KR20070093991A - 양막을 이용한 시트형 조성물 및 그 제작 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 폭 넓은 용도에 적용될 수 있으며, 또한 간편한 이식술로 이식 가능한 시트형 조성물, 즉 양막의 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시킨 시트형 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 태양에 따르면, 접착 성분의 부착 측과는 반대 측의 양막 상에 세포층이 형성되어 있다.

양막, 무봉합, 피브리노겐, 트롬빈, 아프로티닌, 상피, 생체 유래 세포, 이식, 세포 배양

Description

양막을 이용한 시트형 조성물 및 그 제작 방법{SHEET-SHAPED COMPOSITION UTILIZING AMNION AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은, 양막(amnion)을 이용한 시트형 조성물 및 그 제작 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시트형 조성물은, 예를 들면, 안구 표면이나 피부 재건(reconstruction)용의 이식 재료로서 이용될 수 있다.

최근, 각막 상피 줄기 세포를 이용한, 각막 상피 질환에 대한 재생(regeneration) 의료의 기술이 실용화되고 있다. 각막 상피 질환 이외에도, 안과 영역에서는 내피 질환, 망막 질환, 피부과 영역에서는 표피 질환 등, 여러가지 질환을 치료할 목적으로 세포 배양의 새로운 시도가 적극적으로 행하여지고 있다. 앞으로도 이러한 재생 의료에 대한 수요는 점점 커질 것으로 예상된다. 재생 의료에 이용하기 위한 배양 세포의 지지체(support)로서 이용되고 있는 물질 중 하나가 양막(amnion)이다. 양막은 포유 동물의 자궁 내에 존재하는 태반의 가장 내측에 존재하는 조직이며, 태아를 감싸는 한 층의 막이다. 양막은 각종 세포의 배양 기질로서 대단히 우수한 것으로 알려져 있고, 지금까지 양막을 담체(carrier)로 하는 배양 각막 상피 세포 시트, 배양 구강점막 상피 시트, 배양 표피 세포 시트, 배양 세포 시트가 작성되고 있다 (예를 들면 특허 문헌 1 ∼ 3을 참조).

[특허문헌 1]: 국제공개 제2003/043542 A1호 팜플렛

[특허문헌 2]: 국제공개 제2003/092762 A1호 팜플렛

[특허문헌 3]: 국제공개 제2004/078225 A1호 팜플렛

배양 세포 시트나 양막 시트 등으로 높은 치료 효과를 얻기 위해서는, 그것이 신속하게 이식부에 접착되고, 그리고 접착 상태가 유지될 필요가 있다. 즉, 이러한 이식용 시트는 높은 접착성 및 생존성이 요구된다. 그러나 현재로는, 충분한 접착력을 얻을 수 없으므로, 배양 세포 시트나 양막 시트를 생체에 이식할 때는 거의 모든 경우에서 시트를 봉합할 필요가 있다. 일반적으로 봉합을 행할 때는, 1. 조직이 기계적으로 파괴되어 세포의 괴사(necrosis)가 생기고, 2. 세균에 의한 감염이 유발되며, 3. 모세혈관이 파괴되어 출혈이 발생하는 문제점이 있다. 괴사세포나 세균이 생기면 생체는 이들을 제거하고자 시도하며, 랑게르한스 세포(Langerhans cell), 수상 세포(dendritic cell), 대식 세포(macrophage), 백혈구 등의 면역계의 세포가 활성화되어 염증이 생긴다. 또한, 대식 세포로부터 성장 인자가 방출되어 혈관신생(angiogenesis)이 야기된다. 염증은 충혈, 눈물, 눈꼽, 발열, 발적(發赤), 가려움 등의 원인이 된다. 망막 부위에서 혈관신생이 생기면 시력 저하로 연결될 가능성이 있다. 이러한 생리적인 작용이 생기게 되면, 본래의 치료 효과를 감소시킬 뿐만 아니라, 경우에 따라서는 추가적인 처치(치료)가 필요하게 되는 등, 임상 현장에 있어서 큰 문제가 되며, 세포 배양 시트나 양막 시트를 생체에 이식할 때 큰 과제가 되고 있다. 한편, 봉합 작업은 조작이 복잡해서 경험과 숙련을 요하는 시술자가 반드시 필요하다. 그러나, 시트 이식을 실시할 수 있 는 시술자 및 기관이 한정되어 있는 것이 현실이며, 재생 의료가 더욱 보급될 것을 고려하면 잠재적인 구속 요인이 되어 왔다. 또한, 봉합해야할 수고가 필요하고, 이식에 필요한 시간도 증가하므로, 이에 따라 환자의 부담도 증대하여 용태가 악화될 가능성도 있었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 세포 배양 시트 혹은 양막 시트를 생체에 이식할 때는 봉합이 불필요한 것이 요망된다.

한편, 생체에 물질을 무봉합으로 접착할 때에 이용할 수 있는 물질로서는, 지금까지 조직 접착제의 피브린 글루(fibrin glue)(Tissel^TM; Baxter, Bolheal^TM; KASETSUKEN(화학 및 혈청 요법 연구소), Beriplast^TM; Aventis Pharma)이 주로 사용되어 왔다. 피브린 글루는 생체 내에서의 혈액 응고의 최종 단계를 모방하여 조직의 접착, 폐쇄를 행하는 약제이다. 피브린 글루를 사용하여 세포 배양 시트나 양막 시트를 생체에 접착하는 것을 고려할 경우, 시술자가 약제로서 피브린 글루를 별도로 구입하고, 수술중에 조제를 하게 된다. 그러나 피브린 글루의 조제에는 시간이 걸리고 번거로우며, 비교적 쉽게 고화되는 성질이 있으므로 취급하기 곤란하여, 시트를 조직에 접착할 때의 접착제로서 사용하는 것은 용이하지 않다.

무봉합으로 물질을 생체에 접착시키는 제품에는 피브린 글루 이외에도 Tacho Comb^TM(Nycomed Pharma)가 존재한다. 본 제품은 손상 보전제로서 사용되고 있으며, 콜라겐 시트를 담체로 하여 글루가 한쪽 면에 고착화되어 있는 의약품이다. 제품에는 이미 글루가 도포되어 있으므로, 조제 시간이 걸리지 않고 번거롭지 않으며, Tacho Comb^TM를 환부에 접촉시키기만 하면 조직과의 접착이 완료된다. 다만, Tacho Comb^TM의 담체로서 사용되고 있는 것은 콜라겐을 재구성해서 만든 화학 물질이므로, 양막 시트나 배양 세포 시트 등의 생체 유래의 생 조직(living tissue)을 그대로 접착하지는 않는다. 또한, 이 시트형 구축물은 두께가 수mm로서 투명성이 부족하다. 따라서, 이식 후에 충분한 투명성이 요구되는 용도 (예를 들면 안구 표면의 재건)에는 당연히 적용될 수 없다. 또한, 안구 표면의 재건으로 대표되는 상피 조직의 재건 기술 등에서는, 피이식부는 물리적인 공간이 부족하고, 따라서 이식 재료는 얇은 것이 요구된다. 이 점에 있어서도 전술한 제품은 적절하지 않다.

이상 설명한 바와 같이, 지금까지는 기능을 가지는 생체 유래의 조직을 봉합할 필요없이 그대로 생체에 접착하는 기술은 제공되지 않고 있다.

본 발명은 전술한 바와 같은 배경 하에, 안구 표면의 재건, 피부 또는 표피의 재건, 열상(burn) 시의 피복 등, 폭 넓은 용도에 적용할 수 있고, 또한 간편한 이식 기술로 이식 가능한 시트형 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 안구 표면의 재건 등, 그 자체에 높은 투명성이 요구되는 용도에 대하여 적합하게 적용할 수 있는 시트형의 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은, 시트형 조성물을 구축한 상태에서 사용하는 지지체로서 양막을 사용하기로 하였다. 그리고 이식 후의 접착성 및 생존성을 높이기 위해 양막의 표면에 피브린(fibrin) 및 트롬빈(thrombin)을 부착시켰다. 그 결과 얻어진 시트형 조성물은 매우 얇고, 높은 투명성을 확보할 수 있었다. 또한, 충분한 강도를 확보할 수 있었다. 한편, 시트형 조성물의 접착성 및 생존성을 확인하기 위하여, 시트형 조성물을 안구 표면에 적용한 바, 신속한 접착이 확인되고, 또한 장기간에 걸쳐서 양호한 접착 상태가 유지되었다. 이상과 같이, 양막의 표면에 피브린 및 트롬빈을 부착해서 구성되는 시트형 조성물은 투명성, 강도, 접착성 및 생존성이 우수한 것이었다. 즉, 상기 시트형 조성물은, 폭 넓은 용도에 적용하기 위하여 필요한 조건을 충족하는 것이 밝혀졌다. 또한, 높은 접착성 및 생존성을 가지므로, 봉합 등을 병용하지 않는, 간편한 이식 기술을 실현할 수 있는 것으로 여겨진다. 봉합이 불필요하게 되면, 봉합한 경우에 문제가 되고 있었던 염증의 야기와 혈관신생이 생기는 문제가 해소된다. 또한, 생체에 이식할 때에 번거롭지 않게 되며 시간을 절약할 수 있고, 시트 이식의 작업을 행할 수 있는 시술자의 활동 범위가 넓어지고, 재생 의료의 발전에 크게 기여할 수 있는 것으로 기대된다. 한편, 얻어진 시트형 조성물은 높은 투명성을 가지므로, 특히 안구 표면의 재건 등, 그것 자체에 높은 투명성이 요구되는 용도에 적합하게 사용할 수 있는 것이 판명되었다.

이상의 지견을 얻은 후, 상기 시트형 조성물의 접착성에 관해서 더 검토한 바, 접착 성분인 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin)의 첨가량(부착량)과 접착성 사이의 관련성을 발견하기에 이르렀다. 이 지견에 따라 필요한 접착성을 유지하면서, 피브리노겐 등의 첨가량을 저감할 수 있으므로, 피브리노겐 등의 작용에 의한 이식 후의 염증 및 혈관신생을 최소한의 범위 내로 억제할 수 있게 된다. 따라서, 이식 후의 염증 및 혈관신생을 억제할 필요가 있는 용도, 다시 말해, 예를 들면 안구 표면의 재건 등에 있어서 매우 바람직한 이식 재료를 제공할 수 있다.

본 발명은 이상의 성과에 기초하는 것으로, 이하의 구성으로 이루어지며, 피브리노겐 및 트롬빈이 표면에 부착된 양막을 구비하여 이루어지는 시트형 조성물이다. 본 발명의 일 태양에서는, 양막에 있어서 피브리노겐 및 트롬빈의 부착면이 건조 상태로 되어 있다. 본 발명의 다른 태양에서는, 양막 전체가 실질적으로 건조 상태로 되어 있다.

또한, 본 발명의 일 태양은, 양막의 표면에 또한, 아프로티닌(aprotinin)이 부착되어 있는 것을 특징으로 한다. 아프로티닌을 병용함으로써 피브린 괴(덩어리)의 분해를 억제하고, 접착력의 유지 또는 증강을 꾀할 수 있다.

양막으로서 상피가 제거된 양막을 사용할 수 있다. 상피 성분이 포함되지 않음으로 인하여 면역원성(immunogenicity)이 더욱 저하된 시트형 조성물이 된다.

본 발명에 있어서 다른 일 태양에서는, 생체 유래 세포로부터 이루어지는 세포층이 양막 상에 형성되어 있어, 상기 세포층의 형성 면과는 반대 측의 양막 표면이 피브리노겐 등의 부착 면이 된다. 본 태양의 배양 세포 시트는, 함유하는 세포의 작용에 의해 치료 효과가 높은 이식용 시트가 된다. 세포층을 형성하는 세포는 예를 들면, 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관(腸管) 점막 상피 유래의 세포이다.

양막에 대한 피브리노겐의 부착량을 양막 1cm²당 O.5mg ∼ 2Omg으로 설정하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 양막에 대한 트롬빈의 부착량을 양막 1cm²당 1㎍ ∼ 1mg으로 설정하는 것이 바람직하다. 이는, 높은 접착성을 유지하면서, 이식 후의 염증 및 혈관신생의 발생을 저감시킬 수 있기 때문이다.

본 발명의 시트형 조성물은, 양막을 사용함으로써, 두께를 10㎛ ∼ 200㎛로 조제할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물은, 사전에 트롬빈 등을 부착시켜 둠으로써, 사람의 조직에 대하여 접착성을 가지고, 이식 시에 봉합하지 않더라도 양호한 접착력을 얻을 수 있다.

한편, 본 발명은 상기 시트형 조성물의 제작 방법도 제공한다. 구체적으로는 이하의 구성을 제공한다.

즉, (a) 양막을 조제하는 단계, (b) 상기 양막의 표면으로 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시키는 단계를 포함하여 이루어지는 시트형 조성물의 제작 방법이다.

본 발명의 일 태양에서는 또한, 단계 b 후에, 건조 처리하는 단계(단계 c)가 실시된다. 건조 처리는, 사용 용도에 맞추어서, 조성물 전체 또는 피브리노겐 등의 부착면에 대해서만 실시된다.

본 발명의 일 태양에서는, 양막의 표면에 아프로티닌을 부착시키는 단계(단계 b-1)가 실시된다. 또한, 피브리노겐 및 트롬빈의 부착 단계와 동시에 상기 단계 b-1을 실시하는 것이 바람직하다.

단계 a의 일부로서, 양막으로부터 상피를 제거하는 단계(단계 a-1)를 실시하는 것이 바람직하다. 본 태양에서는, 상피가 제거된 양막을 이용하여 시트형 조성물이 제작된다.

또한, 단계 a의 일부로서, 양막을 건조시키는 단계(단계 a-2)를 실시할 수 있다. 즉, 본 태양에서는 시트형 조성물의 제작 과정에 있어서 일단 양막이 건조되었다가, 그 후의 공정에 제공된다.

본 발명에 또 다른 태양에서는, 단계 a와 단계 b 사이에, 생체 유래 세포로 이루어지는 세포층을 양막 상에 형성하는 단계(단계 A)가 실시된다. 상기 단계 A에 의해 양막 상에 세포층이 형성되고, 최종적으로 배양 세포 시트가 제작된다.

도 1은, 양막 상에 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 배양할 때의 기구 등의 상태를 모식적으로 나타낸 단면도다. 배양 접시(1) 내에 배양 삽입 용기(2, culture insert)가 정치되고, 배양 접시(1)의 저면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입 용기(2)의 저면 상에 양막(3)이 정치되고, 그 위에 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포(4)가 배양되는 상태가 나타나 있다. 부호 6은 배지(culture medium)이다.

도 2는, 접착 성분의 부착량과 접착성의 관계에 대한 실험 결과를 통합한 표이다. 접착의 여부는 +(시트가 어긋나 있지도 않고, 박리되어 있지도 않다) 및 - (시트가 어긋나 있다)로 나타내어 진다.

[부호의 설명]

1: 배양 접시(제1 용기) 2: 배양 삽입 용기 (제2 용기)

3: 양막 4: 각막 상피 세포

5: 3T3세포층 6: 배지

본 발명의 일 측면은 시트형 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 시트형 조성물에서는 그 주요 구성 성분의 하나로서 양막(amnion)이 사용된다. 양막이 가지는 높은 투명성 및 강인성(强靭性)에 의하여, 투명성 및 강도가 우수한 시트형 조성물을 구성할 수 있다. 또한, 양막의 높은 생체 친화성 및 저면역원성에 의하여, 생체 친화성이 한층 우수하면서 동시에 면역원성이 낮은 시트형 조성물을 구성할 수 있다. 양막을 사용함으로써 또한, 항염증 작용, 반흔(scar) 형성의 억제, 혈관신생의 저해 작용을 기대할 수 있다. 양막을 사용하는 것은, 본 발명의 시트형 조성물이 세포층을 포함할 경우에 있어서, 상기 세포층을 양호하게 형성시키는 점에서도 바람직하다. 즉, 후술하는 바와 같이, 세포층을 구비하는 시트형 조성물은, 양막을 기질(지지체)로 하여, 그 위에 소정의 세포를 파종(seeding), 배양함으로써 형성하면, 양막은 그 위에 세포가 양호하게 접착 및 증식하는 특성을 가지므로, 양막을 사용하면 양호한 세포의 접착, 증식, 및 세포층의 형성이 가능하게 된다.

양막은, 소파(搔爬) 처리 등에 의해 상피를 제거한 것이 더 바람직하다. 상피 성분이 포함되지 않음으로써, 면역원성이 더 저하된 시트형 조성물이 되기 때문이다. 또한, 상피가 제거된 양막에서는 그 위에 세포가 더욱 양호하게 접착 및 증식하므로, 보다 단시간 내에 높은 품질의 각막 상피양(epithelium-like) 시트를 구 축할 수 있는, 제작 상의 이점도 있다.

상피를 제거한 양막인지의 여부는, 시트형 조성물에 양막 상피층의 세포가 포함되어 있지 않은 것을 조사함으로써 확인할 수 있다. 또한, 양막으로서 사람의 양막을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 시트형 조성물에 있어서 양막의 표면에는 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin)(이하, 이들을 합쳐서 「접착 성분」이라고도 한다)이 부착되어 있다. 이로 인해, 본 발명의 시트형 조성물을 이식했을 때, 우선 트롬빈에 의해 피브리노겐이 특이적 으로 가수분해되어서 피브린이 생성되고, 계속해서 피브린이 중합되어 안정된 피브린 괴가 되어 접착 작용을 발휘한다.

피브리노겐 및 트롬빈은, 본 발명의 시트형 조성물의 용도에 따라서, 양막의 한쪽 면 또는 양쪽 면에 부착될 수 있다. 한쪽 면에 부착된 경우에는, 양막에 있어서의 상피의 유무에 관계되지 않고, 양막의 융모막 측 표면 (즉, 상피 측과는 반대 측의 표면)이 부착 면이 된다. 따라서, 이러한 구성의 시트형 조성물을 사용할 경우에는, 양막의 상피가 존재하던 측을 위로 하여 적용 부위에 이식된다. 생체 접착제를 목적으로 하여 생체 내에 이식될 경우, 양막의 양쪽 면에 접착 성분을 부착시키는 것이 바람직하다.

그리고, 후술하는 바와 같이 본 발명의 시트형 조성물은, 사용 목적 등을 고려하여 양막 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시키는 공정을 거쳐서 적절한 상태(예를 들면, 건조 상태 또는 습윤 상태)에서 조제된다. 따라서, 그 제작 과정에 있어서 및/ 또는 그 최종 상태의 여하에 따라서는, 사용될 때까지의 사이에 일부의 피브리노겐으로부터 피브린이 생성될 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 시트형 조성물에는, 이러한 원인에 의해 생긴 피브린 또는 피브린 괴가 부착되어 있는 것도 포함된다.

피브리노겐 및 트롬빈의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 사람, 원숭이, 침팬지, 소, 말, 양, 돼지 등의 혈액을 재료로 하여 피브리노겐 및 트롬빈을 조제할 수 있다. 또한, 피브리노겐 및 트롬빈으로서, 배양 세포(예를 들면 CHO 세포나 COS 세포)를 이용하여 얻어진 재조합체(genetic recombinants)를 사용할 수도 있다. 사람 유래(특히 사람 유래의 재조합체)의 피브리노겐 및 트롬빈을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 면역원성을 포함하여, 안전성의 면에서 유리하기 때문이다. 또한, 품질이 안정된 것을 사용할 수 있는 점 및 감염의 문제를 고려하면, 재조합체를 이용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 시트형 조성물의 이식을 받는 환자(recipient)의 혈액에 유래하는 피브리노겐 및 트롬빈을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 이들 접착 성분에 기인하는 면역 거부 반응을 일으킬 우려가 없기 때문이다.

또한, 피브리노겐 및 트롬빈의 유래는 반드시 동일하지 않아서 된다. 일례를 제시하면, 인간 혈액 유래의 피브리노겐과, 소 혈액 유래의 트롬빈을 조합해서 사용할 수도 있다.

피브리노겐 및 트롬빈의 부착량은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 피브리노겐의 부착량을, 양막 1cm²당 O.1mg ∼ 5Omg의 범위 내에서 설정할 수 있다. 마찬가지로, 트롬빈의 부착량을, 양막 1cm²당 O.5㎛g ∼ 10mmg의 범위 내에서 설정할 수 있다.

피브리노겐 및 트롬빈의 부착량의 설정 시에는, 먼저 접착력이 고려된다. 즉, 기대되는 접착량이 얻어질 수 있도록, 이들 성분의 부착량을 설정할 필요가 있다. 한편, 피브리노겐이나 트롬빈의 부착량이 지나치게 많을 경우에는, 사용하는 피브리노겐의 유래에 따라 상이하지만, 면역 반응이나 혈관신생이 쉽게 생기는 점이 문제가 된다.

여기서, 예를 들어 안구 표면의 재건에 적용되는 시트형 조성물로 형성할 경우 등에, 이식 후에 이들 성분에 의한 혈관신생이 문제가 될 경우에는, 혈관신생의 생기는 것을 될 수 있는 한 억제하기 위하여, 이들 성분의 부착량을 적게 설정하는 것이 바람직하다. 이들 성분의 부착량을 가능한 범위 내에서 적게 설정함으로써, 이식 후의 혈관신생이 억제되어, 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 후술하는 실시예에 도시한 바와 같이, 본 발명자들이 검토한 결과, 피브리노겐의 부착량이 양막 1cm²당 약 O.5mg이상의 경우에, 안구 표면에 대한 양호한 접착력을 얻을 수 있었다. 트롬빈에 대해서는 그 부착량을 양막 1cm²당 약1㎍으로 설정한 경우라도 안구 표면에 대한 양호한 접착력을 얻을 수 있었다. 이러한 지견에 기초하여, 피브리노겐의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 0.5mg ∼ 20mg, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 O.5mg ∼ 10mmg, 더 한층 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 0.5mg ∼ 6mg(구체적으로는, 예를 들면 약 0.5mg, 약 1mg, 약 2mg)을 들 수 있다. 마찬가지로, 트롬빈의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1㎍ ∼ 1mg, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 5㎍ ∼ 200㎍, 더 한층 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 10㎍ ∼ 100㎍ (구체적으로는, 예를 들면 약 10㎍, 약 20㎍, 약 30㎍)을 들 수 있다.

본 발명의 일 형태에서는, 피브리노겐 및 트롬빈에 더하여 아프로티닌(aprotinin)이 양막 표면에 부착되어 있다. 아프로티닌은, 트롬빈의 작용에 의해 형성된 피브린 괴가 플라스민(plasmin)에 의해 용해되는 것을 저해한다. 따라서, 아프로티닌을 병용함으로써, 피브린 괴의 분해를 억제하고, 접착력의 유지 또는 증강을 꾀할 수 있다.

아프로티닌의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 소, 말, 양, 돼지, 원숭이, 침팬지 등의 췌장(pancreas) 유래의 아프로티닌을 사용할 수 있다. 또한, 배양 세포(예를 들면, CHO 세포나 COS 세포)를 이용하여 얻어진 재조합체(genetic recombinants)의 아프로티닌을 사용할 수도 있다. 품질이 안정된 점 및 감염의 문제를 고려하면, 재조합체를 이용하는 것이 바람직하다.

아프로티닌을 사용할 경우, 그 부착량은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 아프로티닌의 부착량을 양막 1cm²당 0.1KIU ∼ 200KIU의 범위 내에서 설정할 수 있다.

상기 피브리노겐의 부착량의 검토에 초점을 맞추어서, 아프로티닌에 관한 부 착량도 변화시켜서 접착력에 대한 영향을 조사한 바, 아프로티닌 량을 1KIU ∼ 2 KIU의 범위 내에서 설정한 경우라도 안구 표면에 대한 충분한 접착력을 얻을 수 있었다. 이 지견에 기초하여, 아프로티닌의 부착량의 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIu ∼ 10KIU, 더욱 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIU ∼ 20KIU, 더 한층 바람직한 범위로서 양막 1cm²당 1KIU ∼ 10KIU(구체적으로는, 예를 들면 약 1KIU, 약2 KIU, 약 3KIU)를 들 수 있다. 아프로티닌량이 지나치게 많으면, 제조 비용이 상승되는 것은 물론, 아프로티닌 자체의 면역원성 등에 기인하는 부작용의 우려가 커진다. 한편, 아프로티닌 량이 지나치게 적을 경우에는, 피브린 괴의 분해를 억제하는, 아프로티닌의 작용이 충분히 발휘되지 않을 우려가 있다.

또한, 다양한 용도에 있어서 피브린 괴가 접착제로서 이용되고 있지만, 그러한 용도로는 아프로티닌을 병용하는 것이 일반적이다. 본 발명자들이 검토한 결과, 본 발명의 시트형 조성물에서는, 아프로티닌을 사용하지 않더라도 생체에 대한 충분한 접착력이 얻어지는 것이 밝혀졌다. 아프로티닌을 사용하지 않아도 되는 것은, 구성이 간단하게 되어서 제작 및 비용면에서 유리하게 될 뿐만 아니라, 아프로티닌 자체의 면역원성등에 기인하는 부작용을 고려할 필요가 없음을 의미한다.

본 발명의 시트형 조성물의 일 태양은, 양막 상에 세포층을 구비한다. 본 태양에서는, 세포층이 형성되지 않는 측의 양막 표면에 접착 성분(피브리노겐 등)이 부착된다.

본 태양에서는 상피가 제거된 양막이 사용된다. 그리고, 상피가 존재하고 있던 측에 세포층이 형성된다. 여기서 세포층은 생체 유래 세포로 구성된다. 세포층을 구성하는 세포의 유래는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관 점막 상피 유래의 세포에 의해 세포층이 구성된다. 서로 상이한 2가지 종류 이상의 세포에 의해 세포층이 구성되어 있어도 된다. 이와 같이 유래가 상이한 2가지 종류 이상의 세포를 포함해서 구성되어 있는 것을, 본 명세서에서는 「하이브리드화」라고도 한다. 하이브리드화된 세포층에 있어서의 세포의 함유 형태(하이브리드화의 상태)는 특별히 한정되지 않고 예를 들면, 각각의 세포가 산재되어 있어도 되고, 어느 하나의 세포(또는 여러 종류의 세포)가 일정하게 통합되어 존재하고 있어도 된다. 또한, 각 세포의 함유율이 세포층 전체에 걸쳐서 균일하지 않아도 된다. 세포층은 단층일 수도 있고, 다층(중층화된 상태)일 수도 있다.

하이브리드화된 세포층이 구비된 경우에 있어서의, 세포층을 구성하는 세포의 종류를, 각막 상피의 재건용으로서 본 발명의 시트형 조성물이 구축될 경우를 예를 들어, 이하에 상세하게 기술한다.

하이브리드화된 세포층에는 2종류 이상의 세포가 함유된다. 따라서, 설명의 편의 상, 세포층에 포함되는 세포 종류 중 하나를 제1 세포라 하고, 이것과 종류가 다른 세포종을 제2 세포라 한다. 먼저, 제1 세포로서 자가 세포(autologous cell)를 이용한다. 본 명세서에 있어서 「자기」는, 본 발명의 시트형 조성물을 적용하는 대상, 즉 이식을 받는 사람(recipient)이라 한다. 한편, 이러한 「자기 」이외의 사람을 「타인(allogeneic)」이라 한다. 후술하는 제2 세포와 하이브리드화시켰을 경우에 각막 상피양의 점막 상피층을 형성할 수 있다면, 제1 세포의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 제1 세포의 예로서는, 구강 점막 상피, 결막 상피, 비강 점막 상피 등의 점막 상피에 유래하는 세포, 혹은 이러한 점막 상피를 구축가능한 미분화 세포 (즉, 점막 상피의 줄기 세포)에 유래하는 세포를 들 수 있다. 여기서 「유래하는, 또는 유래의」의 용어는, 출발 재료를 특정할 목적으로 사용된다. 따라서 예를 들면, 구강 점막 상피에 유래하는 (또는 유래의) 세포라 하면, 구강 점막 상피 세포를 출발 재료로 하여 얻어진 세포를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 「점막 상피를 구축가능한 미분화 세포」는, 해당 점막 상피를 구성하는 세포로 분화될 수 있는 분화능을 가지는 세포를 의미한다. 예를 들면, 구강 점막 상피를 구축 가능한 미분화 세포라 하면, 구강 점막 상피 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미한다. 미분화 세포의 구체예로서는, 구강 점막 상피나 결막 상피 등, 특정한 조직을 구성하는 세포의 전구체(precursor) 또는 줄기 세포, 혹은, 더 분화도가 낮은 상피계 줄기 세포 등을 들 수 있다.

하이브리드화된 세포층은, 상이한 2가지 종류 이상의 제1 세포를 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 구강 점막 상피에 유래하는 세포와, 결막 상피에 유래하는 세포를 포함한 상태에서 세포층이 구축되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서의 「구강 점막 상피」에는, 구강 내연 점막 상피부, 입술부, 구개부(입천장), 볼(뺨)부 등이 포함된다. 구강 점막 상피에 유래하는 세포인지의 여부는, 구강 점막 상피 특이적인 케라틴 4(keratin 4), 또는 케라틴 13이 발 현되고 있는 것을 지표로 하여 확인할 수 있다. 또는, 케라틴 3을 발현하고 있는 것을 지표로 삼을 수도 있다. 상기 케라틴 3은, 각막 특이적 케라틴의 하나로서 알려져 있지만, 구강 점막 상피에서도 발현되고 있는 것이 확인되고 있다. 또한, 상기 각막 특이적 케라틴인 케라틴 3을 발현하고 있는 점에서, 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 이식용의 조성물을 제작하는 재료로서 이용하는 것은 바람직하다고 할 수 있다.

한편, 구강 점막 상피 세포 특이적인 유전자의 발현을 조사하는 것에 의해서도, 그것이 구강 점막 상피 유래인 것을 확인할 수 있다.

또한, 구강 점막 상피 이외의 조직에 유래하는 세포의 경우도 마찬가지로, 해당 조직에 특이적인 마커(marker) 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

제2 세포의 구체예로서는, 각막 상피, 결막 상피, 또는 양막 상피에 유래하는 세포를 들 수 있다. 그 중에서도, 제2 세포는 각막 상피 또는 결막 상피에 유래하는 세포인 것이 바람직하다. 안구 표면 조직에 유래하는 세포에 의해 구축된 세포층은, 각막 상피에 보다 가까운 특성을 가지기 때문이다. 제2 세포는 각막 상피에 유래하는 세포인 것이 특히 바람직하다. 각막 상피와 한층 유사한 특성을 가지는 세포층이 되기 때문이다.

제2 세포는 자기 세포 또는 타인의 세포 중 어떠한 것이라도 된다. 자기 세포에 의해 구축된 세포층이면, 면역 거부의 문제가 없거나 또는 적은 세포층이 된다. 타인의 세포에 의해 구축된 세포층이면, 원재료가 되는 세포의 입수가 용이 하므로, 그 제작의 관점에서 유리한 세포층이 된다. 본 발명의 세포층이, 상이한 2가지 종류 이상의 제2 세포를 포함하고 있어도 된다. 예를 들면, 각막 상피에 유래하는 세포와, 결막 상피에 유래하는 세포를 포함한 상태에서 세포층이 구축되어 있어도 된다.

본 발명의 시트형 조성물에 있어서의 세포층이 각막 상피에 유래하는 세포를 포함하는 것은, 예를 들면, 각막 상피 특이적인 케라틴 3 또는 케라틴 12가 발현되고 있는 것을 지표로 하여 확인할 수 있다. 또는, 케라틴 4를 발현하고 있는 것을 지표로 삼을 수도 있다.

또한, 각막 상피 이외의 조직에 유래하는 세포의 경우도 마찬가지로, 해당 조직에 특이적인 마커 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물은, 지지체로서 양막을 사용하므로, 매우 얇은 상태로 구축할 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물을, 세포층을 포함하지 않을 경우에는, 예를 들면 10㎛ ∼ 100㎛의 두께, 세포층을 포함할 경우에는, 예를 들면 20㎛ ∼ 200㎛의 두께로 조제할 수 있다. 이와 같이 매우 얇은 것도 본 발명의 하나의 커다란 특징이다. 이러한 특징에 의하여, 다양한 용도로 적용할 수 있게 된다. 특히, 높은 투명성을 이용하여 안구 표면의 재건 등에 적용할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물의 상태는 특별히 한정되지 않고, 건조 상태 (예를 들면, 동결 건조 상태), 반건조 상태, 습윤 상태(예를 들면, 용액에 담그어진 상태) 중 어떤 상태라도 된다. 예를 들면, 양막에 있어서 접착 성분의 부착 면만 건 조 상태가 될 수도 있고, 혹은 양막 전체가 건조 상태라도 된다. 세포층을 포함할 경우에는, 세포층 부분은 습윤 상태인 것이 바람직하고, 그 밖의 부분은, 예를 들면 반건조 상태 또는 건조 상태로 한다. 구체적으로는, 예를 들면 세포층을 습윤 상태로 하고, 양막에 있어서 피브리노겐 등의 부착면(피브리노겐 등도 포함함)을 건조 상태 또는 반건조 상태로 하고, 양막의 그 밖의 부분을 습윤 상태로 할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물을, 유리나 플라스틱 등의 케이스에 수납된 상태, 혹은 투명 필름이나 차광 시트 등을 이용하여 포장된 상태로 제공할 수도 있다. 본 발명의 시트형 조성물은 밀봉 상태로 제공되는 것이 바람직하다. 또한, 통상적으로는 사전에 멸균 처리가 실시된 후에 제공된다.

양막 대신, 양막과 동등한 성질과 상태(희미함, 투명성 등)인 콜라겐 시트를 사용하여 시트형 조성물을 구축할 수도 있다. 양막은 IV형 콜라겐을 풍부하게 함유하며, 이러한 콜라겐 시트의 예로서 IV형 콜라겐의 함유율이 높은 것을 들 수 있다. 예를 들면, 소, 돼지, 또는 말의 콜라겐을 이용하여 상기 시트를 구성할 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물은, 조직의 재건용의 이식 재료 등으로서 사용된다. 본 발명의 시트형 조성물의 적용 영역으로서 안과 영역, 소화기 외과 영역, 산부인과 영역, 피부과 영역을 들 수 있다. 이들 각 영역에서의 적용 부위, 대상 질환, 및 용도의 예를 이하에 나타낸다.

1. 안과 영역

세포층을 구비하지 않는 시트형 조성물은, 강막이나 각막의 재건(익상편(pterygium)이나 각막 상피 결손 등에 대한 치료), 검구 유착(symblepharon) 방지에 적용될 수 있다. 다른 한편으로는, 세포층을 구비하는 시트형 조성물은, 각막이나 망막의 재건(스티븐-존슨 증후군(Steven-Johnson Syndrome), 열화학 외상, 안성 유사천포창(ocular pemphigoid), 망막 박리, 노화성 황반 변성증, 녹내장, 망막 색소 변성증 등에 대한 치료)에 적용될 수 있다.

2. 피부과 영역

세포층을 구비하지 않는 시트형 조성물은, 피부(표피) 궤양, 열상 시의 피복에 적용될 수 있다. 다른 한편으로는, 세포층을 구비하는 시트형 조성물은, 표피 -당뇨병성 궤양(표피), 표피 수포증, 또는 열상의 치료에 적용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 시트형 조성물의 제작 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제작 방법은 다음 단계를 포함한다. 즉, (a) 양막을 조제하는 단계와 (b) 상기 양막의 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시키는 단계이다.

「양막」은, 포유 동물에 있어서 자궁과 태반의 가장 표층을 덮는 막으로서, 콜라겐이 많은 실질 조직 상에 기저막, 상피층이 형성되어서 구성된다. 양막으로서 사람의 양막을 사용하는 것이 바람직하다. 사람의 양막은, 예를 들면 분만시에 후산으로 얻어지는 사람의 태아막, 태반 등으로부터 채취할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 사람의 태아막, 태반 및 제대(탯줄, umbilical cord)로부터 이루어지는 일체물을 처리 및 정제함으로써 사람의 양막을 조제할 수 있다. 처리 및 정제하는 방법은, 일본 특개평 5-5698호에 기재된 방법 등의 공지 된 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만 시에 얻어지는 태아막으로부터 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등에 의해 잔존 조직을 제거하고, 적절한 세정 공정을 거쳐서 사람의 양막을 조제할 수 있다.

이와 같이 제조한 사람의 양막은, 사용 시까지 동결해서 보존해 둘 수 있다. 사람의 양막의 동결은, 예를 들면 -80℃, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 글리세롤을 부피 비율로 등량 혼합한 액중(液中)에서 행할 수 있다. 동결 보존함으로써 조작성이 향상되는 것은 물론, 항원성이 저하되는 것도 기대할 수 있다.

양막을 그대로 사용할 수도 있지만, 소파 처리 등에 의해 양막으로부터 상피를 제거한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상피를 제거함으로써 항원성이 저하된다. 예를 들면, 전술한 바와 같이 동결 보존한 인간 양막을 해동한 후, EDTA나 단백 분해 효소로 처리하여 세포 간의 접착을 느슨하게 하고, 그리고 셀 스크레이퍼(cell scraper) 등을 이용해서 상피를 긁어냄으로써, 상피가 제거된 사람의 양막을 조제할 수 있다.

양막은 사전에 건조 처리해 두는 것이 바람직하다. 건조 상태의 양막을 사용함으로써, 피브리노겐 등의 접착 성분을 보다 양호하게 부착시킬 수 있다. 여기에서의 건조 처리로서는 예를 들면, 동결 건조, 공기 건조, 진공 건조, 감압 건조를 들 수 있다. 그 중에서도 동결 건조를 채용하는 것이 바람직하다. 동결 건조 처리할 경우, 양막의 유연성이 쉽게 저하되지 않기 때문이다.

양막의 표면에 대한 피브리노겐 및 트롬빈의 부착은, 각각 단독으로 또는 동 시에 행하여 진다. 부착 방법은 특별히 한정하지는 않는다. 부착 방법의 예로서, 부착시키는 성분의 용해액을 양막 표면에 도포, 적하, 또는 분무하는 방법, 혹은 부착시키는 성분의 용해액에 양막을 침지(浸漬)하는 방법을 들 수 있다. 또한, 피브리노겐 자체(또는 트롬빈 자체)를, 또는 피브리노겐(또는 트롬빈)을 적당한 용매에 용해한 후 석출시킨 성분을 양막 표면에 첨가(바름)함으로써, 피브리노겐(또는 트롬빈)을 양막 표면에 부착시킬 수도 있다.

바람직하게는 이들 두가지 성분의 혼합액을 조제하고, 상기 혼합액을 이용한 도포 및 적하 등에 의해 피브리노겐 및 트롬빈을 동시에 양막 표면에 부착시킨다. 이러한 두가지 성분을 동시에 부착시키는 방법의 구체예를 이하에서 설명한다.

먼저, 피브리노겐 용해액을 조제한다. 구체적으로는 피브리노겐을, 원하는 농도가 되도록 에탄올 (예를 들면 94% 에탄올) 등의 용제(용매)에 용해한다. 에탄올 외에 무수 에탄올, 이소프로판올, 메탄올 등의 알코올류나 아세톤 등을 용제로서 이용할 수 있다. 한편, 동일한 순서로 트롬빈 용해액을 별도로 조제한다. 이 경우의 용제로서는, 예를 들면 에탄올 (예를 들면 99.5% 에탄올), 무수 에탄올, 이소프로판올, 메탄올 등의 알코올류나 아세톤 등을 이용할 수 있다.

그 다음에, 이상의 순서로 준비한 피브리노겐 용해액 및 트롬빈 용해액을 혼합한다. 이와 같이 하여 얻어진 혼합액을 사용하여, 상기와 같이, 양막 상에 도포 및 적하 등을 실시한다. 이상과 같이 피브리노겐 용해액과 트롬빈 용해액을 홉합하고, 혼합액을 사용하여 부착 조작을 실시할 경우에는, 혼합액 중의 수분량이 많아지지 않도록 유의하는 것이 바람직하다. 만일 혼합액 중의 수분량이 많아지면, 부착 조작 전에 피브리노겐과 트롬빈 사이의 반응이 일어나고, 부착 조작에 지장을 초래한다. 또한, 이식 후에 양호한 접착력을 얻기 위해서는, 피브리노겐과 트롬빈이 사전에 작용하지 않는 상태에서 양막 상에 부착되어 있는 것이 바람직하다. 이상의 점을 고려하면, 피브리노겐의 용제 및 트롬빈의 용제로서는 각각 수용성이면서 동시에 수분량이 적으며, 휘발성인 것을 채용하는 것이 바람직하다.

피브리노겐 용해액 및 트롬빈 용해액, 또는 피브리노겐과 트롬빈의 혼합액의 도포 및 적하 등은, 전형적으로는 양막 표면의 모든 영역에 대하여 균일하게 실시되지만, 예를 들면 일부 영역에만 실시되거나(예를 들면, 부분적으로 간격을 두고 복수 영역에 실시하거나, 주변부에만 실시), 부착량의 농도를 변화시켜서 실시될 수도 있다.

전술한 방법으로는 피브리노겐 및 트롬빈의 부착이 동시에 행하여 지지만, 각각의 성분을 별개의 공정으로 부착시켜도 된다. 즉, 피브리노겐의 부착과, 트롬빈의 부착을 2개의 단계로 실시할 수도 있다. 다만, 조작을 간단하게 할 수 있는 점, 및 피브리노겐과 트롬빈을 보다 균일한 분산 상태로 부착할 수 있는 점에 있어서, 피브리노겐과 트롬빈의 혼합액을 사용하여 하나의 단계로 부착 조작을 행하는 것이 바람직하다.

그리고, 피브리노겐 및 트롬빈은, 통상적인 방법에 따라서 혈액으로부터 조제될 수 있다. 재조합체의 피브리노겐 등을 사용할 수도 있고, 이 경우에는 적절한 배양 세포의 배양액 또는 세포 파쇄액으로부터 통상적인 방법으로 조제할 수 있다. 또한, 시판되는 피브리노겐 등을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 인간 유래의 피브리노겐은 백스터(Baxter)사에서 구입할 수 있다. 마찬가지로, 인간 유래의 트롬빈도 백스터사에서 구입할 수 있다.

피브리노겐 및 트롬빈에 더하여, 아프로티닌을 양막 표면에 부착시킬 수도 있다. 즉, 상기 태양에서는, 아프로티닌을 부착시키는 단계(단계 b-1)를 더 실시한다. 아프로티닌의 부착은, 피브리노겐 등과 동일한 수단 및 순서로 실시할 수 있다. 즉, 아프로티닌 용해액을 이용한 도포, 적하, 분무, 침지 등에 의해 양막 표면에 아프로티닌을 부착시킬 수 있다. 아프로티닌 용해액은, 염화나트륨 용액(예를 들면 0.85% 용액), 염화 칼륨 용액, 염화 칼슘 용액, 염화 마그네슘 용액 등에 아프로티닌을 용해함으로써 조제할 수 있다.

또한, 아프로티닌은, 통상적인 방법에 따라서 소의 췌장으로부터 조제할 수 있다. 재조합체의 아프로티닌을 사용할 수도 있고, 이 경우에는 적절한 배양 세포의 배양액 또는 세포 파쇄액으로부터 통상적인 방법으로 조제할 수 있다. 또한, 시판되는 아프로티닌을 사용할 수도 있다. 예를 들면, 소 유래의 아프로티닌은 바이엘 약품에서 구입할 수 있다.

아프로티닌을 부착시키는 단계를 단독으로 실시할 수도 있지만, 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시키는 단계와 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 접착 성분의 부착 조작이 전체적으로 간단하게 되기 때문이다. 또한, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌을 보다 균일하게 분산된 상태에서 양막 표면에 부착할 수 있기 때문이다. 예를 들면, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌의 혼합액을 조제하고, 이것을 도포함으로써 이들 3가지 성분이 양막에 동시에 부착될 수 있다. 이들 3가지 성분 의 혼합 순서는 특별히 한정되지는 않는다.

피브리노겐 등의 부착은, 양막의 한쪽 면 또는 양쪽 면에 대하여 실시된다. 전자의 경우에는 원칙적으로, 양막의 상피의 유무에 관계없이, 상피 측(상피가 존재하고 있던 측)과는 반대 측의 표면(즉, 융모막 측)에 피브리노겐 등의 부착이 행하여 진다.

피브리노겐 및 트롬빈(경우에 따라서는 아프로티닌을 더 부착)을 부착시킨 후, 필요에 따라 건조 처리를 실시한다. 이에 따라, 보존 안정성이 우수한 시트형 조성물이 된다. 또한, 취급(수송, 이식 조작 등)의 면에서도 바람직한 형태가 된다.

건조 처리로서, 공기 건조, 진공 건조, 감압 건조, 동결 건조 등, 일반적인 건조 처리 방법을 채용할 수 있다.

본 발명의 일 태양에서는, 양막 상에 생체 유래 세포를 이용한 세포층이 형성된다. 상기 세포층은, 양막 표면에 대한 트롬빈 등의 부착 조작에 선행하여 형성된다. 즉, 본 태양에서는, 양막 상에 세포층을 형성한 후, 트롬빈 등의 접착 성분을 양막 표면(세포층이 형성되지 않는 측의 표면)에 부착시킨다.

세포층을 형성하는 단계는 다음과 같은 순서로 실시할 수 있다. 먼저, 적절한 생체 유래 세포를 준비한다(생체 유래 세포를 조제하는 단계). 생체 유래 세포로서는, 최종적으로 얻어지는 시트형 조성물의 용도에 적합한 세포를 사용한다. 예를 들면, 피부 표피 조직 재생용의 시트를 제작할 경우에는, 피부 표피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함)나 모낭 상피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 각막 상피 조직의 재생을 목적으로 할 경우에는 각막 상피 세포 (그 줄기 세포, 전구 세포를 포함)를 바람직하게 사용할 수 있고, 점막 상피 조직의 재생을 목적으로 할 경우에는 점막 상피 세포(그 줄기 세포, 전구 세포를 포함)를 바람직하게 사용할 수 있다. 점막 상피 세포의 예로서는 구강 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포 등을 들 수 있다.

생체 유래 세포의 조제 방법에 대해서, 피부 표피 세포, 각막 상피 세포, 구강 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포 및 기도 점막 상피 세포를 예를 들어 설명한다.

(피부 표피 세포)

먼저, 피부를 채취할 때는, 사전에 채취 부위를 예방적으로 포비돈 요드(povidone iodine) 등의 소독약으로 소독하고, 항진균제(antifungal agent)의 외용 도포를 행한 후, 소피부편(small skin piece)을 피부 생체 검사에 준하여 채취한다. 표피 각질 형성 세포를 배양할 때는, 피부편으로부터 지방 조직과 진피를 가위로 최대한 제거하고, Dulbecco 인산 완충액(Dulbecco's phosphate buffer, PBS)으로 수회 세정한다. 70% 에탄올에 1분간 담그어서 멸균한다. 직사각형으로 잘라서, 디스파제액(dispase solution)에 담그고, 4℃로 하룻밤 정치한다. 계속하여 표피를 진피로부터 박리한다. 박리한 표피를 세정 후, 표피편을 풀어 내고, 표피 각질 형성 세포 부유액을 조정한다. 세포를 무혈청 배지에 현탁하고, 콜라겐 코트 접시(collagen-coated dish)에 파종하고, 계대 배양(subculture)을 행한다.

(각막 상피 세포)

각막 상피 세포는 각막 윤부 조직(corneal limbus tissue)으로부터 얻을 수 있다. 예를 들면 각막 윤부 조직으로부터 내피 세포를 박리 제거하고, 결막을 절제하여 단일 세포 현탁액을 제작한다. 그리고 이것을 질소 탱크에 보존하고, 그 후 37℃로 급속히 융해시켜서 각막 상피 세포 부유액을 조정한다. 필요에 따라 계대 배양한다. 계대 배양에는, 예를 들면 무혈청 배지인 EpiLif^TM(Cascade사), MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)나 이들 배지의 아미노산 조성 등을 개변해서 제작되는 배지 등을 사용할 수 있다.

(구강 점막 상피 세포)

구강 점막 상피 세포로서는 치근부(齒根部)에 존재하는 세포(구강 내연 점막 상피 세포(oral crevicular mucosal epithelial cells)), 입술부의 세포, 구개부(palate part)의 세포, 볼부의 세포 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도 구강 내연 점막 상피 세포는 그 증식능이 높고, 또한, 항원성이 낮으므로, 이것을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는, 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 긁어냄으로써 채취할 수 있다. 구강 내연 점막 상피 세포에서는, 발치(tooth extraction)된 이빨에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 이행부(enamel cement transition port)로부터 분리하고, 이에 따라 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신(trypsin)등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람 직하다.

(장관 점막 상피 세포)

장관 점막 상피 세포는 대장 내시경하 장관 상피 생체 검사 조직으로부터 채취, 또는 개복 수술 시에 통상적인 방법으로 채취된다. 또한, 조직으로부터 레이저 현미해부(lazer capture microdissection)에 의해 상피 세포를 절제할 수도 있다. 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 등, 사람의 모든 소화관 상피 세포를 이용해서 제작되는 생체 조직 시트에 대해서도 본 발명의 기술은 적용된다. 궤양이나 염증 등으로 사람의 소화관 상피가 상해를 입었을 때, 골수 유래 세포가 긴급 사태에 대응하는 구조대적인 역할을 수행하여, 상피가 수복된다. 소화관 상피 세포도 일부라고는 해도 골수로부터 만들어진다. 이러한 의미에서, 본 발명의 의의는 각막 상피 세포를 이용하는 것과 동등하다고 볼 수 있다. 통상적으로는, 1000개에 불과 몇 개 정도밖에 없는 골수로부터 생기는 상피 세포가, 위궤양, 대장염 등으로 생긴 소화관 내면의 궤양이 호전되는 과정에서는 50배로부터 100배로도 증가하고, 대략 10개에 1개의 소화관 상피 세포가 골수 유래인 것이 밝혀지고 있다. 여기서 제작되는 소화관 점막 상피 세포 유래 생체 조직 시트는 난치병(불치병)으로 지정되어 있는 중증 장관 감염증, 궤양성 대장염, 크론병(Crohn's disease), 베쳇병(Behchet's disease) 등의 장 질환의 낫기 어려운 궤양, 염증에 대하여, 장관 상피의 재생을 촉진하는 의미로도 대단히 의미가 있는 것으로 여겨진다. 또한, 장관 알레르기에 대한 유용성도 기대된다.

(기도 점막 상피 세포)

기도 점막 상피 세포는 기도 점막의 생체 검사 조직으로부터 용이하게 얻어지고, 상기 조직과 마찬가지로 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 기도 점막 상피 세포는 β-디펜신(defensin)의 생합성, 방출 등을 통하여, 각종 감염증의 병의 용태 진전에 중요한 작용을 담당한다. 또한, 천식이나 알레르기 질환에 있어서도 기도 점막 상피는 중요한 역할을 감당한다. 조직 장애를 입은 기도 점막에 본 발명의 기도 점막 상피 세포로 제작되는 생체 조직 시트를 제공하는 것은, 긴급시 대응을 넘어서, 기도(氣道)의 제공과도 연결된다. 특히, 양막 상에 제작된 시트가 가지는 면역 억제 작용은 유용하다.

구강 점막 상피 세포나 장관 점막 상피 세포 등은 특히, 조직의 채취 후, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

생체 유래 세포는, 생체 조직 시트의 이식을 받는 사람(recipient)으로부터 조제하는 것이 바람직하다. 즉, 생체 유래 세포의 제공자(donor)와, 생체 이식 시트의 이식을 받는 사람이 동일인인 것이 바람직하다. 이러한 자가 세포를 이용함으로써, 면역 거부의 문제가 해소된다.

조제된 생체 유래 세포는, 양막 상에 파종되어(생체 유래 세포를 양막 상에 파종하는 단계), 그 후 배양에 이용된다(파종한 생체 유래 세포를 배양하여 증식시키는 단계).

본 태양에 있어서는 특히, 상피가 제거된 양막을 이용하는 것이 바람직하다. 상피의 제거에 의해 항원성의 저하를 기대할 수 있고, 또한, 불필요한 세포를 사전에 제거함으로써 목적하는 세포층을 양호하게 형성할 수 있게 된다. 상피가 제거된 양막을 이용할 경우, 상피를 제거해서 표출된 면 측 (즉, 기저막 측)에 생체 유래 세포를 파종하는 것이 바람직하다. 상기 표출된 면 측에는, IV형 콜라겐이 풍부하게 포함되어 있으므로, 파종된 생체 유래 세포의 증식 및 중층화가 양호하게 진행되는 것으로 여겨지기 때문이다.

여기서, 2가지 종류 이상의 세포를 이용함으로써, 하이브리드화된 세포층을 형성하도록 해도 된다. 이러한 경우의 세포층의 구체적인 형성 방법을, 각막 상피 재건용의 시트형 조성물을 제작할 경우를 예를 들어, 이하에 상세하게 기술한다.

먼저, 세포층의 형성에 사용하는 세포 종류의 하나(제1 세포)로서 구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 또는 그 밖의 점막 상피 세포, 혹은 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포가 바람직하게 사용될 수 있다. 다른 한편으로는, 제1 세포와 함께 세포층의 형성에 사용되는 세포 종류(제2 세포)로서는, 각막 상피 세포, 결막 상피 세포, 또는 양막 상피 세포가 바람직하게 이용될 수 있다. 이들 세포는, 그것이 존재하는 생체 조직으로부터 채취된다. 구체적으로는, 예를 들면, 목적하는 세포가 존재하는 조직의 일부를 메스 등으로 채취한 후, 결합 조직의 제거, 세포의 분리 등의 처리를 거쳐서 세포 부유 액(현탁액)의 형태로 제조된다. 또한, 제1 세포로서 상이한 2가지 종류 이상의 세포를 사용할 수도 있다. 제2 세포에 대해서도 마찬가지로, 상이한 2가지 종류 이상의 세포를 사용할 수도 있다.

제1 세포의 채취원으로서 바람직한 구강 점막 상피에는 줄기 세포의 존재가 시사되고 있고, 상피양 세포층을 형성하는 세포로 분화 유도를 행하기 용이한 것으로 여겨진다. 또한, 구강 점막 상피 세포를 사용하는 것은, 채취가 용이하고, 다량의 세포를 채취 가능하며, 거기에 더하여, 양안성의 환자를 처치할 경우에 있어서도 자기 세포를 이용해서 이식 재료를 조제할 수 있는 것 등의 이점을 가진다. 특히, 각막 상피 세포를 채취 불가능한 환자에 대하여, 자기 세포 유래의 이식 재료를 적용할 수 있는 이점은, 임상에 있어서 매우 중요한 거부 반응의 문제를 대폭 해소할 것으로 기대된다.

구강 점막 상피 세포로서는 치근부에 존재하는 세포(구강 내연 점막 상피 세포), 입술부의 세포, 구개부의 세포, 볼부의 세포 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도 구강 내연 점막 상피 세포는 그 증식능이 높고, 또한, 항원성이 낮으므로, 이것을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는, 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 긁어냄으로써 채취할 수 있다. 구강 내연 점막 상피 세포에서는, 발치된 이빨에 부착하고 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 전이부로부터 분리하고, 이것으로부터 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위하여, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해 제작되는 시트형 조성물을 이식 예정 환자가 아닌 다른 생체의 구강으로부터 채취한 구강 점막 상피 세포를 이용할 수도 있지만, 면역 거부 반응을 고려하면, 환자 자신의 구강으로부터 구강 점막 상피 세포를 채취하여, 배 양에 제공하는 것이 바람직하다.

구강 점막은 증식능이 높고, 통상적으로 수술후 몇일간의 항생제 내복, 이소딘(isodine) 소독 등으로 창상(創傷)을 치유하므로, 점막 채취에 의한 환자 자신에 대한 침습은 가벼울 것으로 생각된다(light-invasive).

한편, 제2 세포로서는, 타인(allo)의 각막 상피 세포를 바람직하게 이용할 수 있다. 이러한 각막 상피 세포는, 예를 들면, 감염 증세가 없는 도너 안구를 아이 뱅크(Northwest eye bank 등)으로부터 입수할 수 있다. 제2 세포로서 사용 가능한 세포는 각막 상피 세포에 한정되지 않고, 결막 상피 세포, 양막 상피 세포 등을 사용할 수도 있다. 단, 생체에 있어서의 각막 상피를 구성하는 세포인 각막 상피 세포, 또는 그 부근에 존재하는 결막 상피 세포를 채용하면, 각막 상피의 특성을 보다 양호하게 재현하는 시트형 조성물을 구축할 수 있는 것으로 여겨진다. 본 발명자들이 검토한 결과, 제2 세포로서 각막 상피 세포를 사용한 경우에는, 각막 상피에 가까운 세포층을 구축할 수 있는 것이 확인되었다. 이 사실은, 전술한 예상을 지지하는 것임과 동시에, 제2 세포로서 각막 상피 세포가 특히 바람직한 것임을 뒷받침하는 것이다. 한편, 제2 세포로서 양막 상피 세포를 사용한 경우에도, 각막으로서 요구되는 특성을 양호하게 재현한 세포층을 형성할 수 있는 것이 확인되었다. 이 사실은, 제2 세포로서 양막 상피 세포도 바람직하게 사용할 수 있는 것을 나타내는 것이다.

제2 세포로서 자기 세포를 사용할 수도 있지만, 타인의 세포를 사용하기로 하면 세포를 보다 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들면, 양안성의 환자의 치료용 으로 시트형 조성물을 제작할 경우에 있어서도, 제2 세포로서의 각막 상피 세포를 입수할 수 있다.

각각 조제된 제1 세포와 제2 세포 (이하, 이들을 통합해서 「제1 세포 등」이라고도 한다)는 양막 상에 파종되고, 배양에 제공된다. 통상적으로, 세포 부유 액의 형태로 조제된 제1 세포와 제2 세포를 각각 양막 상에 적하하여, 배양을 실시한다.

전형적으로는, 제1 세포의 파종과 제2 세포의 파종을 동시(여기서 「동시」는, 문자 그대로의 동시는 물론, 한 쪽의 파종 뒤에 실질적인 시간적 간격을 두지 않고 다른 쪽을 파종할 경우를 포함)에 실시하지만, 예를 들면, 제1 세포의 파종후, 수분 ∼ 몇시간 경과한 시점에서 제2 세포를 파종하는 등, 양 측을 상이한 타이밍으로 파종할 수도 있다. 이와 같이 파종의 시기를 상이하게 설정함으로써, 예를 들면, 제1 세포에 유래하는 세포가 풍부한 영역이 국소적으로 존재하고 있는 세포층을 구축하는 등, 세포층의 구성 및 그것에 수반하는 특성을 변화시키거나 또는 조정할 수 있게 된다.

파종되는 제1 세포 등의 비율은 특별히 한정되지는 않지만, 전형적으로는, 각각 거의 동일한 개수의 제1 세포와 제2 세포가 파종되도록 한다. 또한, 제1 세포로서 구강 점막 상피 세포를, 제2 세포로서 각막 상피 세포를 사용한 실험에 있어서, 제1 세포의 개수: 제2 세포의 개수가 3: 7의 경우, 5: 5의 경우, 및 7: 3의 경우를 비교한 바, 세포 증식의 면 및 중층화의 면에 대해서 이들 사이의 명확한 차이는 확인되지 않았다(데이터 제공하지 않음).

양막 상에서 제1 세포 및 제2 세포를 배양함으로써, 이들 세포가 증식하여 세포층을 형성한다 (이 과정에 있어서 최소한 일부 세포가 분화하는 것으로 여겨진다). 세포층이 형성된 후, 상기 세포층의 표층을 공기에 접촉시키는 단계를 실시한다. 또한, 본 단계를 본 명세서에 있어서 에어 리프팅(Air-lifting)이라고도 한다. 본 단계는, 세포층을 형성하는 세포의 분화 및 보호 기능(barrier function)의 유도를 위해서 행하여 진다.

본 단계는, 배양액의 일부를 스포이트, 피펫 등을 이용해서 일시적으로 제거함으로써 배양액 표면적을 저감시키고, 이에 따라 세포층의 가장 표층을 일시적으로 배양액 외로 노출시킴으로써 행할 수 있다. 또는, 세포층을 양막 채로 들어 올리고, 가장 표층을 배양액 표면으로부터 일시적으로 노출시킴으로써 행할 수도 있다. 나아가서, 튜브 등을 이용해서 공기를 배양액 내로 송출하고, 세포층의 가장 상층에 공기를 접촉시킬 수도 있다. 조작의 용이성의 관점에서, 배양액 표면적을 저감시켜서 세포층의 가장 표층을 노출되게 하는 방법에 의해 행하는 것이 바람직하다.

본 단계를 행하는 시간, 즉 중층화된 세포층의 가장 표층을 공기에 접촉시키는 시간은, 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 변동하지만, 예를 들면 3일 ∼ 2주일 정도이며, 바람직하게는 1주일 이내, 더욱 바람직하게는 3일 이내이다.

이상, 본 발명의 방법에 의해, 양막 상에 있어서, 제1 세포 등이 중층화된 각막 상피양의 세포층이 형성된다. 이와 같이 하여 얻어진 시트형 조성물은, 제1 세포 등의 배양 기질로서 이용할 수 있는 양막과 함께, 각막을 손상 혹은 결손한 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로서 이용할 수 있다. 이 경우, 양막이 안구 측이 되도록 각막 상피 결손부에 이식된다.

본 발명의 일 태양에서는, 생체 유래 세포의 배양을 지지 세포의 존재 하에서 행한다. 지지 세포는 영양 세포(feeder cell)라고도 하며, 배양액 내로 성장 인자 등을 공급한다. 지지 세포와 공존 하에서 배양함으로써, 세포의 증식 효율이 향상된다. 지지 세포로서는, 예를 들면 3T3 세포(스위스 마우스 3T3세포, 마우스NIH3T3 세포, 3T3J2 세포) 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 증식 효율, 취급의 용이성 등의 관점에서 마우스 NIH3T3 세포를 지지 세포로서 이용하는 것이 바람직하다.

지지 세포를 사전에 마이토마이신C(mitomycin C) 등을 이용하여 불활성화해 두는 것이 바람직하다. 지지 세포 자체가 증식함으로써 생체 유래 세포의 증식이 저해되는 것을 방지하고, 생체 유래 세포의 증식 효율을 상승시키기 위해서이다. 이러한 불활성화는 방사선 처리 등에 의해서도 행할 수 있다.

지지 세포의 세포 밀도는, 예를 들면 약 1×10²개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1×10²개/cm² ∼ 약 1×10⁷개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1×10³개/cm² ∼ 약 1×10⁵개/cm²가 될 수 있다. 제1 세포 등과 대비하면, 사용하는 지지 세포 개수를, 예를 들면 생체 유래 세포의 총 개수에 대하여 1/10³배 ∼ 1×10²배, 바람직하게는 1/10² ∼ 1배가 되는 조건으로 배양을 행할 수 있다. 지지 세포 개수가 적으면 생 체 유래 세포의 증식율이 저하되고, 지나치게 적을 경우에는 생체 유래 세포의 증식이 불량해지고 중층화되기 곤란하다. 한편, 지지 세포 개수가 지나치게 많을 경우에는, 도리어 생체 유래 세포의 증식율을 저하시키므로 바람직하지않다.

생체 유래 세포의 배양을 지지 세포의 공존 하에서 행할 경우에는, 지지 세포와 양막 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 포어 사이즈(pore size)의 격리막을 존재시키는 것이 바람직하다. 상기 격리막의 이용함으로써, 배양시에 양막 측(즉, 생체 세포 측)에 지지 세포가 침입하는 것을 방지할 수 있다. 그 결과, 최종적으로 얻어지는 시트형 조성물 내에 지지 세포가 혼재할 우려가 없게 된다. 이는, 지지 세포에 의한 면역 거부의 문제가 없는 시트형 조성물의 제작할 수 있는 것을 의미하고, 임상 상 극히 큰 의미가 있다.

격리막으로서는, 지지 세포를 통과할 수 없는 포어 사이즈를 가지는 공지된 것을 적절하게 선택해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리카보네이트제, 포어 사이즈가 약 0.4㎛ ∼ 3.0㎛인 막을 이용할 수 있다. 격리막의 재질은 특별히 한정되지 않고, 폴리카보네이트 외에 폴리에스테르 등이 될 수도 있다. 이러한 격리막은 시판되고 있으므로, 용이하게 입수할 수 있다.

격리막을 이용한 경우의 배양 방법의 예로서 이하의 방법을 들 수 있다. 먼저, 샤레 등의 용기 (제1 용기)에 불활성화한 지지 세포를 파종해서 배양함으로써, 용기 표면에 지지 세포층을 형성시킨다. 그 다음에, 격리막으로 바닥면을 형성한 제2 용기를, 제1 용기 내에 설치한다. 이때, 제2 용기의 바닥면이 배양액 내가 되도록 제2 용기의 위치를 조정한다. 계속해서, 제2 용기의 바닥면, 즉 격리막 상에 양막을 올리거나 또는 부착시킨다. 그리고, 양막 상에 생체 유래 세포를 파종하고, 배양한다.

제2 용기의 바닥면에 사전에 양막을 올리거나 또는 부착시켜 두고(예를 들면, 제2 용기의 바닥면에 상피를 제거한 양막을 올리고, 이 상태에서 일단 건조 처리를 행한다), 상기 제2 용기를, 지지 세포를 파종한 제1 용기 내에 설치하고, 그리고 양막 상에 생체 유래 세포를 파종하고, 배양을 행할 수도 있다.

생체 유래 세포를 배양할 때에 이용할 수 있는 배양액은, 상기 세포를 증식시키고, 중층화할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상피 세포의 성장에 통상적으로 이용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 섞고, FBS, 성장 인자, 항생 물질 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 구체예로서는, FBS(10%), 인슐린(5 mg/ml), 콜레라 톡신(cholera toxin)(0.1nM), 상피 세포 증식 인자(ECF) (10ng/ml), 및 페니실린-스토렙토마이신(50IU/ml)을 첨가한, DMEM과 햄 F12 배지의 혼합 배지(혼합 체적비 1:1)를 들 수 있다. 또한, 트리요드사이로닌(triiodothyronine)(예를 들면, 2nM), 글루타민(예를 들면, 4 mM), 트랜스페린(transferrin)(예를 들면, 5mg/ml), 아데닌(예를 들면, 0.18mM), 및/또는 하이드로코르티손(hydrocortisone)(예를 들면, 0.4mg/ml)을 더 첨가한 DMEM/햄 F12 혼합 배지를 이용할 수도 있다.

생체 유래 세포의 배양을, 이종 동물 세포 비존재 하에서 행하도록 할 수도 있다. 본 발명에 있어서 「이종 동물 세포 비존재하」는, 생체 유래 세포를 배양 할 때의 조건으로서, 상기 생체 유래 세포에 대하여 이종인 동물의 세포가 사용되지 않는 것을 의미한다. 구체적으로는 생체 유래 세포로서 인간 세포(예를 들면 인간 피부 표피 세포나 인간 각막 상피 세포)를 사용할 경우에, 마우스나 랫 등, 인간 이외의 동물종의 세포가 배양액 내에 존재(병존)하지 않는 조건을 의미한다. 이러한 조건으로 배양을 실시함으로써, 최종적으로 얻어지는 이식 재료 (즉 시트형 조성물)에 이종 유래의 성분(이종 세포 자체를 포함함)이 혼입될 우려가 없어진다.

생체 유래 세포를 배양할 때에 이용할 수 있는 배지는, 상기 세포를 증식시키는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)나, EpiLife^TM(Cascade사), 이들 배지의 아미노산 조성 등을 개변하여 제작되는 배지, 상피 세포의 성장에 통상적으로 이용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 섞은 배지 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 무혈청이면서 이종 동물 유래의 단백질을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용할 수도 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 있어서의 배양 방법으로서 무혈청 배양법을 채용하는 것이 바람직하다. 혈청 유래의 성분의 혼입에 의한 면역 거부 등의 문제를 회피할 수 있기 때문이다. 또한, 혈청을 포함하는 배지 내에서 배양해도 되지만, 그 경우에는 동종 유래의 혈청(인간 생체 유래 세포를 배양할 때는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하 다. 물론, 가능하면, 면역 거부 반응을 야기할 우려가 없는 자가 혈청을 사용하는 것이 바람직하다.

생체 유래 세포의 양호한 증식을 목적으로, 배양 단계의 도중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.

배양 단계의 결과, 양막 상에서 생체 유래 세포가 증식한다. 이와 같이 하여 얻어진 세포층의 표층을 각질화(keratinization)할 필요가 있을 경우(예를 들면, 피부 표피 세포를 이용하여 피부 표피 시트를 제작할 경우나, 각막 상피 세포를 이용하여 각막 상피 시트를 제작할 경우)에는, 상기 에어 리프팅(Air-lifting)을 실시할 수 있다.

생체 유래 세포는, 예를 들면 세포 밀도가 약 1×10³개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1×10³개/cm² ∼ 약 1×10⁷개/cm², 더 바람직하게는 약 1×10⁴개/cm² ∼ 약 1×10⁶개/cm²가 되도록 양막 상에 파종된다.

바람직한 일 태양에서는, 사전에 제조한 인간 섬유아 세포(fibroblast)함유 콜라겐 매트릭스 상에 양막을 올리고, 그 후, 양막 상에 생체 유래 세포를 파종하고 배양한다. 즉, 본 태양에서는, 콜라겐 겔 내에서 인간 섬유아 세포를 배양하는 단계(단계 B), 및 상기 콜라겐 겔 상에 양막을 올린 후, 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 상에 파종 또는 올리는 단계(단계 C)가 실시된다. 이러한 순서로 제작된 시트형 조성물은, 인간 섬유아 세포를 함유하는 콜라겐 겔 상에 올린 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를 함유하게 된다. 본 태양의 시트형 조성물은, 콜라겐 매트릭스를 제거한 후에 이식 재료로서 이용할 수도 있다. 또한, 콜라겐 매트릭스인 채로 이식 재료로서 사용할 수도 있다.

「콜라겐 겔」은 인간 섬유아 세포의 배양 기질로서 기능한다. 콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않고, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 여러 종류의 콜라겐이 혼재하는 것을 사용할 수도 있다. 이들 콜라겐은, 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화 방법, 알칼리 가용화 방법, 효소 가용화 방법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 저하시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소로 처리함으로써 텔로펩타이드(telopeptide)를 제거한, 소위 아테로콜라겐(atherocollagen)화 된 것을 이용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔 재료로서 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용할 수도 있다. 여기서, 양막 유래의 의미는, 양막을 출발 원료로서 얻은 것을 의미한다.

콜라겐 겔에 함유되는 인간 섬유아 세포의 유래는 특별히 한정되지 않고, 콜라겐을 생산하는 것이면 어떠한 조직 유래라도 되며, 예를 들면, 피부 조직, 구강 점막 조직 등으로부터 제조한 인간 섬유아 세포를 사용할 수 있다.

콜라겐 매트릭스의 제작 방법의 구체예를 나타낸다. 먼저, 이하의 순서로 인간 섬유아 세포를 제조한다. 피부를 채취하고, 계속해서 피부로부터 진피를 박리한다. 진피를 가늘게 자르고, I형 콜라겐 코트 접시에 밀착되게 한다. 정치 배양하고, 진피편으로부터 이동하는 인간 섬유아 세포를 계대 배양한다. 세포를 접시 바닥면으로부터 박리시키고, 세포 부유액을 조정하고, 세포 배양용 접시에 파종 한다. 세포를 적절하게 동결 보존(예를 들면, 액체 질소중에 보존)한다.

한편, I형 콜라겐을 이용해서 중화 콜라겐 액을 제조한다 (후술하는 실시예를 참조). 이것을 배양 용기(예를 들면, 배양 삽입 용기)에 첨가하고, 실온에서 10분 정도 정치시켜서 겔화시킨다. 그 다음에, 전술한 방법에 의해 사전에 배양해 둔 대수 증식기(logarithmic growth phase)의 인간 섬유아 세포를 상기 겔에 혼합하고, 다시 겔화시킨다. 그 후, 정치 배양한다. 이상의 순서에 의해 인간 섬유아 세포를 함유하는 콜라겐 매트릭스가 얻어진다. 이 창의적인 연구에 의해, 필요한 강도를 가지고, 양막층이나 생체 유래 세포를 올릴 수 있는 콜라겐 매트릭스가 된 것으로서, 본 발명의 근간을 이룬다. 콜라겐 매트릭스의 위에는, 별도로 준비한 양막이 올려진다(밀착된다). 그 후, 전술한 순서로 세포의 파종, 배양이 실시된다.

이하, 본 발명의 실시예(실험예를 포함)를 설명한다.

[실시예]

1. 접착제 부착 시트의 제작

1-1. 접착 성분 혼합액의 조제

먼저, 피브리노겐(Vaxter사) 84mg과 94% 에탄올 700㎕를 혼합하고, 균질기(homogenizer)로 교반한 후, 4℃로 20시간 정치시켰다(A액). 한편, 트롬빈(Vaxter사) 2mg과 100% 에탄올 35㎕를 혼합하고, 피펫팅(pipetting)에 의해 교반한 후, -30℃로 16시간 정치시켰다 (B액).

A액 및 B액을 혼합하고, 계속해서 3000 KIU/ml로 조정한 아프로티닌(Vaxter 사)을 7㎕ 첨가하였다. 이와 같이 하여 얻어진 3가지 성분 혼합액을 후술하는 부착 처리에 사용하였다.

1-2. 접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트의 제작

양막(상피를 가진다)에 접착 성분이 부착된 시트 (이하, 「접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트」라고도 한다)를 이하의 순서로 조제하였다.

1-2-1. 양막의 채취

양막은, 전신에 합병증이 없는 제왕 절개 예정인 임산부에 대하여 사전에 산부인과 의사와 함께 충분한 인폼드컨센트(informed consent, 설명에 입각한 동의)를 행한 후, 수술실에서 제왕 절개 시에 채취하였다. 청결에 주의하여 조작하였고, 수술 조작에 준해서 손을 씻은 후에 전용 가운을 착용(사용)하였다. 분만 전에 청결한 양막 채취용의 통(vat)과 세정용의 생리 식염수를 준비하였다. 분만 후에 태반 조직을 상기 통에 옮기고, 손으로 양막 조직을 태반으로부터 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.

1-2-2. 양막의 처리

양막 처리의 과정은 (1) 세정, (2) 트리밍(trimming), (3) 보존의 순으로 행하였다. 모든 과정에 있어서, 조작은 청결한 드래프트(draft) 내에서 행하는 것이 바람직하고, 사용하는 용기나 기구도 모두 멸균된 것을 사용하고, 샤레 등은 멸균된 1회용(디스포저블) 타입을 사용하였다. 채취한 양막에 부착된 혈액 성분을 생리 식염수로 세정하면서 제거하고, 또한, 충분량의 생리식염수(0.005% ofloxacin 첨가)로 세정하였다. 다음에 양막을 샤레 내의 인산 완충액(PBS)에 옮기고, 가위 를 사용하여 약 4cm×3cm 정도의 사이즈로 분할하였다. 분할 후에, 또한 몇 개의 샤레에 보존액을 담그고, 그 중에서 상태가 좋은 양막을 선별하였다.

1-2-3. 양막의 보존

2cc의 저온 배관(cryotube)에 보존액을 1cc씩 넣고, 거기에 채취 및 세정하여 선별된 양막을 1장씩 넣어 라벨을 붙인 후, -80℃의 냉동고에 보존하였다. 보존액에는 멸균처리된 50% 글리세롤 in DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium: GIBCOBRL사)을 사용하였다. 보존된 양막의 사용 기한은 3개월로 설정하고, 기한이 지나면 소각 처분하였다.

1-2-4. 건조 처리

한 세트의 멸균된 플라스틱 프레임으로 협지한 후, 클립으로 고정하였다. 프레임채 -80℃의 급속 냉동고(deep freezer) 내에 옮기고, 양막의 동결을 확인한 후, 진공 동결 건조기(Yamato, NEOCOOL)를 이용해서 동결 건조 처리(-110℃, 약 1시간)를 행하였다. 사용 설명서에 따라서, 충분한 건조체가 얻어지도록 조건을 설정하였다.

1-2-5. 건조 양막 시트에 대한 접착 성분의 도포

1-1.에 따라 조제한 A액, B액, 및 아프로티닌액을 혼합하고, 충분히 피펫팅을 행하였다(혼합액). 그 다음에, 1-2-4.에 따라 제작한 건조 양막의 표면(융모막 측)의 거의 전체적으로 넓혀지도록, 상기 혼합액을 적하한 후(피브리노겐의 부착량: 5.5mg/cm², 트롬빈의 부착량: 0.13mg(1.4U)/cm², 아프로티닌의 부착량: 1.4KIU/cm²), 상온으로 2시간 동안 감압 건조시켰다. 계속해서, 건조된 양막을 프레임으로부터 떼어내고, 외측이 폴리아미드 나일론, 내측이 폴리에틸렌으로 이루어지는 2층 구조로 된 봉지에 옮기고, 가정용 진공팩기(Flaem Nouva사, MAGIC VAG)를 이용하여 진공 포장하였다. 이와 같이 하여 얻어진 진공팩 상태의 양막에 γ(감마)선을 조사(약25kGy)하여 멸균하였다. 멸균 처리 후의 양막을 진공팩 상태인 채로 사용 직전까지 상온 보존하였다 (접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트).

1-3. 접착 성분 부착-상피가 제거된 양막 시트의 제작

상피가 제거된 양막에 접착 성분이 부착된 시트(이하, 「접착 성분 부착-상피가 제거된 양막 시트」라고도 한다)를 이하의 순서로 조제하였다.

1-3-1. 양막 상피의 제거

상기의 순서(1-2-1. ∼ 1-2-3.)로 채취 및 보존한 양막을 실온에서 해동한 후, 샤레 내의 멸균된 인산 완충액(PBS)으로 충분히 세정하였다. 세정후 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque사)에 2시간 동안 37℃로 보존한 후, 셀 스크레이퍼(cell scraper, Nunc사 USA)를 이용해서 기계적으로 상피를 제거하였다. 이와 같이 하여 얻어진, 상피를 포함하지 않는 양막에 대하여, 상기의 순서(1-2-4 및 1-2-5)로 건조 처리 및 접착 성분의 도포를 실시하여(피브리노겐의 부착량: 0.5mg/cm², 트롬빈의 부착량: 12㎍/cm², 아프로티닌의 부착량: 0.12KIU/cm²), 진공팩 상태의 접착 성분 부착-상피가 제거된 양막 시트를 얻었다.

1-4. 접착 성분 부착-세포층 형성 양막 시트(1) (접착제 부착-배양 각막 시 트)의 제작

각막 상피 세포에 유래하는 세포층이 양막(상피가 제거됨) 상에 형성되고, 또한, 양막의 표면에 접착 성분이 부착된 시트(이하, 「접착 성분 부착-배양 각막 시트」라고도 한다)를 이하의 순서로 조제하였다.

1-4-1. 양막 상피의 제거

상기 순서(1-2-1. ∼ 1-2-3.)로 채취 및 보존한 양막을 실온에서 해동한 후, 샤레 내의 멸균된 인산 완충액(PBS)으로 충분히 세정하였다. 세정 후, 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque사)에 2시간 동안 37℃로 보존한 후, 셀 스크레이퍼(Nunc사 USA)를 이용해서 기계적으로 상피를 제거하였다. 이와 같이 하여 얻어진, 상피를 포함하지 않는 양막을 이하의 세포 배양의 기질로서 사용하였다.

1-4-2. 각막 상피 세포의 회수

6주령(6 week old)의 일본 백색 집토끼의 각막 윤부(corneal limbus)로부터 수술용 메스를 이용해서 약 5mm×10mm의 각막 윤부조직편을 채취하였다. 채취한 조직편을 50IU/m1의 페니실린 스트렙토마이신, 겐타신(gentacin)을 함유하는 인산 완충액(PBS)에 30분 동안 실온의 조건으로 2회 침지하였다. 그 후, 조직을 1.2U 디스파제(Nacalai tesque사)를 함유하는 인산 완충액(PBS)에 1시간 동안, 37℃의 조건으로 침지하고, 계속해서 0.05% 트립신-EDTA 용액(GIBCOBRL사)에 15분 동안 침지 처리하여 세포를 분리시켰다. 효소 활성은 10%의 소의 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM에 침지시킴으로써 정지시켰다. 그 후, 60㎛의 셀·필터로 잔여 조직을 제거하고, 각막 상피 세포를 단리(單離)하였다 (각막 상피 세포 부유액).

1-4-3. 공동 배양 세포(co-cultured cell)의 조제

공동 배양의 세포(지지 세포)로서, NIH-3T3 세포 (이하, 「3T3세포」로 약칭함)을 사용하였다. 사전에 배양해서 75F 플라스크(BD Falcon사)에서 융합된 3T3 세포를 0.05% 마이토마이신C 용액에 2시간 동안 침지시켜서, 3T3의 증식 활성을 억제하였다. 계속해서, 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정하여 마이토마이신 C를 제거한 후, 0.05% 트립신―EDTA용액으로 처리함으로써, 3T3 세포 부유액을 조제하였다.

1-4-4. 세포 배양 및 점막 상피의 유도

1-4-1.에 의하여 얻어진, 상피를 소파한 인간 양막을 기질로 하여, 각막 상피 세포와, 전술한 바와 같은 처리를 실시한 3T3 세포를 이하의 순서로 공동 배양하였다. 배양 기구로서는 6웰의 배양 접시(culture dish) (Corning사, NY)와, 배양 삽입 용기(culture insert)(폴리카보네이트제, 평균 포어 사이즈 3.0㎛, Corning사, NY)를 이용하였다.

먼저, 배양 접시 상에 약 1×10⁴개/cm²의 세포 밀도가 되도록 3T3 세포 부유액을 파종하고, 37℃, 5% CO의 조건 하에서 배양하였다. 또한, 배양 삽입 용기 상에 소파한 상피 측을 위로 해서 양막 기질을 정치하여 부착하고, 실온에서 10분 동안 건조시켰다. 그 후, 양막을 접착시킨 배양 삽입 용기 상에 각각 약 1×10⁴개/cm²의 세포 밀도가 되도록 각막 상피 세포 부유액을 파종하였다.

이상의 조작 후, 도 1에 도시한 바와 같이, 배양 삽입 용기를 배양 접시 내에 설치하고, 3T3 세포 및 각막 상피 세포를 동일한 배지 내에서 배양하였다. 또 한, 도 1은 배양중인 상태를 나타낸 모식 단면도이다. 배양 접시(1) 내에 배양 삽입 용기(2)가 정치되고, 배양 접시(1)의 바닥면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입 용기(2)의 바닥면 상에 양막(3)이 정치되고, 그 위에 각막 상피 세포(4)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 6은 배지이다.

배지에는, DMEM/햄 F12 혼합 배지(혼합 부피비 1: 1)에, 10% FBS, 인슐린(5 mg/ml), 콜레라톡신(0.1nM), 페니실린 스트렙토마이신(50 IU/ml), 인간 재조합체 상피 세포 증식 인자(EGF)(10ng/ml)를 첨가한 것을 사용하였다.

전술한 바와 같은 배지 내에서 약 7일간 배양하였다(Submerge). 그 후, 점막 상피를 분화 유도하기 위해, 소위 에어 리프팅(Air lifing)법으로 약 3일간 배양하였다. 에어 리프팅법은, 배지의 액면을, 양막 상에 형성된 세포층면까지로 설정하고, 상기 세포층의 표면을 공기중에 폭로하는 방법이다. Submerge중에는 이틀마다 배지를 교환하고, 에어 리프팅 후에는 매일 배지 교환하여 배양을 행하였다.

이상의 방법으로 배양함으로써, 약 10일간(에어 리프팅법에 의한 3일간의 배양을 포함) 5 ∼ 6층의 중층화된 세포층을 형성하였다 (배양 각막 시트).

1-4-5. 접착 성분의 부착

이상의 결과 얻어진 배양 각막 시트를 배양액 중에서 꺼낸 후, 그 세포층 형성 측과는 반대 측의 표면(융모막 측)을, 송풍에 의한 공기 건조에 의해 반건조 상태로 하였다. 그 다음에, 반건조 상태의 양막 표면을, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌의 혼합액(1-2-5.와 동일한 순서로 조제된다)에 침지하고, 계속해서 바람으로 건조하여 반건조 상태로 하였다. 이러한 일련의 작업중, 세포 배양면을 습윤 상태로 유지하였다. 이상의 조작의 결과, 세포층이 형성된 측과는 반대 측의 양막 표면에 접착 성분이 부착된 시트형 조성물(접착제 부착-배양 각막 시트)을 얻었다.

1-5. 접착 성분 부착-세포층 형성 양막 시트(2)(접착 성분 부착-배양 표피 시트)의 제작

표피 각질 형성 세포에 유래하는 세포층이 양막(상피가 제거됨) 상에 형성되고, 또한, 양막의 표면에 접착 성분이 부착된 시트(이하, 「접착 성분 부착-배양 각막 시트」라고도 한다)를 이하의 순서로 조제하였다.

1-5-1. 양막 상피의 제거

상기 순서(1-2-1. ∼ 1-2-3.)로 채취 및 보존한 양막을 실온에서 해동한 후, 샤레 내의 멸균된 인산 완충액(PBS)으로 충분히 세정하였다. 세정후 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque사)에 2시간 동안 37℃로 보존한 후, 셀 스크레이퍼(Nunc사 USA)를 이용해서 기계적으로 상피를 소파하였다. 이와 같이 하여 얻어진, 상피를 포함하지 않는 양막을 이하의 세포 배양의 기질로서 사용하였다.

1-5-2. 표피 각질 형성 세포의 조제

1-5-2-1. 피부의 채취

사전에 채취 부위를 3일정도 예방적으로 포비돈 요드로 소독·항진균제를 외용 도포한 후, 소피부편을 피부 생체 검사에 준해서 채취한다.

1-5-2-2. 표피 각질 형성 세포의 무혈청 배양법

가위로 피부편으로부터 지방 조직과 진피를 제거할 수 있는 만큼 제거하고, Dulbecco 인산 완충액(PBS)으로 수회 세정한다. 70% 에탄올에 1분간 담그어 멸균 한다. PBS로 세정후, 폭 3mm, 길이 10mm정도의 직사각형으로 자르고, 디스파제액(디스파제II, Goudou Shusei, 250단위/ml Dulbecco modified Eagle's medium; DMEM)에 담그고, 4℃로 하룻밤(18 ∼ 24시간) 동안 정치한다. 다음날, 핀셋으로 표피를 진피로부터 박리한다. 박리된 진피는 섬유아 세포 배양에 제공된다. 박리한 표피를, DMEM으로 세정하고, 계속하여, PBS로 세정한 후, 0.25% 트립신 용액중에 담그고, 37℃, 10분 동안 처리를 행한다. 표피를 트립신 중화액을 넣은 플라스틱 샤레에 옮기고, 핀셋으로 표피편을 풀어내고, 50ml의 멸균 튜브로 옮긴다. PBS를 첨가하여, 표피 각질 형성 세포 부유액을 조정한다. 세포 개수를 세고, 1000rpm, 5분간 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 상청액을 흡인하고, 세포를 무혈청 배지인 MCDB153 배지로 현탁하고, 100mm의 콜라겐막 샤레(ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION, I형 콜라겐막 접시; 4010-010)당 2 ∼ 3×10⁶세포/mm1 배양액의 비율로 파종한다. 다음날 배양액을 교환하고, 이후 이틀마다 배양액을 교환한다. 세포 밀도가 70 ∼ 80%정도가 된 시점에서 계대 배양을 행한다.

1-5-3. 섬유아 세포의 조제

박리한 진피를 DMEM으로 세정 후, 한변이 1 ∼ 2mm인 메스를 이용해서 가늘게 자른다. 가늘게 자른 진피편을 Ⅰ형 콜라겐막 접시에 약 1cm 간격으로 밀착되게 한다. CO₂ 인큐베이터에 30분 동안 정치하고, 완전히 밀착되게 한다. 그 후, 소의 태아 혈청을 10% 포함하는 DMEM 배지를 약 5ml 첨가하고, 7일 동안 정치한다. 7일째에 첫회의 배양액 교환을 행한다. 진피편으로부터 섬유아 세포가 이동해 오 는 것을 확인한다. 세포가 증식하고, 진피편의 주위 5mm까지 이동해 온 단계에서, 계대 배양을 행한다. PBS에서 세정후, 0.125% 트립신 및 0.05% EDTA를 포함하는 용액을 3ml 첨가하고, 37℃에서 3분 동안 처리한다. 세포가 접시 바닥면으로부터 박리된 것을 현미경으로 확인한 후, 3ml의 트립신 저해제를 첨가하여 세포를 회수하고 50ml의 튜브에 옮긴다. PBS를 이용하여 잔여 세포를 회수하고, 1000rpm, 5분 동안의 원심 처리로 세포를 침전시키고, 상청액을 흡인한 후, 소의 태아 혈청을 10% 포함하는 DMEM 배지를 첨가하여, 세포 부유액을 조정하고, 세포 배양용 접시에 파종한다. 계대 배양 시의 세포 밀도는 대체로 1: 3 정도로 설정한다. 세포를 적절하게 동결 보존한다. 동결 보존액은 10% 글리세롤, 20% FCS, 70% DMEM을 이용하고, 액체 질소중에서 보존한다.

1-5-4. 중화 콜라겐 겔의 제작

I형 콜라겐 용액(세포 매트릭스 타입 1A: 3mg/ml: Nitta Gelatin Inc.): 6용량에 대하여 0.1NNaOH: 1용량, 8배 농도 DMEM: 1용량, 20% FCS/DMEM: 10용량의 비율로 중화 콜라겐액(콜라겐의 최종 농도: 1mg/ml)을 4℃에서 제작하고, 직경 24mm의 배양 삽입 용기(Corning-Costar사)에 1ml씩 첨가하고, 실온에서 10분 동안 정치하여 겔화시킨다. 사전에 배양해 둔 대수 증식기의 섬유아 세포(디스파제 처리하여 표피를 박리한 잔여 진피로부터 outgrow법으로 배양하고, 5 ∼ 10대 계대 배양한 세포를 이용한다.) 를 5×10⁵세포/ml, 10% FCS/DMEM의 농도로 조정하고, 이 세포현탁액: 2용량에 대하여 중화 콜라겐액: 8용량의 비율로 혼합하고, 세포를 포함하 는 중화 콜라겐 용액을 조제한다(콜라겐의 최종농도: 0.8mg/ml). 이 용액을 각 배양 삽입 용기에 3.5ml씩 첨가하고, CO²인큐베이터 내(37℃, 5% CO₂)에 정치한다. 약 30분만에 겔화된 것을 확인한다. 그 후 10% FCS/DMEM을 겔이 잠길 정도(배양 삽입 용기 내측에 3ml, 배양 삽입 용기 외측에 3ml)로 첨가하여 5일 동안 정치 배양한다. 배양 2일째부터 겔은 수축을 시작하고, 섬유아 세포의 증식을 위상차 현미경 하에서 관찰할 수 있다.

1-5-5. 양막의 접착

배양 개시 5일 후에는 콜라겐 겔의 바닥면은 세포막에 밀착되어 있지만 콜라겐 겔 상부는 수축되어 두께가 2mm ∼ 3mm로 되어 있다. 보존하던 양막(1-3-1.과 동일한 순서로 제조한, 상피를 제거한 양막)을 PBS로 2회 세정하고, 또한, 각질 형성세포용 배양액으로 1회 세정한다. 양막의 실질 세포 측을 아래로 하여 배양 삽입 용기에 옮기고, 핀셋을 이용하여 콜라겐 겔과 밀착되게 한다. 핀셋으로 주름이 생기지 않도록 연장시키고, 배양 삽입 용기의 측벽에 양막의 주변을 밀착되게 한다. CO₂ 인큐베이터 내에 옮기고, 37℃로 30분 동안 정치한다.

1-5-6. 각질화 세포의 파종

1-5-2.에 의하여 제조한 각질와 세포를 트립신·EDTA를 이용해서 접시로부터 박리하여 회수한다. 1000rpm으로 5분 동안 원심 처리하고, 상청액을 제거하며, 200만개/0.25ml의 농도가 되도록 세포를 현탁한다. 배양 삽입 용기 내측의 양막 상에 0.25ml의 세포 현탁액을 파종하고, CO₂ 인큐베이터 내에 옮기고, 각질화 세포 가 양막에 밀착되도록 1.5 ∼ 2.0시간 동안 배양기 내에서 정치하고, 그 후 1ml의 표피 세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 천천히 첨가하고, 또한, 배양 삽입 용기 외측에 1ml 첨가한다. 다음날 표피 세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 천천히 추가하고, 또한, 배양 삽입 용기 외측에도 1ml 추가한다.

1-5-7. 기상하 배양(culture under vapor phase conditions)

표피 세포를 양막에 파종 후, 3일째에 에어 리프팅(air-lifting)을 행한다. 에어 리프팅용의 유지 용기에 멸균한 여과지를 설치하고, 중층화용 배지를 여과지가 잠길 정도(약 9ml)만큼 첨가한다. 배양 삽입 용기 내측의 배양액을 조심스럽게 제거하고, 배양 삽입 용기를 여과지 위로 옮겨서, CO² 인큐베이터 내에서 배양한다. 배양액은 이틀마다 교환한다. 7 ∼ 14일의 에어 리프팅에 의해 3차원 배양 피부가 완성된다. 중층화용 배지는 이하와 같이 조정한다. Dulbecco modified Eagle's medium 배지: F-12 배지 = 1: 1, 칼슘 농도; 1.95mM, monoethanolamine; 0.1mM, 0-phosphoeLhanolamine; 0.1mM, insulin; 5ug/m1, hydrocortisone; 0.4ug/ml, L-glutamine; 4mM, Adenin; 0.18mM, transfferin; 5ug/m1, selenious acid; 53nM, triiodothyronine; 20pM, serine; 1mM, choline chloride; 0.64mM, linoleic acid; 2ug/m1, FCS;2%.

이상의 조작의 결과 얻어지는 배양 표피 시트는, 접시 바닥면으로부터 또는 콜라겐 매트릭스로부터 용이하게 박리된다. 종래 기술로는 시트의 수축이 일어나기 때문에, 키틴막(chitin film)(BESCHITIN W)을 지지체로서 이용할 필요가 있으 며, 또한, 파손되는 경우도 많지만, 이상의 방법에 의하면 견고한 시트가 제작되고, 시트의 수축도 확인되지 않으므로, 지지체를 사용할 필요가 없다.

이상의 방법으로 배양 표피 시트를 제작한 바, 공기 폭로 후 7일째에서는 표피는 5 ∼ 8층이 되고, 각질층의 형성이 확인되며, 정상 인간 피부와 거의 동일한 구조를 나타내고 있다. 중층화된 각질화 세포의 조직 소견은 한 층의 기저세포양(basal cell-like) 세포와 그 위에 5 ∼ 8층의 중층화되고, 분화된 세포 구축이 확인된다. 3대 계대 배양된 세포로 배양 표피 시트를 제작한 경우, 피부 채취후 약 4주일만에 배양 표피 시트를 사용할 수 있게 되고, 배양면의 표면적은 계산상 몇천배로 증가한다.

제작된 배양 표피 시트는 담체와 함께 또는 담체없이 소량의 보존액을 사용함으로써 동결할 수 있다. 구체적으로는 먼저, -80℃의 냉동고에 동결 보존하고, 다음날, -150℃의 초저온 냉동고에 보존한다. -150℃에서 보존하면 장기간 시트의 형태로 보존할 수 있으므로, 실제로 충분한 치료 효과가 얻어지고 있다. 그 외, 생체 조직의 보존에 이용할 수 있는 보존액을 사용하여 4℃로 보존할 수도 있고, 이 경우에는 항산화 물질을 첨가해 두는 것이 바람직하다.

1-5-8. 접착 성분의 부착

콜라겐 매트릭스로부터 박리시킨 배양 표피 시트를 꺼낸 후, 그 세포층 형성 측과는 반대 측의 표면을, 송풍에 의한 공기 건조에 의해 반건조 상태로 하였다. 그 다음, 반건조 상태의 양막 표면을, 피브리노겐, 트롬빈, 및 아프로티닌의 혼합액 (1-2-5.와 동일한 순서로 조제된다)에 침지하고, 계속해서 바람으로 건조하여 반건조 상태로 하였다. 이러한 일련의 작업중, 세포 배양면을 습윤 상태로 유지하였다. 이상의 조작의 결과, 세포층이 형성된 측과는 반대 측의 양막 표면에 접착 성분이 부착된 시트형 조성물(접착 성분 부착-배양 표피 시트)을 얻었다.

2. 접착 성분 부착 시트를 이용한 이식 실험

2-1. 돼지 강막(sclera)에 대한 적용

접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트(1-2-5.)의 접착성에 대해서, 돼지 강막을 적용 부위로 하여 검토하였다.

식용으로 도살된 돼지의 눈(사후 약 6 ∼ 10시간 경과)의 조직을 이용하였다. 상기 돼지의 눈으로부터 가위를 이용해서 결막을 절제하고, 강막을 노출되게 하였다(노출 상태). 또한, 익상편의 치료 시에는, 통상적으로 이상 결막을 박리하고, 결막 제거 부위가 정상 결막으로 피복되며, 전술한 바와 같은 처리를 실시한 돼지 눈은 익상편의 임상 모델로서 널리 이용되고 있다.

이식용 시트로서, 접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트(1-2-5.)를 이용하였다. 이식용 시트의 적용 방법은 아래와 같다. 먼저, 전술한 처리를 실시한 돼지 눈의 강막 표면의 수분을 면봉으로 닦고, 조직을 반건조 상태로 하였다. 또한, 육안으로 판단해서 미세한 물방울이 확인되지 않을 정도를 기준으로 하였다. 상기 강막 상에, 1-2-5.에 의하여 제조한 접착 성분 부착-상피가 부착된 양막 시트를 그 접착 성분 부착면 측을 아래로 하여 건조 상태인 채로 올렸다. 그 다음에, 핀셋을 이용해서 시트를 가볍게 누르고, 기포가 들어가지 않도록 주의하면서 전 영역을 강막에 접촉시켰다. 이상의 조작에 따라 시트에 부착된 접착 성분이, 강막 상에 잔존하는 소량의 수분에 의해 습윤되어, 시트와 조직을 접착시킨다.

시트를 올리고 나서 1주일 후에 이하의 두가지 시험을 행하여, 접착성을 평가하였다.

(1) 시프트 시험: 면봉으로 눌러 수평 방향으로 힘을 가하고, 시트가 조직으로부터 어긋나지 않는지를 검토하였다.

(2) 스트레치 시험: 핀셋으로 시트를 집어 수직 방향으로 힘을 가하고, 시트가 조직으로부터 벗겨지지 않는지를 검토하였다.

검토 결과, 시트가 어긋나거나, 벗겨지지 않고, 양호한 접착성이 확인되었다.

계속하여, 접착 성분의 양과 접착성의 관계를 조사하기 위하여, 부착 접착 성분량이 상이한 시트를 복수매 준비하고, 전술한 순서로 이식, 및 접착성의 평가를 실시하였다. 평가 결과를 도 2의 표에 나타낸다. 표 중의 피브리노겐량은, 시트 1cm²당의 부착량이다. 또한, 표 중의 +는 시트가 어긋나지도 벗겨지지도 않음을 나타내고, -는 시트가 어긋난 것을 나타낸다 (약간 어긋나더라도 -로 나타낸다). 또한, 모든 시험 군의 부착 성분 비율(피브리노겐 부착량: 트롬빈 부착량: 아프로티닌 부착량)이 동일하게 되도록, 트롬빈 부착량 및 아프로티닌 부착량을 조정하였다.

도 2의 표에 나타낸 바와 같이, 피브리노겐 부착량이 0.5mg/cm²(트롬빈 부착량: 12㎍/cm², 아프로티닌 부착량:0.12KIU/cm²)이상이면, 시트가 조직으로부터 어긋 나거나 벗겨지지 않고, 대단히 양호한 접착성이 확인된다. 즉, 피브리노겐 부착량이 O.5mg/cm²이면 충분한 접착성이 얻어지는 것이 명확하게 되었다.

2-2. 토끼 강막에 대한 적용

접착 성분 부착-상피가 제거된 양막 시트(1-3-1.)의 접착성 및 작용에 대해서, 토끼 강막을 적용 부위로서 검토하였다.

먼저, 토끼에 마취를 놓아 눈의 결막을 가위로 약 1mm×1cm만큼 절제하고, 강막을 노출되게 하고(노출 상태), 익상편 모델을 작성하였다. 다음에 강막 표면의 수분이나 혈액을 면봉으로 닦아, 강막 표면을 반건조 상태가 되게 하였다. 출혈이 적어지고, 육안으로 수분을 판별할 수 없을 때를 기준으로 하여 시트 적용의 직전까지 건조 작업을 행하였다.

상기 강막 상에, 1-3-1.에 의하여 제조된 접착 성분 부착-상피가 제거된 양막 시트를 상기 접착 성분 부착면 측을 아래로 하여 건조 상태인채로 올렸다. 그 다음에, 핀셋을 이용해서 시트를 가볍게 누르고, 기포가 들어가지 않도록 주의하면서 전 영역을 강막에 접촉시켰다. 시험 기간중, 토끼에게는 하루에 1회의 항균제(Tarivid 연고), 스테로이드제(Rinderon 연고)의 투여를 실시하였다.

시술 후, 시트의 접착성 및 생리적 작용에 대해서 검토하기 위하여, 카메라 촬영에 의한 표면 관찰을 실시하였다(시트 이식일부터 1주째, 2주째 및 4주째). 카메라 촬영은 이하의 순서로 실시하였다. 토끼에게 마취를 놓은 후, 시트 피복 부위를 Medical Nikol(니콘사제) 또는 Slit Lamp(올림푸스사제)로 촬영하였다. 이 때, 관찰 항목은 시트의 잔존, 혈관 신생의 유무 및 염증의 유무의 3개 항목으로 설정하였다. 다음에 플루오레세인(fluorescein)을 한 방울 적하하고, 시트 상에 있어서의 상피의 피복의 유무를 관찰하였다. 이식 4주 후에는 시트 적용 부위의 조직을 채취하고, 면역 염색에 의해 시트(양막)의 접착 및 잔존, 피브리노겐의 잔존을 조사하였다.

검토 결과, 본 시트는 이식 후 즉시 강막에 접착하고, 이식 1주째에는 시트(양막) 이식부의 전 영역에서 상피화가 진행되고 있었다. 한편, 혈관 신생 및 염증의 야기는 확인되지 않았다. 2주째 및 4주째에 있어서도 시트는 접착 상태를 유지하고, 상피화의 상태도 유지되었다. 2주째 및 4주째에 있어서도 혈관 신생 및 염증은 확인되지 않았다. 또한, 면역 염색의 결과로부터, 4주째에는 피브리노겐이 생물 분해되어 있는 것을 알 수 있었다. 한편, 양막은 강막 상에 잔존하고 있었다. 또한, 양막 상에서는 정상적인 상피화가 확인되고, 결막의 피복도 정상이었다. 이상의 결과를 종합하면, 본시트의 적용에 따라 1. 충분한 접착성이 얻어지고, 2. 상피화가 정상적으로 생기며, 3. 혈관 신생 및 염증은 유발되지 않고, 4. 시트에 부착된 피브리노겐은 적어도 4주일 이내에 생물 분해되며, 5. 결막의 피복이 정상적으로 생기는 것이 밝혀졌다. 이와 같이 본 시트는, 안구 표면의 재건용의 이식 재료로서 바람직한 작용을 발휘할 수 있는 것을 알 수 있다.

2-3. 토끼 각막에 대한 적용

접착 성분 부착-배양 각막 시트(1-4-6.)의 접착성 및 작용에 대해서, 토끼 각막을 적용 부위로 하여 검토하였다.

집토끼에 대하여, 윤부(limbus)로부터 4mm 외측으로부터 크리센트 나이프(crescent knife)를 이용해서, 1OO㎛의 두께를 가지는 각막 및 결막 상피를 모두 제거하였다. 이 조작에 의해 각막 상피 줄기 세포를 포함하는 상피 세포가 존재하지 않게 되기 때문에, 인위적인 안구 표면 줄기 세포 피폐증이 재현되는 것으로 생각할 수 있다. 그 다음에, 접착 성분 부착-배양 각막 시트를 둘레부에서 다소 내측의 영역에 이식하였다. 수술 후, 항균제(Tarivid 연고) 및 스테로이드제(Rinderon 연고)를 하루에 1회 도포하였다.

시트는 이식 후 즉시 안구 표면에 접착하였다. 또한, 이식 후 4주째에 있어서도 접착성을 유지하고 있었다. 한편, 혈관 신생 및 염증은 경미하게 발생하였다.

2-4. 피부에 대한 적용

접착 성분 부착-배양 표피 시트(1-5-8.)의 접착성 및 작용에 대해서, 토끼 피부를 적용 부위로 하여 이하의 순서로 검토할 수 있다.

먼저, 토끼의 등의 일부의 털을 깍은 후, 그 부분의 표피를 박리한다. 그 다음에, 접착 성분 부착-배양 표피 시트(1-5-8.)를 이식한다. 이식 후, 시트를 가볍게 눌러서 전 영역을 접촉시킨다. 수술 후, 하루에 1회의 항균제의 외용 도포를 행한다. 이식 후의 접착 상태, 및 시간 경과에 따른 접착 상태의 변화를 관찰함으로써, 본 시트의 접착성 및 작용을 평가할 수 있다.

본 발명이 제공하는 시트형 조성물은, 조직 재건용의 이식 재료 등으로서 사 용될 수 있다. 본 발명의 시트형 조성물의 적용 영역으로서 안과 영역, 소화기 외과 영역, 산부인과 영역, 피부과 영역을 들 수 있다.

본 발명의 시트형 조성물은 접착성이 우수하다. 따라서, 적용 후 단시간 내에 주위 조직에 접착하고, 또한 장기간에 걸쳐서 양호한 접착 상태를 유지하는 것을 기대할 수 있다. 이로 인해, 봉합 등을 병용하지 않더라도 높은 치료 효과를 기대할 수 있다. 적용 대상에 따라서는 한층 높은 접착력이 요구되어, 봉합 등을 병용하는 것이 적절할 것으로 여겨지는 경우라 하더라도, 비교적 간편한 수단으로 대처할 수 있고, 의사 및 환자의 부담을 경감시킬 수 있다.

본 발명은, 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명에 전혀 한정되지 않는다. 특허청구 범위 내의 기재를 일탈하지 않고, 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 범위 내에서 다양한 변형 태양도 본 발명에 포함된다.

본 명세서 내에서 명시한 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용함으로써 인용될 수 있다.

(1) 상기 단계 A가 이하의 단계를 포함하는, 제17항에 기재된 제작 방법:

(A-1) 생체 유래 세포를 조제하는 단계;

(A-2) 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 상에 파종하는 단계;

(A-3) 파종된 상기 생체 유래 세포를 배양하여 증식시키는 단계.

(2) 상기 단계 A가 이하의 단계를 포함하는, 제17항에 기재된 제작 방법:

(A-1) 생체 유래 세포를 조제하는 단계;

(B) 콜라겐 겔 내에서 인간 섬유아 세포를 배양하는 단계;

(C) 상기 콜라겐 겔 상에 상기 양막을 올린 후, 상기 양막 상에 상기 생체 유래 세포를 파종하는 단계;

(A-3) 파종한 상기 생체 유래 세포를 배양하여 증식시키는 단계.

(3) 상기 단계 A-3이, 이종 동물 세포 비존재 하에서 실시되는, 상기 (1) 또는 상기 (2)에 기재된 제작 방법.

(4) 이하의 단계를 추가로 포함하는, 상기 (1) ∼ 상기 (3) 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법:

(A-4) 상기 생체 유래 세포가 증식된 후, 가장 표층을 공기에 접촉시키는 단계.

(5) 상기 단계 A-3은, 무혈청 배지를 사용해서 실시되는, 상기 (1) ∼ 상기 (4) 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

(6) 상기 단계 A-3은, 혈청 성분으로서, 수용자에 유래하는 혈청만을 포함하는 배지를 사용하여 실시되는, 상기 (1) ∼ 상기 (4) 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

(7) 상기 생체 유래 세포가 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관 점막 상피 유래의 세포인, 제17항 및 상기 (1) ∼ (6) 중 어느 한 항에 기재된 제작 방법.

Claims (17)

1. 피브리노겐(fibrinogen) 및 트롬빈(thrombin)이 표면에 부착된 양막(amnion)을 포함하는 시트형 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 양막에 있어서, 상기 피브리노겐 및 상기 트롬빈의 부착면이 건조 상태 인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
3. 제2항에 있어서,

   상기 양막이 건조 상태인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 양막의 표면에 아프로티닌(aprotinin)이 더 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 양막은 상피가 제거된 양막인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
6. 제5항에 있어서,

   생체 유래 세포로부터 이루어지는 세포층이 상기 양막 상에 형성되어 있고, 상기 세포층의 형성 면과는 반대 측의 양막 표면에 상기 피브리노겐 및 상기 트롬빈이 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 생체 유래 세포는 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막 상피, 홍채 색소 상피, 망막 색소 상피, 기도 점막 상피 또는 장관 점막 상피유래의 세포인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 피브리노겐의 부착량은 상기 양막 1cm²당 O.5mg ∼ 2Omg인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 트롬빈의 부착량은 상기 양막 1cm²당 1㎍ ∼ 1mg 인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

    두께가 10㎛ ∼ 200㎛인 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,

    인체 조직에 대하여 접착성을 가지고 있으며, 이식 시에 봉합이 불필요한 것을 특징으로 하는 시트형 조성물.
12. 이하의 단계를 포함하여 이루어지는, 시트형 조성물의 제작 방법:

    (a) 양막을 조제하는 단계;

    (b) 상기 양막의 표면에 피브리노겐 및 트롬빈을 부착시키는 단계.
13. 제12항에 있어서,

    이하의 단계를 추가로 포함하는, 시트 조성물의 제작 방법:

    (c) 단계 (b) 후에 건조 처리하는 단계.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서,

    이하의 단계를 추가로 포함하는, 시트 조성물의 제작 방법:

    (b-1) 상기 양막의 표면에 아프로티닌을 부착시키는 단계.
15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단계 (a)는 이하의 단계를 포함하는, 시트 조성물의 제작 방법:

    (a-1) 상기 양막으로부터 상피를 제거하는 단계.
16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단계 (a)는 이하의 단계를 포함하는, 시트 조성물의 제작 방법:

    (a-2) 상기 양막을 건조시키는 단계.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단계 (a)와 상기 단계 (b) 사이에, 이하의 단계를 포함하는, 시트 조성물의 제작 방법:

    (A) 생체 유래 세포로부터 이루어지는 세포층을 상기 양막 상에 형성하는 단계.

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