KR102400168B1 - 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 종양 조직의 체외 배양 효율성을 향상시킬 수 있으며, 암세포의 고유한 특성을 유지하면서 소량의 샘플로 다수의 종양 모사체를 제조할 수 있어 환자 ??춤형 치료제 발굴에 활용될 수 있는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법{an ex vivo drug testing platform for recapitulating in vivo tumor microenvironment and method of manufacturing that}

본 발명은 종양의 약물 효능을 평가할 수 있는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법에 관한 것이다.

인류 주요 사망 원인 중 하나인 암을 치료하기 위하여, 현재까지 다양한 종류의 종양 모델이 개발되어져 왔다. 종양 모델은 주로 암의 성장 방법과 과정에 대한 정보를 제공하고 특히 공격성 획득 또는 치료 내성 획득 메커니즘에 대한 관찰 수단을 제공함으로써, 신약 개발 및 새로운 치료 방법 고안에 기여 한다.

수많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 암의 다양성과 이질성은 여전히 이해하기 어려운 분야로 이러한 암의 특성은 최적의 항암제 발굴과 치료에 걸림돌이 되고 있다. 또한 현재 암 치료제들은 대부분 화학적 합성에 의해서 만들어진 물질이며, 특히 세포 독성 항암제의 경우 정상 세포에까지 독성을 유발하여 치료과정에서 여러 가지 고통 및 부작용을 일으킬 수 있다. 이때 나타나는 극심한 부작용은 환자의 면역력 저하 및 고통스런 자각증상으로 인해 환자 삶의 질에 부정적인 영향을 끼친다.

기존의 암세포 배양을 통한 항암제 시험 방법은 환자 유래 암세포를 분리하여 세포 배양 플레이트에서 2차원으로 배양된 세포에 항암제를 처리하였다. 하지만 2차원 상에서 자란 암세포와는 다르게 3차원 상에서 자란 암세포는 조금 더 생체 내와 유사한 무리(cluster)를 형성하며, 전이, 혈관신생 등에 관여하는 핵심 유전자에 대한 발현도 2차원 배양과는 차이를 보인다.

암세포의 3차원 배양을 위해 주로 사용 되고 있는 재료로는 마트리젤(matrigel), 콜라젠I(type I collagen), 피브로넥틴(fibronectin), 젤라틴(gelatin) 등이 있으며, 콜라젠을 이용하여 암세포를 배양하는 방법과 관련하여 대한민국 등록특허 제11674468호가 개시되어 있다. 또한 알긴산(alginic acid)과 같이 세포 독성을 나타내지 않는 생체 적합 재료들도 단독 또는 혼합하여 사용되어지고 있다. 하지만 이러한 단일 성분 혹은 인위적인 재료의 조합으로 이루어진 3차원 세포 배양 환경은 실제 조직의 세포외기질(ECM) 성분과 구조를 모방하는데 한계가 있다.

Patient Derived Tumor Xenograft (PDX) 모델은 환자의 종양으로부터 조직 또는 세포를 취하여 면역 결핍 마우스 피하에 이식하여 배양 시킨 것을 의미한다. 하지만 환자 유래 암세포 또는 암조직을 마우스에 이식했을 때 생착 성공률은 10-20 내외로 굉장히 낮은편이며, 암이 자라는 시간도 짧게는 2개월에서 길게는 6개월까지 걸린다는 한계가 있다. 또한 PDX 모델을 구축하고 유지하는데 드는 비용도 매우 비싸며, 면역 항암제와 같은 약물 시험에는 사용할 수 없다는 취약점을 가진다. 최근 전 세계적으로 동물 실험이 금지되고 있는 시점에서 PDX 모델을 대체하는 새로운 ex vivo 종양 모델의 개발이 시급한 상황이라고 할 수 있다.

대한민국 등록특허 제11674468호(2016.11.10.공고)

본 발명은 전술한 문제점을 해결하여 조직 수준의 체외 종양 모사체를 제조하여 약물 효능을 평가할 수 있는 약물 시험용 플렛폼을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

상기 과제의 해결 수단으로서, 포유류로부터 추출된 종양조직을 세절하는 단계, 하이드로젤과 세절된 종양조직을 혼합하여 바이오 잉크를 생성하는 단계 및 바이오 잉크를 이용하여 프린팅하는 단계를 포함하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법이 제공될 수 있다.

한편, 종양조직을 세절하는 단계는 인간으로부터 채취된 종양조직 또는 인간으로부터 채취된 종양조직을 쥐의 체내에서 배양하여 채취될 수 있다.

한편, 하이드로젤은 종양이 발병한 기관에 대응하는 기관조직으로부터 유래된 탈세포화 물질을 포함할 수 있다.

한편, 바이오 잉크를 생성하는 단계는, 탈세포화 물질을 포함하는 하이드로젤을 세절된 종양조직이 포함된 미디어와 1:1의 부피비로 혼합하여 수행될 수 있다.

한편, 프린팅하는 단계는 플레이트 상에 3D 프린팅하여 수행될 수 있다.

한편, 프린팅하는 단계는, 바이오잉크의 겔화를 방지하면서 프린팅될 수 있도록 프린터 헤드의 온도를 0℃ 내지 10℃로 유지하며, 플레이트의 온도를 0℃ 내지 15℃로 유지한 상태에서 수행될 수 있다.

한편, 프린팅하는 단계는 5KPa 내지 40KPa의 압력으로 프린팅될 수 있다.

한편, 바이오 잉크가 프린팅된 플레이트를 소정온도로 가열하여 겔화시키는 겔화 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 소정온도는 37℃이며, 가열시간은 30분 내지 1시간일 수 있다.

한편, 겔화 단계 이후 약물 시험 플랫폼을 소정기간동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다.

한편, 종양조직은 위암조직으로부터 추출된 조직이며, 기관은 위일 수 있다.

추가로, 포유류로부터 추출된 종양조직을 세절하는 단계, 하이드로젤과 세절된 종양조직과 혼합하여 바이오 잉크를 생성하는 단계 및 세절된 종양조직과 탈세포화 단계에서 생성된 탈세포화 물질을 배합하여 바이오 잉크를 생성하는 단계 및 바이오 잉크를 이용하여 프린팅하여 생성되는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼이 제공될 수 있다.

한편, 하이드로젤은 종양이 발병한 기관에 대응하는 기관조직으로부터 유래된 탈세포화 물질을 포함할 수 있다.

한편, 바이오 잉크는 프린팅 이후 소정온도로 가열하여 겔화될 수 있다.

본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법은 종양 조직의 체외 배양 효율성을 향상시킬 수 있으며, 암세포의 고유한 특성을 유지하면서 소량의 샘플로 다수의 종양 모사체를 제조할 수 있어 환자 ??춤형 치료제 발굴에 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법에 관한 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법에 관한 순서도이다.
도 3는 종양조직을 세절하는 단계의 수행 전후의 조직을 촬영한 사진이다.
도 4은 프린팅 단계의 개념을 도시한 도면이다.
도 5은 프린팅 단계시 프린팅 압력에 따른 바이오 잉크의 프린팅 상태를 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명에 따라 환자 1에서 채취된 종양조직으로 제조된 약물시험 플랫폼에서의 세포 증식률 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따라 환자 2에서 채취된 종양조직로 제조된 약물시험 플랫폼에서의 세포 증식률 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 약물시험 플랫폼에서의 암세포가 배양된 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 약물시험 플랫폼에서의 다양한 세포가 배양된 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 약물시험 플랫폼에서의 다양한 세포가 배양되어 공존하는 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 약물시험 플랫폼에서 배양된 조직에 대한 조직 염색 결과를 도시한 도면이다.
도 12a 및 도 12b는 약물시험 플랫폼에서 배양된 조직을 활용하여 항암제 독성평가를 수행한 결과를 도시한 그래프이다.

이하, 본 발명의 실시 예에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법에 대하여, 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그리고 이하의 실시예의 설명에서 각각의 구성요소의 명칭은 당업계에서 다른 명칭으로 호칭될 수 있다. 그러나 이들의 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 변형된 실시예를 채용하더라도 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 각각의 구성요소에 부가된 부호는 설명의 편의를 위하여 기재된다. 그러나 이들 부호가 기재된 도면상의 도시 내용이 각각의 구성요소를 도면내의 범위로 한정하지 않는다. 마찬가지로 도면상의 구성을 일부 변형한 실시예가 채용되더라도 기능적 유사성 및 동일성이 있다면 균등한 구성으로 볼 수 있다. 또한 당해 기술 분야의 일반적인 기술자 수준에 비추어 보아, 당연히 포함되어야 할 구성요소로 인정되는 경우, 이에 대하여는 설명을 생략한다.

이하에서는 도 1 내지 도 5를 참조하여 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

도 1은 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법에 관한 개념도이다.

도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법은 포유류의 조직에서 발병한 종양조직을 채취한 뒤 체내 환경을 모사한 미세 환경에서 배양하여 그 양을 증폭시킬 수 있도록 구성된다.

본 발명에 따라 포유류에서 채취한 종양 조직을 세절하고, 채취한 종양 조직이 발병했던 기관의 조직을 탈세포화 하여 종양조직과 함께 프린팅하고 배양하여 약물 시험 플랫폼을 제조할 수 있게 된다. 따라서 신체 내에서 종양세포가 증식하는 환경에 가장 밀접한 조직 특이적인 환경을 조성하여 배향함으로써 종양세포 고유의 특성을 유지한 상태로 양을 증폭시킬 수 있게 된다.

도 2는 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법에 관한 순서도이다.

도 3은 종양조직을 세절하는 단계의 수행 전후의 조직을 촬영한 사진이며, 도 4는 프린팅 단계의 개념을 도시한 도면이고, 도 5는 프린팅 단계시 프린팅 압력에 따른 바이오 잉크의 프린팅 상태를 촬영한 사진이다.

도 2를 참조하면, 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법은 종양조직을 세절하는 단계(S100), 바이오 잉크를 생성하는 단계(S200), 프린팅하는 단계(S300), 겔화 단계(S400) 및 배양하는 단계(S500)를 포함하여 구성될 수 있다.

종양조직을 세절하는 단계(S100)는 포유류에서 종양 조직을 채취하고 세절하는 단계에 해당한다. 종양조직의 채취는 인체에서 채취된 종양 조직이거나, 인체에서 채취한 종양을 면역 결핍 마우스 피하에 배양한 이후 채취하여 이루어질 수 있다.

도 3을 참조하면, 채취된 종양조직(1)은 분쇄하여 세절될 수 있으며, 종양조직(1)의 적어도 일부가 세포단위로 유지될 수 있는 크기로 세절될 수 있다.

바이오 잉크를 생성하는 단계(S200)는 세절된 종양조직과 탈세포화 물질을 혼합하여 프린팅에 이용되는 바이오 잉크를 제조하는 단계에 해당한다.

체내에서 채쥐된 종양조직은 그 자체로 체외에서 장시간 배양이 어려우므로 배양 지지체와 함께 배양하게 된다. 일 예로서, 세절된 종양조직을 3차원적으로 장기간 배양하기 위한 지지체로서 마트리젤, 콜라젠, 피브로넥틴, 젤라틴, 알지네이트 등과같은 생체적합성 하이드로젤이 사용될 수 있다. 일 예로서, 돼지 위 조직으로부터 유래된 탈세포화 세포외기질 성분을 포함하는 하이드로젤이 사용될 수 있다. 탈세포화 물질은 기관조직을 세절한 뒤 세포 및 세포외기질에 포함되어 있는 다양한 단백질, 당단백질 및 클리코사미노글리칸(glycosaminoglyca, GAG) 등의 손상을 최소화 하면서 조직에 포함된 세포의 DNA를 제거하여 제조될 수 있다.

바이오 잉크를 생성하는 단계(S200)는 세절된 종양조직을 미디어에 혼합한 물질과 탈세포화된 물질을 포함하는 2 중량%의 하이드로젤이 1:1의 부피비로 혼합하여 제조될 수 있다.

제조된 바이오 잉크는 최종적으로 1중량% 하이드로젤을 포함하고, 10% 중량 종양조직을 포함할 수 있다. 바이오 잉크의 혼합은 하이드로젤의 겔화를 방지할 수 있도록 0℃ 내지 10℃ 의 온도를 유지하면서 수행될 수 있다.

프린팅하는 단계(S300)는 종양세포가 조직 단위를 모사하여 배양될 수 있도록 플레이트 상에 바이오 잉크를 3D 프린팅하는 단계에 해당한다. 프린팅하는 단계(S300)는 일예로서 18G 노즐을 이용하여 수행될 수 있으며, 조직 단위를 모사할 수 있도록 50μL의 이상이 프린팅될 수 있다. 프린팅하는 단계(S300)는 프린팅 도중 겔화를 방지할 수 있도록 프린터 헤드의 온도를 0℃ 내지 10℃ 유지하면서 수행될 수 있다. 이때 바이오 잉크가 프린팅되는 플레이트 또한 프린팅시 급속한 겔화를 방지할 수 있도록 0℃ 내지 15℃를 유지될 수 있다.

도 4를 참조하면, 프린팅하는 단계(S300)는 복수의 웰에 바이오 잉크를 프린팅하여 수행될 수 있다. 일 예로서, 플레이트(30) 상에서 배열되어 있는 복수의 웰에 프린팅하기 위하여 ‘S’또는 ‘ㄹ’경로를 따라 3D 프린터의 노즐(20)을 이동시켜 각각의 웰에 순차적으로 바이오 잉크(100)를 분사하여 수행될 수 있다.

프린팅하는 단계(S300)는 프린팅된 시편의 부피 및 세포의 농도가 조직단위를 모사하기에 적합할 수 있도록 적절한 압력으로 분사될 수 있다. 도 5를 참조하면 다양한 압력 조건에서 웰 상에 프린팅된 시편(10)이 도시되어 있으며, 25KPa(도 5(a)), 35KPa(도 5(b)) 및 45KPa(도 5(c))로 프린팅된 상태가 도시되어 있다. 프린팅 압력이 낮은 경우 시편의 외부 접촉 면적이 작아지게 되어 배양시 효율이 낮아지며, 프린팅 압력이 큰 경우 조직 단위와의 유사성이 떨어지게 되므로 5KPa 내지 40KPa 의 압력으로 프린팅되는 것이 바람직하다.

겔화 단계(S400)는 프린팅된 시편에서 배양하기 위한 준비를 하는 단계에 해당한다. 겔화 단계(S400)는 하이드로겔의 특징을 이용하여 프린팅 이후 소정시간 동안 가열하여 수행될 수 있다. 일 예로 겔화 단계(S400)는 포유류의 체온과 유사한 37℃로 가열하여 유지할 수 있으며, 시편의 내부까지 경화될 수 있도록 30분 내지 1시간 동안 수행될 수 있다.

배양하는 단계(S500)는 배양 배지를 추가하여 시편 내에서 세포들을 증식시키켜 약물시험 플랫폼을 제조하는 단계에 해당한다. 배지는 소정기간동안 교체하여 지속적으로 세포들의 증식을 수행할 수 있으며, 일 예로 2일에 1회씩 교체시켜 수행될 수 있다.

이하에서는 도 6 내지 도 12b를 참조하여 본 발명에 따라 생성된 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

이하의 도 6 및 도 7에서는, 서로 다른 환자에게서 채취한 종양조직인 샘플 1 및 샘플 2를 이용하여 각각 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼을 제조하여 세포 증식률에 대하여 설명하도록 한다.

도 6은 본 발명에 따라 환자 1로부터 채취된 종양조직 샘플 1로 제조된 약물시험 플랫폼에서의 세포 증식률 결과를 도시한 그래프이며, 도 7은 본 발명에 따라 환자 2로부터 채취된 종양조직 샘플 2로 제조된 약물시험 플랫폼에서의 세포 증식률 결과를 도시한 그래프이다

도 6 및 도 7을 참조하면, 환자 1 샘플은 인체로부터 채취한 종양조직을 쥐의 피하에서 배양한 조직(PDX 조직)이며, PDX 조직을 탈세포화 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 내 10중량%의 비율로 혼합하여 프린팅한 후 배양한 것(10wt%라고 표기)과 하이드로젤 내에 혼합하지 않고 PDX 조직 덩어리(100wt%, positive control)를 체외에서 배양한 조직에 대한 세포 증식률의 결과를 비교할 수 있다.

본 발명에 따라 환자 1 샘플 및 환자 2 샘플로부터 제조된 바이오 잉크를 프린팅하여 체외에서 배양하였을 때 세포 증식률은 14일차 배양일까지 꾸준하게 증가되는 것으로 평가되었으며, Calcein-AM 염색 결과 체외 배양 시작 이후 28일까지도 세포 생존률에 변화가 없음을 확인하여 프린팅 된 PDX 조직의 장기간 체외 배양이 가능함이 확인되었다. 반면, PDX 조직 자체를 배양했을 때(100wt%) 하이드로젤과 같은 지지체 내에 혼합하지 않고 배양했을 때 증식률이 지속적으로 감소하는 경향을 나타내는데, 100wt%의 조직은 체외 배양에서 조직이 미디아에 풀어지는 문제로 체외에서 장기간 배양이 어려움을 확인하였다.

이하에서는 도 8을 참조하여 세포의 생존률에 대하여 상세히 설명하도록 한다.

도 8은 약물시험 플랫폼에서의 암세포가 배양된 결과를 나타낸 도면이다.

도 8을 참조하면, 배양이후 생존률을 평가하기 위하여 1일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일에서의 세포 생존률을 각각 측정하였다. 생존률을 평가하기 위하여 배양 배지를 제거한 이후 소정온도의 1X PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척한 뒤 live/dead assay 용액이 포함된 1X PBS 500 μL 를 추가하여 시편이 완전히 잠긴 상태로 만들었다. 이후 1시간 동안 37°C 배양기에서 반응 시킨 후, 1X PBS로 2회 세척한 이후 형광현미경으로 관찰하였다. 환자 1 로부터 유래된 종양조직을 본 발명에 따라 프린팅하고 배양한 경우 포도 모양의 형태로 aggregation이 되어 있는 암세포가 확인되었으며, 환자 2로부터 유래된 종양조직을 본 발명에 따라 프린팅하여 배양한 경우 구 형태의 aggregation 된 암세포가 확인되었다. 또한 배양 이후 28일차에도 암세포의 형태를 확인할 수 있어 암세포가 장기간 체외에서 배양할 수 있음이 확인되었다.

이하에서는 도 9 및 도 10을 참조하여 본 발명에 따른 약물 시험 플랫폼에서 배양된 시편의 조직학적 특성의 평가에 대하여 설명하도록 한다.

도 9은 약물시험 플랫폼에서의 다양한 세포가 배양된 결과를 나타낸 도면이며, 도 10은 약물시험 플랫폼에서의 다양한 세포가 배양되어 공존하는 결과를 나타낸 도면이다.

도 9를 참조하면, 본 발명에 따른 약물 시험 플랫폼에서 환자 1 및 환자 2 샘플을 배양 후 7일 및 14일차에 형광현미경으로 촬영된 영상에서 서로 다른 morphology(형태)를 가지는 2가지 이상의 세포가 함께 존재하는 것으로 확인되었다. 또한 도 10을 참조하면, 시편의 배양이후 7일차에서 형광현미경으로 시편을 촬영하였으며, 3가지의 서로 다른 형태의 세포가 동시에 존재함을 확인하였다. 결국 본 발명에 따라 3차원 바이오 프린팅을 수행하여 생성된 시편의 경우 단일 세포 프린팅에 그치는 것이 아니라 조직 수준의 하나의 구조체를 인쇄하고 배양시켜 조직 모사의 유사도를 높일 수 있게 된다.

도 11은 약물시험 플랫폼에서 배양된 조직에 대한 조직 염색 결과를 도시한 도면이다.

도 11은 PDX 조직을 탈세포화 세포외기질을 포함하는 하이드로젤 내 10중량%의 비율로 혼합하여 프린팅한 후 배양한 것(10wt%라고 표기)과 하이드로젤 내에 혼합하지 않고 PDX 조직 덩어리(100wt%라 표기했고, positive control)를 체외에서 배양된 조직에 대한 조직 염색 결과를 도시한 도면이다. 도 11을 참조하면, 환자 1 및 환자 2 조직 샘플에 대한 조직 염색(H&E) 결과이다. 환자 1 조직은 diffuse type gastric cancer의 특징인 반지모양(signet ring)의 세포가 관찰되었으며(Native), 10중량%로 프린팅 된 PDX 조직을 체외에서 배양하였을 때 반지 모양의 특징이 잘 유지됨을 확인하였다. 환자 2 조직은 intestinal type gastric cancer의 특징인 관상 형태가 관찰되었으며(Native), 10중량%로 프린팅 된 PDX 조직을 체외에서 배양하였을 때 관상 형태의 특징이 잘 유지됨을 확인하였다. PDX 조직을 하이드로젤과 같은 지지체 내에 혼합하지 않고 배양했을 때 증식률이 지속적으로 감소한 결과(도6 내지 7 참고)와 마찬가지로 조직 염색 결과에서도 100wt%의 조직은 체외 배양에서 조직이 미디아에 풀어지는 문제로 인해 조직 특유의 형태학적 특성 유지가 어려움을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 프린팅 된 PDX 조직의 체외 장기 배양 조건에서 원래 종양 조직의 특성을 그대로 잘 유지함을 보여주었다.

이하에서는 도 12a 및 도 12b를 참조하여 본 발명에 따른 약물 시험 플랫폼을 이용한 항암제 반응성 평가에 대하여 설명한다.

도 12a 및 도 12b는 약물시험 플랫폼에서 배양된 조직을 활용하여 항암제 독성평가를 수행한 결과를 도시한 그래프이다.

도 12a 및 도 12b를 참조하면, 환자 1 샘플 및 환자 2 샘플에서 10 중량% PDX 시편의 항암제 독성 평가를 실시하였으며, 항암제는 임상에서 위암 치료를 위해 사용 중인 5-FU(fluorouracil) 및 docetaxel를 사용하였다.조직마다 항암제에 대한 약물 저항성이 다르게 나타나는 이러한 결과는 환자 특이적 항암제 시험에 대한 가능성을 보여주었다. 한편, 5-FU 단독 처리 농도는 0.01, 0.1, 1, 10, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μM이며, docetaxel 단독 처리 농도는 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μM이다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼 및 그 제조방법은 종양 조직의 체외 배양 효율성을 향상시킬 수 있으며, 암세포의 고유한 특성을 유지하면서 소량의 샘플로 다수의 종양 모사체를 제조할 수 있어 환자 ??춤형 치료제 발굴에 활용될 수 있다.

1: 종양조직
10: 시편
20: 노즐
30: 플레이트
100: 바이오 잉크

Claims (14)

1. 포유류로부터 추출된 종양조직을 세절하는 단계;
   탈세포화 물질을 포함하는 2 중량% 의 하이드로젤과 세절된 상기 종양조직이 포함된 미디어를 1:1 부피로 혼합하여 1 중량%의 상기 하이드로젤 및 10 중량%의 상기 종양조직을 포함하는 바이오 잉크를 생성하는 단계; 및
   상기 바이오 잉크를 이용하여 조직 단위와 유사한 구조체를 생성할 수 있도록 상기 바이오 잉크를 5KPa 내지 40KPa 압력으로 3D 프린팅하는 단계를 포함하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 종양조직을 세절하는 단계는, 인간으로부터 채취된 종양조직 또는 인간으로부터 채취된 종양조직을 쥐의 체내에서 배양하여 채취된 조직을 세절하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
3. 제2 항에 있어서,
   상기 탈세포화 물질은 상기 종양이 발병한 기관에 대응하는 기관조직으로부터 유래하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제3 항에 있어서,
   상기 프린팅하는 단계는,
   상기 바이오잉크의 겔화를 방지하면서 프린팅될 수 있도록 프린터 헤드의 온도를 0℃ 내지 10℃로 유지하며,
   플레이트의 온도를 0℃ 내지 15℃로 유지한 상태에서 수행되는 것을 특징으로 하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
7. 삭제
8. 제6 항에 있어서,
   상기 바이오 잉크가 프린팅된 상기 플레이트를 소정온도로 가열하여 겔화시키는 겔화 단계를 더 포함하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
9. 제8 항에 있어서,
   상기 소정온도는 37℃이며,
   가열시간은 30분 내지 1시간인 것을 특징으로 하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
10. 제9 항에 있어서,
    상기 겔화 단계 이후 상기 약물 시험 플랫폼을 소정기간동안 배양하는 단계를 포함하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
11. 제1 항에 있어서,
    상기 종양조직은 위암조직으로부터 추출된 조직이며,
    기관은 위인 것을 특징으로 하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼의 제조방법.
12. 포유류로부터 추출된 종양조직을 세절하는 단계;
    탈세포화 물질을 포함하는 2 중량% 의 하이드로젤과 세절된 종양조직이 포함된 미디어를 1:1의 부피비로 혼합하여 1 중량% 의 상기 하이드로젤 및 10 중량% 의 상기 종양조직을 포함하는 바이오 잉크를 생성하는 단계; 및
    상기 바이오 잉크를 이용하여 조직 단위와 유사한 구조체를 생성할 수 있도록 상기 바이오 잉크를 5KPa 내지 40KPa 압력으로 3D 프린팅하는 단계를 수행하여 생성되는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼.
13. 제12 항에 있어서,
    상기 탈세포화 물질은 상기 종양이 발명한 기관에 대응하는 기관조직으로부터 유래된 탈세포화 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼.
14. 제13 항에 있어서,
    상기 바이오 잉크는 프린팅 이후 소정온도로 가열하여 겔화된 것을 특징으로 하는 생체 내 종양 미세 환경을 재현하는 생체 외 종양 약물 시험 플랫폼.

Images