CN112592897A - 一种肿瘤类器官的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肿瘤类器官的制备方法，包括：获取肿瘤组织样本；在细胞培养板上铺上一层甲基丙烯酰化明胶，使胶凝固，然后再铺上一层猪皮明胶或者多聚赖氨酸凝胶，使胶凝固；将样本组织放置于无菌容器中，在细胞培养基中切碎，得到组织团块；将切碎后的样本组织‑培养基混悬液一并通过无菌滤网；将滤网拦截的组织团块用细胞培养基冲洗至新的无菌容器，加入肿瘤组织样本来源的血清，混匀；加入至细胞培养板孔中，培养过夜；观察组织团块，待团块以半镶嵌方式吸附于胶面上层，不会随液体来回漂动，则获得肿瘤类器官。本发明的方法制备肿瘤类器官的时间短，类器官内部细胞之间有很好的连接，不易散落，且很方便看出类器官是否有活性，还可以用于检测细胞杀伤。

Description

一种肿瘤类器官的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地，涉及一种肿瘤类器官的制备方法。

背景技术

类器官(organoid)指由多个细胞组成的，具有生物活性的细胞团(群)。相比于单个细胞，它更加接近于多个细胞协同生长的实际情况。类器官历史大致可追溯至21世纪初，剑桥大学神经科学家Lancaster在培养脑细胞时发现未贴壁的脑细胞可形成细胞团，且具有生物活性，因此更加贴近细胞协同工作或协同生长的状态。

类器官培养技术能借助来源于组织、胚胎源性干细胞及成体干细胞的细胞，在体外诱导分化成为拥有其来源器官基本特性的功能性细胞团，为模拟活体器官提供新的体外模型。与传统二维培养物相比，类器官更能模拟体内细胞运动及多细胞间信号交流，且能在扩增中维持基因稳定性。与动物实验相比，类器官能模拟动物实验不易或不能准确代表的人体发育和疾病的发生发展过程，并可实现实时成像和更为符合实验伦理要求。

目前类器官培养已用于各种组织，其中包括肠道、肝脏、胰腺、肾脏、前列腺、肺、视杯以及大脑。作为一种工具，类器官技术在科研和临床方面均潜力巨大，包括发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生机制、精准医疗以及药物毒性和药效试验。相比于单个培养的细胞，类器官中的各个细胞间可建立较小的微环境，存在有效的细胞交流。类器官中的细胞可通过细胞因子的旁分泌途径，使周围细胞接受化学信号，并作出相应反应。一些类器官包含分化潜能，对于研究组织器官发育以及相关的信号分子调节有重要意义。

在过去的几十年里，人们对某些类型癌症的治疗取得了实质性进展，但癌症仍是全球最主要的健康问题。人们已认识到，基础科研研究到临床实际治疗的转化成了发展新肿瘤治疗方案的主要障碍之一，这主要是因为许多肿瘤模型仅仅对肿瘤组织进行了大体概括，无法很好地维持肿瘤细胞的高度异质性，正是这些原因，许多在传统癌症模型中有效的药物在临床试验中无法得到论证。虽然动物癌症模型已为癌症基础研究提供了重要的实验材料，但它们的繁殖周期是耗时、耗力的，并且这些模型无法充分地反映癌症患者的致病过程。例如，基因工程建立的小鼠癌症模型并不能反映人类癌症的组织复杂性和遗传异质性。随着类器官体外3D培养技术的发展，研究人员开发了新的、更符合人类癌症的研究模型——肿瘤类器官模型。

肿瘤类器官模型还具有其他很多优点，包括可保持长期扩增、冷冻保存及基因改造等。这种新的模型在基因药物相关性研究、抗癌药物的临床前筛选、药物反应和患者预后的预测中具有巨大潜力。

以科研为主的类器官主要由少量细胞(50个细胞左右)增值而成，培养过程中动物类器官需添加β-FGF等生长因子，人源细胞或细胞系增殖而成的类器官需添加EGF2等生长因子，在培养基中培养。时间大概需培养5-10天，才可以生长为较成型的类器官。之后用于生理学，病理学分析。

研究表明，肿瘤类器官模型本身的生长速度慢于其相应的正常组织类器官生长速度，甚至在许多情况下以较慢的速率生长，这可能与失败的有丝分裂和分裂之后的细胞死亡有关。而且，对于肿瘤类器官的检测也存在一定的困难。

发明内容

本发明的目的在于提供制备肿瘤类器官的培养方法，其可以克服现有技术中类器官培养的缺陷，培养时间短，且类器官内部细胞之间有很好的连接，不易散落，且很方便看出类器官是否有活性，还可以用于检测细胞杀伤。

本发明的技术方案如下：

1.一种肿瘤类器官的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：

1)获取肿瘤组织样本，保存在组织保存液中；

2)在细胞培养板上铺上一层甲基丙烯酰化明胶，使胶凝固，然后再铺上一层猪皮明胶或者多聚赖氨酸，使其附着于甲基丙烯酰化明胶表面；

3)将样本组织从保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将样本组织在细胞培养基中切碎，得到组织团块；

4)将切碎后的样本组织-培养基混悬液一并通过无菌滤网；

5)将滤网拦截的组织团块用细胞培养基冲洗至新的无菌容器，加入肿瘤组织样本来源的血清，混匀；

6)加入至步骤2)制备的细胞培养板孔中，放入CO2培养箱，37℃培养过夜；

7)观察组织团块，待团块吸附于胶中，不会随液体来回漂动，则获得肿瘤类器官。

作为上述技术方案的改进，所述步骤3)中组织团块的体积在0.5mm×0.5mm以下。

作为上述技术方案的改进，所述步骤4)中滤网的孔径为100μm。

作为上述技术方案的改进，所述细胞培养基为原代细胞培养基。

本发明还提供了一种采用上述制备方法制备的肿瘤类器官。

本发明还提供了一种上述肿瘤类器官在药物筛选中的用途。

本发明的肿瘤类器官的培养方法培养时间短，且类器官内部细胞之间有很好的连接，不易散落，且很方便看出类器官是否有活性，还可以用于检测细胞杀伤。本发明方法制备的肿瘤类器官可以作为一种药物检测工具，用于临床病人在化疗前先对可能用到的化疗药物或治疗方案进行一次初筛，找到针对病人自身肿瘤效果好的药物或治疗方案，进而使医生更有目标性地选择用药。当然，也可以用于常规的肿瘤药物筛选过程中的各种效力或毒性试验的检测工具。

附图说明

图1显示传统类器官的包埋培养状态。

图2显示本发明的肿瘤类器官的培养状态。

图3显示传统类器官的包埋培养方式。

图4显示本发明的肿瘤类器官的培养方式。

图5显示NK细胞或者CAR-T细胞对于传统类器官的杀伤状态。

图6显示NK细胞或者CAR-T细胞对于本发明的肿瘤类器官的杀伤状态。

图7显示传统类器官的检测状态。

图8显示本发明的肿瘤类器官的检测状态。

图9为本发明的肿瘤类器官的浸润性生长情况。

图10为实施例2中本发明的肿瘤类器官应用于药物筛选的情况。

图11为实施例3中本发明的肿瘤类器官应用于药物筛选的情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：肿瘤类器官的制备

1)获得癌症或肿瘤患者的活检组织。

2)活检组织浸泡在组织保存液中，保证组织活性。

3)在细胞培养板(96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板均可)上铺上一层甲基丙烯酰化明胶，照射蓝光使胶凝固，然后再铺上一层猪皮明胶，使其附着于甲基丙烯酰化明胶表面。

4)将组织从保存液中取出，放置于细胞培养皿中，加入细胞培养基，将组织在细胞培养基中切碎，小团块体积在0.5mm×0.5mm以下。

5)将切碎后的组织-培养基混悬液混合，一并通过孔径为100um的无菌滤网。

6)通过滤网的液体或丢弃或用于培养原代细胞，被滤网拦截的组织团块由培养基冲洗至新的无菌容器。

7)将团块与培养基以及患者的血清重悬混匀，加入至有凝胶的细胞培养板孔中。

8)培养板放入CO₂培养箱，37℃培养过夜。

9)次日观察组织团块，若团块吸附于凝胶，不会随液体来回漂动，则说明团块有活性，视为成功培养起了该病人的PSO肿瘤类器官。

10)培养成功的PSO肿瘤类器官可用于做加药实验。

在传统的类器官培养过程中，类器官是直接被完全包埋在基质胶中的，一般是matrixgel胶，如图1、图3所示。而在本发明的肿瘤类器官培养过程中，培养板中加了一层基质胶和一层分子膜，下面一层基质胶是甲基丙烯酰化明胶，上面一层分子膜是猪皮明胶或者多聚赖氨酸，然后把粉碎的类器官种在基质胶和分子膜上，如图2、图 4所示。甲基丙烯酰化明胶疏松多孔，生物相容性良好，作为支架，培养基可渗入，便于类器官附着在凝胶一侧的细胞吸收营养；猪皮明胶或者多聚赖氨酸是很薄的一层分子多聚物，便于细胞贴附于凝胶，这样形成的就是贴附生长的类器官，而不是完全被包埋在凝胶中的类器官。

如果采用传统的类器官培养方式，就是类器官被基质胶全包埋的方式，不能短期直接看出类器官是否有活性。要培养一段时间，一般至少得4～5天，等类器官长大，或者看到细胞有浸润性生长，才能确定类器官是活的，然后才能进行各种药物测试，如图3所示。由于细胞离体时间太久，其性状是否还类似在患者体内的情况都不一定。

然而，采用本发明的培养方式制备的肿瘤类器官，一般情况下，类器官具备活性的话，第二天就可以贴附到胶上生长(实质性肿瘤的肿瘤细胞趋于贴壁生长，且有浸润性，倾向于向凝胶下层延申，如果类器官没有存活，其不会贴附在胶上)，如图4 和图9所示。因此，第二天就知道哪些类器官是活的，所以第二天就可以加药测试，大大地提高了药物测试的效率。

而且，采用传统的被基质胶全包埋的方式培养的类器官，只能检测药物，不能检测细胞杀伤，比如用NK细胞杀伤或者用CAR-T细胞杀伤，因为NK细胞或CAR-T细胞不容易深入进凝胶，如图5所示。而采用本发明的制备方法制备的肿瘤类器官，由于肿瘤类器官是暴露在培养基中的，除了可以测试药物，还可以测试CAR-T细胞或NK细胞对肿瘤类器官的杀伤，因为CAR-T细胞或NK细胞可以与肿瘤类器官直接接触，如图6 所示。

另外，如图7所示，采用传统方法制备的全包埋在凝胶里的类器官是在不同平面，收集数据时(例如，拍照或录视频)，不易全都观察到。而采用本发明的制备方法制备的肿瘤类器官，相当于把类器官全都放在了凝胶表面，便于拍照和录像，如图8所示。

在本发明的肿瘤类器官的制备过程中，组织样本是反复切碎的，不加胰酶，这样保证了细胞上的钙粘蛋白和桥联蛋白的完整，细胞易贴附，而且肿瘤类器官内部的细胞之间也有很好的连接，不易散落，方便细胞间信号传递。

还有，相比于传统的类器官制备过程中添加各种生长因子，本发明的肿瘤类器官的后续培养中直接加了组织样本来源的血清到培养基中，基本和患者体内生长的肿瘤保持高度一致的相似性，更加贴近临床试验情况，增强药物筛选的可靠性，有更高的临床应用价值。

实施例2：药物筛选

对于一些新药的测试，一般实验室常用模型为PDX模型(患者来源肿瘤异体移植模型，Patient-Derived tumor Xenograft)或CDX模型(细胞系来源肿瘤异体移植模型，Cell-line-Derived tumor Xenograft)。PDX模型即提取病人原代细胞，移植于裸鼠皮下或其它免疫缺陷鼠皮下，使细胞生长成为肿瘤。之后再给小鼠注射药物，注射数个周期后，测量肿瘤质量和体积，看是否相比于对照组有所减小。这其中的问题在于，虽然实验数据算作体内实验数据，但是在小鼠体内生长环境和人体内生长环境有很大不同。比如人的正常神经干细胞移植到小鼠体内是无法生长的。因此能够在小鼠体内顺利生长的病人肿瘤细胞，其性状是否改变则不可知。

本发明的肿瘤类器官的生长环境除了包括提供各种必须营养因子的原代细胞培养基，还加入了组织样本来源的自身的血清，这使得肿瘤类器官的生长环境更接近于人体。相较而言，新药对肿瘤类器官的杀伤结果，一定程度上更能真实反映新药对患者肿瘤的杀伤效果。此外，本技术相比于小鼠模型的突破在于，一般情况下，肿瘤细胞在体外无法成瘤，只能植入于小鼠体内成瘤，而肿瘤类器官是以人体肿瘤的性质体外培养，本身为肿瘤组织，而非单个细胞，且培养环境接近人体体内，关键在于保证其生物活性，最后直接用于药物筛选。

从汕头肿瘤医院经患者知情同意情况下，得到患者盆腔肿瘤组织样本，组织样本被装入组织保存液中，然后按照实施例1的指标方法得到肿瘤类器官。用此肿瘤类器官做加药实验，测试药物有吉西他滨、紫杉醇、吉西他滨-罗米地辛-顺铂联合用药、C188- 9、伊维菌素-顺铂联合用药、BBI608-紫杉醇联合用药。其中C188-9和BBI608为新型小分子药物，其它为医院常用的化疗药物。测试结果如图10所示，由图可知，C188-9 和BBI608联合紫杉醇方案，可使部分肿瘤类器官消融，其它常用化疗药物效果不明显。

实施例3：药物测试

从汕头肿瘤医院经患者知情同意情况下，得到患者的复发宫颈癌组织样本，组织样本被装入组织保存液中，然后按照实施例1的指标方法得到肿瘤类器官。用此肿瘤类器官做加药实验，测试药物有吉西他滨、紫杉醇、吉西他滨-罗米地辛-顺铂联合用药、 C188-9、伊维菌素-顺铂联合用药、BBI608-紫杉醇联合用药。其中C188-9和BBI608为新型小分子药物，其它为医院常用的化疗药物。测试结果如图11所示，由图可知，该肿瘤类器官对伊维菌素-顺铂联合用药，以及BBI608-紫杉醇联合用药的用药方案较为敏感，而对实施例2中的肿瘤类器官测试有效的C188-9未表现出明显药效。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种肿瘤类器官的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：

1)获取肿瘤组织样本，保存在组织保存液中；

2)在细胞培养板上铺上一层甲基丙烯酰化明胶，使胶凝固，然后再铺上一层猪皮明胶或者多聚赖氨酸，使其附着于甲基丙烯酰化明胶表面；

3)将样本组织从保存液中取出，放置于无菌容器中，加入细胞培养基，将样本组织在细胞培养基中切碎，得到组织团块；

4)将切碎后的样本组织-培养基混悬液一并通过无菌滤网；

5)将滤网拦截的组织团块用细胞培养基冲洗至新的无菌容器，加入肿瘤组织样本来源的血清，混匀；

6)加入至步骤2)制备的细胞培养板孔中，放入CO₂培养箱，37℃培养过夜；

7)观察组织团块，若团块吸附于胶面，不会随液体来回漂动，则获得肿瘤类器官。

2.如权利要求1所述的肿瘤类器官的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中组织团块的体积在0.5mm×0.5mm以下。

3.如权利要求1所述的肿瘤类器官的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中滤网的孔径为100μm。

4.如权利要求1所述的肿瘤类器官的制备方法，其特征在于，所述细胞培养基为原代细胞培养基。

5.一种采用权利要求1～4任一项所述制备方法制备的肿瘤类器官。

6.如权利要求5所述的肿瘤类器官在药物筛选中的用途。

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