WO2005075002A1 - 医療用材料及びその製造方法 - Google Patents

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Tetsushi Taguchi
Hisatoshi Kobayashi
Junzo Tanaka
Kazuo Tsubota
Naoshi Shinozaki
Shigeto Shimmura
Hideyuki Miyashita
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National Institute For Materials Science
Bio Link, Incorporated
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    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea

Definitions

  • the present invention relates to a medical material and a method for producing the same, and more specifically, to a medical material using an amniotic membrane that has been subjected to a cross-linking treatment by bonding a biocompatible high molecular film and a method for producing the same.
  • the cornea is a transparent tissue that does not include blood vessels, which is the outermost part of the optical system that constitutes the eyeball. Good visual acuity can be obtained because the cornea and tears form a smooth eyeball surface.
  • keratoconjunctival epithelial cells are always in contact with the outside world, and foreign substances such as microorganisms in the outside world, and the light power such as ultraviolet rays, have a protective effect of protecting the eyeball.
  • corneal conjunctival epithelial cells play an extremely important role in maintaining the transparency of the cornea, protecting the entire eyeball and maintaining homeostasis.
  • Corneal transplantation has been used as a treatment for the loss of visual acuity caused by such corneal turbidity. Corneal transplantation involves removing the cornea of a patient who has lost transparency and replacing it with a new transparent cornea. By performing such a transplant, the transparency of the cornea can be restored, and visual acuity can be regained.
  • the cornea is composed of epithelium (about 50 m thick), Bowman's membrane (about 10 m), stromal corneal layer (about 500 m), Descemet's membrane (about 10 m), and endothelial layer (about 5 m). It is composed of five layers and has a total thickness of 0.5 mm, with the corneal stromal layer accounting for 90% of the thickness.
  • the cornea to be implanted must be both transparent and approximately 0.5 mm thick.
  • a cornea having a non-uniform corneal thickness does not provide good visual acuity because it causes irregular astigmatism, which is also weak in intensity.
  • the corneal epithelium functions to prevent bacteria from entering by covering the corneal surface and to maintain an optically smooth surface. The only cornea suitable for such transplantation is the donor-derived cornea.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 a transplantation method using amniotic membrane has been developed.
  • the amniotic membrane used in this transplantation method can also obtain placental strength in pregnant women and the like who have undergone cesarean section.
  • the amniotic membrane since the amniotic membrane has a thick basement membrane, it acts as a substrate for keratoconjunctival epithelial cells to proliferate and differentiate.
  • amniotic membrane since amniotic membrane has an anti-inflammatory action and scar formation inhibiting action, which are almost immunogenic, the keratoconjunctival epithelium transplanted onto the amniotic membrane and these stem cell tissues may cause rejection of the transplant recipient (recipient). Protected from etc.
  • the scar tissue of the eye on which the cornea has been removed is removed, and the cornea and the sclera are exposed.
  • An amnion is stuck to the exposed cornea and sclera for ocular surface reconstruction.
  • the provided corneal tissue was cut out of the central cornea (including epithelium, dermis and endothelium), trimmed around the limbal tissue, and transplanted onto the exposed amniotic membrane and corneal stroma. Will be met.
  • the limbus transplanted in this manner is differentiated and proliferated using the amniotic membrane as a substrate while being protected by the non-immunogenic amniotic membrane, and the corneal epithelium is regenerated on the amniotic membrane.
  • epithelial stem cells are preliminarily attached to an amniotic membrane and cultured in vitro, so that the epithelial cells cover the amnion surface.
  • a method of growing cells see Patent Documents 15).
  • Non-patent document 1 Medical Asahi September 1999 issue: p62-65
  • Non-patent document 2 Kazuo Tsubota et al. N Engl J Med 340: 1697 Riki et al. 1703, 1999 Patent document 1: JP 2001-161353
  • Patent Document 2 JP-A-2002-320666
  • Patent Document 3 JP 2002-331025 A
  • Patent Document 4 JP 2003-126236 A
  • Patent Document 5 JP-T-2003-532466
  • an implant using an amniotic membrane as a substrate has a thickness of less than 100 microns and has a layer corresponding to the corneal stroma, so that it is weak in strength. Although suitable for reconstructing the ocular surface, it is not suitable for thick transplants, including corneal stroma. In cases where the disease extends to the corneal stroma, further improvements in the amniotic transplantation method are needed.
  • An object of the present invention is to provide a medical material capable of achieving higher therapeutic results in epithelial cells such as keratoconjunctival epithelial cells using amniotic membrane and a method for producing the same.
  • the inventors of the present invention cultivated epithelial stem cells on the surface of a crosslinked amniotic membrane adhered to a biocompatible polymer membrane and obtained a biocompatible polymer membrane, an amniotic membrane, and an epithelial stem cell. Further, the present inventors have found that a medical material containing epithelial cells grown to cover the amniotic membrane from the cells can be obtained.
  • the present invention includes an amniotic membrane, which is a placental tissue, a polymer membrane bonded to one surface of the amniotic membrane and subjected to a cross-linking treatment, and a cell adhered to the other surface of the amniotic membrane. Medical materials.
  • the present invention provides a step of preparing an amniotic membrane from which a sponge layer has been removed, a step of bonding a biocompatible polymer film to one surface of the amniotic membrane and performing a cross-linking treatment, and the other step of the aforementioned amniotic membrane.
  • the method for producing a medical material as described above comprising a step of attaching epithelial stem cells to the surface and a step of growing epithelial cells from the epidermal stem cells to the amniotic membrane surface.
  • the biocompatible polymer membrane Since the biocompatible polymer membrane has high biocompatibility, the engraftment rate after transplantation of the graft is higher than in the case where the biocompatible polymer membrane is not used. Further, since the biocompatible polymer membrane is transparent and can be appropriately changed in thickness, it is particularly effective for transplantation of corneal epithelium or conjunctival epithelium and corneal stroma.
  • amniotic membrane is the innermost membrane of the vertebrate amniotes (Amniota: reptiles, birds, mammals) formed during the developmental process and directly covers the embryo.
  • Amniotic membrane is a suitable material for transplantation because it has a thick basement membrane and does not express histocompatibility antigens on the cell surface, and has an anti-inflammatory effect with almost no immunogenicity.
  • amniotic membrane has almost no immunogenicity, but the animal species to which the medical material of the present invention is transplanted in order to more reliably prevent the induction of an immune response after transplantation and to prevent interspecies infection. It is desirable to use an amniotic membrane from the same animal.
  • amniotic membrane in order to produce a medical material for transplantation into humans, it is desirable to use human amniotic membrane.
  • an amniotic membrane derived from the same animal species as the animal into which the graft is transplanted it is not limited to those having a kin relationship such as a parent and a child, and those of another person can be used.
  • Human-derived amniotic membrane can be obtained by cesarean section of a pregnant woman. If it is not from a pregnant woman undergoing a cesarean section, it is generally difficult to use because of the potential for contamination.
  • the amniotic membrane generally has a sponge layer (sponge layer), a compact layer, a basement membrane layer, and an epithelial layer from the lower side, but the amniotic membrane used for the medical material of the present invention is composed of the sponge layer and the upper layer. It is desirable to use a skin layer that has been removed in advance.
  • "amniotic membrane” means an amniotic membrane from which a sponge layer and an epithelial layer have been removed.
  • the amniotic membrane from which the sponge layer and the epithelial layer have been removed is bonded to a biocompatible polymer membrane and subjected to a bridge bonding treatment.
  • the biocompatible polymer membrane that can be used in the present invention may be a biopolymer, a synthetic polymer, or a hybrid thereof.
  • Biopolymers include proteins, glycosaminodalican, proteodalican, alginic acid, chitosan, polyamino acids, or a combination of two or more of these.
  • Glycosaminodalican includes chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparan sulfate, heparin, keratan sulfate, or derivatives thereof.
  • the protein include collagen, atelocollagen, alkali-treated collagen, gelatin, keratin, serum albumin, ovalbumin, hemoglobin, casein and globulin, fibrinogen, and derivatives thereof.
  • the synthetic polymer used for the biocompatible polymer membrane include a polymer of a water-soluble monomer or a water-soluble polymer.
  • Water-soluble monomers include n-isopropylacrylamide, acrylamide, acrylic acid, methacrylic acid, burpyrrolidone or a combination of two or more thereof. Further, as the water-soluble polymer, one or two or more of polyvinyl alcohol (PVA), polyallylamine, polybulamine, aliphatic and aromatic diisocyanates, PVA having an amino group introduced by CNBr, or two or more of these Combinations are possible.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • polyallylamine polyallylamine
  • polybulamine polybulamine
  • aliphatic and aromatic diisocyanates PVA having an amino group introduced by CNBr, or two or more of these Combinations are possible.
  • the collagen film is preferably a crosslinked product of alkali-treated type I collagen.
  • Such a film is preferably made of, for example, swine skin-derived alkali-treated type I collagen available from NITTA GELATIN Inc. Can be used. Collagen has more than a dozen types of forces, independent of these types and origins.
  • One type of cross-linking between the amniotic membrane and the biocompatible polymer membrane is immobilization by covalent bonding. This can be performed by performing a cross-linking treatment in the presence of a cross-linking agent such as daltaraldehyde or formaldehyde and collagen or gelatin. This processing can be specifically performed by the following steps.
  • an amniotic membrane is spread on a glass plate, and a mixed solution of a crosslinking agent and collagen is applied thereto. Thereafter, by mounting the biocompatible polymer membrane, a cross-linking reaction occurs between the amniotic membrane and the biocompatible polymer membrane, and the amniotic membrane can be fixed. Further, alternatively, the cross-linking treatment can be performed by applying only a cross-linking agent to the amniotic membrane and reacting the amniotic membrane with the biocompatible polymer membrane. Since such a cross-linking is a covalent cross-linking, it has a feature that the amniotic membrane and the biocompatible membrane are stably present without peeling off even in a physiological environment.
  • the epithelial stem cells adhered onto the amniotic membrane cross-linked with the biocompatible polymer membrane are capable of cell division to generate epithelial tissue cells.
  • the epithelial cells used include corneal epithelial cells and conjunctival epithelial cells.
  • the stem cells of the corneal epithelial cells that divide and give rise to the corneal epithelium are present in the limbus.
  • stem cells of conjunctival epithelial cells that undergo cell division to generate conjunctival epithelium are present in the conjunctival fornix and the like. These These cells can be removed from the living body by cutting out the tissue at the site where the cells are present.
  • the removed cells are directly placed on the amniotic membrane, or only the cells are removed by treating the cut tissue with an enzyme such as trypsin or dispase, and the cells are seeded on the amniotic membrane. It can be attached on the amniotic membrane by such a method. Cells that have adhered to the amniotic membrane can be, for example, in the presence of feeder layer cells.
  • DMEM / F12 liquid medium with 15% by volume serum and cholera toxin, epidermal growth factor, insulin, dimethyl sulfoxide-added medium, etc. it is possible to grow on amniotic membrane.
  • Epithelial cells stratified in the same way as the cornea of living organisms are cultured by growing the cells that have grown to cover the entire amniotic membrane, and reducing the volume of the culture medium until the cells are exposed to air. It can be obtained by doing.
  • the limbus is used as an epithelial stem cell tissue
  • the conjunctival rim or the like is used as the epithelial stem cell. It can be used as a medical material.
  • Epithelial stem cell tissues such as the limbus or conjunctival margin containing epithelial stem cells include epithelial cells, fibroblasts, and vascular endothelial cells in addition to stem cells, even if they are substantially only stem cells. May be included.
  • the epithelial stem cell tissue may be obtained either from the relatives of the recipient of the transplant (recipient) or may be obtained from others who are completely related to the recipient. When obtaining epithelial stem cells other than the recipient, those derived from an HLA-type-compatible donor are preferable in order to avoid the possibility of immune rejection.
  • epithelial stem cells derived from a donor whose HLA type is compatible cannot be obtained, epithelial stem cells derived from a donor whose HAL type is compatible may be used.
  • epithelial stem cells derived from a donor whose HAL type is compatible may be used.
  • tissue provided that has been confirmed in advance that there is no fear of infection or the like.
  • the epithelial stem cells those obtained by the recipient of the transplant (recipients) themselves can be used as long as they are determined to contain stem cells.
  • the epithelial stem cell tissue is preferably one that can proliferate epithelial cells whose condition is poor.
  • the size of the stem cell tissue from which the donor or recipient's own power is also extracted is, for example, When the condition of the stem cell tissue is good, it may be about 1 mm square for a 2 cm square amniotic membrane. The size of the excised stem cell tissue can be appropriately changed according to the state of the cells, the degree of the disease of the recipient, and the like.
  • the epithelial stem cell tissue cut out from the donor is adhered onto an amniotic membrane that has been cross-linked with a biocompatible polymer membrane.
  • an amniotic membrane that has been cross-linked with a biocompatible polymer membrane.
  • the epithelial stem cell tissue is a limbus
  • the epithelial stem cell be molded into a size about the size of the recipient's cornea and arranged in a shape close to a ring.
  • Epidermal stem cells placed on a cross-linked amniotic membrane adhered to a biocompatible polymer membrane are exposed to air in vitro after the amniotic membrane and the stem cells are immersed in a culture solution in vitro.
  • the epithelium can be stratified by exposing the epithelium.
  • the epithelial cells include stem cells contained in the epithelial stem cell tissue that have proliferated by cell division, but also arise from cell division of epithelial cells other than the stem cells contained in the provided epithelial stem cell tissue. May be included.
  • epithelial cells are proliferated and differentiated on the amniotic membrane from the (epithelial) stem cells so as to cover the amniotic membrane surface, and preferably the stratification of the epithelial cells is promoted.
  • epithelial stem cell tissue which does not undergo proliferation in vitro, may be transplanted to a recipient in a state where it is adhered to the amniotic membrane, and epithelial cells may be propagated in the affected area of the recipient.
  • epithelial cells grown on amniotic membrane are desired to be in a good condition at the time of transplantation.
  • cells in the logarithmic growth phase have a constant metabolic activity.
  • Cells that are maintained in a stable manner and are repeatedly dividing at a constant cell cycle are preferred.
  • the medical material containing the epithelial stem cell tissue adhered to the surface and the stem cell tissue-proliferated epithelial cells is transplanted together with the epithelial cells to the affected area where the stem cell tissue has been eradicated or damaged.
  • Glutaraldehyde is added Caro to a final concentration of 6mM in dimethyl sulfoxide collagen (DMSO) solution (30 wt 0/0), the silicone rubber of the mixed solution thickness 500 m and spacer one The mixture was poured between two glass plates and reacted at 37 ° C. for 24 hours to obtain a collagen gel sheet. Thereafter, DMSO was replaced by immersing the gel sheet in a large excess of a phosphate buffer.
  • DMSO dimethyl sulfoxide collagen
  • a water / DMSO mixed solvent solution (15% by volume) of PVA (average degree of polymerization: 77,000) was dissolved in an autoclave at 120 ° C. for 5 hours. The solution was poured between two glass plates of 200-500 m thick silicone rubber as a spacer, left in a freezer at 20 ° C for 2 hours, and thawed at room temperature to obtain a PVA gel sheet . Then, put the PVA gel sheet and lyophilized 10 weight 0/0 toluene solution of hexamethylene diisocyanate to tin catalysts containing a nitrogen Baburi ring, Isoshiana one preparative groups PVA gel sheet surface by stirring at room temperature for one hour Was introduced. The gel sheet was immersed in a large excess of a phosphate buffer to convert isocyanate groups to amino groups.
  • 3T3 cells treated with mitomycin C were seeded in a well below a transwell. Thereafter, the limbus cut out from the human cornea for transplantation provided by a foreign donor was treated with 0.05% by weight of trypsin EDTA at 37 ° C for 1 hour to separate epithelial cells including stem cells.
  • the collagen gel sheet immobilized on the amniotic membrane and the PVA gel sheet immobilized on the amniotic membrane obtained in the above step 2 are respectively placed in the upper well of the transwell.
  • the amniotic membrane was placed on top, and epithelial cells were seeded on it and cultured on the amniotic membrane surface until the cells completely covered the surface.
  • the stratification of the epithelial layer was performed by reducing the volume of the medium until the surface of the epithelial cells was exposed to air and culturing for 2 weeks.
  • FIG. 2 shows an optical micrograph (HE staining) of a cross section of corneal epithelial cells layered on an amniotic membrane-immobilized collagen gel sheet.
  • FIG. 3 shows an optical micrograph (HE staining) of a cross section of corneal epithelial cells layered and cultured on an amniotic membrane PVA gel sheet. It can be seen that a uniform corneal epithelial layer having a thickness of about 50 microns was formed.
  • FIG. 1 An optical micrograph as a substitute for a drawing showing a cross section of an amnion-immobilized collagen gel of Example 1.
  • FIG. 2 is an optical microscope photograph (HE staining) as a substitute for a drawing, showing a cross section of corneal epithelial cells layered and cultured on an amniotic membrane-collagen gel sheet according to the method of Example 1.
  • FIG. 3 is an optical micrograph (HE staining) as a substitute for a drawing, showing a cross section of corneal epithelial cells layered and cultured on an amniotic membrane PVA gel sheet by the method of Example 1.

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Abstract

【課題】羊膜を用いる角結膜上皮細胞などの上皮細胞において、より高い治療成果が計られる医療用材料及びその製造方法を提供すること。 【解決手段】胎盤組織である羊膜と、前記羊膜の一方の表面に張り合わせて架橋結合処理されている高分子膜と、前記羊膜の他方の表面に付着した細胞とを含む医療用材料。スポンジ層を取り除かれた羊膜を調製するステップと前記羊膜の一方の表面に生体適合性高分子膜を貼り合わせて架橋結合処理するステップと前記羊膜の他方の表面に上皮幹細胞を付着させるステップと前記羊膜表面に前記上皮幹細胞から上皮細胞を増殖させるステップとを含む前記医療用材料の製造方法。

Description

明 細 書
医療用材料及びその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、医療用材料及びその製造方法に関し、より具体的には、生体適合性高 分子膜を張り合わせて架橋結合処理した羊膜を用いた医療用材料及びその製造方 法に関する。
背景技術
[0002] 角膜は、眼球を構成する光学系の最も外側にあり、血管を含まない透明な組織で ある。角膜と涙液が平滑な眼球表面を形成することにより、良好な視力を得ることがで きる。また、角結膜上皮細胞は常に外界と接し、外界の微生物などの異物、紫外線な どの光線力も眼球を守る防御作用を持っている。すなわち、角結膜上皮細胞は、角 膜の透明性を維持し、眼球全体を防御して恒常性 (homeostasis)を維持するために極 めて重要な役割を果たして 、る。
[0003] 角膜炎、角膜潰瘍、穿孔等の病態により角膜が濁り、透明性が失われてしまうと、視 力が永続的に低下する。このような角膜の濁りにより生じた視力低下に対する治療法 として、角膜移植が行なわれている。角膜移植は、透明性が失われた患者の角膜を 取り除き、新たに透明な角膜を移植する。このような移植を行なうことによって、角膜 の透明性が回復し、再び視力を取り戻すことができる。
[0004] 角膜は、表面から上皮 (厚さ約 50 m)、ボーマン膜 (約 10 m)、角膜実質層（約 500 m)、デスメ膜 (約 10 m)、内皮層（約 5 m)の 5層で構成され、合わせて 0. 5 mmの厚さであり、角膜実質層が 90%の厚さを占める。移植される角膜は、透明であ ると同時に約 0. 5ミリの厚みがなければならない。角膜厚が不均一な角膜は、強度的 にも弱ぐ不整乱視の原因となるため良好な視力は得られない。角膜上皮は、角膜 表面を覆うことにより細菌の侵入を防ぐとともに、光学的に平滑な面を維持する働きが ある。こうした移植に適する角膜は、ドナー由来の角膜しか存在しない。
[0005] ドナー不足により角膜の提供がない場合、角膜実質を含む移植を必要とする患者 は治療できない。角膜実質の代わりに、単に高分子膜を移植するだけでは、移植さ れた膜は脱落し、長期に維持できない。高分子膜を移植する場合には、上皮が生着 しないため、上皮がない状態で維持しなければならない。しかし、上皮がない状況で は細菌の侵入に対して防御することはできず、感染の原因となりうる。角膜上皮のみ を移植する方法の一つとして、羊膜を用いた移植法が開発されている (非特許文献 1 、2)。
[0006] この移植法に用いられる羊膜は、帝王切開した妊婦等の胎盤力も得ることができる 。また、この羊膜は、厚い基底膜をもつことから、角結膜上皮細胞が、増殖、分化する ための基質として作用する。さらに、羊膜は、免疫原性がほとんどなぐ抗炎症作用、 瘢痕形成抑制作用などを併せ持つため、羊膜上に移植される角結膜上皮やこれら の幹細胞組織は、移植受容者 (レシピエント)の拒絶反応等から保護される。
[0007] 羊膜を用いた移植法では、まず、角膜ィ匕した眼瘢痕 (scar)組織を除去し、角膜及び 強膜を露出させる。露出された角膜及び強膜に、眼表面再建のため、羊膜が貼り付 けられる。提供された角膜組織力ゝらは、中央部角膜 (上皮、実皮、内皮を含む)が切り 出され、角膜輪部組織の周囲が整えられて、露出された羊膜及び角膜実質上に移 植、逢着される。このように移植された角膜輪部は、免疫原性のない羊膜に保護され た状態で、羊膜を基質として分化、増殖し、羊膜上で角膜上皮が再生される。
[0008] 羊膜を用いた眼表面再建方法の改良法の一つとして、予め羊膜上に上皮幹細胞 を付着させてインビトロ (in vitro)で培養し、上皮細胞が羊膜表面を覆うように幹細胞 力 上皮細胞を増殖させる方法がある (特許文献 1一 5を参照)。
[0009] 非特許文献 1：メディカル朝日 1999年 9月号： p62— 65
非特許文献 2 : Kazuo Tsubota et al.N Engl J Med 340 : 1697力ら 1703、 1999 特許文献 1 :特開 2001— 161353号公報
特許文献 2：特開 2002-320666号公報
特許文献 3 :特開 2002-331025号公報
特許文献 4 :特開 2003— 126236号公報
特許文献 5：特表 2003 - 532466号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0010] 上記の各文献に開示されている羊膜を用いた眼表面再建方法では、移植は、上皮 幹細胞及び該上皮幹細胞力 増殖した上皮細胞が上に付着した羊膜ごと行なう。
[0011] しかし、羊膜を基質として用いた移植片は 100ミクロンに満たない厚みしかない上、 角膜実質に相当する層がな 、ために強度的に脆弱である。眼表面の再構築に適し ていても、角膜実質を含む、厚みを必要とした移植には適さない。角膜実質にまで病 変が及ぶ症例には、羊膜を用いた移植方法に更なる改良が必要である。
[0012] 本発明の目的は、羊膜を用いる角結膜上皮細胞などの上皮細胞において、より高 い治療成果が計られる医療用材料及びその製造方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0013] 上記目的達成のため、本発明者らは、生体適合性高分子膜と張り合わされ架橋さ れた羊膜表面において、上皮幹細胞を培養すれば、生体適合性高分子膜、羊膜、 上皮幹細胞及びその細胞から羊膜を覆うように増殖して一層になった上皮細胞を含 む医療用材料が得られることを見出した。
[0014] すなわち、本発明は、胎盤組織である羊膜と、前記羊膜の一方の表面に張り合わ せて架橋結合処理されている高分子膜と、前記羊膜の他方の表面に付着した細胞と を含む医療用材料、である。
[0015] また、本発明は、スポンジ層を取り除かれた羊膜を調製するステップと前記羊膜の 一方の表面に生体適合性高分子膜を貼り合わせて架橋結合処理するステップと前 記羊膜の他方の表面に上皮幹細胞を付着させるステップと前記羊膜表面に前記上 皮幹細胞から上皮細胞を増殖させるステップとを含む上記の医療用材料の製造方 法、である。
発明の効果
[0016] 生体適合性高分子膜は生体親和性が高!ヽため、生体適合性高分子膜を用いな!/ヽ 場合に比べて、移植片を移植した後、生着率が高まる。また、生体適合性高分子膜 は透明で厚みを適宜変えることができるため、角膜上皮又は結膜上皮と角膜実質の 移植に特に有効である。
[0017] また、生体適合性高分子膜と予め架橋結合処理された羊膜上で上皮幹細胞を培 養することにより、ハンドリングが向上し、縫合が容易になるという利点が生じる。角膜 上皮と角膜内皮を両面に生着させることにより、人工角膜として応用できる。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 羊膜は、脊椎動物の有羊膜類 (Amniota:爬虫類、鳥類、哺乳類)の発生過程にお いて形成される胚膜のうち、最内側にあって胚を直接覆う膜である。羊膜は、厚い基 底膜を有し、細胞表面に組織適合性抗原を発現していないため、免疫原性がほとん どなぐ抗炎症作用等を有するため、移植に適した材料である。このように羊膜は、免 疫原性がほとんどないが、移植後の免疫反応の惹起をより確実に防止するため並び に種間感染を防ぐために、本発明の医療用材料を移植される動物種と同一の動物 に由来する羊膜を使用するのが望ましい。すなわち、ヒトに移植するための医療用材 料を製造するためには、ヒトの羊膜を使用するのが望ましい。また、移植片を移植さ れる動物と同一動物種に由来する羊膜を用いる限り、親、子供など血縁関係にあるも のに限定されず、他人のものを使用することができる。
[0019] ヒト由来の羊膜は、帝王切開した妊婦力 得ることができる。帝王切開した妊婦から のものでないと一般に汚染の可能性があるので使用しにくい。羊膜は、一般に、下層 側から、スポンジ層（海綿層）、緻密層 (compact layer),基底膜層、上皮層を有するが 、本発明の医療用材料に用いるための羊膜は、スポンジ層と上皮層は予め除去処理 されているものを用いることが望ましい。以下の明細書では、特に示さない限り、「羊 膜」とは、スポンジ層と上皮層を除去された羊膜を意味する。
[0020] スポンジ層と上皮層を除去された羊膜は、生体適合性高分子膜と張り合わされて架 橋結合処理されている。本発明で使用できる生体適合性高分子膜は、生体高分子、 合成高分子及びこれらのハイブリッドであってもよい。生体高分子としては、タンパク 質、グリコサミノダリカン、プロテオダリカン、アルギン酸、キトサン、ポリアミノ酸、又はこ れらの 2つ又はそれ以上の組み合わせが挙げられる。グリコサミノダリカンには、コンド ロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、へパラン硫酸、へパリン、ケラタン硫酸 、又はこれらの誘導体が挙げられる。また、タンパク質としては、コラーゲン、ァテロコ ラーゲン、アルカリ処理コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、血清アルブミン、卵白アルブ ミン、ヘモグロビン、カゼイン及びグロブリン、フイブリノ一ゲン、又はこれらの誘導体が 挙げられる。 [0021] 生体適合性高分子膜に用いる合成高分子としては、水溶性モノマーの重合体又は 水溶性高分子が挙げられる。水溶性モノマーとしては、 n-イソプロピルアクリルアミド、 アクリルアミド、アクリル酸、メタクリル酸、ビュルピロリドン又はこれらの 2つ又はそれ以 上の組み合わせが挙げられる。また、水溶性高分子としては、ポリビュルアルコール (PVA)、ポリアリルァミン、ポリビュルァミン、脂肪族及び芳香族ジイソシアナート、 CNBrによりアミノ基を導入した PVA、の 1つ又はこれらの 2つ又はそれ以上の組み合 わせが挙げられる。
[0022] これらのうちで、入手が容易であること及び角膜等への親和性の高さから、コラーゲ ンを用いるのが好ましい。コラーゲンの膜は、アルカリ処理 I型コラーゲンの架橋体が 好ましぐこのような膜は、例えば、新田ゼラチン株式会社 (NITTA GELATIN Inc.)か ら入手できるブタ皮膚由来アルカリ処理 I型コラーゲンなどを用いることができる。コラ 一ゲンには、十数種類のタイプがある力 これらのタイプ及び由来にはよらない。
[0023] 羊膜と生体適合性高分子膜との架橋結合の様式としては、共有結合による固定ィ匕 がある。これは、ダルタルアルデヒドやホルムアルデヒドなどの架橋剤とコラーゲンや ゼラチンの存在下で架橋処理を行うことにより実施することができる。この処理は、具 体的には次のようなステップにより行うことができる。
[0024] まず、羊膜をガラス板上に広げ、そこに架橋剤とコラーゲンの混合溶液を塗布する 。その後、生体適合性高分子膜を載せることにより羊膜と生体適合性高分子膜との 間で架橋反応が起こり、羊膜を固定することができる。さらに、代替的に架橋剤のみ を羊膜に塗布し、生体適合性高分子膜と反応させても架橋結合の処理を行うことが できる。このような架橋結合は、共有結合による架橋であるため、生理的環境下でも 羊膜と生体適合性膜が引き剥がれることが無ぐ安定に存在するという特徴を有する
[0025] 上記生体適合性高分子膜と架橋した羊膜の上に付着させる上皮幹細胞は、細胞 分裂して上皮組織細胞を生じる能力があるものである。本発明にお！/、て用いられる 上皮細胞としては、角膜上皮細胞及び結膜上皮細胞などが含まれる。細胞分裂して 角膜上皮を生じる角膜上皮細胞の幹細胞は、角膜輪部に存在する。また、細胞分裂 して結膜上皮を生じる結膜上皮細胞の幹細胞は、結膜円蓋部等に存在する。これら の細胞は、その細胞が存在する部位の組織を切り出すことにより、生体から取り出す ことができる。
[0026] 取り出した細胞は、切り出した組織を羊膜の上に直接置ぐあるいは切り出した組織 をトリプシンやディスパーゼなどの酵素で処理することで細胞のみを取り出し、その細 胞を羊膜の上に播ぐなどの方法で羊膜の上に付着させることができる。羊膜の上に 付着した細胞は、例えば、フィーダ一レイヤー (feeder layer)細胞の存在下で
DMEM/F12液体培地に 15容積％の血清とコレラトキシン、上皮増殖因子、インシユリ ン、ジメチルスルフォキシドを添カ卩した培地などを用いることで、羊膜の上で増殖させ ることができる。生体の角膜と同じように重層化した上皮細胞は、羊膜の上をくまなく 覆うまで増殖させた細胞を、引き続!/、て培地の液量を細胞が空気に晒されるまで減 らして培養する事で得ることができる。
[0027] 以下、角膜輪部を上皮幹細胞組織として用いた場合を説明するが、結膜円縁部等 を上皮幹細胞として用いた場合も同様であり、あるいは、角膜内皮細胞も同様に本発 明の医療用材料として使用することができる。
[0028] 上皮幹細胞を含む角膜輪部又は結膜円縁部のような上皮幹細胞組織は、実質的 に幹細胞のみ力 なるものであっても、幹細胞以外に上皮細胞、線維芽細胞、血管 内皮細胞を含んでいるものであってもよい。上皮幹細胞組織は、移植を受ける患者（ レシピエント）の血縁者力も得られたものであっても、レシピエントとは血縁関係の全く な 、他人力 得られたものであってもよ 、。レシピエント以外力 上皮幹細胞を得る 場合には、免疫による拒絶反応が生じる惧れを回避するために、 HLAタイプの適合 した提供者に由来するものが好ましい。しかし、 HLAタイプが適合した提供者に由来 する上皮幹細胞が得られな 、場合には、 HALタイプが適合して 、な 、提供者に由 来する上皮幹細胞を用いてもよい。移植による感染等を防止するために、提供された 組織は、予め感染などの惧れがな 、ことを確認されて 、るものを用いるのが望ま ヽ 。上皮幹細胞は、幹細胞を含んでいると判断される限り、移植を受ける患者 (レシピエ ント）自身力 得られたものを用いることができる。
[0029] さらに、上皮幹細胞組織は、状態がよぐ上皮細胞を増殖し得るものが好ましい。ま た、提供者又はレシピエント本人力も切り出される幹細胞組織の大きさは、例えば、 幹細胞組織の状態がよい場合には、 2cm平方の大きさの羊膜に対して lmm平方程 度でもよい。切り出される幹細胞組織の大きさは、細胞の状態、レシピエントの疾患の 程度等に応じて適宜変更可能である。
[0030] 提供者から切り出された上皮幹細胞組織は、生体適合性高分子膜と架橋結合処 理した羊膜の上に付着させる。上皮幹細胞組織を羊膜上に付着させるときには、本 発明の医療用材料を移植した際に、上皮幹細胞組織が生体内で本来配置している ような位置に付着させるのが望ましい。例えば、上皮幹細胞組織が、角膜輪部である 場合には、レシピエントの角膜の大きさ程度に成型し、環状に近い形状で配置する のが望ましい。
[0031] 生体適合性高分子膜と張り合わされて架橋結合処理された羊膜上に置かれた上 皮幹細胞は、インビトロで羊膜と幹細胞が培養液に浸力るようにした後、幹細胞が空 気に晒される状態にすることにより上皮を重層化させることができる。この上皮細胞は 、上皮幹細胞組織に含まれる幹細胞が細胞分裂して増殖したものを含むが、それ以 外に提供された上皮幹細胞組織に含まれる幹細胞以外の上皮細胞が細胞分裂する こと〖こより生じたものを含んでもよい。最終的には、羊膜表面を覆うように (上皮)幹細 胞から上皮細胞を羊膜上で増殖分化させ、好ましくは上皮細胞の重層化を促す。ま た、増殖をインビトロで行なうことなぐ上皮幹細胞組織を羊膜上に付着させた状態で レシピエントに移植して、上皮細胞の増殖をレシピエントの患部にて行っても良い。
[0032] また、羊膜上で増殖させた上皮細胞は、移植の際に状態のよいものであることが望 ましぐ例えば、対数増殖期 (logarithmic growth phase)にある細胞であり、代謝活性 が定常的に維持され，一定の細胞周期 (cell cycle)で分裂を繰り返している状態の細 胞が好ましい。
[0033] このように、羊膜と、前記羊膜に架橋結合処理されて!、る生体適合性高分子膜と、 前記生体適合性高分子膜と貼り合わされて!/ヽな!ヽ側の前記羊膜表面に付着された 上皮幹細胞組織と、前記幹細胞組織力 増殖させた上皮細胞とを含む医療用材料 は、上皮細胞とともにその幹細胞組織まで根絶又は損傷した患部に移植される。 実施例 1
[0034] 1.生体適合性膜の調製 1)生体高分子ゲル (コラーゲンゲルシート）
コラーゲンのジメチルスルフォキシド (DMSO)溶液（30重量0 /0)にグルタルアルデヒドが 最終濃度 6mMになるように添カロし、その混合溶液を厚さ 500 mのシリコーンゴムを スぺーサ一とする 2枚のガラス板間に流し込み、 37°Cで 24時間反応を行い、コラー ゲンゲルシートを得た。その後、ゲルシートを大過剰のリン酸緩衝液に浸漬すること により、 DMSOを置換した。
2)合成高分子ゲル (PVAゲルシート）
PVA (平均重合度 77,000)の水/ DMSO混合溶媒溶液（15容積％)をオートクレープに て 120°C、 5時間力けて溶解した。その溶液を厚さ 200— 500 mのシリコーンゴムを スぺーサ一とする 2枚のガラス板間に流し込み、 20°Cの冷凍庫で 2時間放置後、室 温で解凍し、 PVAゲルシートを得た。その後、凍結乾燥した PVAゲルシートをスズ触 媒含有へキサメチレンジイソシアナートの 10重量0 /0トルエン溶液に入れ、窒素バブリ ング下、室温で 1時間攪拌することにより PVAゲルシート表面にイソシアナ一ト基を導 入した。そのゲルシートを大過剰のリン酸緩衝液に浸漬することにより、イソシアナ一 ト基のアミノ基への変換を行った。
2.生体適合性高分子膜への羊膜の化学的固定ィ匕
コラーゲンの DMSO溶液 (30重量0 /0)に架橋剤としてダルタルアルデヒドが最終濃度 2 OOmMになるように添加し、その混合溶液を羊膜上に滴下した。その後、コラーゲン ゲルの混合溶液を塗布し、上記 1.で調製したコラーゲンゲルシートある 、は PVAゲル シートをその上に置いた。固定ィ匕の反応は、 37°C、 24時間で行った。図 1の断面光 学顕微鏡写真（へマトキシリン (Hematoxylin)—ェォジン (Eosin) (HE)染色）に示される とおり、羊膜固定化コラーゲンゲルが得られた。
3.生体適合性高分子膜に固定した羊膜への上皮細胞層の形成
フィーダ一レイヤー細胞として、マイトマイシン Cで処理した 3T3細胞をトランスゥエル (transwell)の下のゥエルに播種した。その後、海外ドナー提供の移植用ヒト角膜より切 り出した輪部を 37°Cの 0. 05重量％トリプシン EDTAで 1時間処理する事により、幹 細胞を含む上皮細胞を分離した。トランスゥエルの上のゥエルに上記 2.の工程で得 られた羊膜固定化コラーゲンゲルシート及び羊膜固定ィ匕 PVAゲルシートをそれぞれ 羊膜が上になるように置き、その上に上皮細胞を播種して羊膜表面を細胞が完全に 表面を覆うまで培養した。上皮層の重層化は、培地の液量を上皮細胞の表面が空気 に晒されるまで減らして 2週間培養することによって行った。
[0035] 図 2に、羊膜固定化コラーゲンゲルシート上に、角膜上皮細胞を重層培養した断面 の光学顕微鏡写真 (HE染色)を示す。また、図 3に、羊膜固定ィ匕 PVAゲルシート上 に、角膜上皮細胞を重層培養した断面の光学顕微鏡写真 (HE染色)を示す。厚み が約 50ミクロンの均一な角膜上皮層が形成されたことが分る。
図面の簡単な説明
[0036] [図 1]実施例 1の羊膜固定化コラーゲンゲル断面を示す図面代用の光学顕微鏡写真
(へマトキシリンーェォジン (HE)染色）である。
[図 2]実施例 1の方法により羊膜固定化コラーゲンゲルシート上に、角膜上皮細胞を 重層培養した断面を示す図面代用の光学顕微鏡写真 (HE染色)である。
[図 3]実施例 1の方法により羊膜固定ィ匕 PVAゲルシート上に、角膜上皮細胞を重層 培養した断面を示す図面代用の光学顕微鏡写真 (HE染色)である。

Claims

請求の範囲
[1] 胎盤組織である羊膜と、前記羊膜の一方の表面に張り合わせて架橋結合処理され ている高分子膜と、前記羊膜の他方の表面に付着した細胞とを含む医療用材料。
[2] 請求項 1記載の細胞が、幹細胞から羊膜上で増殖分化して重層化した上皮細胞で あることを特徴とする請求項 1に記載の医療用材料。
[3] 請求項 1記載の細胞が、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、角膜内皮細胞又は結膜 上皮細胞であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の医療用材料。
[4] 請求項 1記載の高分子膜が、生体高分子、合成高分子又はこれらの 2つ又はそれ 以上の組み合わせ力 なるゲルであることを特徴とする請求項 1から 3のいずれかに 記載の医療用材料。
[5] スポンジ層を取り除かれた羊膜を調製するステップと前記羊膜の一方の表面に生 体適合性高分子膜を貼り合わせて架橋結合処理するステップと前記羊膜の他方の 表面に上皮幹細胞を付着させるステップと前記羊膜表面に前記上皮幹細胞から上 皮細胞を増殖させるステップとを含む請求項 1記載の医療用材料の製造方法。
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