CN109576213B - 一种黑色素细胞液的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种黑色素细胞液的制备方法及其应用，所述黑色素细胞液的制备方法包括以下步骤：S1、取黑色素疱壁用无菌PBS清洗，再放入胰蛋白酶中，保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，离心，弃去上清液，留取沉淀物；S2、向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度，接种于培养瓶中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素，当细胞达到80％～90％融合后，用胰蛋白酶‑EDTA对黑素细胞进行消化传代，即得黑色素细胞液。本发明提出的制备方法，操作简单，黑色素细胞的存活率高、增殖速度快，制备得到的黑色素细胞液能应用于自体黑色素细胞移植中。

Description

一种黑色素细胞液的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，涉及一种黑色素细胞液的制备方法及其应用，具体涉及一种用于治疗白癜风的黑色素细胞液的制备方法及其在自体黑色素细胞移植中的应用。
背景技术
白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病。由于皮肤的黑素细胞功能消失引起，全身各部位均可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等部位。目前医学上常用的治疗手段有药物治疗、物理治疗和表皮移植治疗。但药物治疗和物理治疗对顽固型白癜风的治疗效果不佳。所以针对顽固型白癜风常采用表皮移植治疗，传统的表皮移植治疗是直接将患者自体正常部位的皮肤表皮层移植于白斑皮损区，以增加皮损区黑色素细胞的数量，但对于白斑皮损区面积较大或者数量较多的患者就需要多次在正常部位去皮，会造成患者的痛苦。近年来，自体黑色素细胞培养后再移植，逐渐兴起，其可以通过一次取皮培养多个黑色素细胞，以减轻传统移植方法中患者的痛苦。但是目前自体黑色素细胞培养后再移植仍存在以下弊端：1)由于患者自身可能存在的黑色素细胞异常会直接影响自体黑色素细胞培养后再移植的成功率，导致治愈率不高；2)多数情况下，移植的细胞不能很好地存活和增殖。基于现有技术的不足，本发明提出一种黑色素细胞液的制备方法及其应用。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的治疗方法对顽固型白癜风的治疗效果不佳，表皮移植治疗方法对大面积或多数量患者的去皮次数较多、创伤较大，且目前自体黑色素细胞培养后再移植的治疗方法中存在治愈率低、黑色素细胞存活和增殖率低的问题，而提出的一种黑色素细胞液的制备方法及其应用。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗2～3次，再放入浓度为0.05％～0.25％的胰蛋白酶中，于2～5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000～3000r/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，留取沉淀物；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3～6×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素80～150ug/ml，1～3天换液一次，当细胞达到80％～90％融合后，用浓度为0.02％～0.1％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：7％～15％的血清、0.5％～2％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂10～30ug/ml、佛波酯40～60ng/ml、聚乙二醇200 20～40ng/ml、内皮素20～40ng/ml、海藻糖15～25g/ml、霍乱毒素10～20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05～0.2mmol/L、原钒酸钠0.5～2umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
优选的，所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次。
优选的，所述吸疱时的工作负压为40～60kPa、时间60～90min。
优选的，所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：10％的血清、1.5％的青霉素-链霉素、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子25ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂20ug/ml、佛波酯50ng/ml、聚乙二醇20030ng/ml、内皮素30ng/ml、海藻糖20g/ml、霍乱毒素15ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.15mmol/L、原钒酸钠1.5umol/L。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，包括以下步骤：
A、制备用于移植的脱细胞羊膜：
a、取新鲜的胎盘，剥离出羊膜，羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用细胞刮刀将羊膜双面刮干净，并用PBS清洗，得到干净的半透明羊膜；
b、用体积浓度为75％的酒精将半透明羊膜漂洗1～2次，再用PBS漂洗2～4次，得PBS混合液，然后将由青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合液进行混合得到双抗/PBS混合溶液，其中：青霉素-链霉素混合溶液在双抗/PBS混合溶液中的含量为200～600U/L，再将半透明羊膜按体积比为1：1～3置于双抗/PBS混合溶液中浸泡震荡，每12～24h换液一次，共三次，每次换液时用细胞刮刀将羊膜双面刮干净；
c、将青霉素、链霉素、曲拉通100混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中：青霉素在综合PBS溶液中的含量为200～600U/L，链霉素在综合PBS溶液中的含量为200～600U/L，曲拉通100在综合PBS溶液中的重量比为0.5％～3％，将步骤b处理后的半透明羊膜按体积比为1：1～3的体积比置于综合PBS溶液中，于30～40℃浸泡震荡，每8～12h换液一次，共两次，然后将半透明羊膜用细胞刮刀刮洗干净，用双抗/PBS混合溶液漂洗1～2次；
d、将步骤c处理后的半透明羊膜按1：1～2的体积比浸泡在胰脂酶双抗水溶液中，所述胰脂酶双抗水溶液由青霉素-链霉素混合溶液和胰脂酶混合而来，其中：胰脂酶在胰脂酶双抗水溶液中的含量为1000～4000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在胰脂酶双抗水溶液中含量为200～600U/L，然后在胰脂酶双抗水溶液温度为30～40℃下震荡处理两次，第一次10～20h，第二次5～10h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液漂洗1～2次；
e、将步骤d处理得到的半透明羊膜按体积比为1：1～3浸泡在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中，所述DNA酶/双抗/PBS混合溶液由DNA酶、青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合而来，其中：DNA酶在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中的含量为2000～5000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中含量为200～600U/L，并在溶液温度为30～40℃下震荡处理10～20h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液震荡漂洗；
f、将步骤e处理得到的半透明羊膜从DNA酶/双抗/PBS溶液中取出，置于双抗/PBS混合溶液中震荡漂洗，每12h换液一次，共两次，得到脱细胞羊膜，并将脱细胞羊膜放到双抗/PBS混合溶液中，在4℃的温度下保存待用；
g、将步骤f处理得到的脱细胞羊膜铺展于聚四氟乙烯板上，于40～50℃下烘干15～20h，然后根据移植面积需要裁剪成不同大小规格，包装完成后用钴60辐照灭菌，即得用于移植的脱细胞羊膜；
所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml；
B、用浓度为0.05％～0.25％的胰蛋白酶将黑色素细胞液消化成单个细胞，并按照3～5×104接种于步骤A得到的用于移植的脱细胞羊膜上，当达到80％～90％融合时，即为黑色素羊膜；
C、用复方利多卡因软膏涂抹移植区皮肤表面，再用超脉冲CO2激光磨削去除表层皮，能量为200～300mJ/s，然后将黑色素羊膜侧贴于磨削面，无菌纱布包牢，再进行术后常规处理即可。
本发明提出的制备方法，与现有技术相比优点在于：
1、本发明提出的制备方法，操作简单，对黑色素疱壁进行预处理后再用黑色素细胞完全培养基进行培养，以达到黑色素细胞的高存活和快速增殖，制备得到的黑色素细胞液能够在自体黑色素细胞移植中应用，能将取自患者自体的黑色素进行体外培养、增殖，再接种在用于移植的脱细胞羊膜上，最后移植在患者皮肤表面，仅需从患者取一次黑色素疱壁，即可进行多数量、大面积的黑色素细胞移植，避免传统表皮移植治疗的取皮次数多，对患者创伤大的问题，并并经实验证明可以有效治愈顽固型白癜风，有效解决了传统药物或物理治疗方法对顽固型白癜风的治疗效果不佳，以及自体黑色素细胞移植的治疗方法中存在治愈率低、黑色素细胞存活和增殖率低的问题。
2、本发明提出的制备方法中使用的黑色素细胞完全培养基由血清、青霉素-链霉素和Ham F10细胞培养基为基本组成，并添加合理比例的成纤维细胞生长因子、磷酸二酯酶抑制剂、佛波酯、聚乙二醇200、内皮素、海藻糖、霍乱毒素、二丁酰环腺苷酸和原钒酸钠，尤其是聚乙二醇200和海藻糖的加入可以起到协同增效的作用，两者同时添加可以显著提高黑色素细胞的存活率，保证黑色素细胞的质量，加速正常黑色素细胞的增殖速度，提高自体黑色素细胞移植的成功率，进而提高自体黑色素细胞移植对顽固型、大面积白癜风患者治愈率，经实验证明本发明制备得到的黑色素细胞液应用到顽固型白癜风治疗中的治疗效果显著。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗3次，再放入浓度为0.05％的胰蛋白酶中，于5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000r/min的转速下离心10min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为40kPa、时间90min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素150ug/ml，3天换液一次，当细胞达到80％融合后，用浓度为0.02％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：15％的血清、0.5％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂30ug/ml、佛波酯40ng/ml、聚乙二醇20040ng/ml、内皮素20ng/ml、海藻糖15g/ml、霍乱毒素20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05mmol/L、原钒酸钠2umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，包括以下步骤：
A、制备用于移植的脱细胞羊膜：
a、取新鲜的胎盘，剥离出羊膜，羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用细胞刮刀将羊膜双面刮干净，并用PBS清洗，得到干净的半透明羊膜；
b、用体积浓度为75％的酒精将半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗2次，得PBS混合液，然后将由青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合液进行混合得到双抗/PBS混合溶液，其中：青霉素-链霉素混合溶液在双抗/PBS混合溶液中的含量为600U/L，再将半透明羊膜按体积比为1：1置于双抗/PBS混合溶液中浸泡震荡，每24h换液一次，共三次，每次换液时用细胞刮刀将羊膜双面刮干净；
c、将青霉素、链霉素、曲拉通100混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中：青霉素在综合PBS溶液中的含量为600U/L，链霉素在综合PBS溶液中的含量为600U/L，曲拉通100在综合PBS溶液中的重量比为0.5％，将步骤b处理后的半透明羊膜按体积比为1：1的体积比置于综合PBS溶液中，于40℃浸泡震荡，每12h换液一次，共两次，然后将半透明羊膜用细胞刮刀刮洗干净，用双抗/PBS混合溶液漂洗1次；
d、将步骤c处理后的半透明羊膜按1：2的体积比浸泡在胰脂酶双抗水溶液中，所述胰脂酶双抗水溶液由青霉素-链霉素混合溶液和胰脂酶混合而来，其中：胰脂酶在胰脂酶双抗水溶液中的含量为4000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在胰脂酶双抗水溶液中含量为600U/L，然后在胰脂酶双抗水溶液温度为30℃下震荡处理两次，第一次20h，第二次5h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液漂洗1次；
e、将步骤d处理得到的半透明羊膜按体积比为1：3浸泡在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中，所述DNA酶/双抗/PBS混合溶液由DNA酶、青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合而来，其中：DNA酶在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中的含量为2000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中含量为600U/L，并在溶液温度为30℃下震荡处理20h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液震荡漂洗；
f、将步骤e处理得到的半透明羊膜从DNA酶/双抗/PBS溶液中取出，置于双抗/PBS混合溶液中震荡漂洗，每12h换液一次，共两次，得到脱细胞羊膜，并将脱细胞羊膜放到双抗/PBS混合溶液中，在4℃的温度下保存待用；
g、将步骤f处理得到的脱细胞羊膜铺展于聚四氟乙烯板上，于50℃下烘干15h，然后根据移植面积需要裁剪成不同大小规格，包装完成后用钴60辐照灭菌，即得用于移植的脱细胞羊膜；
所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml；
B、用浓度为0.25％的胰蛋白酶将黑色素细胞液消化成单个细胞，并按照3×104接种于步骤A得到的用于移植的脱细胞羊膜上，当达到90％融合时，即为黑色素羊膜；
C、用复方利多卡因软膏涂抹移植区皮肤表面，再用超脉冲CO2激光磨削去除表层皮，能量为200mJ/s，然后将黑色素羊膜侧贴于磨削面，无菌纱布包牢，再进行术后常规处理即可。
利用实施例1制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对12例顽固型白癜风患者的31处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，12例患者中有11例患者的27处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
实施例2
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗3次，再放入浓度为0.15％的胰蛋白酶中，于4℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在2000r/min的转速下离心8min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为50kPa、时间75min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为4×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素120ug/ml，2天换液一次，当细胞达到85％融合后，用浓度为0.06％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：15％的血清、0.5％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂30ug/ml、佛波酯40ng/ml、聚乙二醇20040ng/ml、内皮素20ng/ml、海藻糖15g/ml、霍乱毒素20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05mmol/L、原钒酸钠2umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，包括以下步骤：
A、制备用于移植的脱细胞羊膜：
a、取新鲜的胎盘，剥离出羊膜，羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用细胞刮刀将羊膜双面刮干净，并用PBS清洗，得到干净的半透明羊膜；
b、用体积浓度为75％的酒精将半透明羊膜漂洗2次，再用PBS漂洗3次，得PBS混合液，然后将由青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合液进行混合得到双抗/PBS混合溶液，其中：青霉素-链霉素混合溶液在双抗/PBS混合溶液中的含量均为400U/L，再将半透明羊膜按体积比为1：2置于双抗/PBS混合溶液中浸泡震荡，每12h换液一次，共三次，每次换液时用细胞刮刀将羊膜双面刮干净；
c、将青霉素、链霉素、曲拉通100混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中：青霉素在综合PBS溶液中的含量为400U/L，链霉素在综合PBS溶液中的含量为400U/L，曲拉通100在综合PBS溶液中的重量比为0.2％，将步骤b处理后的半透明羊膜按体积比为1：2的体积比置于综合PBS溶液中，于40℃浸泡震荡，每12h换液一次，共两次，然后将半透明羊膜用细胞刮刀刮洗干净，用双抗/PBS混合溶液漂洗2次；
d、将步骤c处理后的半透明羊膜按1：2的体积比浸泡在胰脂酶双抗水溶液中，所述胰脂酶双抗水溶液由青霉素-链霉素混合溶液和胰脂酶混合而来，其中：胰脂酶在胰脂酶双抗水溶液中的含量为2000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在胰脂酶双抗水溶液中含量为400U/L，然后在胰脂酶双抗水溶液温度为40℃下震荡处理两次，第一次15h，第二次8h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液漂洗2次；
e、将步骤d处理得到的半透明羊膜按体积比为1：2浸泡在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中，所述DNA酶/双抗/PBS混合溶液由DNA酶、青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合而来，其中：DNA酶在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中的含量为4000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中含量为400U/L，并在溶液温度为40℃下震荡处理15h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液震荡漂洗；
f、将步骤e处理得到的半透明羊膜从DNA酶/双抗/PBS溶液中取出，置于双抗/PBS混合溶液中震荡漂洗，每12h换液一次，共两次，得到脱细胞羊膜，并将脱细胞羊膜放到双抗/PBS混合溶液中，在4℃的温度下保存待用；
g、将步骤f处理得到的脱细胞羊膜铺展于聚四氟乙烯板上，于45℃下烘干18h，然后根据移植面积需要裁剪成不同大小规格，包装完成后用钴60辐照灭菌，即得用于移植的脱细胞羊膜；
所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml；
B、用浓度为0.15％的胰蛋白酶将黑色素细胞液消化成单个细胞，并按照4×104接种于步骤A得到的用于移植的脱细胞羊膜上，当达到85％融合时，即为黑色素羊膜；
C、用复方利多卡因软膏涂抹移植区皮肤表面，再用超脉冲CO2激光磨削去除表层皮，能量为250mJ/s，然后将黑色素羊膜侧贴于磨削面，无菌纱布包牢，再进行术后常规处理即可。
利用实施例2制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对14例顽固型白癜风患者的38处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，14例患者中有13例患者的35处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
实施例3
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗2次，再放入浓度为0.25％的胰蛋白酶中，于2℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在3000r/min的转速下离心5min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为60kPa、时间60min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为6×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素80ug/ml，1天换液一次，当细胞达到90％融合后，用浓度为0.1％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：7％的血清、2％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子30ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂10ug/ml、佛波酯60ng/ml、聚乙二醇200 20ng/ml、内皮素40ng/ml、海藻糖25g/ml、霍乱毒素10ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.2mmol/L、原钒酸钠0.5umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，包括以下步骤：
A、制备用于移植的脱细胞羊膜：
a、取新鲜的胎盘，剥离出羊膜，羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用细胞刮刀将羊膜双面刮干净，并用PBS清洗，得到干净的半透明羊膜；
b、用体积浓度为75％的酒精将半透明羊膜漂洗1次，再用PBS漂洗4次，得PBS混合液，然后将由青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合液进行混合得到双抗/PBS混合溶液，其中：青霉素-链霉素混合溶液在双抗/PBS混合溶液中的含量为200U/L，再将半透明羊膜按体积比为1：3置于双抗/PBS混合溶液中浸泡震荡，每12h换液一次，共三次，每次换液时用细胞刮刀将羊膜双面刮干净；
c、将青霉素、链霉素、曲拉通100混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中：青霉素在综合PBS溶液中的含量为200U/L，链霉素在综合PBS溶液中的含量为200U/L，曲拉通100在综合PBS溶液中的重量比为3％，将步骤b处理后的半透明羊膜按体积比为1：3的体积比置于综合PBS溶液中，于30℃浸泡震荡，每8h换液一次，共两次，然后将半透明羊膜用细胞刮刀刮洗干净，用双抗/PBS混合溶液漂洗2次；
d、将步骤c处理后的半透明羊膜按1：1的体积比浸泡在胰脂酶双抗水溶液中，所述胰脂酶双抗水溶液由青霉素-链霉素混合溶液和胰脂酶混合而来，其中：胰脂酶在胰脂酶双抗水溶液中的含量为1000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在胰脂酶双抗水溶液中含量为200U/L，然后在胰脂酶双抗水溶液温度为40℃下震荡处理两次，第一次10h，第二次10h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液漂洗2次；
e、将步骤d处理得到的半透明羊膜按体积比为1：1浸泡在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中，所述DNA酶/双抗/PBS混合溶液由DNA酶、青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合而来，其中：DNA酶在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中的含量为5000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在DNA酶/双抗/PBS混合溶液中含量为200U/L，并在溶液温度为40℃下震荡处理10h，然后将半透明羊膜取出用双抗/PBS混合溶液震荡漂洗；
f、将步骤e处理得到的半透明羊膜从DNA酶/双抗/PBS溶液中取出，置于双抗/PBS混合溶液中震荡漂洗，每12h换液一次，共两次，得到脱细胞羊膜，并将脱细胞羊膜放到双抗/PBS混合溶液中，在4℃的温度下保存待用；
g、将步骤f处理得到的脱细胞羊膜铺展于聚四氟乙烯板上，于40℃下烘干20h，然后根据移植面积需要裁剪成不同大小规格，包装完成后用钴60辐照灭菌，即得用于移植的脱细胞羊膜；
所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml；
B、用浓度为0.05％的胰蛋白酶将黑色素细胞液消化成单个细胞，并按照5×104接种于步骤A得到的用于移植的脱细胞羊膜上，当达到80％融合时，即为黑色素羊膜；
C、用复方利多卡因软膏涂抹移植区皮肤表面，再用超脉冲CO2激光磨削去除表层皮，能量为300mJ/s，然后将黑色素羊膜侧贴于磨削面，无菌纱布包牢，再进行术后常规处理即可。
利用实施例3制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对13例顽固型白癜风患者的46处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，13例患者中有11例患者的40处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
对比例1
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗3次，再放入浓度为0.05％的胰蛋白酶中，于5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000r/min的转速下离心10min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为40kPa、时间90min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素150ug/ml，3天换液一次，当细胞达到80％融合后，用浓度为0.02％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：15％的血清、0.5％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，同实施例1。
利用对比例1制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对13例顽固型白癜风患者的28处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，13例患者中有10例患者的14处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
对比例2
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗3次，再放入浓度为0.05％的胰蛋白酶中，于5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000r/min的转速下离心10min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为40kPa、时间90min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素150ug/ml，3天换液一次，当细胞达到80％融合后，用浓度为0.02％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：15％的血清、0.5％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂30ug/ml、佛波酯40ng/ml、内皮素20ng/ml、海藻糖15g/ml、霍乱毒素20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05mmol/L、原钒酸钠2umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，同实施例1。
利用对比例2制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对14例顽固型白癜风患者的33处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，14例患者中有11例患者的20处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
对比例3
本发明提出的一种黑色素细胞液的制备方法，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗3次，再放入浓度为0.05％的胰蛋白酶中，于5℃保存消化过夜，然后加入Ham F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000r/min的转速下离心10min，弃去上清液，留取沉淀物；
所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，吸疱时的工作负压为40kPa、时间90min，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素150ug/ml，3天换液一次，当细胞达到80％融合后，用浓度为0.02％的胰蛋白酶-EDTA对黑素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基包括以下重量百分比的原料：15％的血清、0.5％的青霉素-链霉素混合溶液、余量的Ham F10细胞培养基，且黑色素细胞完全培养基中还包括成纤维细胞生长因子15ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂30ug/ml、佛波酯40ng/ml、聚乙二醇20040ng/ml、内皮素20ng/ml、霍乱毒素20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05mmol/L、原钒酸钠2umol/L；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
上述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中的应用方法，同实施例1。
利用对比例3制备的黑色素细胞液以及在自体黑色素细胞移植中的应用方法，对15例顽固型白癜风患者的39处皮片进行移植治疗，并于2周后进行随访，患者均无红肿等炎症反应，15例患者中有12例患者的24处皮片有色素出现，随访1～6个月，色素持续存在。
上述临床研究数据显示：实施例1～3制得的黑色素细胞液在顽固型白癜风上的治疗效果要远优于对比例，表明通过本发明提出的制备方法制得的黑色素细胞液及其在自体黑色素细胞移植中的应用方法能够对顽固型白癜风具有显著的治疗效果。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种黑色素细胞液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、黑色素疱壁的预处理：取黑色素疱壁用无菌PBS清洗2～3次，再放入浓度为0.05％～0.25％的胰蛋白酶中，于2～5℃保存消化过夜，然后加入Ham-F10细胞培养基，吹打成细胞悬液，在1000～3000r/min的转速下离心5～10min，弃去上清液，留取沉淀物；
S2、黑色素细胞的培养：向沉淀物中加入黑色素细胞完全培养基，吹打成细胞悬液，调整黑色素细胞的浓度为3～6×105/ml，接种于培养瓶中，再置于37℃、5％CO2的培养箱中进行黑色素细胞培养，并于第三天加入基因素80～150ug/ml，1～3天换液一次，当细胞达到80％～90％融合后，用浓度为0.02％～0.1％的胰蛋白酶-EDTA对黑色素细胞进行消化传代即得黑色素细胞液；
所述黑色素细胞完全培养基由以下重量百分比的原料组成：7％～15％的血清、0.5％～2％的青霉素-链霉素混合溶液、成纤维细胞生长因子15～30ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂10～30ug/ml、佛波酯40～60ng/ml、聚乙二醇200 20～40ng/ml、内皮素20～40ng/ml、海藻糖15～25g/ml、霍乱毒素10～20ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.05～0.2mmol/L、原钒酸钠0.5～2umol/L、余量的Ham-F10细胞培养基；所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种黑色素细胞液的制备方法，其特征在于，所述黑色素疱壁由以下方法制得：用表皮分离吸疱仪在正常皮肤处吸疱，疱壁晶莹饱满后，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下即得黑色素疱壁，并将疱壁浸入无菌PBS中，立即送到细胞实验室，再用无菌PBS液清洗2次。
3.根据权利要求2所述的一种黑色素细胞液的制备方法，其特征在于，所述吸疱时的工作负压为40～60kPa、时间60～90min。
4.根据权利要求1所述的一种黑色素细胞液的制备方法，其特征在于，所述黑色素细胞完全培养基由以下重量百分比的原料组成：10％的血清、1.5％的青霉素-链霉素混合溶液、成纤维细胞生长因子25ng/ml、磷酸二酯酶抑制剂20ug/ml、佛波酯50ng/ml、聚乙二醇20030ng/ml、内皮素30ng/ml、海藻糖20g/ml、霍乱毒素15ng/ml、二丁酰环腺苷酸0.15mmol/L、原钒酸钠1.5umol/L、余量的Ham-F10细胞培养基。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中制备黑色素羊膜的应用，其特征在于，应用方法包括以下步骤：
用浓度为0.05％～0.25％的胰蛋白酶将黑色素细胞液消化成单个细胞，并按照3～5×104接种于用于移植的脱细胞羊膜上，当达到80％～90％融合时，即为黑色素羊膜。
6.根据权利要求5所述的一种黑色素细胞液的制备方法所制得的黑色素细胞液在自体黑色素细胞移植中制备黑色素羊膜的应用，其特征在于，制备脱细胞羊膜的方法包括如下步骤：
a、取新鲜的胎盘，剥离出羊膜，羊膜除去血块和绒毛膜，留下包含上皮细胞层、基底膜和无血管基质的完整羊膜组织，用细胞刮刀将羊膜双面刮干净，并用PBS清洗，得到干净的半透明羊膜；
b、用体积浓度为75％的酒精将半透明羊膜漂洗1～2次，再用PBS漂洗2～4次，得PBS混合液，然后将青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合液进行混合得到双抗-PBS混合溶液，其中：青霉素-链霉素混合溶液在双抗-PBS混合溶液中的含量为200～600U/L，再将半透明羊膜按体积比为1：1～3置于双抗-PBS混合溶液中浸泡震荡，每12～24h换液一次，共三次，每次换液时用细胞刮刀将羊膜双面刮干净；
c、将青霉素、链霉素、曲拉通100混合到PBS中形成综合PBS溶液，其中：青霉素在综合PBS溶液中的含量为200～600U/L，链霉素在综合PBS溶液中的含量为200～600U/L，曲拉通100在综合PBS溶液中的重量比为0.5％～3％，将步骤b处理后的半透明羊膜按1：1～3的体积比置于综合PBS溶液中，于30～40℃浸泡震荡，每8～12h换液一次，共两次，然后将半透明羊膜用细胞刮刀刮洗干净，用双抗-PBS混合溶液漂洗1～2次；
d、将步骤c处理后的半透明羊膜按1：1～2的体积比浸泡在胰脂酶双抗水溶液中，所述胰脂酶双抗水溶液由青霉素-链霉素混合溶液和胰脂酶混合而来，其中：胰脂酶在胰脂酶双抗水溶液中的含量为1000～4000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在胰脂酶双抗水溶液中含量为200～600U/L，然后在胰脂酶双抗水溶液温度为30～40℃下震荡处理两次，第一次10～20h，第二次5～10h，然后将半透明羊膜取出用双抗-PBS混合溶液漂洗1～2次；
e、将步骤d处理得到的半透明羊膜按体积比为1：1～3浸泡在DNA酶-双抗-PBS混合溶液中，所述DNA酶-双抗-PBS混合溶液由DNA酶、青霉素-链霉素混合溶液和PBS混合而来，其中：DNA酶在DNA酶-双抗-PBS混合溶液中的含量为2000～5000U/L，青霉素-链霉素混合溶液在DNA酶-双抗-PBS混合溶液中含量为200～600U/L，并在溶液温度为30～40℃下震荡处理10～20h，然后将半透明羊膜取出用双抗-PBS混合溶液震荡漂洗；
f、将步骤e处理得到的半透明羊膜从DNA酶-双抗-PBS溶液中取出，置于双抗-PBS混合溶液中震荡漂洗，每12h换液一次，共两次，得到脱细胞羊膜，并将脱细胞羊膜放到双抗-PBS混合溶液中，在4℃的温度下保存待用；
g、将步骤f处理得到的脱细胞羊膜铺展于聚四氟乙烯板上，于40～50℃下烘干15～20h，然后根据移植面积需要裁剪成不同大小规格，包装完成后用钴60辐照灭菌，即得用于移植的脱细胞羊膜；
所述青霉素-链霉素混合溶液中青霉素的含量为10000U/ml、链霉素的含量为10mg/ml。
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