）が、グルコーストランスポーターを介して選択的に取り込まれないこと、を示した。

本発明者はまた、スフェロイド形成したがん細胞（マウスインスリノーマＭＩＮ６）に２−ＮＢＤＬＧを適用したところ、がん細胞が２−ＮＢＤＬＧを選択的に細胞内に取り込むことを示した（特許文献２）。本発明者は同時に、２−ＮＢＤＬＧに加えて、Ｌ−グルコースの第二位に蛍光基Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄを導入した２−ＴＲＬＧが壊死した細胞の検出に使えることを報告している（特許文献２）。さらに、本発明者は、２−ＮＢＤＬＧを、ヒトから摘出した生きたがん組織やがん細胞に適用すると、がん細胞が選択的に２−ＮＢＤＬＧを取り込んで蛍光を発し、非がん細胞と識別可能であることを見出した（特願２０１４−０１５７３５、および特願２０１４−１９３４２４）。

そして興味深いことに、２−ＮＢＤＬＧは、細胞が大小不同の核様態を示し、細胞間が十分に緻密なスフェロイドに取り込まれるという特徴を有していた。このようなスフェロイドは、スフェロイド作製用の特殊培養容器やマトリゲルや特殊培地等を添加しても、再現性よく多量に作製することは困難で、種々の工夫によっても一つの培養ｄｉｓｈに２−ＮＢＤＬＧを顕著に取り込むスフェロイドが２−３個あればよいという結果であった。

一方、本発明の方法を用いると、細胞間の結合がタイト（つまり、細胞間が緻密な状態）で、スフェロイド中心部の細胞が多核や異常な核様態を示すヘテロな状態のスフェロイドを再現性よく多量に得ることができる。すなわち、本発明によれば、簡易な方法で、良質なスフェロイドを再現性良く多量に作製することが可能である。

以下、マウスインスリノーマ細胞であるＭＩＮ６を例として、本発明により良質なスフェロイドを形成する方法を説明するが、本発明の方法は、他の細胞にも適用できることは当業者に明らかである。かかる場合は、それぞれの細胞に関する公知の情報に従い、用いる材料、試薬、条件を適宜選択し、使用することができる。

マウスインスリノーマ細胞ＭＩＮ６をＤ−グルコース含有培地を用いて１０×１０⁴個／ｍｌになるように細胞懸濁液を調整し、その後の観察及び解析に合わせてディッシュまたはカバースリップ等に播種することができる。播種する細胞数は、例えば市販の直径９０ｍｍディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＴＣシャーレ６６４１６０）の場合は３０−６０×１０⁴個／ｄｉｓｈ、またＷｉｌｌＣｏ−Ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ Ｄｉｓｈ（ＷｉｌｌＣｏ Ｗｅｌｌｓ １７０ｍｉｃｒｏｎ直径４０ｍｍ）の場合は１０×１０⁴個／ｄｉｓｈが適当である。或いは、６ｍｍ×２ｍｍ大のガラススリップの場合６００〜１０００個の細胞を播種するのが適当である。

次いで培養開始後一定時期にＤ−グルコース培地をＬ−グルコース培地に置換する。かかる培地の置換は、当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、細胞の培養に用いているＤ−グルコース培地を除去してあるいは培地中から細胞を回収して、Ｌ−グルコース培地を加えることにより行うことができる。
培地の置換はまた、以下のようにして行うこともできる。まず最初に、培地のＤ−グルコース濃度が当初濃度の２５％（６．２５ｍＭ）になるように培地交換を行う。そのために培地の半量交換を２回続けて行うことでＤ−グルコース２５％濃度にすることができる。培地交換に用いる培地はＬ−グルコース含有培地（Ｄ−グルコース不含培地）を用いることができる。Ｄ−グルコース濃度を当初濃度の２５％にするのは培養開始後２日目から１０日目が適している。その後、Ｄ−グルコース濃度２５％で２日間培養した後、さらに濃度を段階的に減少させていくために、培地の半量交換を行いＤ−グルコース濃度を１２．５％（３．１２５ｍＭ）にして２日間培養した後、培地を全量捨ててＬ−グルコース含有培地で２回Ｗａｓｈした後Ｌ−グルコース培地を加えることで、培地に加えているＤ−グルコース濃度を０％にできる。

細胞によって状態は異なるが、Ｌ−グルコース培地にすることにより、例えば以下のようなことが起こる。
培養中に、増殖を続けてきた細胞の中で、Ｄ−グルコース濃度１２．５％（３．１２５ｍＭ）以降は浮遊する死細胞が目立つようになり、Ｄ−グルコース濃度が０％になってからは細胞の浮遊は顕著に見られ、そしてそれまで増え続けてきた細胞数は一旦減少する。
浮遊してくる死細胞からの代謝産物を取り除くために、培地添加のＤ−グルコース濃度が０％になった時点から６時間毎にＬ−グルコース含有培地で培地の半量交換を行う。これにより、代謝産物の影響を極力受けないようにすることができる。６時間毎の培地交換は少なくとも４回以上、浮遊する細胞が目立たなくなるまで行うことが好ましい。以降の培地交換については、Ｄｉｓｈ全体の細胞が少ない期間は１日おきに、十分に細胞が増え始める１９日目以降は毎日、培地の半量交換を行うことが好ましい。

上記のように培養していく中で直径およそ１００ミクロン以上、周辺部には増殖する細胞、中心部に壊死細胞が生じる典型的なＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ（不均一）な大量のスフェロイドがＬ−グルコース培地での培養開始後のある日数後、例えば３〜１０日目以降に形成され、それ以降もスフェロイドがＤｉｓｈ中に継続的に見られる。
これらのスフェロイドに蛍光Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧを投与すると、２−ＮＢＤＬＧの強い取込みが見られる。この取込みはガラス底のＷｉｌｌＣｏ−Ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ Ｄｉｓｈまたはガバースリップを使うことで、共焦点レーザー顕微鏡での観察が可能となるが、スフェロイド周辺部には２−ＮＢＤＬＧの緑色の強い蛍光が見られ、中心部には２−ＮＢＤＬＧと同時に投与した２−ＴＲＬＧの赤色の取込みすなわち壊死した細胞が見られるＨｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓなスフェロイドが形成される。
なお、以下に記載する実施例２では２−ＮＢＤＬＧの取込みを示すスフェロイドが７０％を超え、一方実施例３では半数を超えるスフェロイドが取込みを示している。

本発明によれば、ヒトがん細胞における蛍光Ｌ−グルコース誘導体の取り込みを、ｉｎ ｖｉｔｒｏで再現する良質ながん細胞スフェロイドを多量に安定に形成させることが可能である。また、がん細胞を用いて、本発明で作成したスフェロイドと既存の３次元プラットフォームにより作成したスフェロイドとでは蛍光Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧの取り込みに大きな違いがみられることが確認できている。蛍光Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧは組織中の癌病変部から生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）に取り出した組織に強く取込まれることから、本発明によるスフェロイドは、従来法で作成したスフェロイドに比べ、よりｉｎ ｖｉｖｏと近い特徴を有していると考えられる。

以下、実施例をもとに本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない、

１．使用細胞
凍結保存していたＭＩＮ６細胞（大阪大学の宮崎純一教授より供与を受けて５−８回継代した細胞）を常法に従って培養に移し、トータルで６−９回継代したものを実験に供した。
ＨＴ−２９ヒト結腸腺がん細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手した（細胞番号：ＨＴＢ−３８）。

２．使用培地
Ｄ−グルコース入り培地
ＤＭＥＭ−ハイグルコース培地（ＳＩＧＭＡ：Ｄ５６４８、Ｄ−グルコース濃度２５ｍＭ）１３．４ｇを蒸溜水に溶かし、ＮａＨＣＯ₃を３．７ｇ、２−メルカプトエタノール５μｌを加えた。ｐＨを７．３に調製し全量を１０００ｍｌとした後、ろ過滅菌を行い、ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ：ＳＨ３００７０）を１０％になるように加え、ペニシリン・ストレプトマイシンを加えてＤ−グルコース入り培地（以下、「Ｄ−グルコース培地」という）とした。

Ｌ−グルコース入り培地（Ｄ−グルコース不含）
グルコース不含ＤＭＥＭ培地（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ不含ＳＩＧＭＡ：Ｄ５０３０）８．３ｇを蒸溜水に溶かし、ＮａＨＣＯ₃を３．７ｇ、２−メルカプトエタノール５μｌ、Ｌ−グルコース（東京化成）４．５ｇ、およびＰｈｅｎｏｌ ｒｅｄを加えた。ｐＨを７．３に調製し全量を１０００ｍｌとした後、ろ過滅菌を行い、次いでＬ−グルタミン（ＳＩＧＭＡ：Ｇ７５１３）２０ｍｌ、さらにＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ：ＳＨ３００７０）を１０％になるように加え、ペニシリン・ストレプトマイシンを加えてＬ−グルコース入り培地（以下、「Ｌ−グルコース培地」という）とした。

３．２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧの適用
２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧは、ペプチド研究所（大阪）に依頼して合成した。
２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧのＭＩＮ６スフェロイドへの適用および蛍光の検出は、ＷＯ２０１０／０１６５８７号公報およびＷＯ２０１２／１３３６８８号公報に記載の方法に従って行った。

（実施例１）プラスチックディッシュ上でのスフェロイドの形成
一般的な細胞培養で用いられる培地であるＤ−グルコース培地にＭＩＮ６細胞（マウスインスリノーマ由来細胞）を３０×１０⁴個／ｍｌで懸濁し、この細胞懸濁液１ｍｌをプラスチックディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、セルカルチャー用ＴＣシャーレ１００×２０ｍｍ）に加え、さらに培地を添加して、合計の培地量を１０ｍｌとした。５％ＣＯ₂インキュベーターで、３７℃にて培養を開始し（培養開始後０日とする：１００％Ｄ−グルコース）、培養開始後３日目までそのまま静置した。
次いで、培養開始後３日目にＤ−グルコース培地を用いて培地を半量（５ｍｌ）交換した（培養３日目：１００％Ｄ−グルコース）。
引き続き培養を続け、培養６日目にＬ−グルコース培地を用いて、培地半量交換を２回続けて行うことにより、培地中のグルコースを、Ｌ−グルコース７５％（１８．８ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を２５％（６．３ｍＭ）とした（培養６日目：２５％Ｄ−グルコース、７５％Ｌ−グルコース）。

さらに培養を続け、培養８日目にＬ−グルコース培地を用いて培地の半量交換を行い、Ｌ−グルコース８７．５％（２１．９ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を１２．５％（３．１ｍＭ）とした（培養８日目：１２．５％Ｄ−グルコース、８７．５％Ｌ−グルコース）。この段階から、それまで増殖していた細胞塊のうち、縮小するものが多く観察されるようになった。

培養１０日目に培地を全量捨てて、Ｌ−グルコース培地５ｍｌで培養皿を２回洗った後、Ｌ−グルコース培地を１０ｍｌ加えＬ−グルコース培地１００％（２５ｍＭ）で培養した（培養１０日目：１００％Ｌ−グルコース）。この時点をＬ−グルコース培養０日とした。この後、死細胞が浮遊し、それが増加した。
培養１１〜１２日目に、６時間おきにＬ−グルコース培地を用いて、培地半量交換を行い、浮かんでいる細胞を取り除くようにした（１００％Ｌ−グルコース）。その後は毎日、培地の半量交換を行った。Ｌ−グルコース培養開始後、１１日過ぎには中心部に壊死細胞を擁するスフェロイドが多数認められ、Ｌ−グルコース培養２１日目においても同様のスフェロイドが多数形成され続けた。Ｌ−グルコース培養開始後１３日目に細胞を観察した結果を図１に示す。

（実施例２）ガラス底ディッシュで接着性スフェロイドを形成させた後のＬ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧの取りこみ観察
ＭＩＮ６細胞（マウスインスリノーマ由来細胞）をＤ−グルコース培地に１０×１0⁴個／ｍｌで懸濁し、培養皿ＷｉｌｌＣｏ−Ｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍ Ｄｉｓｈ（ＷｉｌｌＣｏ Ｗｅｌｌｓ：１７０ｍｉｃｒｏｎ直径４０ｍｍ）に細胞懸濁液１ｍｌを加え、Ｄ−グルコース培地を加えて合計の培地量を３ｍｌとして５％ＣＯ₂、３７℃にて培養を開始し（培養開始後０日とする：１００％Ｄ−グルコース）、培養開始後３日目までそのまま静置した。

培養開始後３日目に、Ｄ−グルコース培地で半量１．５ｍｌを交換した（培養３日目：１００％Ｄ−グルコース）。
培養６日目に、Ｌ−グルコース培地を用いて、培地の半量交換を２回行いＬ−グルコース７５％（１８．７５ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を２５％（６．２５ｍＭ）にした（培養６日目：２５％Ｄ−グルコース、７５％Ｌ−グルコース）。
培養８日目に、Ｌ−グルコース培地を用いて培地の半量交換を行い、Ｌ−グルコース８７．５％（２１．８７５ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を１２．５％（３．１２５ｍＭ）とした（培養８日目：１２．５％Ｄ−グルコース、８７．５％Ｌ−グルコース）。この後、増殖をしていた細胞塊は縮小するものが多く観察された。

培養１０日目に、培地を全量捨てて、Ｌ−グルコース培地２ｍｌで培養皿を２回洗った後、Ｌ−グルコース培地を３ｍｌ加えＬ−グルコース培地１００％（２５ｍＭ）で培養を開始した（培養１０日目：１００％Ｌ−グルコース）。この時点をＬ−グルコース培養０日とした。この後、死細胞が浮遊し、増えるのが観察された。
培養１１〜１２日目に、６時間おきに培地の半量交換を行い、浮かんだ細胞を取り除いた後、さらにその後、Ｌ−グルコース培地を用いて、毎日、培地の半量交換を行い、培養を続けた。Ｌ−グルコース培養開始後１１日目には再現性良く多数のスフェロイドが形成されてきた。１４日目には、一枚のディッシュ上に、中心部に壊死領域を有するスフェロイドが、合計６２個観察された。１１日目、１４日目、および２１日目に細胞を観察した結果を、それぞれ図２、３および４に示す。

このように形成したＬ−グルコース培養開始後１４日目のスフェロイドを用いて、Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧの取込みを共焦点レーザー顕微鏡により、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長は緑チャネル５００−５８０ｎｍ、赤チャネル５８０−７４０ｎｍで観察した。観察したスフェロイド２４個のうち１９個が２−ＮＢＤＬＧをよく取込んでいることが確認できた。観察結果を図５に示す。

（実施例３）カバースリップ上に形成させたスフェロイドに対するＬ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧ／２−ＴＲＬＧ混合液の取りこみ観察
６．５ｍｍ×２ｍｍ大にカットしたカバースリップ（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ ＭＩＣＲＯＣＯＶＥＲ ＧＬＡＳＳ Ｎｏ．０ １３ｘ２２ｍｍ）を３５ｍｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ Ｄｉｓｈ １０００−０３５）に置き、Ｄ−グルコース培地で１０×１０⁴個／ｍｌに懸濁したＭＩＮ６細胞１０μｌをカバースリップ上に播種した。Ｄ−グルコース培地３ｍｌをディッシュに加え、５％ＣＯ₂、３７℃にて培養を開始し（培養開始後０日：１００％Ｄ−グルコース）、培養開始後３日目までそのまま静置した。
培養３日目に、Ｄ−グルコース培地を用いて培地半量１．５ｍｌを交換した（培養３日目：１００％Ｄ−グルコース）。
培養６日目に、Ｌ−グルコース培地を用いて、培地半量交換を２回行いＬ−グルコース７５％（１８．７５ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を２５％（６．２５ｍＭ）とした（培養６日目：２５％Ｄ−グルコース、７５％Ｌ−グルコース）。
培養８日目に、Ｌ−グルコース培地を用いて培地の半量交換を行い、Ｌ−グルコース８７．５％（２１．８７５ｍＭ）に対してＤ−グルコースの割合を１２．５％（３．１２５ｍＭ）とした（培養８日目：１２．５％Ｄ−グルコース、８７．５％Ｌ−グルコース）。この後、増殖をしていた細胞塊は縮小するものが多くなった。

培養１０日目に、培地を全量捨てて、Ｌ−グルコース培地２ｍｌで培養皿を２回洗った後、Ｌ−グルコース培地を３ｍｌ加えＬ−グルコース入り培地１００％（２５ｍＭ）で培養した（培養１０日目：１００％Ｌ−グルコース）。この時点をＬ−グルコース培養０日とした。この後死細胞が浮遊し増えてきた。
培養１１〜１２日目に、６時間おきに培地の半量交換を行い、浮かんでいる細胞を取り除き、その後は、毎日、培地の半量交換を行った（１００％Ｌ−グルコース）。Ｌ−グルコース培養開始後１０日過ぎから多数のスフェロイドが形成された。１１日目の観察結果を図６に示す。形成したスフェロイドを用いて、Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧの取込みを共焦点レーザー顕微鏡により観察した。結果を図７および図８に示す。

上記の実施例２および実施例３における２−ＮＢＤＬＧの取込みを示すスフェロイドの割合を表１に示す。実施例２では７０％を超え、一方実施例３では半数を超えるスフェロイドが２−ＮＢＤＬＧの取込みを示している。

（実施例４）カバースリップ上に形成させたスフェロイドの安定性
実施例３と同様にして、Ｌ−グルコース培地でＭＩＮ６細胞を培養してＭＩＮ６細胞スフェロイドを形成させ、その推移を観察した。結果を図９に示す。本発明の方法により作製したスフェロイドは、周辺部には増殖する細胞、中心部には壊死細胞が生じる典型的なＨｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ（不均一）な細胞集塊を形成していることが判る。また、本発明の方法により作製したスフェロイドは、長期間にわたり安定したスフェロイドが維持されているのが判る。

（比較例１）ナノインプリンティングディッシュで形成されたスフェロイドの安定性
並行してナノインプリンティングディッシュ（Ｓｃｉｖａｘ社ＮａｎｏＣｕｌｔｕｒｔｅＰｌａｔｅ ＭＳパターン、低接着、９６ウェル）で以下のようにして培養し、スフェロイドを形成した。
Ｄ−グルコース培地で１０×１０⁴個／ｍｌに懸濁したＭＩＮ６細胞を、ナノインプリンティングディッシュのウェルに１００μｌずつ播種した。Ｄ−グルコース培地１００μｌをディッシュに加え、５％ＣＯ₂、３７℃インキュベーター条件下で培養を開始した。 十分な大きさのスフェロイドが形成される培養開始後１１日目に、マイクロピペットを用いてスフェロイドをガラス底ディッシュに移し観察に供した。その結果を図１０Ａに示す。また培養１４日目に、マイクロピペットを用いてカバースリップ上に播種し１日かけて定着をさせた後、培養１５日目に観察に供した。結果を図１０Ｂに示す。
（比較例２）Ｄ−グルコース培養で形成されたスフェロイドの安定性
Ｄ−グルコース培地で１０×１０⁴個／ｍｌに懸濁したＭＩＮ６細胞を、３５ｍｍディッシュに置いた６．５ｍｍ×２ｍｍ大のカバースリップに１０μｌずつ播種した。Ｄ−グルコース培地３ｍｌをディッシュに加え、５％ＣＯ₂、３７℃にて培養を開始した。
十分な大きさのスフェロイドが形成される１４日目に観察に供した。結果を図１０Ｃに示す。

以上の結果より、本発明によるＬ−グルコース培養で形成されたスフェロイドは中心部（central core）の目玉様の領域に壊死細胞が出現し、スフェロイド全体の直径は２００μｍ以上の大きさを維持しておりなおかつＬ−グルコース培養開始後１１−２１日目にかけて形が崩れていない。しかし、ナノインプリンティングディッシュによるスフェロイドは、大きさは本発明のスフェロイドより小さく、培養１１日目では早くも形が崩れ始めるスフェロイドが出現し、１５日目ではその形態を維持できていない。
またカバースリップ上においてＤ−グルコース培地で形成したスフェロイドは１４日目ではその形態が全く維持されていない。Ｄ−グルコース培地で形成したスフェロイドの形態が崩れる時期は個々のスフェロイドで異なるが、理想的なスフェロイドが形成されるとそれから数時間から１日のうちに形が崩れることも稀ではない。

（実施例５）ＨＴ−２９ヒト結腸腺がん細胞をＬ−グルコース培地により培養し、スフェロイドを形成させた例
一般的な細胞培養で用いられる培地であるＤ−グルコース培地にヒト結腸腺がん細胞ＨＴ−２９を１０×１０⁴個／ｍｌの割合で懸濁し、この細胞懸濁液３ｍｌを浮遊細胞用フィルタキャップフラスコ（住友ベークライトＭＳ−２３２５Ｒ、２５０ｍｌ）に加え、さらに培地を添加して、合計の培地量を２０ｍｌとした。５％ＣＯ₂インキュベーターで、３７℃にて培養を開始し（培養開始後０日とする：１００％Ｄ−グルコース）、培養開始後３日目までそのまま静置した。
培養開始後３日目に、遠心操作（５０Ｇ、１分）を行い、培地をＬーグルコース培地（２ーメルカプトエタノールを含まず）と全量交換した（培養３日目：１００％ Ｌーグルコース培地）。この時点をＬーグルコース培養開始後０日とした。
Ｌ−グルコース培養開始後２日目（培養開始後通算５日目）から、１日おきに遠心操作（５０Ｇ、１分）を行い、培地の半量（１０ｍｌ）を新鮮なＬーグルコース培地と交換した。
Ｌーグルコース培養開始後３日目（培養開始後通算６日目）には、中心部に壊死領域を示すスフェロイド形成を認めた（図１１Ａ）。
同様の方法で、ただしＬーグルコース培地を用いず、Ｄ−グルコース含有培地のみを用いてＨＴ−２９ヒト結腸腺がん細胞を培養すると、疎に細胞が集合した３次元細胞集塊（Sparsely-packed three dimensional cell cluster）となり、良質ながん細胞スフェロイドが形成されなかった（図１１Ｂ、培養開始後通算６日目の例）。
Ｌーグルコース培地で培養を開始してから５日目（培養開始後通算８日目）には、直径が２００μｍを超えるスフェロイド形成も認められた（図１１Ｃ）。

（実施例６）Ｌ−グルコース培地により培養したＨＴ−２９ヒト結腸腺がん細胞のＬ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧ／２−ＴＲＬＧ混合液の取りこみ観察
実施例５の培養法により形成したＨＴ−２９細胞のスフェロイドを共焦点顕微鏡で観察するために、Ｌーグルコース培養開始後１０日目（培養開始後通算１３日目）にカバースリップに移して、定着をさせた。その翌日、つまりＬーグルコース培養開始後１１日目（培養開始後通算１４日目）に形成したスフェロイドを用いて、実施例３と同様にして、Ｌ−グルコース誘導体２−ＮＢＤＬＧおよび２−ＴＲＬＧの取込みを共焦点レーザー顕微鏡により観察した。結果を図１２に示す。
中心部の細胞には壊死を起し、２−ＴＲＬＧを取り込んでいるがその周辺には２−ＮＢＤＬＧの強い取込みを示す細胞が認められる。

上記で示したように、本発明によれば、培養液からＤ−グルコースを除き、代わりにＬ−グルコースで置換するシンプルな方法により、通常の培養容器やカバースリップを用いながら、良質なスフェロイドを再現性良く、かつ多量に形成させることができる。

上記の記載は、本発明の目的および対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更および置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。

本発明により作製されたスフェロイドは、がん研究や薬剤スクリーニング等の医療分野、胚様態の形成等の幹細胞生物学分野、ニューロスフェア形成等の神経生物学分野、その他様々な細胞の研究分野などにおいて利用できる。

Claims (22)

1. グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地を用いて細胞を培養することを特徴とするスフェロイドの作製方法。
2. Ｌ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である請求項１に記載の方法。
3. 前記細胞が、がん細胞由来の細胞である請求項１または２に記載の方法。
4. 前記培地での培養が３日以上である請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
5. 前記培地が、成長因子および／または接着因子を添加しない培地である、請求項１〜４のいずれか一つに記載の方法。
6. 前記培地が、細胞間マトリックスを添加しない培地である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の方法。
7. 前記培養が立体的な支持体を用いない培養である請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
8. 以下の工程：
   （ａ）Ｄ−グルコースを含有する培地にて細胞を培養する工程、
   （ｂ）培地中のＤ−グルコースをＬ−グルコースに置き換える工程、
   （ｃ）グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成される培地を用いて細胞を培養する工程、
   を含む、スフェロイドの作製方法。
9. 前記工程（ｂ）が、培地中のＤ−グルコース濃度を段階的に下げるとともに、Ｌ−グルコース濃度を段階的に上げて細胞を培養する工程である、請求項８に記載の方法。
10. 工程（ｃ）におけるグルコース含有培地中のＬ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である請求項８または９に記載の方法。
11. 前記工程（ｃ）における培養が３日以上である、請求項８〜１０のいずれか一つに記載の方法。
12. 前記細胞が、がん細胞由来の細胞である請求項８〜１１のいずれか一つに記載の方法。
13. 前記工程（ｃ）の培地が、成長因子および／または接着因子を添加しない培地である、請求項８〜１２のいずれか一つに記載の方法。
14. 前記工程（ｃ）の培地が、細胞間マトリックスを添加しない培地である、請求項８〜１３のいずれか一つに記載の方法。
15. 前記工程（ａ）〜（ｃ）の培地が、成長因子、接着因子、細胞間マトリックスのいずれも添加しない培地である、請求項８〜１４のいずれか一つに記載の方法。
16. 前記培養が立体的な支持体を用いない培養である請求項８〜１５のいずれか一つに記載の方法。
17. 請求項１〜１６のいずれか一つに記載の方法により作製されたスフェロイド。
18. 前記スフェロイドが細胞間が緻密な状態なスフェロイドである請求項１７に記載のスフェロイド。
19. グルコース含有培地であってグルコースが実質的にＬ−グルコースから構成されるスフェロイド培養培地。
20. Ｌ−グルコースの割合が、Ｄ−グルコースおよびＬ−グルコースからなる全グルコースの９０％以上である請求項１９に記載の培地。
21. 前記培地が成長因子および／または接着因子を添加しない培地である、請求項１９または２０に記載の培地。
22. 前記培地が細胞間マトリックスを添加しない培地である、請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の培地。

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