JPH07265406A - フィブリンゲル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】フィブリノーゲン１mg当たりトロンビンの量な
どを規定した。 【効果】クロスリンク度が高く、線溶酵素（プラスミ
ン）に対して抵抗性を有し、長期の保存性に優れ、血小
板に対する反応性が低く、組織細胞の増殖を促進し、生
体内に移植したとき良好な抗血栓性と組織治癒性を有す
るフィブリンが得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細胞誘導性（組織治癒
性）および抗血栓性に優れたフィブリンゲルに関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブリンは多くの生理的機能を有する
ことが知られており、また種々の生理活性物質を固定化
することも可能である。フィブリンの利用としては、生
体組織接着剤としての利用が周知であり、皮膚、神経、
腱に応用した文献（二見俊郎；第６回バイオマテリアル
学会大会抄録集、１０、１９８４年）があり、また遊離
皮膚弁の移植に応用した文献（井原成男；Medical Post
graduates,20,5,335,1982）があり、良好な成績が示さ
れている。組織の治癒過程がシアノアクリレートの場合
と異なり、フィブリンの存在が線維芽細胞の増殖に役立
ち、組織の再生、毛細血管の新生が良好であると述べて
いる。さらには、大血管の解離腔の充填、気管支切断端
の補強、肺や肝臓等の実質臓器の切断面の補修など数多
く上げることができ、特に肺の切断面へ応用した文献
（桑原修；日本胸部外科学会誌；３３，１８１７，１９
８５年）では良好な成績を示し、肺の容量縮小や変形が
避けられて、肺機能の温存に役立つとしている。

【０００３】フィブリンの創傷保護材としての利用は特
許公報特開昭５８−１８５１６２号、特開昭５７−１５
３６４５号等に記載されており、また止血用、傷の手当
用として特許公報特開昭５８−３６５４５号に、さらに
コラーゲン、フィブリノーゲンの両方を含有させ、フィ
ブリン膜を形成させ、傷口手当材として応用した例が特
許公報ドイツ公開番号３０３７５１３号に記載されてい
る。そのほかのフィブリンの応用として、フィブリン膜
にリゾチームを固定化し、出血部位に適用することによ
り、血液を吸収し、組織修復の促進、化膿を防止し、さ
らにその後、組織中で吸収される材料として提示した例
等も報告されている。このようにフィブリンには多くの
生理作用のあることが報告されており、生体組織接着剤
として市販されている。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】前述の様にフィブリンは多く
の生理作用を有しているが、フィブリン単体を高分子材
料等の支持体に固定化して医療用具として製品化してい
る例は少なく、フィブリンを製造するためのフィブリノ
ーゲンおよびトロンビンをセットにして、生体組織接着
剤として商品化したものが知られている。

【０００５】しかしながら、これらの生体組織接着剤は
適時、フィブリノーゲンとトロンビンを反応させること
によりフィブリンを形成させるものであり、反応させる
フィブリノーゲンおよびトロンビンの量比を厳密に規定
したものではない。フィブリン形成にあずかるトロンビ
ンとフィブリノーゲンの量比が血液適合性に影響するこ
とも報告されており（和泉ら；人工臓器、１２、１、２
１７−２２０、１９８３年）、生体適合性に優れたフィ
ブリンを作製するには、作用させるフィブリノーゲンと
トロンビンの量比が重要であることを示唆している。

【０００６】また、これらに用いられているフィブリノ
ーゲンは、それに混入しているプラスミノーゲンを除去
して用いてはおらず、フィブリン作製後、そのプラスミ
ノーゲンの作用により自己分解してしまい、長期の安定
性（保存性）に欠けるという欠点を有している。

【０００７】フィブリンとして長期安定化させるため
に、抗線溶剤であるアプロチニンを添加することが行な
われているが、アプロチニンはキニン系、血液凝固系、
線溶系および白血球、組織中の蛋白分解酵素に対して強
い阻害作用を有しており、このアプロチニンを配合し、
フィブリンーゲンおよびトロンビンをセットにした生体
組織接着剤の使用においても血管内への投与、凝固促進
剤、抗線溶剤、アプロチニン製剤とのとの併用は避ける
べきとされ、流出性出血の激しい部位の接着、閉鎖には
注意を要することが明記されている。

【０００８】したがって本発明は以上の点に鑑み、クロ
スリンク度（重合度）が高く、線溶酵素（プラスミン）
に対して抵抗性を有し、長期の保存性に優れ、血小板に
対する反応性が低く、組織細胞の増殖を促進し、医療用
器具（例えば人工血管基材）に被覆して生体内に移植し
たとき良好な抗血栓性と組織治癒性を有するフィブリン
ゲル及びフィブリンゲルの製造方法を提供するものであ
る。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
鑑みて鋭意研究を重ねた結果、本発明のフィブリンゲル
及びフィブリンゲルの製造方法を見いだした。すなわ
ち、上記目的は以下の本発明により達成される。 （１） フィブリノーゲンと、フィブリノーゲン１mgに
対し０.０７から０.３６単位のトロンビンとから形成さ
れることを特徴とするフィブリンゲルゲル。 （２） フィブリノーゲンと、フィブリノーゲン１mgに
対し０.０７から０.３６単位のトロンビンを反応させる
ことを特徴とする上記（１）記載のフィブリンゲルの製
造方法。

【００１０】（３） １mg中のプラスミノーゲン含量が
９×１０^-2μg以下でかつ１mg/ml溶液中の血液第１３因
子活性が正常ヒト血漿に比し６０％以上の活性を有する
フィブリノーゲン溶液と、フィブリノーゲン１mgに対し
０.０７から０.３６単位のトロンビンとＣａ²⁺を含むト
ロンビン溶液を反応させることを特徴とし、少なくとも
高分子量αポリマーおよびγ２量体（γ−ダイマー）を
構造体として含有するフィブリンゲル。 （４） １mg中のプラスミノーゲン含量が９×１０^-2μ
g以下でかつ１mg/ml溶液中の血液第１３因子活性が正常
ヒト血漿に比し６０％以上の活性を有するフィブリノー
ゲン溶液と、フィブリノーゲン１mgに対し０.０７から
０.３６単位のトロンビンとＣａ²⁺を含むトロンビン溶
液を反応させることを特徴とし、少なくとも高分子量α
ポリマーおよびγ２量体（γ−ダイマー）を構造体とし
て含有する上記（２）記載のフィブリンゲルの製造方
法。

【００１１】（５） イオン強度０.１５から０.５０の
条件下で、フィブリノーゲンとフィブリノーゲン１mgに
対し０.０７から０.３６単位のトロンビンとから形成さ
れることを特徴とするフィブリンゲルゲル。 （６） イオン強度０.１５から０.５０の条件下で、フ
ィブリノーゲンとフィブリノーゲン１mgに対し０.０７
から０.３６単位のトロンビンとから形成されることを
特徴とする上記（５）記載のフィブリンゲルゲルの製造
方法。

【００１２】（７） イオン強度０.１５から０.５０の
条件下で、１mg中のプラスミノーゲン含量が９×１０^-2
μg以下でかつ１mg/ml溶液中の血液第１３因子活性が正
常ヒト血漿に比し６０％以上の活性を有するフィブリノ
ーゲン溶液と、フィブリノーゲン１mgに対し０.０７か
ら０.３６単位のトロンビンとＣａ²⁺を含むトロンビン
溶液を反応させることを特徴とし、少なくとも高分子量
αポリマーおよびγ２量体（γ−ダイマー）を構造体と
して含有するフィブリンゲル。 （８） イオン強度０.１５から０.５０の条件下で、１
mg中のプラスミノーゲン含量が９×１０^-2μg以下でか
つ１mg/ml溶液中の血液第１３因子活性が正常ヒト血漿
に比し６０％以上の活性を有するフィブリノーゲン溶液
と、フィブリノーゲン１mgに対し０.０７から０.３６単
位のトロンビンとＣａ²⁺を含むトロンビン溶液を反応さ
せることを特徴とし、少なくとも高分子量αポリマーお
よびγ２量体（γ−ダイマー）を構造体として含有する
上記（７）記載のフィブリンゲルの製造方法。

【００１３】（９） 上記（１），（３），（５）及び
（７）記載のフィブリンゲルを付与した医療用具。 （１０） 医療用具の外側および内側に当該医療用具と
同等の形状を有する枠を設け、当該医療用具と当該枠と
の隙間に、フィブリノーゲンと、当該フィブリノーゲン
１mgに対し０.０７から０.３６単位のトロンビンを、同
時に連続的に注入することにより成形される上記（９）
記載の医療用具の製造方法。 （１１） 上記（９）記載の医療用具の製造方法におい
て、医療用具の外側および内側に当該医療用具と同等の
形状を有する枠を設け、当該医療用具と当該枠との隙間
に、１mg中のプラスミノーゲン含量が９×１０^-2μg以
下でかつ１mg/ml溶液中の血液第１３因子活性が正常ヒ
ト血漿に比し６０％以上の活性を有するフィブリノーゲ
ン溶液と、フィブリノーゲン１mgに対し０.０７から０.
３６単位のトロンビンとＣａ²⁺を含むトロンビン溶液
を、同時に連続的に注入することにより成形される医療
用具の製造方法。

【００１４】（１２） 上記（９）記載の医療用具の製
造方法において、医療用具の外側および内側に当該医療
用具と同等の形状を有する枠を設け、当該医療用具と当
該枠との隙間に、各々のイオン強度０.１５から０.５０
の条件下で、１mg中のプラスミノーゲン含量が９×１０
^-2μg以下でかつ１mg/ml溶液中の血液第１３因子活性が
正常ヒト血漿に比し６０％以上の活性を有するフィブリ
ノーゲン溶液と、フィブリノーゲン１mgに対し０.０７
から０.３６単位のトロンビンとＣａ²⁺を含むトロンビ
ン溶液を、同時に連続的に注入することにより成形され
る医療用具の製造方法。

【００１５】本発明においてトロンビンの単位は、通常
精製フィブリノーゲン０.１％液１mlを１５秒で凝固さ
せる量を１単位（ＮＩＨ（米国国立衛生研究所）単位：
ミニウム リクイアメント フォー ドライド トロン
ビン[Minimum Requirementsfor Dried Thorombin](194
6)）とする。ヒト血漿１mlを１５秒で凝固させるにはト
ロンビン２単位が必要である。

【００１６】本発明のフィブリンゲルの製造方法におい
て、反応させるフィブリノーゲンとトロンビンの比は、
フィブリノーゲン１ｍｇあたり、トロンビン０.０７か
ら０.３６、より好ましくは０.０７から０.１８単位で
反応させることが良い。この比率よりもトロンビンが多
いとフィブリンのクロスリンク度（重合度）が低下し、
安定化フィブリンゲルが形成されにくくなる。また、血
小板との反応性も高くなる。逆にトロンビンが少なくて
もフィブリンのクロスリンク度が低下し、安定化フィブ
リンゲルが形成されにくくなり、線溶（プラスミン）に
対する抵抗性も低下する。

【００１７】さらに、本発明のフィブリンゲルの製造方
法は、フィブリノーゲンとして混入するプラスミノーゲ
ンを除去したものを使用することが好ましい。プラスミ
ノーゲンの除去法としては、特に限定されないが、一般
的なアフィニティクロマトグラフィーによる方法が挙げ
られる。アフィニティクロマトグラフィーにおける担体
としては、リジンを結合させたセファロースカラムが好
適に使用できる。この操作を行なったフィブリノーゲン
により形成されたフィブリンは自己融解が抑制され、長
期の安定性が向上する。

【００１８】本発明において、フィブリノーゲンはトロ
ンビンの作用により可溶性フィブリンとなり、さらにカ
ルシウムイオンの存在下でトロンビンにより活性化され
た血液凝固第１３因子により物理的強度を持った尿素不
溶性の安定なフィブリンとなる。この安定なフィブリン
は線維芽細胞や平滑筋細胞の増殖を促進し、良好な組織
修復を達成する。この安定化フィブリンの形成には、血
液凝固第１３因子活性が正常ヒト血漿１ml中の活性値に
対し６０％以上の活性が必要であり、より好ましくは８
０％以上の活性が必要である。また添加するカルシウム
イオンは２mM濃度以上が好ましい。

【００１９】さらに本発明において、フィブリンゲルを
形成時における各溶液のイオン強度を０.１５〜０.５、
より好ましくは０.１５〜０.３に調整することにより、
プラスミンに対する抵抗性、及び細胞増殖性に優れたフ
ィブリンゲルを得ることができる。以上詳述した製造方
法によって得られたフィブリンゲルは、血小板に対する
反応性が低く、組織細胞の増殖を促進し、良好な抗血栓
性と組織治癒性を有する。

【００２０】また本発明により得られたフィブリンゲル
は、医療用具に有効に使用できる。医療用具へのフィブ
リンの付与方法としては、医療用具の外側および内側に
当該医療用具と同じ形状を有する枠を設け、外枠と内枠
との隙間に、上記記載のフィブリノーゲンの溶液とトロ
ンビンの溶液を同時に連続的に注入して形成されるフィ
ブリンゲルを被覆することにより製造される。

【００２１】本発明における医療用具の製造方法におい
て、フィブリノーゲン溶液またはトロンビン溶液の、ど
ちらか一方の溶液を先に注入後、他方の溶液を注入して
フィブリンゲルを形成させる方法では２種の溶液が最初
に接触した部分からゲル化が進行し、作成されたフィブ
リンゲルの密度が不均一になるばかりでなく、ゲル化し
ない部分も生じることもある。

【００２２】また本発明において注入するフィブリノー
ゲン溶液とトロンビン溶液との容量比は６〜７：１とす
ることが好ましい。トロンビン溶液に対するフィブリノ
ーゲン溶液の比率が小さいと、注入途中でゲル化してし
まう危険があり、逆に大きいとゲルが脆弱なものになっ
てしまう。

【００２３】上記の製造方法により、医療用具の形状に
適したフィブリンゲルの被覆が可能であり、注入するフ
ィブリノーゲンとトロンビンの割合を厳密に制御するこ
とができる。

【００２４】本発明において、フィブリンゲルを付与し
た医療用具としては、例えば人工血管、人工気管などの
人工導管や組織修復用のパッチ等が挙げられる。また、
当該医療用具を構成する基材はポリエステル、ナイロ
ン、ポリテトラフルオロエチレン（テフロン）、ポリウ
レタン等の生体内で安全な合成高分子材料あるいは生体
組織等が用いられる。これらの基材はフィブリンとのア
ンカーリング性（接合性）を良好にすべく、多孔質体で
あることが望ましい。

【００２５】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに詳細に
説明する。 （実施例１）フィブリノーゲン製剤（フィブリノゲンＨ
Ｔ−ミドリ：(株)ミドリ十字製）を１４０mM ＮａＣｌ
を含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）にて２０
mg/mlにて調整した（１mg/ml溶液の吸光度を１.５と
し、吸光度法により濃度を測定した）。このフィブリノ
ーゲン溶液をプラスチックシャーレ（２４穴）に２６６
μlずつ分注した。

【００２６】さらに２０mM ＣａＣｌ₂，１４０mM Ｎａ
Ｃｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）で溶
解した ５，１０，２５，５０，１００，２００単位/ml
のトロンビン溶液（持田製薬）をそれぞれ３８μlずつ
分注し、３７℃で一夜インキュベートしてフィブリンゲ
ルを得た。それぞれのフィブリンゲルのトロンビン／フ
ィブリノーゲン比（Ｔ／Ｆ比）は、０.０３６，０.０７
１，０.１８，０.３６，０.７１，１.４３となる。

【００２７】当該フィブリンゲルをＰＢＳで洗浄した
後、エックスプラント（Ｅｘｐｌａｎｔ）法にて初代培
養した家兎腹部大動脈平滑筋細胞を８×１０³個ずつ播
種し、１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（アプロチ
ニン１００単位／ml添加）で培養した。細胞播種後（２
４時間後）、４日目（９６時間後）に既知細胞数の吸光
度を検量線として、それぞれの細胞数をＭＴＴ−セル
グロウ アッセイ キット［MTT-cell growth assay ki
t]（ケミコン インターナショナル[Chemicon Internat
ional Inc.]）を用いて吸光度法により測定した。それ
ぞれの値から細胞の倍加時間（Doubling time；Ｄ.
Ｔ.）を以下の式１より算出した。

【００２８】

【数１】

【００２９】ただし、ｔ，ｔ₀は細胞を数えた時間、Ｎ₀
はｔ₀時での細胞数、Ｎはｔ時での細胞数とする。結果
を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】Ｔ／Ｆ比０.１８，０.３６のフィブリンで
Ｄ.Ｔ.は低い値を示した。すなわち増殖性が良好であっ
た。

【００３２】（実施例２）フィブリノーゲン製剤（フィ
ブリノゲンＨＴ−ミドリ：(株)ミドリ十字製）を０.１
Ｍ ＮａＣｌ，２.５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０mMＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.４）で溶解し、リジン−セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社製）カラムにかけ、同
緩衝液にて溶出した。溶出液に２５％エタノールを含む
５５mMクエン酸緩衝液（ｐＨ６.４）をエタノール終濃
度が８％になるように冷却下で撹拌しながら加え、生成
した沈殿物を遠心分離後、１４０mM ＮａＣｌを含む１
０mM ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝液（ｐＨ７.４）に再溶
解した。この溶液を０.８μmフィルターで濾過した後、
３０mg/ml濃度に調製した。この操作により、フィブリ
ノーゲン中に混入するプラスミノーゲンを除去した。

【００３３】得られたフィブリノーゲン中のプラスミノ
ーゲン含量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定し
た。また同様にして、リジン−セファロース４Ｂカラム
を通さなかったフィブリノーゲン（比較例１）、および
生物学的組織接着剤（商品名ティシール：日本臓器製
薬）中のフィブリノーゲン（比較例２）を用いて同様に
測定した。結果を表２に示した。

【００３４】

【表２】

【００３５】この結果より、除去操作によりプラスミノ
ーゲン含量は１００分の１以下になった。ここで調製し
たフィブリノーゲンを１４０mM ＮａＣｌを含む１０mM
Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）にて２.２mg/mlに再調
整し、この２００μlを２４穴プラスチックディッシュ
に分注した。これに２２.２μlの２００mM ＣａＣｌ₂、
７.５μlの１００単位/mlトロンビン（持田製薬）を順
次加え、３７℃で一夜静置してフィブリンゲルを作成し
た。

【００３６】また同様にして、リジン−セファロース４
Ｂカラムを通さなかったフィブリノーゲン（比較例
１）、および生物学的組織接着剤（商品名ティシール：
日本臓器製薬）中のフィブリノーゲン（比較例２）を用
いて、同様にフィブリンゲルを作製した。このフィブリ
ンゲルを３７℃、６日間保存後、自己溶解性を観察し
た。すなわち、ゲル上清中の蛋白量を バイオラッド プ
ロテインアッセイ キッド（Bio-Rad proteinassay kit)
（バイオラッド社）を用いて測定したところ、比較例１
では作製したフィブリンのほぼ１００％が溶解し、比較
例２では約４０％の蛋白が溶解したのに対し、本実施例
ではほとんど溶解は見られなかった。

【００３７】また、さらにこれらのフィブリンゲルに、
プラスミノーゲンをプラスミンに転換し、線溶を亢進さ
せる酵素である組織プラスミノーゲンアクチベーター
（ｔ−ＰＡ）２０ng/mlを含むＰＢＳを５００μl添加
後、３７℃で保存して、その溶解性を前述の蛋白量測定
の方法と同様に測定した。その結果、比較例１、２とも
に添加後８時間以内にすべてのゲルが溶解したのに対
し、本実施例のフィブリンは添加後４８時間経過しても
ほとんど溶解しなかった。すなわち、フィブリノーゲン
中のプラスミノーゲン含量が０.０９μg/mgより小さく
なることで、フィブリンの安定性（長期保存性）が著し
く向上した。

【００３８】（実施例３）実施例２で製造したプラスミ
ノーゲン除去フィブリノーゲンを凍結乾燥した後、４℃
にて保存した。製造直後、保存３カ月，６カ月，１２カ
月後のフィブリノーゲンを再溶解し、フィブリノーゲン
溶液中の血液第１３因子活性を第１３因子テストキット
（ヘキストジャパン社製）を用いて測定した。測定値は
正常ヒト血漿１ml中の活性値に対する割合で表示され、
測定結果を表３に示した。

【００３９】

【表３】

【００４０】この結果により、長期の保存により、第１
３因子活性は低下が認められた。測定に用いたフィブリ
ノーゲンをそれぞれ１４０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈ
ｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）にて１０mg/mlに再調整
し、２００μlを試験管に分注した。これに２０mM Ｃａ
Ｃｌ₂、１４０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩
衝液（ｐＨ７.４）で溶解した１０単位/mlトロンビン溶
液を２７.８μlずつ注入し、フィブリンゲルを作製し
た。これらのゲルは３７℃で一夜静置した後、２％ＳＤ
Ｓ、２％メルカプトエタノール、９Ｍ尿素を含む１０mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７.６）を１ml加え、６
０℃、１８時間処理しフィブリンを溶解後、ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。泳動ゲルは
クーマシーブリリアントブルーＲ２５０による染色を行
なった。

【００４１】その結果、第１３因子活性が６０％以上の
フィブリノーゲンによるフィブリンでクロスリンクが生
じ、高分子量α−ポリマーおよびγ−ダイマーの生成が
観察された。第１３因子活性が４０％および活性値なし
ではγ−ダイマーの生成量は少なくα−ポリマーの生成
は認められなかった。すなわち、前述の安定なフィブリ
ンの生成（高分子量α−ポリマーおよびγ−ダイマーの
生成）には６０％以上の血液第１３因子活性が必要であ
る。

【００４２】（実施例４）実施例２で作製したプラスミ
ノーゲン除去フィブリノーゲンを、それぞれ１８、９
８、１４８、２４８、４４８mM ＮａＣｌ、２０mM Ｃａ
Ｃｌ₂を含む１０mMＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）で４
mg/ml濃度に調整した（イオン強度はそれぞれ０.０８、
０.１５、０.２、０.３、０.５）。それぞれのフィブリ
ノーゲン溶液を１００μlずつ２４穴ポリスチレン製シ
ャーレに各３穴ずつ分注し、１４０mM ＮａＣｌを含む
１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）で溶解した１０
単位/mlトロンビン溶液（持田製薬）６.８μlを加え、
３７℃で一夜インキュベートしてフィブリンゲルを作製
した。

【００４３】またこのときのトロンビン/フィブリノー
ゲン比（単位/mg）は０.１７とした。１４０mM ＮａＣ
ｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）で３回
洗浄した後、同緩衝液で調整した０.０５単位/mlプラス
ミン（プロトゲン エー・ジー[Protogen AG]社）を５
００μl加え、３７℃で１２０分放置した後、上清中に
溶解した蛋白量を２８０nmの吸光度としてフィブリンに
添加しなかったプラスミン溶液を盲検に測定した。測定
結果を表４に示した。数値の高いもの程、プラスミンに
溶解し易いことを示す。

【００４４】

【表４】

【００４５】イオン強度０.１５で作製したフィブリン
ゲルが最も低値を示し、すなわちプラスミン（線溶）に
対する抵抗性が認められた。その両側域ではプラスミン
抵抗性が減少する傾向が見られ、イオン強度０.０８の
フィブリンゲルで最も抵抗性は低かった。線溶に対する
抵抗性の点においてはイオン強度０.１５〜０.３０で作
製したフィブリンゲルが好適と言える。

【００４６】（実施例５）実施例４と同様にして、２４
穴の組織培養用ディッシュにイオン強度の異なるフィブ
リンゲルを各３穴ずつ作製した。このディッシュを３枚
作製し、それぞれブタ大動脈内皮細胞、ブタ大動脈平滑
筋細胞、ヒト皮膚線維芽細胞の増殖性を評価した。内皮
細胞と平滑筋細胞は１×１０⁴個/穴、線維芽細胞は５×
１０³個/穴ずつ藩取し、１５％牛胎児血清、１００ＫＩ
Ｅ/mlアプロチニンを含むＤＭＥＭ培地で８日間培養し
た後、ＭＴＴ−セル グロウ アッセイ キット［MTT-
cellgrowth assay kit]（ケミコン インターナショナ
ル[Chemicon InternationalInc.]）を用いて細胞増殖性
を比較した。測定結果を表５に示した。数値の高いもの
程、増殖性が良好であることを示す。

【００４７】

【表５】

【００４８】ブタ内皮細胞ではイオン強度０.２以上の
フィブリンゲル増殖性が良好であった。ブタ平滑筋細胞
ではイオン強度の違いによる差は特に見られなかった。
ヒト線維芽細胞ではイオン強度０.１５のフィブリンゲ
ルで最も低値を示し、その両側域で増加する傾向が見ら
れた。これらの結果より、細胞増殖性においてはイオン
強度０.２〜０.５で作製したフィブリンゲルが好適であ
ると言える。

【００４９】実施例４及び５よりフィブリンゲルを形成
時におけるイオン強度は０.１５〜０.５が好ましく、よ
り好ましくは０.１５〜０.３であると言える。

【００５０】（実施例６）本発明の医療用具の一実施例
として、人工血管を製造した。まず、ポリエステル製の
編み管状体（内径６mm、長さ１０cm）を６本作製した。
これに０.６mmφのポリプロピレンモノフィラメントを
ピッチ１.２５mmでスパイラル状に巻き付け、熱溶着し
た。これを内径８mmの塩化ビニール製チューブに挿入
し、さらに管状体内腔に内径５mmのガラス棒を挿入する
ことにより、外枠および内枠を作製した。この外枠と内
枠との隙間に、実施例２で調製したフィブリノーゲン
を、１４０mM ＮａＣｌを含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液
（ｐＨ７.４）にて２０mg/mlに再調製し、このフィブリ
ノーゲン溶液と２０mM ＣａＣｌ₂、１４０mM ＮａＣｌ
を含む１０mM Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７.４）で溶解し
た２００、１００、５０、２５、１０、５単位/mlの各
濃度のトロンビン溶液を注入量比７：１（フィブリノー
ゲン：トロンビン）で同時注入し、各トロンビン濃度に
対し、１本づつのフィブリン被覆人工血管を製造した。

【００５１】被覆されたフィブリンのトロンビン／フィ
ブリノーゲン比（ユニット／mg）は、トロンビン濃度の
高い方から、それぞれ１.４３、０.７１、０.３６、０.
１８、０.０７１、０.０３６である。それぞれ作製した
フィブリン被覆人工血管を３７℃、一夜静置した後、１
cmを切り取り、２％ＳＤＳ、２％メルカプトエタノー
ル、９Ｍ尿素を含む１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７.６）を５００μl加え、６０℃、１８時間処理
しフィブリンを溶解後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行なった。泳動ゲルはクーマシーブリリア
ントブルーＲ２５０による染色を行なった後、デンシト
メトリーにより、フィブリンのクロスリンク程度の指標
となるγ−ダイマー／β比を解析した。結果を表６に示
した。

【００５２】

【表６】

【００５３】トロンビン／フィブリノ−ゲン比０.０７
１、０.１８、０.３６で製造したフィブリン被覆人工血
管でクロスリンク度（重合度）が高くなることが確認さ
れ、０.１８で最も高かった。その両側域ではクロスリ
ンク度は低下した。本実施例で示した医療用具の製造方
法において、用いる外枠および内枠は医療用具の形状に
合わせて容易に整形できる材料で、かつ安全性が高く、
出来る限りフィブリンを付着させないものが望ましい。
例えば、ポリプロピレン、テフロン、塩化ビニール、ガ
ラス、ポリカーボネイト等があげられるが、これに限定
されるものではない。

【００５４】（実施例７）実施例６で作製したフィブリ
ン被覆人工血管をそれぞれ１cmづつ切り取り、０.０５
ユニット/mlのプラスミン溶液５００μlを分注し、３７
℃にて１２０分放置後、アプロチニン１０単位を加え反
応を停止した。上清中の蛋白量を２８０nmの吸光度とし
て測定し、結果を表５に示した。

【００５５】

【表７】

【００５６】トロンビン／フィブリノーゲン比０.３６
から０.０７１で作成したフィブリン被覆人工血管で比
較的低値を示し、他のフィブリン被覆人工血管よりもプ
ラスミンに対し抵抗性を有することが確認された。

【００５７】（実施例８）実施例６で製造したフィブリ
ン被覆人工血管をそれぞれ１cmづつ切り取り、生理食塩
水にて十分に洗浄した後、ポリプロピレン製チューブに
入れ、多血小板血漿（ＰＲＰ，２.５ × １０⁵/μl）を
５００μl分注し、３７℃、２時間放置した。その後、
血小板の活性化により放出された上清中のＰＦ４含量
を、ポリプロピレンチューブ中のＰＲＰをブランクとし
てＥＬＩＳＡ法（アセラクロムＰＦ４キット、ベーリン
ガー・マンハイム山之内社製）を用いて定量した。結果
を表８に示した。

【００５８】

【表８】

【００５９】トロンビン／フィブリノーゲン比０.７１
以上のフィブリン被覆人工血管で高値を示したが、他の
フィブリン被覆人工血管では比較的血小板に対して反応
性が低いことが示された。

【００６０】（実施例９）実施例６で製造したトロンビ
ン／フィブリノーゲン比０.１８および０.０７１のフィ
ブリン被覆人工血管を６０℃で１０分間、温生理食塩水
に浸漬して熱処理した後、雑種成犬（体重２５ｋｇ）の
両頸動脈にヘパリン等、抗凝固剤は一切使用せずに７cm
長でそれぞれを置換移植した。また比較対照として、フ
ィブリンを被覆しない人工血管をプレクロッティング
し、もう１頭の雑種成犬の頸動脈に同様に移植した。

【００６１】移植後６時間で摘出し、人工血管内面への
血栓付着状態を評価した。その結果、フィブリン被覆人
工血管はプレクロット人工血管に比し、ともに血栓付着
量は軽度であり（赤色血栓付着のない面が広範囲に存
在）、特にトロンビン／フィブリノーゲン比０.０７１
のもので抗血栓性に優れていた。

【００６２】また組織治癒性を観察するために同固体に
同サンプルを移植した。移植後１か月後に摘出して人工
血管の治癒性を評価したところ、フィブリン被覆人工血
管はプレクロット人工血管に比し、ともに吻合部付近か
らの細胞伸展が良好に観察された（人工血管の約５０％
が細胞被覆されていた）。

【００６３】

【発明の効果】上述した通り本発明は、フィブリノーゲ
ンとトロンビンを作用させフィブリンを製造する過程に
おいて、フィブリノーゲン１mg当たりトロンビンを０.
０７から０.３６単位で作用させることにより、クロス
リンク度が高く、線溶酵素（プラスミン）に対して抵抗
性を有し、長期の保存性に優れ、血小板に対する反応性
が低く、組織細胞の増殖を促進し、生体内に移植したと
き良好な抗血栓性と組織治癒性を有するフィブリンが得
られる。

【００６４】また本発明において、フィブリノーゲン中
に混入しているプラスミノーゲンを除去したフィブリノ
ーゲンを用いると更に効果が向上する。本発明により得
られたフィブリンは、人工血管等の医療用具に付着させ
て使用することが出来、当該医療用具は優れた生体適合
性を有する。

【００６５】上記医療用具の製造法は、医療用具の外側
および内側に、当該医療用具と同様の形状を有する枠を
設け、当該医療用具と枠との隙間に、上記のフィブリノ
ーゲン溶液およびトロンビン溶液を、同時に連続的に注
入することによりフィブリンを形成させる方法であり、
医療用具の形状に適したフィブリンの被覆が可能であ
り、形成させるフィブリンのフィブリノーゲンとトロン
ビンの割合を厳密に制御することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 谷川 隆洋 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内 (72)発明者 高橋 誠 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500番地 テルモ株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フィブリノーゲンと、フィブリノーゲン１
   mgに対し０.０７から０.３６単位のトロンビンとから形
   成されることを特徴とするフィブリンゲル。