CN105112355A - 一种黑色素细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑色素细胞的培养方法。该方法包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2-4h，所述预培养基为：DMEM培养基与Hamˊs？F-12培养基按体积比2-4:1混合；腺嘌呤1.6-2.0×10-4M；青霉素80-100单位/mL；链霉素80-100μg/mL；氢化可的松0.1-0.5μg/mL；胰岛素2-6μg/mL；表皮生长因子5-12ng/mL；霍乱毒素0.8-1.5×10-10M；胎牛血清4-7％。上述方法中的预培养，促进了黑色素细胞贴壁，提高了黑色素细胞所占比例和细胞活性。传代后从最初的黑色素细胞占1％，最高提高到了90％，并且黑色素细胞形态和功能及遗传性状稳定。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种黑色素细胞的培养方法。
背景技术
白癜风是由于皮肤和毛囊的黑色素细胞(melanocyte，MC)内酪氨酸系统的功能减退、丧失引起的一种以局限性或泛发性色素脱失为特征的皮肤粘膜疾病。黑色素细胞位于表皮的基底层，与表皮细胞共同组成表皮黑素单位,其主要功能是产生黑素小体保护皮肤免受损害。
白癜风患者皮损部位的黑色素细胞变化过程是由早期功能失活到晚期缺失，基于这一病理变化，有效治疗的原理是将自身的黑色素细胞从健康皮肤移植到无黑色素细胞的白斑区，并在移植后成活产生黑素。这一治疗原理是临床中白癜风移植治疗的依据,在移植治疗中,黑色素细胞混悬液移植法为有效手段之一，治愈率达90％以上，其过程为：以非培养或培养的方式制备黑色素细胞悬液，然后将黑色素细胞悬液以700-1000/mm2密度移植到受皮区。
由于黑色素细胞仅占表皮细胞数量的1％左右，而且其生长缓慢，增殖能力极为有限，所以如何在培养过程中去除角质形成细胞是黑色素细胞培养的重点，同时黑色素细胞在培养过程中极易被成纤维细胞污染，有时即使混入了极少量的成纤维细胞也会导致培养的失败。现有技术中，采用既能促进黑色素细胞生长又能抑制角质形成细胞TPA(12-o-tetradecanoylphorbol-13-acetate)和霍乱毒素基本上解决了上述问题。但是TPA具有潜在的促肿瘤作用，从而使上述培养方法在临床上受到了限制。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和二丁酰环腺苷酸(dbcAMP)作为添加剂替代TPA进行原代培养则解决了上述技术问题，该技术可以使促进黑色素细胞生长，并且规避了TPA具有潜在的促肿瘤的风险。一旦发生了成纤维细胞的混杂,一般情况下采用加入G418等有丝分裂细胞抑制剂、降低钙离子浓度或机械刮除等方法以去除成纤维细胞，但是大多数方法不仅达不到完全除去成纤维细胞的效果,更在抑制成纤维细胞的同时也影响了黑色素细胞的生长。
利用上述方法培养的黑色素细胞，占表皮细胞的比例不高，总数有限，分化活性不高，不能满足临床需要。
发明内容
为了解决现有技术黑色素细胞培养中黑色素细胞的比例和总数不高，增殖和分化活性低的问题，提供一种可以产生高比例、高分化活性的黑色素细胞的培养方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种黑色素细胞的培养方法，包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2-4h，所述预培养基为：
DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比2-4:1混合；
腺嘌呤1.6-2.0×10-4M；
青霉素80-100单位/mL；
链霉素80-120μg/mL；
氢化可的松0.1-0.5μg/mL；
胰岛素2-6μg/mL；
表皮生长因子5-12ng/mL；
霍乱毒素0.8-1.5×10-10M；
胎牛血清4-7％(体积浓度)。
上述黑色素细胞的培养方法，优选的，所述预培养基为：DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比3:1混合；
腺嘌呤1.8×10-4M；
青霉素100单位/mL；
链霉素100μg/mL；
氢化可的松0.4μg/mL；
胰岛素5μg/mL；
表皮生长因子10ng/mL；
霍乱毒素1.2×10-10M；
胎牛血清5％(体积浓度)。
上述黑色素细胞的培养方法中，在预培养之前还包括：将离体的表皮用分解混合酶进行消化培养0.5-2小时，终止消化后，过滤、离心，然后接种预培养基进行预培养；所述分解混合酶为胰蛋白酶或和I型胶原酶。
上述黑色素细胞的培养方法中，预培养的接种密度为2-10×104个细胞/cm2。
上述黑色素细胞的培养方法中，将预培养后的黑色素细胞转移到增殖培养基进行增殖培养。
上述黑色素细胞的培养方法中，预培养后，去掉预培养基，然后将贴壁后的细胞转移到增殖培养基，所述增殖培养基为M2培养基。
上述黑色素细胞的培养方法中，所述增殖培养的方法为：每周换液3次，当细胞达到70-80％饱和后，对黑色素细胞进行消化，回收，重悬，播种进行扩增传代。
上述黑色素细胞的培养方法中，对黑色素细胞进行消化的方法为：将1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液加入到培养基中，孵育3-5min，终止消化。
上述黑色素细胞的培养方法中，所述播种的密度为5-10×103个细胞/cm2。
一种黑色素细胞悬液制剂的制备方法，将利用上培养方法培养传代3-4代后的黑色素细胞消化、离心，用黑色素细胞悬液重悬细胞，制备黑色素细胞悬液制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明的黑色素细胞的培养方法，在黑色素细胞增殖培养之前进行预培养，预培养基中的血清成分，可迅速改善分解酶处理过程中对细胞造成的损伤；在预培养基中DMEM培养基和Ham'sF-12培养基、FBS以及其他组分相互作用下，促进黑色素细胞优先于表皮细胞贴壁；在2-4小时内，即可以达到有效数目的黑色素细胞的贴壁；同时实现了对于表皮细胞的优选，活性好、贴壁性能保持良好的角质形成细胞优先贴壁，分化了的增殖性低的角质形成细胞以及受损严重的角质形成细胞不贴壁。同时通过预培养，提早除去贴壁不良或者不能贴壁的细胞，有效提高了培养基成分的有效利用。预培养为后续表皮细胞形成活性高的克隆并通过旁分泌更快地促进黑色素细胞的增殖以及维持其在良好的分化状态和细胞功能以及稳定的遗传性状提供了基础。
2、本发明的黑色素细胞的培养方法，用了胰蛋白酶和I型胶原酶的分解混合酶代替了原来的单一分解酶，低浓度的胰蛋白酶与I型胶原酶配合，在保证细胞消化均匀的前提下，减少了对细胞损伤，保证了细胞的良好状态。
3、本发明的黑色素细胞的培养方法，传代时，严格控制胰蛋白酶的加入量和处理时间，使黑色素细胞会优先于表皮细胞被胰蛋白酶处理下来的，以此来提高黑色素细胞浓度和比例。由此，通过原代培养时候的预培养和控制传代时的胰蛋白酶处理时间，维持少量的表皮细胞的增生活性，而良好的表皮细胞增生会通过旁分泌的形式促进黑色素细胞增生并维持分化活性，从而减少了黑色素细胞有脱分化。
4、本发明的黑色素细胞的培养方法，经过3-4代后，培养的黑色素细胞总数就能扩增到5-10×106细胞数/mL，黑色素细胞与表皮细胞的比例从最初的黑色素细胞占1％，通过培养，提高到了80-90％，并且培养的黑色素细胞形态和功能及遗传性状稳定，满足临床需要。
5、本发明的黑色素细胞悬液制剂的制备方法，黑色素细胞悬液制剂中黑色素细胞数量和比例高、增殖和分化活性高，不使用TPA或G-418安全性高，以供患者再次需要时使用。
附图说明
图1为黑色素细胞增殖培养第三天的状态(20倍物镜)。
图2为黑色素细胞增殖培养第七天的状态(10倍物镜)。
图3为培养的黑色素细胞(4倍物镜)。
图4为培养的黑色素细胞(10倍物镜)。
图5为培养的黑色素细胞(20倍物镜)。
图6为多巴染色的黑色素细胞(10倍物镜)。
图7为多巴染色的黑色素细胞(20倍物镜)。
图8为多巴染色的黑色素细胞(40倍物镜)。
图9为无预培养的黑色素细胞培养第三天的状态(20倍物镜)。
图10为无预培养的黑色素细胞培养第七天的状态(10倍物镜)。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实例对本发明作进一步说明。
实施例1
将20mLDMEM培养基和青霉素、链霉素(青霉素100单位/mL；链霉素100μg/mL)加入50mL离心管，作为皮肤吸泡保存液。
将1mL、10g/L的I型胶原酶加入Φ60mm培养皿，备用。将离体的表皮(吸泡取皮方式获取，8-15个吸泡)放入上述培养皿中，并用眼科剪将表皮剪碎成2mm×2mm的碎片。
剪碎后向培养皿中补加为1mL、2.5g/L胰蛋白酶·0.38g/LEDTA溶液，放入37℃培养箱中，1个小时。
每隔半小时，取出培养皿在显微镜下观察消化的状况。1h后将培养皿取出吹打皮肤碎片，显微镜下观察，如果发现表皮上细胞基本消化完全，即加入预培养基终止消化。
将消化的皮片和悬浮液回收到15mL离心管中，用细胞滤网过滤，并离心，的离心后的细胞。
用5-15mL的预培养基重悬，吹打均匀后接种到1-3个Φ60mm培养皿，播种密度设为4×104个细胞/cm2，放入培养箱中。
预培养基组成为：DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比3:1混合；腺嘌呤1.8×10-4M；青霉素100单位/ml；链霉素100μg/ml；氢化可的松0.4μg/ml；胰岛素5μg/ml；表皮生长因子10ng/ml；霍乱毒素1.2×10-10M；胎牛血清5％。
2个小时后，观察细胞贴壁的情况，去除培养皿中的培养液，加入5mLM2培养基进行增殖培养。
在进行增殖培养后的第二天会发现贴壁的表皮细胞状态好，克隆状态好，播种的第三天即可以发现在表皮细胞克隆周边有黑色素细胞分裂像，如图1所示。播种后第七天可见表皮细胞克隆间隙中的大量的黑色素细胞克隆，黑色素细胞生长增殖快，分化状态好，如图2所示。
每周换液3次，当细胞达到70％饱和后，对细胞进行消化，回收，重悬，播种进行扩增传代。
消化的步骤：用PBS清洗，加入1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液，3分钟后常温消化，显微镜下观察到黑色素细胞已经从培养皿上剥离，即终止消化，回收细胞，重悬接种，接种密度为5×103个细胞/cm2。
上述消化的步骤可以优先将黑色素细胞消化下来。
3周内，传代到3代。此时培养中的黑色素细胞具有良好的增殖活性和分化活性，细胞数目可以达到0.7×107细胞数/mL，黑色素细胞占80％，黑色素细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现两个以上分枝，黑色素细胞的分枝可以彼此相连，也可以伸长到周边的表皮细胞，见图3-5。将细胞进行多巴染色，黑色素细胞呈现阳染。
细胞传至4代时，此时培养中的黑色素细胞具有良好的增殖活性和分化活性，细胞数目可以达到1×107细胞数/mL，黑色素细胞占90％。用移液管吸取DPBS加到培养皿中，清洗培养皿。每个Φ60mm中加入1mL1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液，室温下孵育3-5min，显微镜下确认黑色素细胞完全脱落后,加入胰蛋白酶终止液。回收细胞离心。用不含抗生素的M2培养基或者受试者的条件培养基重悬细胞制备黑色素细胞悬液制剂。细胞重悬液的数量以可治疗面积来决定。
制备成黑色素细胞悬液制剂后，将细胞进行检测，细胞多巴染色时阳性比例高，如图6-8所示。黑色素细胞悬液制剂离心后，细胞沉淀发灰或灰黑，相差显微镜下观察黑色素细胞呈网络排列，形态上细胞体小，呈现两个以上分枝，黑色素细胞的分枝可以彼此相连，也可以伸长到周边的表皮细胞。上述表现说明制备的黑色素细胞悬液制剂中黑色素细胞分化活性高、细胞状态良好。
或者将离心细胞加入到2mL冻存管中，用parafilm封存。剩余的上清也用parafilm封存，备用。
实施例2
将20mLDMEM培养基和青霉素、链霉素(青霉素100单位/mL；链霉素100μg/mL)加入50mL离心管，作为皮肤吸泡保存液。
将1mL、10g/L的I型胶原酶加入Φ60mm培养皿，备用。将离体的表皮(吸泡取皮方式获取，8-15个吸泡)放入上述培养皿中，并用眼科剪将表皮剪碎成2mm×2mm的碎片。
剪碎后向培养皿中补加为1mL、2.5g/L胰蛋白酶·0.38g/LEDTA溶液，放入37℃培养箱中，1个小时。
每隔半小时，取出培养皿在显微镜下观察消化的状况。1h后将培养皿取出吹打皮肤碎片，显微镜下观察，如果发现表皮上细胞基本消化完全，终止消化。
将消化的皮片和悬浮液回收，回收到15mL离心管中，用细胞滤网过滤，并离心。
用5-15mL的M2培养基重悬，吹打均匀后接种到Φ60mm培养皿。播种密度设为5×103cells/cm2，放入培养箱中。
在播种后的播种的第三天可以发现在表皮细胞克隆周边贴壁的黑色素细胞，尚未观察到分裂像，如图9所示。播种后第七天可见表皮细胞克隆间隙中的很少的黑色素细胞增生，如图10所示。黑色素细胞增殖生长速度慢，增殖活性不高，占表皮细胞的比例不高。
实施例3
将20mLDMEM培养基和青霉素、链霉素(青霉素100单位/mL；链霉素100μg/mL)加入50mL离心管，作为皮肤吸泡保存液。
将1mL、10g/L的I型胶原酶加入Φ60mm培养皿，备用。将离体的表皮(吸泡取皮方式获取，8-15个吸泡)放入上述培养皿中，并用眼科剪将表皮剪碎成2mm×2mm的碎片。
剪碎后向培养皿中补加为1mL、2.5g/L胰蛋白酶·0.38g/LEDTA溶液，放入37℃培养箱中，0.5个小时。
每隔15分钟，取出培养皿在显微镜下观察消化的状况。0.5h后将培养皿取出吹打皮肤碎片，显微镜下观察，如果发现表皮上细胞基本消化完全，即加入预培养液终止消化。
将消化的皮片和悬浮液回收，回收到15mL离心管中，用细胞滤网过滤，并离心。
用5-15mL的黑色素细胞预培养基重悬，吹打均匀后接种到1-3个Φ60mm培养皿。播种密度设为10×104个细胞/cm2，放入培养箱中。所述预培养基组成为：DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比2:1混合；腺嘌呤1.6×10-4M；青霉素800单位/ml；链霉素800μg/ml；氢化可的松0.5μg/ml；胰岛素6μg/ml；表皮生长因子5ng/ml；霍乱毒素0.8×10-10M；胎牛血清7％。
4个小时后，观察细胞贴壁的情况，去除培养皿中的培养液，加入5mLM2培养基进行增殖培养。
每周换液3次，当细胞达到80％饱和后，对黑色素细胞进行优先消化，回收，重悬，播种进行扩增传代。
优先消化的步骤：用PBS清洗，加入1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液，5分钟后常温消化，显微镜下观察到黑色素细胞已经从培养皿上剥离，即终止消化，回收细胞，重悬接种，接种密度为10×103个细胞/cm2。
3周内，可以传代到3代。此时的黑色素细胞，黑色素细胞与表皮细胞的比例提高到了80％，黑色素细胞数目可以达到5×106细胞数/mL，细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现两个以上分枝，黑色素细胞的分枝可以彼此相连，也可以伸长到周边的表皮细胞。将细胞进行多巴染色，黑色素细胞呈现阳染。
细胞扩增数量足够厚时，用移液管吸取DPBS加到培养皿中，清洗培养皿。每个Φ60mm中加入1mL1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液，室温下孵育5min，显微镜下确认黑色素细胞完全脱落后,加入胰蛋白酶终止液。回收细胞离心。
用不含抗生素的M2培养基重悬细胞制备黑色素细胞悬液制剂。细胞重悬液的数量以可治疗面积来决定。
制备成黑色素细胞悬液制剂后，将细胞进行检测，细胞多巴染色时阳性比例高。黑色素细胞悬液制剂离心后，细胞沉淀发灰或灰黑，相差显微镜下观察细胞分枝少，呈现成纤维细胞状态。
实施例4
将20mLDMEM培养基和青霉素、链霉素(青霉素100单位/mL；链霉素100μg/mL)加入50mL离心管，作为皮肤吸泡保存液。
将1mL、10g/L的I型胶原酶加入Φ60mm培养皿，备用。将离体的表皮(吸泡取皮方式获取，8-15个吸泡)放入上述培养皿中，并用眼科剪将表皮剪碎成2mm×2mm的碎片。
剪碎后向培养皿中补加为1mL、2.5g/L胰蛋白酶·0.38g/LEDTA溶液，放入37℃培养箱中，2个小时。
每隔半小时，取出培养皿在显微镜下观察消化的状况。2h后将培养皿取出吹打皮肤碎片，显微镜下观察，如果发现表皮上细胞基本消化完全，即加入预培养液终止消化。
将消化的皮片和悬浮液回收，回收到15mL离心管中，用细胞滤网过滤，并离心。
根据细胞数量用5-15mL的黑色素细胞预培养基重悬，吹打均匀后接种到1-3个Φ60mm培养皿。播种密度设为2×104个细胞/cm2，放入培养箱中。所述预培养基组成为：DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比4:1混合；腺嘌呤2.0×10-4M；青霉素1200单位/mL；链霉素1200μg/mL；氢化可的松0.1μg/mL；胰岛素1μg/mL；表皮生长因子12ng/mL；霍乱毒素1.5×10-10M；胎牛血清4％。
2个小时后，观察细胞贴壁的情况，去除培养皿中的培养液，加入5mLM2培养基进行增殖培养。
3-4周内，可以传代到3-4代。传到3代时的黑色素细胞，黑色素细胞与表皮细胞的比例提高到了85％，黑色素细胞数目可以达到0.8×107细胞数/mL，细胞呈网络状克隆样增殖，形态上细胞体小，呈现两个以上分枝，黑色素细胞的分枝可以彼此相连，也可以伸长到周边的表皮细胞。将细胞进行多巴染色，黑色素细胞呈现阳染。
细胞扩增数量足够厚时，用移液管吸取DPBS加到培养皿中，清洗培养皿。每个Φ60mm中加入1mL1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液，室温下孵育4min，显微镜下确认黑色素细胞完全脱落后,加入胰蛋白酶终止液。回收细胞离心。用不含抗生素的M2培养基重悬细胞制备黑色素细胞悬液制剂。细胞重悬液的数量以可治疗面积来决定。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种黑色素细胞的培养方法，其特征在于，包括在黑色素细胞增殖培养之前先进行预培养2-4h，所述预培养基为：
DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比2-4:1混合；
腺嘌呤1.6-2.0×10-4M；
青霉素80-100单位/mL；
链霉素80-120μg/mL；
氢化可的松0.1-0.5μg/mL；
胰岛素2-6μg/mL；
表皮生长因子5-12ng/mL；
霍乱毒素0.8-1.5×10-10M；
胎牛血清4-7％。
2.根据权利要求1所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，所述预培养基为：DMEM培养基与Ham'sF-12培养基按体积比3:1混合；
腺嘌呤1.8×10-4M；
青霉素100单位/mL；
链霉素100μg/mL；
氢化可的松0.4μg/mL；
胰岛素5μg/mL；
表皮生长因子10ng/mL；
霍乱毒素1.2×10-10M；
胎牛血清5％。
3.根据权利要求1或2所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，在预培养之前还包括：将离体的表皮用分解混合酶进行消化培养0.5-2小时，终止消化后，过滤、离心，然后接种预培养基进行预培养；所述分解混合酶为胰蛋白酶或和I型胶原酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，预培养的接种密度为2-10×104个细胞/cm2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，将预培养后的黑色素细胞转移到增殖培养基进行增殖培养。
6.根据权利要求5所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，预培养后，去掉预培养基，然后将贴壁后的细胞转移到增殖培养基，所述增殖培养基为M2培养基。
7.根据权利要求5或6所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，所述增殖培养的方法为：每周换液3次，当细胞达到70-80％饱和后，对黑色素细胞进行消化，回收，重悬，播种进行扩增传代。
8.根据权利要求7所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，对黑色素细胞进行消化的方法为：将1g/L胰蛋白酶·0.152g/LEDTA溶液加入到培养基中，孵育3-5min，终止消化。
9.根据权利要求7或8所述的黑色素细胞的培养方法，其特征在于，所述播种的密度为5-10×103个细胞/cm2。
10.一种黑色素细胞悬液制剂的制备方法，其特征在于，将利用权利要求1-10任一项所述的培养方法培养传代3-4代后的黑色素细胞消化、离心，用黑色素细胞悬液重悬细胞，制备黑色素细胞悬液制剂。
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