KR20070008590A

KR20070008590A - 각막 상피 시트, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 이식방법

Info

Publication number: KR20070008590A
Application number: KR1020067018573A
Authority: KR
Inventors: 고지 하시모토; 유지 시라카타; 유이치 오하시; 준지 하무로
Original assignee: 아르브라스트 가부시키가이샤; 고지 하시모토
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-02-14
Publication date: 2007-01-17
Also published as: JPWO2005087285A1; US20070280993A1; WO2005087285A1; EP1736180A4; EP1736180A1; CN1929877A; CA2559582A1

Abstract

본 발명은 높은 치료 효과를 기대할 수 있는 동시에, 이식시 안전성이 높은 각막 상피 시트를 제공한다. 본 발명의 각막 상피 시트는 (a) 각막 상피세포를 제조하는 단계, (b) 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계, (c) 상기 각막 상피세포를 상기 콜라겐 겔 상에 접종 또는 탑재하는 단계 및 (d) 이종 동물 세포의 비존재하에, 상기 각막 상피세포를 배양 및 증식시키는 단계로 제조된다.

각막 상피 시트

Description

각막 상피 시트, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 이식 방법{CORNEAL EPITHELIAL SHEET, METHOD OF CONSTRUCTING THE SAME AND TRANSPLANTATION METHOD USING THE SHEET}

본 발명은 각막 상피 시트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 이종동물(xenogeneic animal) 유래 세포를 영양 세포(feeder cell)로 사용하지 않고, 각막 상피세포를 콜라겐 겔 상에서 배양 및 증식시켜 제조한 각막 상피 시트, 그의 제조 방법, 및 그의 이용(이식 방법 등)에 관한 것이다.

재생 의료에 기여할 것으로 기대되고 있는 조직중 하나가 각막이다. 각막은 안구를 구성하는 광학 시스템의 가장 외층에 위치하는, 혈관이 없는 투명한 조직으로서, 눈물과 함께 평활한 표면을 형성하여 양호한 시력 확보에 기여하고 있다. 또한, 각결막 상피세포(keratoconjunctival epithelial cell)는 항상 외계와 접하고 있어, 외부 미생물 등의 이물질, 자외선 등의 광선 등으로부터 안구를 지키는 방어 작용을 가지고 있다. 즉, 각결막 상피세포는, 항상성을 유지하기 위하여 각막의 투명성과 안구 전체를 보호하는데 매우 중요한 역할을 수행한다.

각막은, 예를 들면, 각막염, 각막궤양, 천공 등의 병증으로 탁해지거나, 투명성이 소실될 수 있다. 이러한 각막의 혼탁으로 인한 영구적인 시력 저하는, 안 구 기증자의 각막을 이용하는 각막 이식으로 치료하고 있다. 각막 이식은 투명성이 소실된 환자의 각막을 제거한 후, 투명한 각막을 이식하는 방법으로, 이러한 이식에 의해 투명성이 회복되고, 다시 시력을 되찾을 수 있다.

이러한 각막 이식으로 효과적인 치료 효과를 기대할 수 있지만, 각막 이식만으로는 치료하기 어려운 질병도 있다. 예를 들면, 스티븐스-존슨 증후군, 안류 천포창(ocular pemphigoid), 화학적 외상, 화상 등이다. 통상적으로, 각결막 상피세포는 매일 분열하여, 오래된 세포는 탈피되고, 새로운 세포가 줄기세포 조직에서 재생된다. 그러나, 상기한 병증에서는 각막을 재생시키는 줄기세포 조직에 결함이 있는 것으로 알려져 있다.

각막상피를 재생시키는 줄기 세포조직은 "각막 윤부 조직(corneal limbus tissue)"이라고 하며, 정확히 눈의 검은 자위와 백안의 경계부분에 국한되어 있으며, 외부에 노출된 특수한 환경에 있다. 전술한 병증에서는, 줄기세포 조직 자체가 일부 결함되어 결손되는 것으로 여겨지고 있다. 그리고, 줄기세포 조직의 결손으로 인해, 결합 부분이 그 주변에 존재하는 결막 상피로 덮혀, 투명성을 잃게 되고, 시력이 극단적으로 저하된다. 이와 같이, 전술한 병증에서는 각막 윤부가 고갈되었기 때문에, 단순히 각막을 이식하는 것만으로는 이식된 각막을 장기간 유지시킬 수 없다. 따라서, 안구 표면을 항구적으로 재건하기 위해서는 각막 윤부의 이식도 필수적이다. 각막 윤부를 이식하는 방법들 중 한가지 방법으로 양막 이식법이 개발되어 있다(Medical Asahi, September, 1999: p62-65, N Engl J Med 340: 1697 - 1703, 1999: 비특허문헌 1). 상기 이식법에 이용되는 양막은, 제왕 절개한 임산부 등의 태반으로부터 얻어진다. 양막은 두꺼운 기저막을 가지므로, 이식되었을 경우, 각결막 상피세포의 증식 및 분화용 기질로서 작용한다. 또한, 양막은 면역원성이 거의 없으며, 게다가, 항염증 및 반흔 형성 억제 등의 작용을 겸비하고 있어, 양막 위에 이식되는 각결막 상피나 또는 그의 줄기세포 조직은 이식 수용자(recipient)의 거부 반응 등으로부터 보호된다.

비특허문헌 1: Medical Asahi, September, 1999: p62-65, N Engl J Med 340: 1697 - 1703, 1999

발명이 해결하려고하는 과제

각막이 결막 상피로 덮혀 혼탁이 생기는 안구 표면 질환에 대한 외과적 치료로, 현재 각막 상피 이식 기술이 행해지고 있지만, 심한 염증을 수반하는 난치성 각결막 질환(스티븐스-존스 증후군, 안류 천포창, 각막부식 등)에서는, 예후가 매우 나쁘다. 이의 가장 큰 이유는 강한 항원성을 가지는 이질성(allo) 각막 상피를 숙주의 면역계가 인식하여 거부하기 때문이다. 또한, 거부 반응을 예방하기 위해, 수술 후에 다량의 면역억제제를 전신 및 국소투여함으로써 초래되는 합병증도 그 예후를 불량하게 하는 큰 요인이 되고 있다. 한편, 이질성 각막 상피를 이용할 경우에는, 기증자가 부족한 문제가 있다. 따라서, 한쪽 눈으로부터 얻어지는 각막을 이용하여 수십개의 각막 상피 시트를 제조할 수 있는 기술이 현실화된다면, 기능자 부족으로 인한 문제점을 해결할 수 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명은 전술한 상황 및 문제점들을 감안하여 이루어진 것으로, 높은 치료 효과를 기대할 수 있는 동시에 이식 안전성이 높은 각막 상피 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 목적하에, 본 발명자들은 안전성을 고려하여 상피세포를 이종동물 유래 세포(영양 세포)를 사용하지 않고 배양하는 조건하에서, 각막 상피 시트를 제조하고자 시도하였다. 그 결과, 인간 섬유아세포를 함유한 콜라겐 겔상에 각막 상피세포를 배양함으로써, 영양 세포를 사용하지 않고도 양호한 중층화 및 상피화를 달성할 수 있었다. 특히, 무혈청 배지를 사용함으로써 양호한 결과를 얻을 수 있었다.

이상과 같이, 본 발명자들은 이종동물에서 유래된 세포를 전혀 이용하지 않아 안전하면서도 실용적인 각막 상피 시트를 성공적으로 제조하였다.

본 발명은 이러한 결과와 사실을 토대로 완성한 것으로, 다음 구성을 제공한다.

[1] 이종동물세포의 부재하에, 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 겔 상에서 증식시킨 각막 상피세포를 포함하는 각막 상피 시트.

[2] 무혈청 배지를 사용하여 상기 각막 상피세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 각막 상피 시트.

[3] 혈청성분으로서, 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지를 사용하여 상기 각막 상피세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 각막 상피 시트.

발명의 효과

본 발명의 각막 상피 시트는, 제조 과정에 이종동물 유래 세포를 사용하지 않아, 안전성이 매우 높다. 또한, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔을 사용함으로써, 매우 조밀한 세포층을 형성시키고, 최초로 중층배양이 가능하게 되었으며, 이식 후 생존성이 매우 높다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은, 아래 구성을 포함하는 각막 상피 시트를 제공한다. 즉, 이종동물세포 부재하에, 콜라겐 겔 상에서 증식시킨 각막 상피세포의 세포층이 형성되어 있는 각막 상피 시트이다. 본 발명의 각막 상피 시트는, 각막 상피의 재생(재건)에 이용된다. 이하에, 본 발명의 각막 상피 시트 및 그 제조 방법의 특징을 설명한다.

본 발명의 각막 상피 시트는, (a) 각막 상피세포를 제조하는 단계, (b) 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계, (c) 상기 각막 상피세포를 상기 콜라겐 겔 상에 접종 또는 올려두는 단계, 및 (d) 이종동물 세포의 부재하에, 상기 각막 상피세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.

단계 (a)에서, 각막 상피세포가 제조된다. 특별한 기재가 없는 한, 본 명세서에서 "각막 상피세포"는 각막 상피 세포층에 포함된 세포를 포괄하는 표현으로 사용되며, 즉, 각막 상피세포의 줄기세포 및 전구세포도 포함된다. 각막 상피세포의 제조 방법의 일 예는 다음과 같다.

각막 상피세포는 각막 윤부 조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 각막 윤부조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 적출해 단일 세포 현탁액으로 준비한다. 그리고, 이것을 질소 탱크에 저장하고, 그 후 급속히 37℃에서 융해시켜 각막 상피세포 부유액을 준비한다. 필요에 따라, 이차배양(subculture)한다. 이차배양에는, 예컨대, 무혈청 배지인 EpiLifem^TM(Cascade Biologics), MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) 및 이들 배지의 아미노산 조성 등을 변형시킨 배지 등을 사용할 수 있다.

각막 상피세포는 각막 상피 시트의 이식을 받는 사람(수용자)의 것으로 준비하는 것이 바람직하다. 즉, 각막 상피세포의 기증자와 각막 상피 시트의 수용자가 동일인인 것이 바람직하다. 자가세포를 이용함으로써, 면역 거부 반응이 해결된다.

단계 (b)에서는 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양한다. "콜라겐 겔"은 인간 섬유아세포의 배양 기질로서 기능한다. 콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 이용할 수 있다. 복수 종의 콜라겐이 혼재된 것을 이용할 수도 있다. 이러한 콜라겐은, 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등으로 추출 및 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 저하시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소를 처리하여 텔로펩티드(telopeptide)가 제거된, 이른바 아테로콜라겐(atherocollagen)을 이용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔 재료로서 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용할 수도 있다. 여기서, "양막유래"는 넓게는 양막을 출발 원료로 하여 수득한 것을 의미한다.

콜라겐 매트릭스에 포함된 인간 섬유아세포의 기원은 특별히 한정되지 않으며, 콜라겐을 생산하는 임의의 조직 유래의 것일 수 있으며, 예를 들면, 피부 조직, 구강 점막 조직 등으로부터 제조한 인간 섬유아세포를 사용할 수 있다.

콜라겐 매트릭스의 제조 방법의 구체적인 예를 나타낸다. 먼저, 이하의 순서로 섬유아세포를 준비한다. 피부를 수득하고, 이어서 피부에서 진피를 박리시킨다. 진피를 가늘게 잘라, I형 콜라겐으로 코팅된(콜라겐막) 배양 접시에 밀착시킨다. 정치배양한 후, 진피편으로부터 이동한 섬유아세포를 계대 배양한다. 세포를 배양 접시 바닥면에서 탈착시켜 세포 부유액을 준비하고, 이를 세포 배양용 배양 접시에 접종한다. 적절하기로는, 세포는 동결 보존(예, 액체 질소에서 보존)한다.

한편, I형 콜라겐을 이용하여 중화된 콜라겐 액을 제조한다(후술하는 실시예를 참조). 이를 배양 용기(예, 배양 삽입 용기(culture insert))에 첨가하고, 실온에서 10분간 방치하여 겔화시킨다. 다음으로, 전술한 방법에 따라 미리 배양해 둔 대수 증식기의 섬유아세포를 상기 겔과 혼합하여, 다시 겔화시킨다. 그 후, 정치배양한다. 이상의 순서로 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 매트릭스가 준비된다. 이러한 창의적인 연구에 의해, 충분한 강도를 가지며, 양막층이나 생체 유래 세포를 탑재할 수 있는 콜라겐 매트릭스가 제조되는 것으로, 본 발명의 중요한 토대가 된다. 콜라겐 매트릭스 상에 별도로 준비한 각막 상피세포를 접종(탑재)한다.

각막 상피세포는, 예를 들면 약 1 x 10³개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1 x 10³개/cm² - 약 1 x 10⁷개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1 x 10⁴개/cm² - 약 1 x 10⁶개/cm²의 세포 밀도로접종한다.

콜라겐 매트릭스 상에 접종한 각막 상피세포의 배양(단계 d)은, 이종 동물세포의 비존재 하에 실시한다. 본 발명에 있어서, "이종 동물 세포의 부재하에"는, 각막 상피세포를 배양할 때의 조건으로서, 상기 각막 상피세포에 대하여 이종인 동물 세포가 사용되지 않는 것을 말한다. 구체적으로는, 각막 상피세포로서 인간 세포를 사용할 경우에, 마우스나 랫 등, 인간 이외의 동물 종의 세포가 배양액 중에 존재(병존)하지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건으로 배양함으로써, 최종적으로 준비되는 이식 재료(즉 각막 상피 시트)에 이종 유래의 성분(이종세포 자체를 포함함)이 혼입될 우려가 없어진다.

각막 상피세포 배양에 이용할 수 있는 배지는, 상기 세포를 증식시키는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 특히, 본 발명에서는 무혈청이며 동시에 이종 동물 유래의 단백질을 포함하지 않는 배지를 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용할 수도 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 배양 방법으로서 무혈청 배양법을 채택하는 것이 바람직하다. 이는 혈청 유래의 성분의 혼입으로 인한 면역거부 반응 등의 문제를 피할 수 있기 때문이다. 또한, 혈청을 포함하는 배지에서 배양할 수도 있지만, 이런 경우에는 동종 유래의 혈청(인간의 각막 상피세포를 배양하는 때는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 물론, 가능하다면, 면역거부 반응의 우려가 없는 자가혈청을 사용하는 것이 바람직하다.

각막 상피세포의 양호한 증식 및 중층화를 위하여, 배양 단계 과정중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.

단계 (d)의 결과, 각막 상피세포가 콜라겐 매트릭스 상에서 증식한다. 이와 같이 수득한 세포층의 표층 각화를 촉진시키기 위하여, 세포층의 표층을 공기에 접촉시키는 단계(단계 e)를 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 단계를 본 명세서에서는 에어 리프팅(Air-lifting)이라고 한다. 단계 (e)는 세포층을 형성하는 세포를 분화시키고, 경계 기능을 유도하기 위한 목적으로 수행한다.

상기 단계는, 스포이드, 피펫 등을 이용하여 배양액의 일부를 일시적으로 제거함으로써 배양액 수위를 낮추고, 따라서 세포층의 최표층을 일시적으로 배양액 외부로 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 또는, 콜라겐 매트릭스에 함유된 세포층을 들어올려, 최표층을 배양액 표면 외부로 일시적으로 노출시킬 수 있다. 나아가서, 튜브 등을 이용하여 공기를 배양액 중에 공급하고, 세포층의 최상층을 공기에 접촉시킬 수도 있다. 조작의 용이성 측면에서는, 배양액 수위를 낮추어 세포층의 최표층을 노출시키는 방법을 행하는 것이 바람직하다.

이 단계 (e)의 수행 시간, 즉 중층화한 세포층의 최표층을 공기에 접촉시키는 시간은, 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 변동되지만, 예를 들면 3일-3주일정도이며, 바람직하게는 5일-2주일, 보다 바람직하게는 약 1주일이다.

도 1은 실시예의 방법으로 제조한 각막 상피 시트의 헤마톡실린·에오신 염 색 사진이다. 섬유아세포를 포함하는 겔 상에 3-4층으로 이루어진 각막 상피 세포층이 확인된다. 세포의 형태는 정상 각막에 가까우며, 최상층에는 각질층의 형성이 관찰되지 않는, 각막의 형태를 나타내고 있다.

도 2는 실시예의 방법으로 제조한 각막 상피 시트의 전자 현미경 사진이다. 각막 상피 세포층은 3-4층의 세포로 구성되어 있다(A). 기저막 부위에서 헤미데스모좀의 형성, 라미나덴사(lamina densa)의 형성이 관찰된다(B). 세포사이 부분에는 데스모좀이 양호하게 형성되어 있다(C). 최상층에서는 미세융모가 형성되어 있어, 인간 각막의 전자 현미경소견과 거의 동일한 소견을 보인다. 따라서, 미세구조도 각막의 형태를 나타내고 있는 것으로 생각된다.

이하에, 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 상기 실시예로 한정되지 않는다.

실시예 1

콜라겐 겔을 이용한 삼차원 구조의 각막 상피 시트의 제조

1. 각막 상피세포의 제조

1-1. 각막의 조달

기증자의 각막을 Northwest Lions Eye Bank(미국 시에틀)에서 구입하였다.

1-2. 각막 상피세포의 무혈청 배양법

각막을 둘베코 인산 완충액(PBS)이 있는 페트리 디쉬에 옮기고, 실체현미경하에서 윤부를 한 변이 2-3 mm가 되도록 메스로 가늘게 적출하였다. 가늘게 자른 윤부를 PBS로 수회 세정하고, 70% 에탄올에 1분간 담구어 멸균하였다. 이를 PBS로 세정한 후, 디스파제 용액(디스파제II, 고도주정사, 250 Unit/㎖ Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 침지하여, 4℃에서 하룻밤(18-24시간) 방치하였다. 다음날, 실체 현미경하에서 핀셋으로 상피를 기질로부터 박리하였다. 박리한 각막 상피를 DMEM으로 세정하고, 다시 PBS로 세정한 후, 0.25% 트립신 용액에 침지하여 37℃에서 10분간 처리하였다. 표피를 트립신 중화액이 있는 플라스틱 페트리 디쉬에 옮겨, 핀셋으로 표피편을 풀고, 15 ㎖의 멸균 튜브로 옮겼다. 여기에 PBS를 첨가하여 각막 상피세포의 현탁액을 준비하였다. 세포 수를 측정한 다음, 1000 rpm에서 5분간 원심하여 세포를 침전시켰다. 상청을 흡입시키고, 세포는 무혈청 배지인 EpiLife 배지에 현탁하고, 60 mm의 콜라겐막 페트리 디쉬(ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION, I형 콜라겐막 배양접시; 4010-020) 각각에 12 x 10⁶세포/5 ㎖ 배양액의 비율로 접종하였다. 다음날 배양액을 교체하고, 이후 2일마다 배양액을 교체하였다. 세포 밀도가 약 70-80%가 되는 시점에서 이차배양을 수행하였다.

또한, 이상의 방법에서는 무혈청 배지를 사용하여 각막 상피세포를 배양하였지만, 하기 순서와 같이 혈청 배지를 사용할 수도 있다.

(1) 각막 윤부 조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 적출한다.

(2) 디스파제 용액(디스파제I, 고도주정사(Goudou Shusei), 250 Unit/㎖ Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 침지하여, 4℃에서 하룻밤(18-24시 간) 방치한다.

(3) 0.25% 트립신 용액에서, 37℃로 10분간 침지한다.

(4) 현미경 하에 상피만을 트립신 용액중에서 벗겨낸다.

(5) 피펫팅하고, 30% FCS/DMEM을 동량으로 첨가하여 현탁한다.

(6) PBS(-)로 나머지 세포를 회수하고, 원심분리한다.

(7) 적량의 배양액으로 단일 세포 현탁액을 준비한다.

제조한 각막 상피세포의 동결 보존 조건(보존액의 조성 포함함) 및 융해 조건의 일 예를 이하에 나타낸다.

동결 보존 조건: 1℃/시간의 속도로 -20℃까지 온도를 냉각시킨 후 질소 탱크에서 보존한다.

보존액 조성: 20% FCS/10% DMSO/DMEM

융해 조건: 가능한 신속하게 37℃에서 융해시키고, PBS에서 10배로 희석한다.

2. 섬유아세포의 제조

박리한 진피를 DMEM으로 세정한 후, 한 변이 1-2 mm가 되도록 메스를 이용하여 가늘게 자른다. 가늘게 자른 진피편을 I형 콜라겐막 배양 접시에 약 1 cm의 간격으로 밀착시켰다. CO₂ 배양기에 30분간 두어, 완전히 밀착시켰다. 그 후, 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지 약 5 ㎖ 가하여, 7일간 방치하였다. 7일째에, 처음으로 배양액을 교체하였다. 섬유아세포가 진피편으로부터 이동하는 것을 확인 하였다. 세포가 증식하여, 진피편의 주위 5 mm까지 이동하는 시기에, 계대 배양을 수행하였다. 이를 PBS로 세정한 후, 0.125% 트립신, 0.05% EDTA를 포함하는 용액 3 ㎖을 첨가하여, 37℃에서 3분간 처리하였다. 세포가 배양접시 바닥면에서 탈착된 것을 현미경으로 확인한 후, 3 ㎖의 트립신 저해제를 첨가하여 세포를 회수한 다음 50 ㎖의 튜브로 옮겼다. PBS를 이용하여 나머지의 세포를 회수하고, 1000rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상청을 흡입한 후, 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 첨가하여 세포 현탁액을 준비한 다음 이를 세포 배양용 배양접시에 접종하였다. 계대 배양시, 세포밀도는 약 1:3로 한다. 세포는 적절히 동결 보존한다. 동결 보존액으로 10% 글리세롤, 20% FCS, 70% DMEM을 이용하고, 액체 질소에 저장하였다.

3. 중화 콜라겐 겔의 제조

I형 콜라겐 용액(세포 매트릭스 타입 1A: 3 mg/㎖: Nitta Gelatin Inc.) 6 부피에 대하여, 0.1N NaOH 1 부피, 8X DMEM 1 부피, 20% FCS/DMEM 10 부피를 혼합하여, 중화 콜라겐 용액(콜라겐의 최종 농도: 1 mg/㎖)을 4℃에서 제조하고, 직경 24 mm의 배양삽입 용기(Corning-Costar사)에 1 ㎖씩 첨가하여 겔화되도록 실온에서 10분간 방치하였다. 미리 배양해 둔 대수 증식기의 섬유아세포(디스파제를 처리하여 표피를 박피시키고 난 나머지의 진피를 부수 증식(out growth)으로 배양하여 5-10대 계대 배양한 세포를 이용함)를 5 x 10⁵세포/㎖ 및 10% FCS/DMEM로 조절한 다음, 이 세포 현탁액 2 부피에 대하여 중화 콜라겐 용액 8 부피를 섞어, 세포를 포 함하는 중화 콜라겐 용액을 제조하였다(콜라겐의 최종 농도: 0.8 mg/㎖). 이 용액을 각 배양 삽입 용기에 3.5 ㎖씩 첨가하여, CO₂ 배양기(37℃, 5% CO₂)에 두었다. 약 30분 후, 겔화된 것을 확인하였다. 그 후 10% FCS/DMEM을 겔이 잠기는 정도(배양 삽입 용기 내측에 3 ㎖ 및 배양 삽입 용기 외측에 3 ㎖)로 첨가하여 5일간 정치 배양하였다. 배양 2일째부터 겔이 수축되기 시작하였고, 섬유아세포의 증식을 위상차 현미경으로 관찰할 수 있었다.

4. 각막 상피세포의 접종

섬유아세포의 배양 개시 5일째에, 콜라겐 겔의 바닥면이 맴브레인에 밀착되고, 콜라겐 겔 상부가 수축하여 직경은 13-15 mm, 두께는 2-3 mm가 된다. 또한, 콜라겐 겔 중앙은 정확히 크레이터 형(shape of crater)으로 함몰된다. 함몰된 부분 위에 각막 상피세포를 접종하였다. 즉, 상기 1-2에서 제조한 각막 상피세포를 트립신·EDTA를 이용하여 배양접시로부터 박리 및 회수하였다. 이를 1000 rpm으로 5분간 원심분리하고, 상청을 제거하여, 약 3 - 4 x 10⁶세포/㎖로 조절하였다. 부피상으로는, 50-60 ㎕의 현탁액을 콜라겐 겔 상에 첨가할 수 있다. 각막 상피세포가 겔에 밀착되도록, 1.5 - 2.0 시간동안 CO₂ 배양기에 둔 다음, 표피세포 증식용 무혈청 배지를 서서히 첨가하여(배양 삽입 용기 내측에 3 ㎖, 배양 삽입 용기 외측에 3 ㎖), 다시 14일간 액체 상태로 배양하였다. 각막 상피세포의 접종 3일째에, 배양액을 중층화용 배양액(하기 참조)으로 바꾸고, 이후 2일마다 1회씩 배양액을 교체하였다.

중층화용 배지는 다음과 같이 구성된다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) : F-12 배지 = 1 : 1, 칼슘 농도; 1.95 mM, 모노에탄올아민; 0.1 mM, 0-포스포에탄올아민; 0.1 mM, 인슐린; 5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손; 0.4 ㎍/㎖, L-글루타민; 4 mM, 아데닌; 0.18 mM, 트랜스페린; 5 ㎍/㎖, 셀레늄산; 53 nM, 트리요오도티로닌; 20 pM, 세린; 1 mM, 콜린 클로라이드; 0.64 mM, 리놀레익산; 2 ㎍/㎖ 및 FCS; 2%

5. 기상하 배양(Culture under vapor phase condition)

각막 상피세포를 접종한 후 14일째에 에어리프팅(air-lifting)을 행하였다. 에어리프팅용 유지 용기에 멸균한 여과지를 설치하고, 중층화용 배지를 여과지가 잠기는 정도(약 9 ㎖)로 첨가하였다. 배양 삽입 용기 내측의 배양액을 조심스럽게 제거하고, 배양 삽입 용기를 여과지 위에 옮겨, CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3일째에 교체하고, 3일간의 에어리프팅으로 배양한 각막이 완성되었다.

6. 조직학적 분석

에어리프팅후 3일째에, 각막 상피는 3-4층을 가져, 각질층 형성이 확인되었으며, 정상 인간 각막과 거의 동일한 구조를 나타내었다(도 1, 2).

본 발명이 제공하는 각막 상피 시트는, 각막 상피의 재생(재건)에 이용된다. 또한, 본 발명의 각막 상피 시트는 유전자 치료에 이용 가능하다. 유전자 치료에는 크게 생체내 방법과 생체외 방법이 있는데, 전자는 유전자를 직접 생체 내에 도 입하는 방법으로, 후자는 일단 세포를 꺼내어 유전자를 도입한 후 다시 체내로 되돌리는 방법이다. 유전자 치료의 현 기술 수준을 감안하면, 배양 각막 상피에 유전자를 도입하기만 하면, 바로 생체외 방법을 수행할 수 있다. 각종 바이러스 벡터에 의한 각질세포의 유전자 도입의 유효성이 입증되고 있으며, 특히, 아데노 바이러스 벡터를 이용하는 경우 거의 100% 케라티노사이트에 도입가능하다.

본 발명은, 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명으로 전혀 한정되지 않는다. 특허청구 범위의 기재를 이탈하지 않고, 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 범위내의 여러가지 변형예도 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서 명시한 논문, 공개 특허공보, 및 특허공보 등의 내용은, 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

Claims

이종 동물 세포(xenogeneic animal cell)의 부재하에, 인간 섬유아세포를 포함하고 있는 콜라겐 겔 상에서 증식시킨, 각막 상피세포를 포함하는 각막 상피 시트.
제 1항에 있어서, 상기 각막 상피 세포는 무혈청 배지에서 증식시키는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 시트.
제 1항에 있어서, 상기 각막 상피 세포는 혈청 성분으로 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지에서 증식시키는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 시트.
(a) 각막 상피세포를 제조하는 단계;

(b) 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계;

(c) 상기 각막 상피 세포를 상기 콜라겐 겔 상에 접종 또는 탑재하는 단계; 및

(d) 이종 동물 세포의 부재하에, 상기 각막 상피 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 각막 상피 시트의 제조 방법.
제 4항에 있어서, (e) 상기 각막 상피 세포를 증식시킨 후, 최표층을 공기와 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 시트의 제조 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 단계 (d)는 무혈청 배지를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 시트의 제조 방법.
제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 단계 (d)는 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지를 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는, 각막 상피 시트의 제조 방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 따른 각막 상피 시트를 이식 재료로 사용하는, 이식 방법.