RU2787378C1 - Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи - Google Patents
Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи Download PDFInfo
- Publication number
- RU2787378C1 RU2787378C1 RU2021138711A RU2021138711A RU2787378C1 RU 2787378 C1 RU2787378 C1 RU 2787378C1 RU 2021138711 A RU2021138711 A RU 2021138711A RU 2021138711 A RU2021138711 A RU 2021138711A RU 2787378 C1 RU2787378 C1 RU 2787378C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- solution
- tissue
- organoids
- head
- cells
- Prior art date
Links
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 title claims abstract description 71
- 210000002220 Organoids Anatomy 0.000 title claims abstract description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 3
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 239000002609 media Substances 0.000 claims abstract description 16
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 claims abstract description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims abstract description 6
- 102000020504 Collagenase family Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108060005980 Collagenase family Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 51
- 210000003463 Organelles Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth media Substances 0.000 claims description 15
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 7
- 229950003499 FIBRIN Drugs 0.000 claims description 6
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001857 anti-mycotic Effects 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 claims description 6
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 6
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 claims description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 102000007374 Smad Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010007945 Smad Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 4
- 230000001070 adhesive Effects 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims description 4
- 229960004494 Calcium Gluconate Drugs 0.000 claims description 3
- NEEHYRZPVYRGPP-IYEMJOQQSA-L Calcium gluconate Chemical compound [Ca+2].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O NEEHYRZPVYRGPP-IYEMJOQQSA-L 0.000 claims description 3
- 229960002743 Glutamine Drugs 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 3
- 239000004227 calcium gluconate Substances 0.000 claims description 3
- 235000013927 calcium gluconate Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims description 3
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 claims description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 25
- 230000001413 cellular Effects 0.000 abstract description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000006163 transport media Substances 0.000 abstract description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 210000003128 Head Anatomy 0.000 description 17
- 210000002744 Extracellular Matrix Anatomy 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 5
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 101700078950 CD44 Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000018331 Keratin-17 Human genes 0.000 description 4
- 108010066325 Keratin-17 Proteins 0.000 description 4
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 4
- 206010041823 Squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 102100003735 CD44 Human genes 0.000 description 3
- 229940110715 ENZYMES FOR TREATMENT OF WOUNDS AND ULCERS Drugs 0.000 description 3
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229940020899 hematological Enzymes Drugs 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cells Anatomy 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 Cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 2
- 210000000981 Epithelium Anatomy 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N HEPES Chemical class OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastasis Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 210000003205 Muscles Anatomy 0.000 description 2
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 229920001451 Polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000003079 Salivary Glands Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 Stomach Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 2
- 230000002327 eosinophilic Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cells Anatomy 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 2
- 230000000771 oncological Effects 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture media Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N (6aS,11bR)-7,11b-dihydro-6H-indeno[2,1-c]chromene-3,4,6a,9,10-pentol;2',4',5',7'-tetrabromo-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2.O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C(O)C(Br)=C1OC1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 KGAGDPCLSPRTNF-RGCQKQKKSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 210000002469 Basement Membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000000013 Bile Ducts Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 210000002808 Connective Tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003074 Dental Pulp Anatomy 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000003038 Endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003238 Esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 210000000936 Intestines Anatomy 0.000 description 1
- 210000000554 Iris Anatomy 0.000 description 1
- 102000012809 Keratin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108010065070 Keratin-13 Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 210000000867 Larynx Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 210000004293 Mammary Glands, Human Anatomy 0.000 description 1
- 210000004379 Membranes Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 Ovary Anatomy 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 210000002307 Prostate Anatomy 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 description 1
- 208000004841 Squamous Cell Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 210000002536 Stromal Cells Anatomy 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 1
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structures Anatomy 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 201000011231 colorectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940014041 hyaluronate Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 1
- 102000008872 noggin protein Human genes 0.000 description 1
- 108091005284 noggin protein Proteins 0.000 description 1
- 201000002740 oral squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229920003250 poly(2-hydroxyethyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011528 polyamide (building material) Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- -1 polytetramethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M sodium 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonate Chemical compound [Na+].OCCN1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 RDZTWEVXRGYCFV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000004642 transportation engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, клеточной биологии и медицине, в частности к способу получения трёхмерных клеточных органоидов из плоскоклеточных опухолей органов головы и шеи. Для осуществления указанного способа первичный материал транспортируют из оперативного блока в культуральную лабораторию в срок не более 4 часов при хранении материала при +4°С в транспортной среде. Далее ткань трижды промывают в растворе ЭДТА, затем аналогичным образом в растворе антибиотика-антимикотика, после чего трижды отмывают от реагентов в буферном растворе. Опухолевую ткань максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области. Для ферментативной диссоциации ткани в течение 60-90 минут при 37°С в условиях постоянного перемешивания на орбитальном шейкере с минимальной скоростью 50 об/мин используют рекомбинантные коллагеназы или рекомбинантный трипсин, либо их комбинацию, дополнительно используют рекомбинантную ДНКазу. Объем диссоциирующего раствора превышает объем материала в 5 раз. Суспензию изолированных из ткани клеток разбавляют буферным раствором в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм. В качестве культуральной среды используют DMEM/F12, либо 199 среду, необходимую для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода. В культуральную среду вносят 2% v/v аутогенной плазмы, полученной от донора опухолевой ткани. После культивирования в течение нескольких суток сформировавшиеся органоиды могут быть извлечены для исследования либо перенесены в более вязкий матрикс на основе культуральной среды, содержащей 25% v/v аутогенной плазмы. Настоящее изобретение позволяет получить органоиды из опухолевой ткани органов головы и шеи. 3 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в области биомедицинских исследований и разработок для поиска новых терапевтических подходов к лечению социально значимых заболеваний. Изобретение позволяет получить трехмерные клеточные конструкты (органоиды) из плоскоклеточных опухолей органов головы и шеи с использованием гелированной аутоплазмы и без применения культуральных добавок ксеногенного происхождения.
Уровень техники
Предпосылки создания изобретения
Согласно докладу Всемирной организации здравоохранения, в 2018 году онкологические заболевания были диагностированы у 18,1 млн человек и стали причиной смерти 9,6 млн больных; это пугающе огромные цифры, при этом прогнозы выглядят крайне неутешительно: предполагается, что к 2040 году данные показатели могут практически удвоиться [1].
В последние десятилетия многое было предпринято для повышения эффективности раннего выявления онкологических заболеваний и поиска новых терапевтических подходов, однако лишь небольшая часть разрабатываемых методов доказывает свою безопасность и эффективность при прохождении клинических испытаний [2]. Одним из наиболее сложных препятствий на пути в клиническую практику можно по праву считать малую доступность релевантных доклинических моделей, которые бы в полной мере отражали всю сложность организации опухолевой ткани человека. Самая распространенная и недорогая in vitro модель, представляющая собой 2D опухолевые клеточные линии, является чрезмерно упрощенной за счет невозможности воспроизведения исходной гетерогенности опухолевой ткани и ее микроокружения [3], а ведь взаимодействие клеточного (стволовых клеток опухоли, эпителия, эндотелия, инфильтрирующих опухоль иммунных клеток) и неклеточного (внеклеточного матрикса и биологически активных веществ) компонентов во многом определяет прогрессирование заболевания и, соответственно, эффективность терапевтического воздействия [4]. Значительно более сложно устроенная in vivo модель ксенографтов предполагает трансплантацию фрагментов опухолевой ткани иммунодефицитным животным; такая модель достаточно точно отражает гетерогенность опухолевой ткани и даже позволяет изучать процесс метастазирования, однако сложна и дорога в исполнении, обладает низкой воспроизводимостью и исключает возможность исследования вклада иммунного компонента [5]. Одной из наиболее перспективных на сегодняшний день является клеточная 3D модель, которая объединяет преимущества описанных выше моделей: доступность, возможность стандартизации, релевантность, соответствие концепции
персонализированной медицины. Трехмерная клеточная культура по-прежнему не в полной мере способна воспроизвести условия микроокружения опухоли и достаточно ресурсозатратна, однако постепенное развитие биотехнологии в конечном итоге должно привести к повышению эффективности и распространению данного метода моделирования [6].
Трехмерные клеточные модели включают в себя сфероиды и тканевые эксплантаты, а также более сложно устроенные органоиды (в случае получения их из опухолевой ткани часто используют термин «тумороиды»), которые обладают способностью к самоорганизации, содержат гетерогенный клеточный компонент, нуждаются во внеклеточном матриксе и сложном коктейле ростовых факторов. За последние несколько лет органоиды были успешно получены из нормальной и опухолевой тканей головного мозга, легких, пищевода, желудка, кишечника, печени, поджелудочной железы, почек, слюнных желез, яичников, молочных желез, простаты и других органов [6], при этом для каждого источника была необходима разработка отдельного протокола изоляции клеток и условий формирования органоидов. Кроме сложного коктейля ростовых факторов и агонистов/антагонистов различных сигнальных путей для образования органоидов необходим внеклеточный матрикс, в качестве которого в подавляющем количестве исследований используют коммерчески доступный матрикс базальной мембраны саркомы мышей линии Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Помимо высокой вариабельности свойств EHS матрикс обладает еще одним очевидным недостатком - он не соответствует animal-derived free стандартам, которые в ближайшее время, несомненно, станут обязательны для биомедицинских продуктов, поэтому исследователи активно ищут ему замену среди синтетических или природных гидрогелей [7].
К настоящему времени известно несколько изобретений, представляющих собой способы культивирования органоидов из различных тканей и органов человека и животных.
Известны способы культивирования клеток и получения органоидов из эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека (патент RU 2631005 С1, дата публикации 15.09.2017), получения органоидов из эпителиальных стволовых клеток нормальной или опухолевой ткани желудка, поджелудочной железы, толстого или тонкого кишечника (патент RU 2555545 С2, дата публикации 10.07.2015), получения органоидов из эпителиальных и мезенхимальных клеток пульпы зуба (патент RU 2638783 С2, дата публикации 15.12.2017), получения органоидов печени из единственной эпителиальной стволовой клетки, выделенной из фрагмента печени или желчного протока печени (патент RU 2579995 С2, дата публикации 10.04.2016) и аналогичные изобретения, главным недостатком которых является использование культуральных добавок (в том числе фетальной бычьей сыворотки) и внеклеточного матрикса ксеногенного происхождения.
Известен способ культивирования органоидов без указания конкретных клеточных типов с использованием множества вариантов матриксов в виде гидрогелей с вязкостью от 50 до 150 кПа, полученных из природных полисахаридов и белков (агарозы, альгината, хитозана, декстрана, желатина, ламинина, коллагенов, гиалуроната, фибрина или их сочетаний), натуральных внеклеточных матриксов (Matrigel, Myogel или Cartigel), синтетических полимеров (полиуретана, полиамида, поливинилового спирта, полиэтилен гликоля, полиэтилен оксида, полипропилен гликоля, полипропилен оксида, политетраметилен оксида, поливинилпирролидона, полиакриламида, полигидроксиэтилакрилата, полигидроксиэтилметакрилата или их сочетаний) (патент WO2018050862A1, дата публикации 19.09.2016). Недостатком данного изобретения является отсутствие подробного протокола получения органоидов из конкретной ткани или органа.
На сегодняшний день не зарегистрировано изобретений, представляющих собой способы культивирования органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи. Между тем, опухоли головы и шеи занимают 6 место в структуре онкологических заболеваний человека (первые три места данного анти-рейтинга принадлежат раку легких, раку молочной железы и колоректальному раку) [1], в 2018 году было зарегистрировано более 890 тысяч новых случаев и около 450 тысяч смертей вследствие данного заболевания. Согласно прогнозам, частота выявлений опухолей органов головы и шеи продолжит расти и составит к 2030 году более 1 млн случаев [8]. Опухоли головы и шеи представлены в основном плоскоклеточным раком (около 90%), для которого характерен быстрый инвазивный рост, активное метастазирование и возможность рецидивов [8]. Одним из возможных методов для выбора наиболее эффективной тактики лечения (лекарственной, волновой, иммунной терапии) может стать получение органоидов из биоптатов опухолевой ткани в рамках концепции персонализированной медицины. Очевидно, что полученные органоиды должны сохранять основные характеристики исходной опухолевой ткани (в том числе экспрессию маркеров стволовых клеток опухолей головы и шеи CD44 и цитокератина 17 [8-10]) и не подвергаться в процессе культивирования воздействию агентов, способных их изменить, в том числе воздействию продуктов ксеногенного происхождения.
Технической задачей изобретения является разработка способа получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи без применения культуральных добавок, в том числе внеклеточного матрикса, ксеногенного происхождения.
Технический результат изобретения состоит в том, что предлагаемый способ обеспечивает получение органоидов из клеток, выделенных из опухолевой ткани органов головы и шеи, при этом способ позволяет отказаться от использования ксеногенных компонентов сред в процессе обработки ткани и получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов).
Для достижения указанного технического результата предложено изобретение, описываемое следующей формулой: биоптат опухоли органов головы и шеи в течение 4 часов после оперативного вмешательства транспортируют в культуральную лабораторию, где материал отмывают от возможных контаминирующих агентов, очищают от тканей перитуморальной области и поврежденных электроножом тканей, замораживают небольшой фрагмент для последующего гистологического исследования, оставшийся материал измельчают с помощью хирургических инструментов и подвергают ферментативной диссоциации в 5-кратном объеме нагретой до 37°С среды, содержащей рекомбинантные протеазы (коллагеназы 1, 2, 4 или аналог трипсина) и ДНКазу, в течение 90 минут при помешивании на орбитальном шейкере при 50 об/мин, после чего суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют буферным раствором в 10 раз, пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм и осаждают центрифугированием при 200g, затем лизируют содержащиеся в суспензии эритроциты специализированным буфером, после чего снова осаждают центрифугированием при 200g, образовавшийся осадок клеток ресуспендируют в 1 мл культуральной среды и оценивают концентрацию и доли живых и мертвых клеток, после чего разбавляют полной культуральной средой, состоящей из DMEM/F12,199 среды или иной бессывороточной среды с необязательным добавлением 25 мМ солей HEPES, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1 × антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% (v/v) аутогенной плазмы и необязательно дополненной иными факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими реактивами), до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием, который помещают в СО2-инкубатор (стандартные условия 37°С, 5% СО2, насыщенная влажность), визуально подтверждая полимеризацию фибрина, далее динамику формирования органоидов оценивают с помощью инвертированного микроскопа, получают органоиды и при необходимости сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы, после чего органоиды характеризуют, сравнивая их свойства с исходной опухолевой тканью, из которой они были выделены.
Предложенный способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи включает этап забора биологического материала у пациентов с плоскоклеточным раком органов головы и шеи, этап транспортировки биоматериала из операционного блока в культуральную лабораторию, этап первичной подготовки биоматериала (обработки ткани и ее фрагментации), этап ферментативной диссоциации ткани, этап очищения суспензии клеток от нежелательных примесей, этап 3D культивирования, этап верификации полученных органоидов.
В процессе проведения исследований была установлена значимость следующих принципиальных моментов на различных этапах реализации изобретения:
первичный материал транспортируют из оперативного блока в культуральную лабораторию в срок не более 4 часов при хранении материала при +4°С в транспортной среде, т.к. при большем сроке хранения повышается вероятность гибели части клеток и изменения исходного соотношения клеточных субпопуляций опухоли;
для предотвращения возможной контаминации ткань трижды промывают в растворе ЭДТА, затем аналогичным образом в растворе антибиотика-антимикотика, после чего трижды отмывают от реагентов в буферном растворе (растворе Хенкса или аналогичном);
в случае использования электрохирургического метода разъединения тканей (электроножа) биоматериал тщательно очищают от обугленных участков, т.к. они могут содержать токсичные продукты распада;
опухолевую ткань максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области (соединительной, мышечной, жировой), т.к. их присутствие значимо увеличивает время ферментативной диссоциации, что негативно сказывается на выживаемости клеток;
для ферментативной диссоциации ткани используют animal-free реагенты - рекомбинантные коллагеназы (в этом случае для обеспечения стабильной протеазной активности ферментов в раствор добавляют 5 мМ Са++) или рекомбинантный трипсин, либо их комбинацию, дополнительно используют рекомбинантную ДНКазу для разрушения длинных нитей ДНК, попадающих в раствор из клеток с разрушенными мембранами и повышающих его вязкость;
непосредственно перед использованием диссоциирующий раствор подогревают до 37°С для достижения температурного оптимума ферментов;
объем диссоциирующего раствора превышает объем материала в 5 раз, т.к. такое соотношение является достаточным для эффективного выделения клеток из ткани;
ферментативную диссоциацию проводят при 37°С в условиях постоянного перемешивания на орбитальном шейкере с минимальной скоростью 50 об/мин, т.к. такой режим является наиболее щадящим и предотвращает повреждение клеточных мембран;
процесс ферментативной обработки ткани не должен превышать 90 минут, т.к. более длительная инкубация приводит к значительному падению жизнеспособности выделяемых клеток;
суспензию изолированных из ткани клеток разбавляют буферным раствором (раствором Хенкса или аналогичным) в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм, т.к. такая фильтрация позволяет избавиться от недиссоциировавших фрагментов ткани, но оставляет в растворе небольшие конгломераты из нескольких клеток, которые допустимо использовать в дальнейшей работе;
суспензию клеток после отмывания от ферментов дополнительно инкубируют в буфере, лизирующем эритроциты, т.к. примесь эритроцитов значительно снижает эффективность образования органоидов из целевых клеток опухолевой ткани за счет физического препятствия взаимодействию клеток в суспензии;
для осаждения клеток используют щадящий режим центрифугирования (200g) для предотвращения дополнительного повреждения клеточных мембран;
концентрацию клеток в суспензии определяют с помощью счетчика и анализатора жизнеспособности клеток, после чего переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием из расчета 100 тысяч живых клеток в 1 мл, т.к. меньшая концентрация приведет к низкой эффективности образования органоидов, а при более высокой концентрации происходит быстрое истощение культуральной среды;
в качестве культуральной среды используют DMEM/F12, либо 199 среду, либо иную бессывороточную культуральную среду, которая может быть дополнена натриевой солью HEPES для увеличения буферной емкости, а также факторами роста (преимущественно FGF и EGF или иными), ингибиторами BMP (преимущественно Noggin или иными), ингибиторами SMAD-сигнального пути (преимущественно А83-01 или иными), ингибиторами Rho-киназы (преимущественно Y-27632 или иными), активаторами Wnt-сигнального пути (преимущественно R-Spondin 1-4, CHIR99021 или иными), либо иными культуральными добавками, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода;
в культуральную среду вносят 2% (v/v) аутогенной плазмы, полученной от донора опухолевой ткани, при этом при 37°С в течение 30 минут происходит полимеризация фибрина с образованием геля, который обеспечивает активную миграцию клеток в трехмерной сети фибриновых волокон с формированием органоидов, состоящих из различных клеточных субпопуляций, выделенных из исходной опухолевой ткани;
после культивирования в течение нескольких суток сформировавшиеся органоиды могут быть извлечены для исследования либо перенесены в более вязкий матрикс на основе культуральной среды, содержащей 25% (v/v) аутогенной плазмы.
Только строгое соблюдение всех указанных особенностей процесса позволяет эффективно выделять клетки с высокой жизнеспособностью из опухолевой ткани органов головы и шеи и получать из них органоиды, не используя при этом культуральные добавки (в том числе внеклеточный матрикс) ксеногенного происхождения.
Возможность объективного достижения технического результата при использовании изобретения подтверждена данными, приведенными в примере, представляющем собой протокол выделения клеток из опухолевой ткани органов головы и шеи с последующим получением из них трехмерных клеточных конструктов (органоидов) (пример 1), а также в примере, содержащем сведения экспериментального характера, касающиеся характеристики органоидов, полученных с использованием представленного в примере 1 протокола (пример 2).
Изобретение поясняется чертежом, где на рисунке 1 представлен внешний вид органоидов, полученных по протоколу из примера 1, на рисунке 2 представлены данные о соответствии морфологического строения органоида и исходной опухолевой ткани, на рисунке 3 представлены данные о сохранении в органоиде стволовых клеток опухоли, имеющих те же фенотипические признаки, что и в исходной опухолевой ткани, и таблицей 1, в которой представлены данные о донорах опухолевой ткани, из которых были успешно получены органоиды по протоколу из примера 1.
Пример 1. Протокол получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов) из опухолевой ткани органов головы и шеи
1. Транспортировка биоптата опухолевой ткани в культуральную лабораторию
Биопсийный материал помещают в пробирку, содержащую бессывороточную среду (DMEM/F12, F12, 199 среда) с добавлением 1 × антибиотика-антимикотика, охлажденную до +4°С. Дополнительно у донора забирают кровь в вакуумную систему типа Vacuette® с цитратом натрия. Пробирки маркируют, в вертикальном положении помещают в медицинский термоконтейнер и в срок строго не более 4 часов транспортируют в культуральную лабораторию.
2. Первичная обработка биоматериала
Материал тщательно отмывают от возможных контаминирующих агентов в фосфатно-солевом буфере, содержащем 0,02% ЭДТА (растворе Версена), затем в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1 × антибиотик-антимикотик, затем в фосфатно-солевом буфере или растворе Хенкса без добавок. В каждом растворе ткань промывают 3 раза. Затем опухолевую ткань с помощью хирургических инструментов максимально полно очищают от окружающих ее тканей перитуморальной области (соединительной, мышечной, жировой), а также участков обугленной при использовании электроножа ткани. Оставшийся материал еще раз промывают в фосфатно-солевом буфере или растворе Хенкса без добавок, небольшой фрагмент замораживают для дальнейшего гистологического исследования, основную часть измельчают с помощью ножниц.
3. Ферментативная диссоциация опухолевой ткани
Диссоциирующий раствор готовят непосредственно перед использованием. В культуральную среду DMEM/F12 или 199 среду добавляют рекомбинантные коллагеназы 1 и 4 (либо 1, 2 и 4) до концентрации 1 мг/мл, дополненные 5 мМ Са++(из раствора СаСl2), либо в указанные среды добавляют 10% (v/v) рекомбинантной протеазы TrypLE™ Select Enzyme (10×). Дополнительно в диссоциирующий раствор вносят ДНКазу до конечной концентрации 0,1 мг/мл. Перед использованием готовый раствор подогревают на водяной бане до 37°С. В пробирку вносят измельченную ткань и добавляют 5-кратный объем диссоциирующего раствора. Инкубацию проводят при 37°С в условиях постоянного перемешивания с помощью орбитального шейкера (режим 50 об/мин). Инкубацию останавливают после диссоциации всех визуализируемых фрагментов ткани либо через 90 минут после начала.
4. Подготовка выделенной суспензии клеток к культивированию
Суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют раствором Хенкса или фосфатно-солевым буфером в 10 раз и пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм, после чего осаждают центрифугированием при 200g. Клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл раствора Хенкса, добавляют 10-кратный объем лизирующего эритроциты буфера и инкубируют в соответствии с протоколом, предлагаемым производителем, после чего снова осаждают центрифугированием при 200g. Осадок клеток ресуспендируют в 1 мл полной культуральной среды, отбирают аликвоту суспензии для оценки концентрации и долей живых и мертвых клеток с помощью автоматического счетчика и анализатора жизнеспособности клеток.
5. Получение органоидов в условиях 3D культивирования
Готовят полную культуральную среду на основе DMEM/F12, 199 среды или иной бессывороточной среды (допустимо добавление 25 мМ солей HEPES), содержащей 2 мМ L-глутамина, 1 × антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% (v/v) аутогенной плазмы. Также среда может быть дополнена иными культуральными добавками, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода (факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими).
Для получения аутогенной плазмы пробирки с кровью центрифугируют при 300g в течение 5 минут при 18°С. Плазму разделяют на аликвоты по 1 мл, часть используют для приготовления среды, оставшуюся часть хранят при температуре ниже -25°С и используют по мере необходимости (допустимый срок хранения составляет 36 месяцев).
Суспензию клеток разбавляют полной культуральной средой до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием. Культуральную посуду помещают в СО2-инкубатор (стандартные условия 37°С, 5% СО2, насыщенная влажность), через 30 минут визуально подтверждают полимеризацию фибрина. Динамику формирования органоидов оценивают с помощью инвертированного микроскопа каждые 24 часа. При необходимости сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы.
6. Верификация полученных органоидов
Для характеристики исходной опухолевой ткани изготавливают криосрезы, которые затем окрашивают гематоксилином-эозином (для получения обзорных препаратов) либо с антителами к специфическим маркерам опухоли (CD44, цитокератин 17 и др.).
Для характеристики органоидов используют аналогичные методы окрашивания криосрезов или иные методы исследований в зависимости от поставленных задач.
Пример 2. Характеристика органоидов, полученных с использованием представленного в примере 1 Протокола получения трехмерных клеточных конструктов (органоидов) из опухолевой ткани органов головы и шеи
При использовании протокола, представленного в примере 1, были успешно получены органоиды из опухолевой ткани от 5 доноров (таблица 1).
Динамика формирования органоидов представлена на рисунке 1.
В качестве примера верификации приведена сравнительная характеристика биоптата опухолевой ткани от донора (мужчины 58 лет) с плоскоклеточным раком гортани и органоидов, полученных из данной ткани в соответствии с протоколом, представленным в примере 1.
При исследовании ткани была выявлена характерная для плоскоклеточного рака (плоскоклеточной карциномы) гистологическая картина: обильный инвазивный рост плоскоклеточного эпителия, представленного крупными клетками с эозинофильной цитоплазмой, формирующего округлые скопления и окруженного рыхлой волокнистой соединительной тканью стромы. Органоиды, полученные из данной ткани, имели сходное строение: скопления крупных эпителиальных клеток с эозинофильной цитоплазмой, разделенные тяжами стромальных клеток (рисунок 2).
Иммуногистохимическое окрашивание подтвердило экспрессию эпителиальными клетками интегрального клеточного гликопротеина CD44 и цитокератина 17, маркеров опухолевых клеток органов головы и шеи (рисунок 3).
Таким образом, экспериментальные данные подтверждают соответствие основных свойств (морфологическое строение, клеточный состав) опухолевой ткани органов головы и шеи и получаемых из нее органоидов, что свидетельствуют о высокой эффективности предложенного изобретения.
Список литературы
1. World Health Organization. (2020). WHO report on cancer: setting priorities, investing wisely and providing care for all. World Health Organization. https://apps.who.int/iris/handle/10665/330745.
2. Fogel DB. Factors associated with clinical trials that fail and opportunities for improving the likelihood of success: A review. Contemp.Clin. Trials Commun. 2018, 11:156-164.
3. Gillet JP, Varma S, Gottesman MM. The Clinical Relevance of Cancer Cell Lines. J. Natl. Cancer Inst. 2013, 105:452-458.
4. Hinshaw DC, Shevde LA. The tumor microenvironment innately modulates cancer progression. Cancer Res. 2019, 79:4557-4566.
5. Olson B, Li Y, Lin Y, Liu ET, Patnaik A. Mouse Models for Cancer Immunotherapy Research. Cancer Discov. 2018, 8:1358-1365.
6. Gunti S, Hoke A, Vu K, London N. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers. 2021, 13(4):874.
7. Kaur S, Kaur I, Rawal P, Tripathi DM, Vasudevan A. Non-matrigel scaffolds for organoid cultures. Cancer Letters. 2021, 504: 58-66.
8. Johnson DE, Burtness B, Leemans CR, Lui V, Bauman J, Grandis J. Head and neck squamous cell carcinoma. Nat Rev Dis Primers. 2020, 6:92.
9. Chen J, Zhou J, Lu J, Xiong H, Shi X, Gong 1. Significance of CD44 expression in head and neck cancer: a systemic review and meta-analysis. BMC Cancer. 2014, 14:15.
10. Kiani MN, Asif M, Ansari FM, Ara N, Ishaque M, Khan AR. Diagnostic utility of Cytokeratin 13 and Cytokeratin 17 in Oral Epithelial Dysplasia and Oral Squamous Cell Carcinoma. APJCB. 2020, 5(4).
Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи
Claims (1)
- Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи, характеризующийся тем, что биоптат опухоли органов головы и шеи в течение 4 часов после оперативного вмешательства транспортируют в культуральную лабораторию, где материал три раза промывают в растворе ЭДТА, три раза в растворе антибиотика-антимикотика, три раза отмывают от реагентов в растворе Хенкса, очищают от тканей перитуморальной области и поврежденных электроножом тканей, после чего замораживают небольшой фрагмент для последующего гистологического исследования, а оставшийся материал измельчают с помощью хирургических инструментов и подвергают ферментативной диссоциации в 5-кратном объеме нагретой до 37°С среды, содержащей ДНКазу и рекомбинантые коллагеназы 1 и 4 или 1, 2, 4 или рекомбинантный трипсин в течение 60-90 минут при помешивании на орбитальном шейкере при 50 об/мин, после чего суспензию изолированных из опухолевой ткани клеток разбавляют раствором Хенкса в 10 раз, пропускают через нейлоновое сито с размером ячеек 100 мкм и осаждают центрифугированием при 200g, затем лизируют содержащиеся в суспензии эритроциты специализированным буфером и снова осаждают центрифугированием при 200g, после чего образовавшийся осадок клеток ресуспендируют в 1 мл культуральной среды, оценивают концентрацию и доли живых и мертвых клеток, разбавляют полной культуральной средой, состоящей из DMEM/F12 или 199 среды, содержащей 2 мМ L-глутамина, 1× антибиотик-антимикотик, 5 нг/мл huFGF2, 50 нг/мл huEGF, 2% v/v аутогенной плазмы и необязательно дополненной иными факторами роста, ингибиторами BMP, ингибиторами SMAD-сигнального пути, ингибиторами Rho-киназы, активаторами Wnt-сигнального пути или другими реактивами, необходимыми для поддержания недифференцированного состояния опухолевых стволовых клеток и предотвращения эпителиально-мезенхимального перехода, до конечной концентрации 100 тысяч живых клеток в 1 мл и переносят в культуральный пластик с ультранизким адгезивным покрытием, который помещают в СO2-инкубатор, обеспечивающий 37°С, 5% СО2 и насыщенную влажность, визуально подтверждая полимеризацию фибрина и оценивая динамику формирования органоидов с помощью инвертированного микроскопа, после чего в течение 2-3 суток сформировавшиеся органоиды переносят в более вязкий гель на основе культуральной среды с добавлением аутогенной плазмы до 25%, при этом для индукции гелирования добавляют 10% раствор глюконата кальция в объеме 10% от объема добавленной плазмы, после чего органоиды характеризуют, сравнивая их свойства с исходной опухолевой тканью, из которой они были выделены.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2787378C1 true RU2787378C1 (ru) | 2023-01-09 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825474C1 (ru) * | 2023-12-01 | 2024-08-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы" (РУДН) | Способ получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705109C2 (ru) * | 2019-05-16 | 2019-11-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ лечения плоскоклеточного рака полости рта и глотки в сочетании с лучевым и лекарственным воздействием |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2705109C2 (ru) * | 2019-05-16 | 2019-11-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) | Способ лечения плоскоклеточного рака полости рта и глотки в сочетании с лучевым и лекарственным воздействием |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KADLETZ L. et al., Evaluation of spheroid head and neck squamous cell carcinoma cell models in comparison to monolayer cultures, Oncology Letters, 2015, Vol. 10 Issue 3, pp. 1281-1286, https://doi.org/10.3892/ol.2015.3487. * |
| БАЛАЛАЕВА И.В. и др., Сфероиды HER2-положительной аденокарциномы молочной железы человека как модель для тестирования противоопухолевых иммунотоксинов, ACTA NATURAE, Том 9, No. 1(32), 2017, с. 40-46, DOI: 10.32607/20758251-2017-9-1-38-43. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2825474C1 (ru) * | 2023-12-01 | 2024-08-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы" (РУДН) | Способ получения тканеинженерной in vitro модели плоскоклеточного рака головы и шеи человека |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10688221B2 (en) | Human liver scaffolds | |
| JP2020195411A (ja) | 三次元組織体及びその製造方法、並びに、三次元組織体の形成剤 | |
| Vanacker et al. | First transplantation of isolated murine follicles in alginate | |
| US20070238175A1 (en) | Standardization of processes for culturing primary cells | |
| CN1333818A (zh) | 生物工程化的组织构建物、其制备方法及其应用 | |
| CN102388127A (zh) | 肺的组织改造 | |
| CN103458935A (zh) | 使组织或器官再细胞化以提高其可移植性的方法 | |
| CN105765060A (zh) | 羊膜间充质系细胞组合物的制造方法和冷冻保存方法、以及治疗剂 | |
| US10100274B2 (en) | Method for preparing chondrocytes | |
| Tavakol et al. | Injectable, scalable 3D tissue-engineered model of marrow hematopoiesis | |
| Naderi et al. | Three-dimensional scaffold from decellularized human gingiva for cell cultures: glycoconjugates and cell behavior | |
| CN101848718A (zh) | 用于组织再生的细胞组合物 | |
| US20090186004A1 (en) | Method For Preparing An Organ For Transplantation | |
| KR102272551B1 (ko) | 비수술적 방법에 의한 인간유래 3차원 오거노이드의 제조 방법 | |
| JP2022501118A (ja) | 脂肪由来幹細胞およびゼラチンを含む生体材料ならびにその製造方法 | |
| Jones et al. | Decellularization: leveraging a tissue engineering technique for food production | |
| RU2787378C1 (ru) | Способ получения органоидов из опухолевой ткани органов головы и шеи | |
| CN115261326B (zh) | 建立乳腺癌及癌旁类器官模型的培养基及培养方法 | |
| CN117025503A (zh) | 肝内胆管前体样细胞、细胞制剂及制备方法和应用 | |
| CN113215083B (zh) | 一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系 | |
| US20230067199A1 (en) | Organ extracellular matrix-derived scaffold for culture and transplantation of organoid and method of preparing the same | |
| EP3684915A1 (en) | Fabrication of a biomimetic platform system and methods of use | |
| CN112430568B (zh) | 一种脐带间充质干细胞饲养上皮来源类器官的方法 | |
| Minuth et al. | Ultrastructural insights in the interface between generated renal tubules and a polyester interstitium | |
| US20210371825A1 (en) | Compositions for and methods of producing tumor organoids |