JP2001161353A

JP2001161353A - 移植用細胞片及びその作成方法

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Publication number: JP2001161353A
Application number: JP34970599A
Authority: JP
Inventors: Jun Shimazaki; 潤島▲崎▼; Kazuo Tsubota; 一男坪田
Original assignee: JAPAN OPHTHALMIC CONSULTANTS K; JAPAN OPHTHALMIC CONSULTANTS KK
Current assignee: JAPAN OPHTHALMIC CONSULTANTS K; JAPAN OPHTHALMIC CONSULTANTS KK
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2001-06-19
Anticipated expiration: 2019-12-09
Also published as: JP4397082B2

Abstract

(57)【要約】【課題】上皮の再建率の高い移植用細胞片及びその作
成方法を提供する。【解決手段】本移植用細胞片１０は、羊膜１２と、こ
の羊膜１２上に付着させた上皮幹細胞組織１４と、この
幹細胞組織から羊膜表面を覆うように増殖した上皮細胞
１６とから構成される。また、この移植用細胞片１０の
作成は、羊膜１２をディッシュプレートに固定し、羊膜
１２上に上皮幹細胞組織１４を接着させ、その状態で培
養を行う。この培養により、幹細胞組織１４から上皮細
胞１６が増殖し、羊膜１２の表面は、上皮細胞１６によ
り覆われる。これにより、羊膜１２の表面に上皮幹細胞
組織１４が付着し、さらにその表面が増殖した上皮細胞
１６で覆われた移植用細胞片１０が作出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、移植用細胞片及び
その作成方法に関し、特に、上皮細胞、より具体的に
は、角結膜上皮細胞を羊膜上に培養増殖させた移植用細
胞片及びその作成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】角膜は、眼球を構成する光学系の最も外
層にあり、透明な血管のない組織であって、涙液と共に
平滑な表面を形成することにより良好な視力を得ること
に貢献している。また、角結膜上皮細胞は常に外界と接
し、外界の微生物などの異物、紫外線などの光線などか
ら眼球を守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜
上皮細胞は、角膜の透明性と眼球全体を防御し恒常性を
維持するために極めて重要な役割を果たしている。

【０００３】この角膜は、例えば、角膜炎、角膜潰瘍、
穿孔等の病態により濁り、透明性が失われてしまう場合
がある。このような角膜の濁りによる永続的な視力の低
下に対しては、角膜移植による治療が行われている。こ
の角膜の移植は、患者の透明性が失われた角膜を取り除
き、ここに透明な角膜を移植する。この移植により透明
性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。

【０００４】また、このような角膜の移植だけでは対処
できない病気がある。例えば、スティーブンス・ジョン
ソン症候群、眼類天疱瘡、化学外傷、熱傷などである。
通常、角結膜上皮細胞は、毎日分裂を繰り返し、古くな
った細胞は、はがれ落ち、幹細胞組織から新たな細胞が
再生されるが、これらの病態では、この角膜を再生させ
る幹細胞組織に障害があることがわかってきている。

【０００５】この角膜上皮を再生させる幹細胞組織は
「角膜輪部組織」と呼ばれ、ちょうど黒目と白目の境界
部分に限局し、外界に露出された特殊な環境にある。そ
のため、上述した病態では、この幹細胞組織自体がなん
らかの障害を受けて根絶してしまうと考えられている。
そして、この幹細胞組織の根絶により、その欠損部分は
周りに存在する結膜上皮で覆われ、透明性に欠け、視力
の極端な低下がもたらされる。

【０００６】このような病態では、角膜輪部が枯渇して
いるため、単に角膜を移植するだけでは移植された角膜
を長期に維持できない。そのため、恒久的な眼表面再建
を図るためには、角膜輪部をも移植する必要がある。こ
の角膜輪部を移植する方法の一つとして、羊膜を用いた
移植法が開発されている（メディカル朝日１９９９年９
月号：ｐ６２〜６５、ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ３４０：
１６９７〜１７０３、１９９９）。

【０００７】この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開
した妊婦等の胎盤から得ることができる。また、この羊
膜は、厚い基底膜をもつことから、角結膜上皮細胞が増
殖、分化するための基質として作用する。さらに、羊膜
は免疫原性がほとんどなく、抗炎症、瘢痕形成抑制など
の作用を併せ持つことから、羊膜上に移植される角結膜
上皮やこれらの幹細胞組織は移植受容者（レシピエン
ト）の拒絶反応等から保護されることになる。

【０００８】このような性質を有する羊膜を用いた移植
法では、図３に示す通り、先ず、結膜化等した角膜組織
を切除し、角膜実質及び強膜が露出される。露出された
角膜実質及び強膜に、眼表面再建のため羊膜１が張り付
けられる。提供された角膜組織からは、中央部角膜（上
皮・実皮・内皮を含む）２が切り出され、角膜輪部組織
３の周囲が整えられて、露出された羊膜および角膜実質
上に移植、逢着される。このように移植された角膜輪部
３は、免疫原性のない羊膜１に保護された状態で、この
羊膜１を基質として分化、増殖し、羊膜１上で角膜上皮
が再生される。そのため、この方法によれば、角膜上皮
の長期的な維持、再生が可能となる。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】しかし、従来の羊膜を
用いた移植法では、術後、移植された角膜輪部から適切
に上皮化が行われず、視力改善が得られない症例も多数
存在する。また、スティーブンス・ジョンソン症候群や
角膜化学傷などの患者における輪部移植の長期の追跡調
査では、眼表面再建の達成率が約５０％であった。そし
て、半数の非成功例の多くは、上皮化が得られなかっ
た。

【００１０】従来、これら疾患は、外科的治療法は不可
能とされていたが、羊膜を用いた移植法では移植成功率
５０％までに向上されてはいるが、さらなる治療成績の
向上が望まれている。

【００１１】一方、再生医学の分野においては、ヒト皮
膚において真皮、上皮の全層が欠損した損傷部位を移植
するための移植片の開発が進めれられている。例えば、
特開平１０−２７７１４３号公報には、ヒト皮膚等の全
層欠損創を治療するための移植片及びその製造方法が記
載されている。

【００１２】この移植片は、ヒトのフィブリンシート内
に真皮組織由来の線維芽細胞を包埋し、表皮組織をこの
シートの表面に付着して作られる。このような移植片に
よれば、真皮をも欠損している全層欠損創に移植した場
合に優れた生着率が示されている。

【００１３】そこで、本発明は上記課題に鑑みてなされ
たものであり、その目的は、羊膜を用いて角結膜上皮細
胞などの上皮細胞において、より高い治療成果が図られ
る移植用細胞片及びその作成方法を提供することであ
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明は、スポンジ層及び上皮層が除かれた羊膜上
に上皮幹細胞組織を付着させ、この幹細胞組織から該羊
膜表面を覆うように上皮細胞をインビトロで再生させる
ことを特徴とする。

【００１５】上記発明によれば、移植用細胞片におい
て、予め羊膜上に付着された幹細胞組織から上皮細胞を
羊膜表面を覆うように増殖させておくことにより、従来
の羊膜を用いた移植法に比して上皮の再建率を向上さ
せ、より高い治療成果が図られる。

【００１６】また、本移植用細胞片では、予め羊膜上に
幹細胞組織が付着されているため、従来のように羊膜、
角膜輪部を個別に眼表面などに移植する場合に比べ、移
植時間を短縮化させることも可能となる。

【００１７】尚、ここで幹細胞組織は、提供された状態
により、幹細胞組織以外に幹細胞組織周辺の上皮細胞な
どを含むものも含まれる。そのため、羊膜状で幹細胞組
織を培養し、増殖した上皮細胞には、幹細胞組織から増
殖した上皮細胞以外に、提供者からの上皮細胞を存在す
るものも含まれる。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明の好適な実施形態を
図面を用いて説明する。

【００１９】[第１の実施形態]第１の実施形態における
移植用細胞片を図１に示す。

【００２０】図１に模式的に示すように、本移植用細胞
片１０は、羊膜１２と、この羊膜１２の上に付着させた
上皮幹細胞組織１４と、この幹細胞組織から羊膜表面を
覆うように増殖した上皮細胞１６とから構成される。

【００２１】この羊膜１２は、脊椎動物の羊膜類のうち
最内側にあって胚を直接覆う膜であり、厚い基底膜を有
する。また、この羊膜１２は、免疫原性がほとんどな
く、抗炎症作用などを有している。このように羊膜１２
は免疫原性がほとんどないが、移植後の免疫反応の惹起
をより確実に防止するためには、ヒトへの移植用細胞片
の場合には、同じ動物種であるヒト由来の羊膜を用いる
ことが好ましい。

【００２２】但し、この羊膜は、同種由来、すなわちヒ
トへの移植の場合にはヒト由来のものであれば、親、子
供など血縁関係にあるものに限定されず他人のものでも
よい。

【００２３】ヒト由来の羊膜は、例えば、帝王切開した
妊婦から得ることができる。この羊膜は、一般に下層側
から、スポンジ層、緻密層、基底膜層、上皮層とを有す
るが、この移植用細胞片における「羊膜」では、スポン
ジ層と上皮層とは不必要であるため、これらを除去処理
したものを用いることが好ましい。

【００２４】上記羊膜１２の上に付着される上皮幹細胞
組織１４は、上皮細胞を再生させる能力がある細胞組織
である。ここで上皮細胞は、たとえば、角膜上皮細胞、
結膜上皮細胞などが含まれる。

【００２５】上皮幹細胞組織１４は、たとえば、角膜上
皮細胞の幹細胞組織である角膜輪部組織などが挙げられ
る。また、上皮細胞が結膜上皮細胞である場合には、こ
の幹細胞組織１４は、結膜円縁部等にある結膜上皮細胞
の幹細胞組織となる。なお、上記角膜輪部細胞は、眼球
の白目と黒目の境に局在し、眼球表面に露出して存在
し、角膜提供者などから得ることができる。

【００２６】なお、この上皮幹細胞組織１４は、純粋に
幹細胞組織のみであっても、その周辺の上皮細胞、線維
芽細胞、血管内皮細胞を含んでいるものであってもよ
い。

【００２７】上皮幹細胞組織１４は、患者であるレシピ
エント以外のものから提供されたものが用いられるが、
提供者は、レシピエントの親、兄弟など、また、レシピ
エントとは血縁関係のない全く他人であってもよい。

【００２８】他人から提供された上皮幹細胞組織１４
は、免疫による拒絶反応が生じるおそれを回避するため
には、ＨＬＡタイプの適合した提供者由来のものが好ま
しい。しかし、ＨＬＡタイプが適合した提供者由来の上
皮管細胞組織が得られない場合には、ＨＬＡタイプが適
合していない提供者由来のものであってもよい。

【００２９】また、移植による感染などを防止するため
に、提供された組織は予め感染などのおそれがないこと
が確認されたものを用いることがよい。

【００３０】さらに、この上皮幹細胞組織１４は、状態
がよく、上皮細胞を増殖し得るものが好ましい。また幹
細胞組織１４のサイズは、細胞の状態により異なるが、
例えば、幹細胞組織１４の状態がよい場合には、羊膜が
２ｃｍ平方のサイズに対して、例えば１ｍｍ平方程度で
もよい。

【００３１】また、ここで用いる上皮幹細胞組織１４
は、一組織片を用いても、複数の組織片を用いてもよ
い。また、これら上皮細胞組織１４を、羊膜上に載せる
場合には、生体内で本来配置しているように形状に整え
て羊膜上に置くことが望ましい。

【００３２】図１では、上皮幹細胞組織１４として角膜
輪部組織を用いた場合に望ましい配置状態を示してい
る。すなわち、通常、角膜輪部組織は、黒目と白目の境
界部分に局在していることから、この境界部分に相当す
る位置に上皮幹細胞組織１４を配置させた場合を示して
いる。

【００３３】羊膜１２上に増殖させた上皮細胞１６は、
羊膜１２の上に付着させた上記幹細胞組織１４をインビ
トロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で培養して増殖させたもの、
また、提供された幹細胞組織にその周辺の上皮細胞が結
合している状態のものについては、上記幹細胞組織から
増殖した上皮細胞のほかに提供者の上皮細胞を含むもの
も含まれる。

【００３４】また、羊膜上で増殖させた上皮細胞１６
は、移植の際に状態のよいものであることが望ましく、
例えば、増殖曲線を描いたときに右肩上がりの一次直線
を示すような増殖期にある細胞であることが好ましい。

【００３５】上記の通り、羊膜１２の表面に上皮幹細胞
組織を備え、上皮細胞１６で覆われた移植用細胞片１０
は、上皮細胞とともにその幹細胞組織までも根絶又は損
傷したような患部に移植される。そして、本移植用細胞
片１０では、予め羊膜１２の表面を覆うように幹細胞組
織１４から上皮細胞１６が増殖しているため、従来のよ
うに患部に移植された後に上皮細胞を増殖させる方法に
比較して、上皮組織の再建率を向上させることが可能と
なる。

【００３６】[第２の実施形態]本実施形態では、上記移
植用細胞片１０の作成方法について説明する。

【００３７】（１）羊膜の調整羊膜の調整の各工程については、図２に示す。

【００３８】図２に示すように、移植用細胞片の基質と
なる羊膜は、ヒトの場合には帝王切開した妊婦などから
羊膜が採取される（Ｓ２００）。

【００３９】羊膜は採取後すぐに使用しない場合には
（Ｓ２０１）、保存することもできる（Ｓ２０２）。こ
の保存方法としては、上記保存のための処理を行った
後、保存液などに浸して−８０℃で保存することもでき
る。

【００４０】羊膜を保存するための処理は、例えば、
４．２，８．５，１５．０％の濃度でＤＭＳＯ（ジメチ
ルスルホキシド）を含有した生理食塩水を準備し、次い
で、ＤＭＳＯ濃度の低い溶液から順に羊膜を３０分程度
浸すことにより行うことができる。

【００４１】また羊膜の保存液としては、上記１５％Ｄ
ＭＳＯ含有生理食塩水などを用いることができる。

【００４２】上記採取された羊膜又は保存から戻された
羊膜は、羊膜を構成する不必要な上皮層及びスポンジ層
を剥がし易くするために、羊膜が前処理される（Ｓ２０
３）。この前処理の方法は、特に限定はないが、例え
ば、１０％アンモニア水で処理することができる。

【００４３】上記前処理が終了した羊膜は、必要に応じ
て、適切なサイズに切断される（Ｓ２０４）。この適切
なサイズとは、例えば、眼表面再建の場合には、露出し
ている眼表面を十分に覆うことが可能な２ｃｍ平方程度
のサイズなど、移植部位の面積に対応して決定すること
ができる。

【００４４】切断された羊膜は、それぞれ細胞培養用の
ディッシュプレート（例えば、３５ｍｍφなど）に入れ
られる。このプレート内に入れられた羊膜はスポンジ層
と上皮層とが剥がされ、緻密層と、基底膜とが残される
（Ｓ２０５）。そして、基底膜を上向きにした状態で、
羊膜はプレート底部に固定される（Ｓ２０６）。

【００４５】羊膜のプレートへの固定は、特に、羊膜に
大きな損傷を与えない方法であれば特に限定はないが、
例えば、以下のように凍結と乾燥を組み合わせた方法で
実施することができる。

【００４６】すなわち、緻密層及び基底膜が残された羊
膜を、−８０℃で完全に凍結させ、凍結後、室温に再度
戻され、プレート内の水分が吸引除去される。羊膜は、
上皮側が上向きにされて皺が広げられた状態で、無菌的
に羊膜表面を完全に乾燥させることが好ましい。

【００４７】乾燥後は、そのまま使用することもできる
が、再度−８０℃に凍結してもよい。凍結させた場合に
は、使用前に羊膜は室温に戻され、ディッシュプレート
についた水分が除去されて使用可能となる。

【００４８】（２）羊膜上での上皮細胞の培養増殖提供者から採取した上皮幹細胞組織を羊膜上に付着さ
せ、上皮細胞を培養増殖させる。

【００４９】具体的には、ここで用いる幹細胞組織は、
状態がよいものが好ましく、例えば、提供者から提供さ
れた状態のよい幹細胞を提供直後に使用することが好適
である。このような状態のよい幹細胞組織が得られた
ら、上記プレートに固定された羊膜表面に付着させ、幹
細胞組織が浮遊しない程度の培地を注入し、培養を開始
する。但し、幹細胞組織が羊膜に接着した後は、培地の
液量を幹細胞組織や増殖を開始した上皮細胞が十分に培
地に浸る程度まで増やすことが好ましい。

【００５０】羊膜に付着させる幹細胞組織のサイズは、
大きめであることが好ましく、例えば、角膜輪部組織の
場合には、２ｃｍ平方の羊膜に対して１ｍｍ平方程度の
サイズであることが好ましい。しかし、このサイズは、
細胞組織の状態などから大小変更させることは可能であ
る。

【００５１】また、上記幹細胞組織の培養において用い
られる培地は、幹細胞組織から上皮細胞を適切に増殖さ
せ得る培地であれば、特に限定はない。例えば、幹細胞
組織の培養開始時には、ＳＨＥＭ培地などを用いること
ができる。また、上皮細胞増殖開始後は、上皮細胞培養
用の基礎培地、例えば、Medium１６５培地などを用いる
ことができる。なお、ＳＨＥＭ培地及びMediumu１６５
培地の組成については、後に詳述する。

【００５２】これら培地には、細胞培養に必要な血清が
添加される。この血清は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）など
を用いることもできるが、好ましくは、幹細胞組織の提
供者（ドナー）又はレシピエント自身の血清を用いるこ
とがよい。

【００５３】なお、ＦＣＳなどを用いる場合には、市販
品を遠心分離し、さらに、フィルターを通したものを用
いることが好ましい。また、ヒト血清を用いる場合に
は、熱処理（例えば、５６℃、３０分間程度）したもの
や０．２２μｍフィルター等により白血球などの免疫拒
絶反応を惹起するおそれのある細胞などが除去されたも
のを用いることが好ましい。

【００５４】また血清の添加量は、幹細胞組織の培養開
始時には、高濃度、例えば１５％程度とすることができ
る。一方、上皮細胞増殖開始後は、比較的低濃度でもよ
く、例えば、３％程度とすることができる。なお、これ
ら培地の切り替え時期は、顕微鏡下で上皮細胞の増殖が
確認された段階又は、培地にｐＨインディケータなどが
添加されている場合には、細胞増殖によりインディケー
タが酸性を呈した段階で行うことができる。

【００５５】培養は、細胞の増殖に好ましい環境、例え
ば、３７℃に設定されたＣＯ_２インキュベーターなどを
用いて行う。また、培養期間は、短くとも羊膜表面を覆
うために必要な期間とし、最長でも上皮細胞の増殖が盛
んな段階、例えば、細胞の増殖をグラフにプロットした
際に一次直線を描く増殖期の範囲内とすることが好まし
い。

【００５６】例えば、培養用のプレート底面が増殖され
た上皮細胞でちょうど埋まる程度、すなわち、コンフル
エントに達する程度の期間とすることができる。より具
体的には、状態のよい角膜輪部組織（１ｍｍ平方）を、
ディッシュプレート（直径３．５ｃｍ）に固定された羊
膜（２ｃｍ平方）上で培養した場合には、培養期間は、
およそ１０〜１４日程度とすることができる。

【００５７】（３）移植用細胞片の回収上記培養の結果、ディッシュプレート内には、羊膜を基
質として、その表面に幹細胞組織が接着され、また、そ
の羊膜表面を覆うように幹細胞組織から増殖した上皮細
胞が広がった移植用細胞片が生成される。ここで生成さ
れた移植用細胞片は、羊膜をディッシュプレートから剥
がすことにより回収される。ここで回収された移植用細
胞片は、回収後速やかにレシピエントの患部に移植され
る。

【００５８】[第３の実施形態]本実施形態では、移植用
細胞片作成用キットについて説明する。

【００５９】上記第２の実施形態に示した一連の方法に
より、上記移植用細胞片を作成することができるが、こ
の作成を容易に実施し得るように移植用細胞片を作成す
るために、必要な培養液、試薬等及び作成方法を記載し
た説明書などとともにキットとして提供してもよい。

【００６０】例えば、このキットには、プレートに固定
された羊膜、幹細胞組織を培養するために必要な培地な
どを含めることができる。また、必要に応じて、羊膜な
ども含めてもよい。このように羊膜や培地などがキット
として提供されることにより、幹細胞組織などを準備す
れば、上記作成方法に従って比較的簡便に移植用細胞片
を作成することが可能となる。

【００６１】

【実施例】以下に、本発明を実施例を用いてより具体的
に説明するが、本発明は本実施例に限定されるものでは
ない。

【００６２】[実施例１] 羊膜の調整移植用細胞片の基質となる羊膜を調整する。帝王切開し
た妊婦などから羊膜を採取する。採取した羊膜を保存す
る場合には保存用の処理溶液を調整する。この処理溶液
は、滅菌済みＰＢＳ（−）又は滅菌済み生理食塩水に最
終濃度４．２，８．５，１５．０％となるようにＤＭＳ
Ｏを添加した、４．２，８．５，１５．０％溶液として
調整される。ここで調整された溶液をそれぞれ複数の容
器に入れて準備する。

【００６３】採取した羊膜の前処理は、上記４．２，
８．５，１５．０％溶液という濃度の低い順でそれぞれ
３０分ずつ羊膜を浸すことにより行う。処理後、すぐに
使用する場合は次の羊膜上皮の除去を行う。一方、保存
する場合には、上記１５％溶液を含む保存容器に入れ
て、−８０℃で保存する。

【００６４】細胞培養用のディッシュプレート（例え
ば、１００ｍｍφ）に上記１５％溶液を注ぎ、そこに羊
膜を移す。羊膜は、使用する大きさに切断され、それぞ
れ個別のディッシュプレート（例えば、３５ｍｍφ）に
移される。採取された羊膜には、下層から順にスポンジ
層、緻密層、基底膜、上皮を備えるが、このうち最下層
のスポンジ層をピンセットを用いて剥がす。スポンジ層
が剥がされた後、この羊膜を１０％アンモニア水に浸
し、室温で３０分間静置する。

【００６５】次に、羊膜から最上層の上皮をスクレーパ
ーを用いて剥がす。上皮の除去が終了後、１０％アンモ
ニア水を吸引し除去する。その後、ディッシュプレート
に滅菌済みＰＢＳを注入し、羊膜を洗浄する。

【００６６】洗浄後の羊膜を基質として上皮細胞を増殖
培養させるために、この羊膜をディッシュプレートの底
に張り付けて、固定する。この張付け固定は、後に培養
液を添加したときに羊膜が浮上しない程度に行う。

【００６７】羊膜をプレート底部に張り付けるために
は、羊膜を凍結及び乾燥させる。具体的には、２回の凍
結を経る方法では、先ず、上記ＰＢＳ洗浄後の羊膜を−
８０℃に置き、完全に凍結させる。

【００６８】その後、上皮細胞の培養前日に凍結した羊
膜を室温に戻し、プレート内の水分をアスピレータで吸
い取る。水分をアスピレータで除去した後、羊膜を上層
を上向きにして、ピンセットで広げて羊膜の皺を取る。
その状態で、クリーンベンチ内でディッシュプレートの
蓋を開いたまま、ファンをつけて１時間以上風乾させ
る。羊膜の上層面が完全に乾いた事を確認したら、再度
−８０℃に凍結させる。使用する１時間位前に室温に戻
し、ディッシュプレートについた水分を取り除いた後、
使用する。

【００６９】なお、上記羊膜をプレート底面に固定する
場合、２度目の凍結工程を省略することもできる。

【００７０】[実施例２] 移植受容者の親、兄弟などか
ら提供された角膜輪部組織を用いた移植用細胞片の作成角膜輪部組織の提供者から採血し、血清を分離する。分
離された血清を、５６℃、３０分間、熱処理して不活性
化する。この血清をＳＨＥＭ培地に添加し、１５％血清
入りＳＨＥＭ培地を調整する。ここで調整された培地の
一部を予め容器に入れ、提供者から角膜輪部組織を採取
する。採取した角膜輪部組織を前記培地入りの容器に速
やかに投入する。

【００７１】角膜輪部組織を上記ディッシュプレートに
固定された羊膜上に載置し、組織が浮かないように上記
血清含有ＳＨＥＭ培地を注入して、３７℃でインキュベ
ートする。このインキュベートにより組織が羊膜に接着
したら、さらに培地を追加して培養する。

【００７２】培養により、組織の周囲に上皮細胞の増殖
が観察されたところで、培養液を３％血清含有１６５培
地に変更する。なお、上皮細胞増殖の観察は、例えば培
地に含まれるｐＨインディケータが酸性を示しているこ
とにより検知することもできる。

【００７３】上記３％血清含有１６５培地に変更後、こ
の培地を定期的に交換しながら、培養を継続する。培養
は、およそ１０〜１４日間で、ディッシュプレートの底
部がコンフルエントになるまで行う。

【００７４】上記培養の結果、羊膜上に付着させた角膜
輪部組織から上皮細胞が増殖して、羊膜を基底膜としこ
の表面を角膜上皮細胞で覆われ、かつ角膜輪部組織を有
する移植用細胞片が作成される。

【００７５】なお、本実施例で用いた培地の組成を表１
に示す。

【００７６】

【表１】＜ＳＨＥＭ培地＞組成入手先含有量/1l −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＨＥＰＥＳ含有ダルベッコウ変法イーグル培地 GibcoBRL社 15.6g （Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２）ＮａＨＣＯ_３和光純薬（使用時濃度） 2.5g インスリン (human recombinant SIGMA社（使用時濃度） 5mg expressed in E.coli) ヒト上皮細胞成長因子 GibcoBRL社（使用時濃度）10mg （ヒト−ＥＧＦ）コレラ毒素 GibcoBRL社（使用時濃度） 1mg ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ) SIGMA社 5ml 抗生物質(例えば、ベンジルペニシリン、適量ストレプトマイシン) ＜１６５培地＞組成入手先含有量/1l −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Medium１６５培地 KURABO （ヒト角膜上皮細胞培養用基礎培地）インスリン SIGMA社（使用時濃度） 5mg ヒト−ＥＧＦ GibcoBRL社（使用時濃度） 1mg ヒドロコルチゾン（使用時濃度） 0.18mg （ヒト角膜上皮細胞増殖添加剤（ＨＣＧＳ）使用））

【００７７】[実施例３] 他人から提供された角膜輪部
組織を用いた移植用細胞片の作成移植用細胞片の作成における各工程は、上述の一連の工
程により行われる。ここでは、培養液に添加される血清
をドナー由来ではなく、レシピエント由来の血清を用い
ている。

【００７８】すなわち、１５％血清添加ＳＨＥＭ培地及
び３％血清添加１６５培地において、添加される血清は
レシピエントから採取した血清を用いる。なお、この血
清は、上記と同様に、レシピエントから採取した血液か
ら分離し得られ、この血清分離後、５６℃、３０分間、
熱処理を行うことにより不活性化されて使用される。

【００７９】このように提供者からの血清が得られない
場合であっても、レシピエントの血清により、移植用細
胞片を作成することができる。

【００８０】[実施例４] 移植用細胞片の移植患者の眼表面から結膜化等した角膜上皮を除去し、角膜
実質を露出させる。一方、上記の通り作成された移植用
細胞片は、ピンセットなどでプレートから羊膜を剥がし
て回収する。

【００８１】回収した移植用細胞片は、露出した角膜実
質上に羊膜が接触するように移植する。また羊膜上の角
膜輪部組織は、白目と黒目との境界である本来の角膜輪
部の位置に当たるように配置する。配置後、眼表面に移
植された細胞片を生理食塩水などで洗浄し、洗浄後、縫
着する。

【００８２】なお、上記移植を８名程度のレシピエント
に対して実施したところ、早期に上皮細胞の定着が観察
された。

【００８３】

【発明の効果】以上の通り、本発明の移植用細胞片によ
れば、上皮組織の再建率を向上させることができ、より
高い治療効果が期待できる。また、角膜上皮などの上皮
組織の提供が不足している場合でも、幹細胞組織が得ら
れれば、この一部を用いて羊膜上で増殖させることによ
り、複数の角膜上皮などの上皮組織を再生させることも
可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本実施形態の移植用細胞片の全体構成を示す
図である。

【図２】羊膜調整の各工程を示すフローチャートであ
る。

【図３】従来の羊膜移植方法における各工程を示す図
である。

【符号の説明】

１０移植用細胞片、１２羊膜、１４幹細胞組織、
１６上皮細胞。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スポンジ層と上皮層とが取り除かれた羊
膜と、前記羊膜の表面に付着された上皮幹細胞組織と、前記幹細胞組織より該羊膜表面を覆うようにインビトロ
で増殖させた上皮細胞と、を含む移植用細胞片。
【請求項２】前記上皮細胞が、角膜上皮細胞又は結膜
上皮細胞であることを特徴とする請求項１に記載の移植
用細胞片。
【請求項３】スポンジ層と上皮層とが除去された羊膜
を調整する工程と、前記羊膜に上皮幹細胞組織を付着させる工程と、前記羊膜上に該上皮細胞を増殖させる工程と、を有する
移植用細胞片の作成方法。
【請求項４】前記上皮細胞が、角膜上皮細胞又は結膜
上皮細胞であることを特徴とする請求項３に記載の移植
用細胞片の作成方法。
【請求項５】前記幹細胞組織が、角膜輪部細胞である
ことを特徴とする請求項３に記載の移植用細胞片の作成
方法。