CN115927188A - 一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒。本发明提供的试剂盒用于内镜来源的标本构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型，该试剂盒至少包括洗涤液、保存液和孵育液，在保存液中加入强缓冲液以保证保存环境的PH值，加入了高浓度的青链霉素和多粘菌素E，抑制细菌污染；将孵育液中加入EGF、bFGF增强了肿瘤块的活性，加入了多粘菌素E的孵育液可以增强对G‑菌的感染；本发明通过对消化液、保存液和孵育液的优化，解决了内镜标本总量小、污染多、成瘤率极低的缺陷，拓宽了消化道肿瘤PDX的建立来源，为肿瘤临床治疗及研究提供一个较理想的临床前实验动物平台，从而为改善患者的总体预后提供有力支持。

Description

一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒，属于生物模型的构建技术领域。

背景技术

肿瘤动物模型是进行肿瘤相关机制和药物筛选研究的重要平台。目前，临床前肿瘤动物模型多采用肿瘤细胞系悬液建模的方法，它具有肿瘤细胞系易获得和实验易重复等优点。但利用肿瘤细胞系建立的肿瘤模型存在诸多缺陷。肿瘤细胞在体外建系的过程脱离了自然的肿瘤微环境，导致其基因发生改变；体外培养过程中选择性压力以及经过消化酶处理，破坏肿瘤组织及细胞异质性与原结构；细胞系所成的肿瘤缺乏原发瘤相关微环境组份。最终导致肿瘤生物学行为和自然属性不可逆性改变，严重阻碍人类对肿瘤机制及治疗应答的研究，它已成为影响肝脏癌症疗效改善的瓶颈，亟待解决。

患者来源移植瘤模型(patient derived xenograft，PDX)是将患者的肿瘤组织接种到免疫缺陷小鼠皮下构建而成。因其部分保留了患者肿瘤组织的病理组织学和基因组学特征，保留肿瘤的特异基因、分子及其组织学异质性、还原原发瘤侵袭转移及药敏等生物学特性，目前成为肿瘤生物学研究的首选模型。然而既往传统的PDX模型建立有赖于手术标本的获得，既往报道成瘤率在10％-50％不等。如患者为晚期肿瘤或转移肿瘤无法进行手术治疗、无法获得手术标本，则不能建立PDX模型，在科研方面失去了宝贵的研究样本，在临床方面使患者失去了利用PDX筛选敏感药物的机会。

发明内容

本发明的目的是：针对目前构建PDX模型存在成瘤率不高等问题与缺陷，本发明提出一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒，通过优化冲洗液、保存液和孵育液，拓宽了PDX的建立来源，为肿瘤临床治疗及研究提供一个较理想的临床前实验动物平台，从而为改善患者的总体预后提供有力支持。

为了实现上述目的，本发明提供了一种组合试剂在制备用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒中的应用，所述组合试剂包括：用于冲洗组织样本的洗涤液，用于保存冲洗后组织样本的保存液，以及用于孵育组织样本的孵育液，其中：

所述洗涤液为每1000mL含有4mg多粘菌素E，100g氨苄青霉素，和50g链霉素的生理盐水；

所述保存液的组成为：磷酸氢二钠16.5mmol/L，磷酸二氢钾1.65mmol/L，枸橼酸钾25mmol/L，枸橼酸钠25mmol/L，腺嘌呤核苷5mmol/L，1,6-二磷酸果糖100g/L，牛血清白蛋白BSA 100g/L，蛋白酶抑制剂Pepstantin 1mg/L，多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L，以及余量的水；

所述孵育液每1000mL的组成为：DMEM培养液500mL，Matrigel胶500mL，牛血清白蛋白BSA 100g/L，表皮生长因子EGF 20μg/L，成纤维细胞生长因子bFGF 20μg/L，多粘菌素E2mg/L，氨苄青霉素50g/L，以及链霉素25g/L；

所述组织样本为内镜活检消化道肿瘤组织样本，所述消化道肿瘤为结肠癌、胃癌或食管癌

本发明还提供了一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒，该试剂盒至少包括：用于冲洗组织样本的洗涤液，用于保存冲洗后组织样本的保存液，以及用于孵育组织样本的孵育液，其中：

所述洗涤液为每1000mL含有4mg多粘菌素E，100g氨苄青霉素，和50g链霉素的生理盐水；

所述保存液的组成为：磷酸氢二钠16.5mmol/L，磷酸二氢钾1.65mmol/L，枸橼酸钾25mmol/L，枸橼酸钠25mmol/L，腺嘌呤核苷5mmol/L，1,6-二磷酸果糖100g/L，牛血清白蛋白(BSA)100g/L，蛋白酶抑制剂(Pepstantin)1mg/L，多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L，以及余量的水；

所述孵育液每1000mL的组成为：DMEM培养液500mL，Matrigel胶500mL，牛血清白蛋白BSA 100g/L，表皮生长因子EGF 20μg/L，成纤维细胞生长因子bFGF 20μg/L，多粘菌素E2mg/L，氨苄青霉素50g/L，以及链霉素25g/L；

所述组织样本为内镜活检消化道肿瘤组织样本，所述消化道肿瘤为结肠癌、胃癌或食管癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供的试剂盒用于内镜来源的标本构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型，该试剂盒至少包括洗涤液、保存液和孵育液，本发明方案中首先优化了冲洗液及保存液，在保存液中加入强缓冲液以保证保存环境的PH值，加入了高浓度的青链霉素和多粘菌素E，抑制细菌污染；其次，优化了孵育液，将孵育液中加入EGF、bFGF增强了肿瘤块的活性，加入了多粘菌素E的孵育液可以增强对G-菌的感染；本发明通过对消化液、保存液和孵育液的优化，解决了内镜标本总量小、污染多、成瘤率极低的缺陷，拓宽了消化道肿瘤PDX的建立来源，具有实际应用价值和推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中6例内镜组织构建的人源结肠癌PDX的HE染色结果。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明实施例中进行PDX构建的生物样本为内镜活检肿瘤组织样本，来自具备活检适应症、无明确禁忌症的患者以内镜下获得的微量肿瘤样本。在内镜下仔细甄别活性肿瘤组织，避免低度恶性的癌前病变或已坏死的肿瘤组织，使用各类内镜下活检钳(通过内镜下操作咬取样本，取样为颗粒状，大小一枚2mm³左右)、各类圈套器(通过内镜下操作以圈套器圈套勒下样本，取样为颗粒状，大小一枚3-10mm³左右)进行取样。本发明实施例中肿瘤组织样本获取为通过内镜下活检取样，具体步骤如下：

(1)内镜下以活检钳取样：选取肿瘤活跃增殖部位，避免正常组织、坏死以及中-高级别瘤变区域，以活检钳取样4-6块。

(2)留取2-3块肿瘤样本进行病理检测。

实施例

本实施例提供了一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒，该试剂盒包括洗涤液A、保存液B和孵育液C，具体配方如下：

洗涤液A：

成分：多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L。

配制方法：以1000ml为例，多粘菌素E 4mg，氨苄青霉素100g，链霉素50g，加入1000mL 0.9％氯化钠溶液常温下搅拌均匀。

保存液B：

成分：磷酸氢二钠16.5mmol/L，磷酸二氢钾1.65mmol/L，枸橼酸钾25mmol/L，枸橼酸钠25mmol/L，腺嘌呤核苷5mmol/L，1,6-二磷酸果糖100g/L，牛血清白蛋白(BSA)100g/L，蛋白酶抑制剂(Pepstantin)1mg/L，多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L。

配制方法：以1000mL为例，向1000mL容器内加入800mL双蒸水，加入枸橼酸钾7.6599g并搅拌均匀；加入枸橼酸钠6.4518g并搅拌均匀；加入磷酸氢二钠2342.3mg并搅拌均匀；加入磷酸二氢钾224.5485mg并搅拌均匀；加入600mg腺嘌呤核苷并搅拌均匀；加入1,6-二磷酸果糖80g并搅拌均匀；加入100g BSA粉末并搅拌均匀；加入1mg蛋白酶抑制剂Pepstantin并搅拌均匀；多粘菌素E 4mg，加入100g氨苄青霉素并搅拌均匀；加入50g链霉素并搅拌均匀。加入双蒸水调整总容量至1000mL，使用滤菌膜过滤后4℃保存。

孵育液C：

成分：DMEM培养液，Matrigel胶，牛血清白蛋白(BSA)100g/L，表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(bFGF)，多粘菌素E 2mg/L，氨苄青霉素50g/L，链霉素25g/L。

配制方法：以1000mL孵育液为例，向500mL DMEM培养液中加入多粘菌素E 2mg，氨苄青霉素50g，链霉素25g，EGF 20μg，bFGF 20μg，4℃搅拌混匀后保存，使用时1:1加入500mLMatrigel胶制成1000mL孵育液。

采用上述试剂盒建立内镜活检来源的结肠癌PDX，具体包括如下步骤：

(1)取样后样本处理：

内镜下活检取样的样本以50ml洗涤液(A)冲洗3次以上，再放入50ml加有双抗青链霉素混合液、生长因子的DMEM保存液(B)中，可在4摄氏度下最多保存4小时，需在有效时间内种植。

(2)肿瘤种植：

转移到实验室的超净操作台。在实验室超净台下使用洗涤液(A)再次冲洗3次，将组织标本分割为1×1×1mm³的小块，选取3块以上1×1×1mm³的活性组织混入孵育液(C)，将组织含无菌孵育液的试管放入冰中迅速转移到超净台内，备用。在BALC/c-nu小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒。用20号套管针将组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将少量孵育液及组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血。SPF级环境下常规饲养60天，完成建立PDX模型。移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V＝1/2(LW2)计算移植瘤平均体积。移植约5周后，小鼠肉眼可见局部形成肿瘤结节，解剖小鼠，大体移植瘤组织呈乳白色，血供丰富，中央可见少量坏死。

(3)验证

待肿瘤长至1.5cm³以上时杀鼠取瘤，获取部分样本进行石蜡包埋+HE染色+免疫组化，与之前获取的患者肿瘤样本进行肿瘤性质及分子表型的比对。基于6例内镜组织构建的人源结肠癌PDX，HE染色提示组织细胞具有显著异型性，CEA(+)，pan-CK(+)，Vim(-)，如图1所示。

基于上述方法，29例患者成瘤统计及一般情况基线数据如表1所示：

表1

既往文献报道实体瘤来源手术样本依据肿瘤瘤种不同，成瘤率约在20-50％之间，以内镜来源活检样本采用本发明的试剂盒构建PDX，结肠癌(腺癌)成瘤率约50％，胃癌(腺癌)约20％，食管癌(鳞状细胞癌)约10％。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种组合试剂在制备用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒中的应用，其特征在于，所述组合试剂包括：用于冲洗组织样本的洗涤液，用于保存冲洗后组织样本的保存液，以及用于孵育组织样本的孵育液，其中：

所述洗涤液为每1000mL含有4mg多粘菌素E，100g氨苄青霉素，和50g链霉素的生理盐水；

所述保存液的组成为：磷酸氢二钠16.5mmol/L，磷酸二氢钾1.65mmol/L，枸橼酸钾25mmol/L，枸橼酸钠25mmol/L，腺嘌呤核苷5mmol/L，1,6-二磷酸果糖100g/L，牛血清白蛋白BSA 100g/L，蛋白酶抑制剂Pepstantin 1mg/L，多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L，以及余量的水；

所述孵育液每1000mL的组成为：DMEM培养液500mL，Matrigel胶500mL，牛血清白蛋白BSA 100g/L，表皮生长因子EGF 20μg/L，成纤维细胞生长因子bFGF 20μg/L，多粘菌素E2mg/L，氨苄青霉素50g/L，以及链霉素25g/L；

所述组织样本为内镜活检消化道肿瘤组织样本，所述消化道肿瘤为结肠癌、胃癌或食管癌。

2.一种用于构建消化道肿瘤人源肿瘤异种移植动物模型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒至少包括：用于冲洗组织样本的洗涤液，用于保存冲洗后组织样本的保存液，以及用于孵育组织样本的孵育液，其中：

所述洗涤液为每1000mL含有4mg多粘菌素E，100g氨苄青霉素，和50g链霉素的生理盐水；

所述保存液的组成为：磷酸氢二钠16.5mmol/L，磷酸二氢钾1.65mmol/L，枸橼酸钾25mmol/L，枸橼酸钠25mmol/L，腺嘌呤核苷5mmol/L，1,6-二磷酸果糖100g/L，牛血清白蛋白BSA 100g/L，蛋白酶抑制剂Pepstantin 1mg/L，多粘菌素E 4mg/L，氨苄青霉素100g/L，链霉素50g/L，以及余量的水；

所述孵育液每1000mL的组成为：DMEM培养液500mL，Matrigel胶500mL，牛血清白蛋白BSA 100g/L，表皮生长因子EGF 20μg/L，成纤维细胞生长因子bFGF 20μg/L，多粘菌素E2mg/L，氨苄青霉素50g/L，以及链霉素25g/L；

所述组织样本为内镜活检消化道肿瘤组织样本，所述消化道肿瘤为结肠癌、胃癌或食管癌。

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