CN107164308A - 一种黑素细胞均匀生长的培养方法 - Google Patents

一种黑素细胞均匀生长的培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107164308A
CN107164308A CN201710460517.2A CN201710460517A CN107164308A CN 107164308 A CN107164308 A CN 107164308A CN 201710460517 A CN201710460517 A CN 201710460517A CN 107164308 A CN107164308 A CN 107164308A
Authority
CN
China
Prior art keywords
melanocyte
culture
concentration
cell
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201710460517.2A
Other languages
English (en)
Inventor
车景敏
卢永波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd filed Critical Guangdong Bo Xi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201710460517.2A priority Critical patent/CN107164308A/zh
Publication of CN107164308A publication Critical patent/CN107164308A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0626—Melanocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/32—Polylysine, polyornithine

Abstract

本发明公开了一种黑素细胞均匀生长的培养方法，包括：一、收集黑素细胞，用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；二、制备预处理的培养板；三、将培养收集的黑素细胞制成细胞悬液加入预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于CO2培养箱中培养1h后取出培养板；四、将取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于CO2培养箱中增殖培养24h～48h。本发明的方法既可以保证黑素细胞的活性，又能使黑素细胞快速贴壁并能均匀生长，采用本发明方法培养的黑素细胞贴壁率提高了25%～40%。

Description

一种黑素细胞均匀生长的培养方法
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种黑素细胞均匀生长的培养方法。
背景技术
随着体外检测的发展，3D皮肤模型已经成为了体外检测的主要研究工具。目前市场上已经有EpiDerm (MatTek Corporation)和EPISKIN (EPISKIN SNC)已经完成正式的体外皮肤刺激性检测验证，并纳入OECD TG 439指南。并且随着市场的需要，不同类型的皮肤模型也被开发，例如：含黑素的表皮皮肤模型，双层皮肤模型等。
美白祛斑化妆品是化妆品研究中的重要方向之一。目前对于美白化妆品的安全以及功效评价都是基于动物模型如豚鼠进行验证，但是随着欧盟对动物实验的严令禁止，美白化妆品的安全与功效评价成为的化妆品上市前的一大难题。如果有一款黑素皮肤模型的认证成功就可以解决美白化妆品的上市难题。但是黑色素细胞仅占表皮细胞数量的1％左右，而且其贴壁能力差，生长缓慢，增殖能力极为有限，容易聚集，所以提高黑素细胞的贴壁能力以及降低聚集能力是黑色素细胞培养的重点，同时也解决了黑素模型构建过程中的肤色不均的难题。
现有技术中，促进黑色素细胞生长主要是在黑素细胞的培养液中添加一定浓度的TPA(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍乱毒素。但是TPA具有潜在的致癌作用，从而使上述培养方法在临床上受到了限制。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和二丁酰环腺苷酸（dcAMP）作为添加剂替代TPA进行原代培养则解决了上述技术问题，该技术可以使促进黑色素细胞生长，并且规避了TPA具有潜在的致癌的风险。黑素细胞一般在24h才能够完全贴壁，而目前解决的黑素细胞的贴壁方式主要是采用预培养的方式，在接种或是共培养前，将黑素细胞预培养5h～10h，然后在接种其他细胞构建模型或是细胞膜片用于体外检测以及临床。这样的技术虽然解决了黑素细胞的贴壁问题，但是时间过长导致成本增高。
从黑素皮肤模型的研究现状可以看出，黑素皮肤模型的表观有的呈现黑素颗粒的点状聚集，有的呈现黑素的片状聚集。因此对于黑素皮肤模型的黑素细胞的快速贴壁以解决黑素细胞在载体上的均匀分布是解决模型构建中黑色素聚集的关键问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种黑素细胞均匀生长的培养方法。该方法既可以保证黑素细胞的活性，又能使黑素细胞快速贴壁并能均匀生长，采用该方法培养的黑素细胞贴壁率提高了25%～40%。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、收集黑素细胞，用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于孔板中，每个小室底膜滴加200μL多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养收集的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%～10%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM～15mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL～0.8g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L～13nmol/L，氯化钙的浓度为4mM～10mM；
步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于CO2培养箱中增殖培养24h～48h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为0.5%～5%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%。
上述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤一中收集黑素细胞的方法具体为：用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪后用Dispase消化液消化16h～20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化5min～15min；最后用无菌的200目筛网收集黑素细胞。
上述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤二中所述多聚赖氨酸溶液的浓度为25μg/mL～75μg/mL。
上述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤三中所述黑素细胞预培养液的pH值为8～10。
上述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤四中所述增殖培养液的pH值为7.2～7.4。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、采用本发明的培养方法培养的黑素细胞贴壁时间由原来的15h～24h缩短到1h左右，细胞增殖迅速，传代2～3代后细胞数量可以达到2×106cells/mL～6×106cells/mL，并且黑素细胞的活力以及分泌黑素颗粒的能力稳定。
2、本发明的方法既可以保证黑素细胞的活性，又能使黑素细胞快速贴壁并能均匀生长，采用该方法培养的黑素细胞贴壁率提高了25%～40%。
3、采用本发明的方法培养的黑素细胞可以应用于白癜风临床治疗中使用的黑素细胞膜片的制备，也可用于体外检测黑素模型构建过程中保证黑素皮肤模型表观肤色的均匀度。
4、与已有的黑素细胞培养方法相比，本发明的黑素细胞培养方法提高了原代培养中黑素细胞的成活率，减少了黑素细胞的贴壁时间，降低的黑素细胞的聚集程度。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例1的培养板和对比例取出的孔板中黑素细胞的贴壁率对比图。
图2为本发明实施例2增殖培养24h后黑素细胞的镜下形态照片。
图3为本发明实施例2增殖培养的黑素细胞传代到3代后的L-DOPA染色照片。
图4为本发明实施例3增殖培养的黑素细胞传代到3代后的银染照片。
图5为本发明实施例4增殖培养的黑素细胞传代到3代后制备的黑素皮肤模型的表观图。
图6为本发明实施例4增殖培养的黑素细胞传代到3代后制备的黑素皮肤模型的银染图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的黑素细胞均匀生长的培养方法包括以下步骤：
步骤一、用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪成9mm×3mm的碎片后用Dispase消化液消化20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化15min；用无菌的200目筛网收集黑素细胞；最后用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用浓度为50μg/mL的多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于96孔板中，每个小室底膜滴加200μL浓度为50μg/mL的多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将96孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%，胎牛血清的体积百分含量为15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L，氯化钙的浓度为10mM，黑素细胞预培养液的pH值为9。
对比例
步骤一、用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪成9mm×3mm的碎片后用Dispase消化液消化20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化15min；用无菌的200目筛网收集黑素细胞；最后用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、将步骤一中培养的黑素细胞制成细胞悬液加入96孔板的培养小室中，晃动使细胞均匀铺于孔板上，然后向孔板中加入黑素细胞预培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%，胎牛血清的体积百分含量为15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L，氯化钙的浓度为10mM，黑素细胞预培养液的pH值为9。
观察实施例1取出的培养板和对比例取出的孔板中黑素细胞的贴壁情况，并使用MTT法检测黑素细胞的贴壁率，结果如图1所示，可以看出，采用实施例1的方法培养的黑素细胞的贴壁率比对比例提高了30%。
实施例2
本实施例的黑素细胞均匀生长的培养方法包括以下步骤：
步骤一、用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪成9mm×3mm的碎片后用Dispase消化液消化20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化15min；用无菌的200目筛网收集黑素细胞；最后用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用浓度为50μg/mL的多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于96孔板中，每个小室底膜滴加200μL浓度为50μg/mL的多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将96孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%，胎牛血清的体积百分含量为15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L，氯化钙的浓度为10mM，黑素细胞预培养液的pH值为9；
步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于37℃、5%CO2培养箱中增殖培养24h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为3%，胎牛血清的体积百分含量为10%，增殖培养液的pH值为7.3。
观察本实施例步骤三取出的培养板中黑素细胞的贴壁情况，并使用MTT法检测黑素细胞的贴壁率，黑素细胞的贴壁率比对比例提高了25%。
本实施例增殖培养24h后进行观察，发现贴壁的黑素细胞状态好，克隆状态好，如图2所示，图中显示黑素细胞具有较好的细胞状态，黑素细胞胞核透光性好，细胞树突分支较少（树突量≤3个），黑色素细胞分级为3级，具有较好的细胞活性及生物学功能，并且黑素细胞均匀分布于细胞板中，汇合度达到80%左右。
对本实施例增殖培养的黑素细胞继续进行增殖培养，每周换液3次，当细胞达到70%饱和后，对细胞进行消化，回收，重悬，接种进行扩增传代，接种密度为5×103cells/cm2，消化的具体步骤为：用PBS清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%CO2培养箱中消化3min，显微镜下观察到黑素细胞已经从培养板上剥离，即终止消化。1周内即可扩增传代到3代，此时黑素细胞数目可以达到7×106cells/mL，黑素细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现2～3个分枝，黑素细胞的分枝可以彼此相连，对细胞进行多巴染色，结果见图3，从图中可以看出，黑素细胞呈现灰色且均匀分布。
实施例3
本实施例的黑素细胞均匀生长的培养方法包括以下步骤：
步骤一、用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪成9mm×3mm的碎片后用Dispase消化液消化16h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化5min；用无菌的200目筛网收集黑素细胞；最后用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用浓度为75μg/mL的多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于24孔板中，每个小室底膜滴加200μL浓度为75μg/mL的多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将24孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为10%，胎牛血清的体积百分含量为5%，L-谷氨酰胺的浓度为15mM，霍乱毒素的浓度为0.8g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为13nmol/L，氯化钙的浓度为4mM，黑素细胞预培养液的pH值为10；
步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于37℃、5%CO2培养箱中增殖培养48h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为0.5%，胎牛血清的体积百分含量为15%，增殖培养液的pH值为7.2。
观察本实施例步骤三取出的培养板中黑素细胞的贴壁情况，并使用MTT法检测黑素细胞的贴壁率，黑素细胞的贴壁率比对比例提高了40%。
本实施例增殖培养48h后进行观察，发现贴壁的黑素细胞状态好，克隆状态好，黑素细胞具有较好的细胞状态，黑素细胞胞核透光性好。
对本实施例增殖培养的黑素细胞继续进行增殖培养，每周换液3次，当细胞达到70%饱和后，对细胞进行消化，回收，重悬，接种进行扩增传代，接种密度为5×103cells/cm2，消化的具体步骤为：用PBS清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%CO2培养箱中消化3min，显微镜下观察到黑素细胞已经从培养板上剥离，即终止消化。1周内即可扩增传代到3代，传代到2代时黑素细胞数目可以达到2×106cells/mL，传代到3代时黑素细胞数目可以达到7×106cells/mL，黑素细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现2～3个分枝，使用银染试剂盒对黑素细胞进行染色，结果见图4，从图中可以看出，黑素细胞具有良好的分泌黑素颗粒的能力。
实施例4
本实施例的黑素细胞均匀生长的培养方法包括以下步骤：
步骤一、用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪成9mm×3mm的碎片后用Dispase消化液消化18h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化10min；用无菌的200目筛网收集黑素细胞；最后用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用浓度为25μg/mL的多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于48孔板中，每个小室底膜滴加200μL浓度为25μg/mL的多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将48孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为8%，胎牛血清的体积百分含量为10%，L-谷氨酰胺的浓度为10mM，霍乱毒素的浓度为0.5g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为10nmol/L，氯化钙的浓度为6mM，黑素细胞预培养液的pH值为8；
步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于37℃、5%CO2培养箱中增殖培养36h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为5%，胎牛血清的体积百分含量为5%，增殖培养液的pH值为7.4。
观察本实施例步骤三取出的培养板中黑素细胞的贴壁情况，并使用MTT法检测黑素细胞的贴壁率，黑素细胞的贴壁率比对比例提高了35%。
本实施例增殖培养36h后进行观察，发现贴壁的黑素细胞状态好，克隆状态好，黑素细胞具有较好的细胞状态，黑素细胞胞核透光性好。
对本实施例增殖培养的黑素细胞继续进行增殖培养，每周换液3次，当细胞达到70%饱和后，对细胞进行消化，回收，重悬，接种进行扩增传代，接种密度为5×103cells/cm2，消化的具体步骤为：用PBS清洗，然后加入0.25%胰酶溶液在37℃，5%CO2培养箱中消化3min，显微镜下观察到黑素细胞已经从培养板上剥离，即终止消化。1周内即可扩增传代到3代，此时黑素细胞数目可以达到6×106cells/mL，黑素细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现2～3个分枝，将黑素细胞消化，制成细胞悬液，按照常规黑素皮肤模型构建过程接种于黑素皮肤模型的培养装置中，经气液面培养后的黑素皮肤模型表观见图5，从图中可以看出，黑素皮肤模型表观颜色均一，没有明显的黑素颗粒聚集。对黑素皮肤模型进行组织切片银染，结果见图6，从图中可以看出，黑素细胞均匀的分布于表皮的基底层。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (5)

1.一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、收集黑素细胞，用M254液体培养基培养收集的黑素细胞；
步骤二、用多聚赖氨酸溶液对培养小室底膜进行过夜包被处理，然后将包被处理后的培养小室置于孔板中，每个小室底膜滴加200μL多聚赖氨酸溶液进行包被，最后将孔板封闭，于37℃培养箱过夜，得到预处理的培养板；
步骤三、将步骤一中培养收集的黑素细胞制成细胞悬液加入步骤二中预处理的培养板中，晃动使细胞均匀铺于培养板上，然后向培养板中加入黑素细胞预培养液，于CO2培养箱中培养1h后取出培养板；所述黑素细胞预培养液以DMEM培养液为基础液，添加KSFM液体培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、霍乱毒素、12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯和氯化钙，黑素细胞预培养液中KSFM液体培养基的体积百分含量为5%～10%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%，L-谷氨酰胺的浓度为6mM～15mM，霍乱毒素的浓度为0.2g/mL～0.8g/mL，12-O-十四烷酰佛波酯-13-乙酸酯的浓度为3nmol/L～13nmol/L，氯化钙的浓度为4mM～10mM；
步骤四、将步骤三中取出的培养板中的培养液更换成增殖培养液，于CO2培养箱中增殖培养24h～48h；所述增殖培养液以M254液体培养基为基础液，添加黑素细胞生长添加因子HMGS和胎牛血清，增殖培养液中黑素细胞生长添加因子HMGS的体积百分含量为0.5%～5%，胎牛血清的体积百分含量为5%～15%。
2.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤一中收集黑素细胞的方法具体为：用75%的酒精对皮肤样本组织进行消毒，去除血迹；然后剥离皮肤样本组织的皮下疏松结缔组织，接着将皮肤样本组织裁剪后用Dispase消化液消化16h～20h，使表皮层与真皮层分离；再用0.25%胰酶溶液对表皮层消化5min～15min；最后用无菌的200目筛网收集黑素细胞。
3.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤二中所述多聚赖氨酸溶液的浓度为25μg/mL～75μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤三中所述黑素细胞预培养液的pH值为8～10。
5.根据权利要求1所述的一种黑素细胞均匀生长的培养方法，其特征在于，步骤四中所述增殖培养液的pH值为7.2～7.4。
CN201710460517.2A 2017-06-18 2017-06-18 一种黑素细胞均匀生长的培养方法 Withdrawn CN107164308A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710460517.2A CN107164308A (zh) 2017-06-18 2017-06-18 一种黑素细胞均匀生长的培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710460517.2A CN107164308A (zh) 2017-06-18 2017-06-18 一种黑素细胞均匀生长的培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107164308A true CN107164308A (zh) 2017-09-15

Family

ID=59818780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710460517.2A Withdrawn CN107164308A (zh) 2017-06-18 2017-06-18 一种黑素细胞均匀生长的培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107164308A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795842A (zh) * 2018-05-04 2018-11-13 江苏大学 一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用
CN110951675A (zh) * 2019-12-23 2020-04-03 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法
CN111100838A (zh) * 2019-12-27 2020-05-05 广东博溪生物科技有限公司 低温保存运输培养基
CN111117945A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 广东博溪生物科技有限公司 含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用
CN112592897A (zh) * 2020-12-04 2021-04-02 广东普罗凯融生物医药科技有限公司 一种肿瘤类器官的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101605566A (zh) * 2006-10-13 2009-12-16 利莱恩斯生命科学有限公司 生物聚合物上的培养黑素细胞
CN101856517A (zh) * 2010-06-18 2010-10-13 杭州市第三人民医院 基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用
CN105112355A (zh) * 2015-09-07 2015-12-02 北京艾美特夫生物科技有限公司 一种黑色素细胞的培养方法
CN105219696A (zh) * 2014-07-04 2016-01-06 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 一种新型的人表皮培养方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101605566A (zh) * 2006-10-13 2009-12-16 利莱恩斯生命科学有限公司 生物聚合物上的培养黑素细胞
CN101856517A (zh) * 2010-06-18 2010-10-13 杭州市第三人民医院 基于组织工程材料的黑素细胞的培养方法及其应用
CN105219696A (zh) * 2014-07-04 2016-01-06 赫柏慧康生物科技无锡有限公司 一种新型的人表皮培养方法
CN105112355A (zh) * 2015-09-07 2015-12-02 北京艾美特夫生物科技有限公司 一种黑色素细胞的培养方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EISINGER AND MARKO: "Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin.", 《PROC. NATL ACAD. SCI.》 *
汪丽俐，朱晓浚: "人表皮黑素细胞体外培养的条件探讨及鉴定", 《皮肤性病诊疗学杂志》 *
白瑞 等: "羊驼皮肤黑素细胞体外培养鉴定", 《畜牧兽医学报》 *
罗敏辉 等: "鼠尾胶原、多聚赖氨酸和明胶3种基质对角膜上皮细胞增殖的影响", 《毒理学杂志》 *
马慧军 等: "人表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养体外模型的建立", 《中国美容医学》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108795842A (zh) * 2018-05-04 2018-11-13 江苏大学 一种3D悬浮诱导iPS细胞生成自体黑素细胞的方法及应用
CN110951675A (zh) * 2019-12-23 2020-04-03 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法
CN111100838A (zh) * 2019-12-27 2020-05-05 广东博溪生物科技有限公司 低温保存运输培养基
CN111100838B (zh) * 2019-12-27 2023-05-09 广东博溪生物科技有限公司 低温保存运输培养基
CN111117945A (zh) * 2019-12-31 2020-05-08 广东博溪生物科技有限公司 含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用
CN111117945B (zh) * 2019-12-31 2023-11-07 广东博溪生物科技有限公司 含黑色素的表皮皮肤模型及其构建方法和应用
CN112592897A (zh) * 2020-12-04 2021-04-02 广东普罗凯融生物医药科技有限公司 一种肿瘤类器官的制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107164308A (zh) 一种黑素细胞均匀生长的培养方法
CN103179875B (zh) 化妆用生物纤维面膜片及其制备方法
Seligman et al. The histochemical demonstration of succinic dehydrogenase
CN105254917B (zh) 一种利用海藻酸钠水凝胶制备细胞膜片的方法
CN106635954A (zh) 一种基于3d生物打印构建三维血管组织的方法
CN101347640A (zh) 用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型及其构建方法
CN105112355B (zh) 一种黑色素细胞的培养方法
CN105219696A (zh) 一种新型的人表皮培养方法
CN107287152A (zh) 用于化妆品抗衰检测的双层皮肤模型的构建方法及培养液
CN102102090A (zh) 一种非接触共培养诱导干细胞体外定向分化的方法
CN109984977A (zh) 一种含植物糖原的精华液及其制备方法
CN104877953B (zh) 促进黑色素细胞色素产生的皮肤制剂的制备方法
CN103563649B (zh) 一种北虫草栽培方法
CN103243039A (zh) 一种副干酪乳杆菌的高密度培养方法
Biran et al. High‐density lipoprotein and extracellular matrix promotes growth and plating efficiency of normal human mammary epithelial cells in serum‐free medium
CN107287151A (zh) 一种含黑色素细胞的体外皮肤测试模型的构建方法
CN105085938B (zh) 白芨多糖水凝胶、培养基质及其应用与诱导脐带间充质干细胞向角膜上皮细胞分化的方法
CN106568911A (zh) 一种离体状态的模拟皮肤模型
CN101787375B (zh) 一种反向非病毒载体基因转染的方法
CN103320385A (zh) 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法
CN107164314A (zh) 一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法
CN105420278A (zh) 采用光致穿孔的方式制备负载有外源分子细胞的方法及制备该细胞用的基材及该细胞
CN104459145A (zh) 一种化妆品检测
CN101892286B (zh) 黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法
CN107129966A (zh) 一种含血清的角膜上皮细胞培养液

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20170915

WW01 Invention patent application withdrawn after publication