JP2003190192A - 末梢神経再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 事故等により切断した末梢神経を修復するに
適した人工神経鞘を生体に移植して末梢神経の再生を図
る。 【解決手段】 ヒト由来の羊膜から得られる膜材または
膜材の成形体を使用した中空糸または中空糸束を人工神
経鞘として生体内に移植し、切断した末梢神経とつなぎ
合わせて末梢神経を再生させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は事故等により生じた
末梢神経の切断部分を修復するに適した人工神経鞘を生
体に移植することを特徴とする末梢神経再生法に係るも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来、事故等により生じた末梢神経の切
断により、生体に障害が残り、その後の日常生活に支障
を生じることが多くあった。このような支障が生じない
ようにするため、切断した末梢神経を再生させ、生体機
能を修復しようとする試みが種々行われている。その一
つとして屍体から採取した末梢神経を移植する技術があ
る。この技術は免疫拒絶反応、採取した末梢神経の保存
方法等、解決しなければならない重大な問題が数多くあ
り、まだ未解決の状態で実用化にはほど遠い現状であ
る。

【０００３】また、本人の身体の一部位から採取した神
経を患部へ移植する技術も一般的に用いられている。こ
れは移植用ドナーサイトに残る傷痕、その他知覚脱失の
障害が起こることがあり、好ましくはなかった。

【０００４】哺乳動物の組織から抽出、精製してテロペ
プチッドを除去したアテロペプチッド・コラーゲンを用
いる人工神経鞘を利用する末梢神経を再生させる方法が
提案されている。しかしながら、この技術は以下のよう
な問題点があり、これらの問題点はまだ解決されていな
いのが現状である。 哺乳動物が牛、羊の場合、病原体・プリオンの活性
が残存するおそれがあり、これを不活性化または／およ
び除去する方法が未解決である。 テロペプチッドを除去したコラーゲンは、生体に存
在しない異質のコラーゲンであるから、異質コラーゲン
に起因する神経の再生を阻害する各種の医科学に属する
未解決の問題がある。 微弱とされているが、神経の再生にとっては大問題
とする抗原性の残存に関する問題が未解決である。

【０００５】以上のように、末梢神経の再生を可能にす
る技術は種々提案されているが、材料の安定供給性、人
体に対する安全性など、それぞれ重大な未解決の問題を
抱えており、簡便で安定供給が可能な技術の出現が待た
れているのが現状である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記の現状に鑑み、従
来の技術が解決できなかった種々の問題を解決し、安価
で安定性に富んだ人工神経鞘を使って、切断した末梢神
経を再生できる方法を提供することにあり、神経の傷害
者を正常な社会生活へ復帰させ得ることにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の欠点を解決するた
めに本発明者等は鋭意研究した結果、ヒト由来の生体結
合組織膜から得られた緻密層からなる膜材またはその膜
材を使用して得られる成形体を使った中空糸または中空
糸束を生体内に移植することにより、末梢神経を再生で
きることを見いだし、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明の要旨とするところは、
上皮層、基底膜層、緻密層、繊維芽細胞層にて構成され
る生体結合組織膜から、上皮層および繊維芽細胞層等の
細胞質層を溶解、除去することにより得られる無細胞質
である緻密層または緻密層および基底膜層であって、そ
の特徴とするマトリックス構造を保全した医用材料の膜
材またはその膜材を使用して得られる成形体から構成さ
れる中空糸または中空糸束を生体内に移植し、人工神経
鞘として用いることを特徴とする末梢神経再生方法にあ
る。

【０００９】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で云うヒト・哺乳動物の膜状結合組織とは、脳硬
膜、心膜、胸膜、横隔膜、腹膜、大腿筋膜、腸間膜、皮
膚、鼓膜、その他の生体膜、および血管壁、食道壁、気
管壁、尿道・尿管壁、心臓壁、その他生体臓器の外壁、
さらに胎児膜およびそれを構成する羊膜、絨毛膜等を指
称するものである。これらのうち、人工神経鞘にはヒト
羊膜を使用するのが好ましい。ヒト羊膜は分娩後、医療
廃棄物として取扱われ、現在のところ全く用途がなく、
そのうえ、出産のたびごとに採取することができ、安価
に大量に原料を入手することが可能なためである。

【００１０】羊膜は組織学的には上皮層、基底膜層、結
合組織層の３層からなる。結合組織層は基底膜に近い部
分はコラーゲン繊維が主体で、緻密層と呼ぶことができ
る。基底膜層の厚さはナノメートル(nm)単位で示される
超薄層であり、緻密層はマイクロメートル（μｍ）単位
で示すことができる厚さである。

【００１１】ヒト羊膜から上皮層を除去した後に残る基
底膜層の厚みは50〜80nmであり、緻密層の厚みは 8,000
〜10,000nmであって、基底膜層は非常に薄い膜層であ
る。このように、緻密層と基底膜層では両者の厚みに極
端な差があるため、以下、本発明では緻密層と基底膜層
を含めて緻密層と云う。

【００１２】本発明で使用する緻密層の膜状物は、一例
として次のような手法で得ることができる。生体結合組
織膜は緻密層よりなる膜層の両面に上皮層と繊維芽細胞
層等の細胞質層が存在している。これらの細胞膜は、細
菌の細胞膜と同様に実質的にタンパク質である。採取さ
れた生体結合膜は、生理食塩水中で除血、脱血された
後、 0.1％の塩化ベンザルコニウム液中で24時間以上放
置して細胞層の電位的変性を生じさせる。

【００１３】次いで、pH値が中性付近の電位環境下、最
もタンパク分解能を発揮するプロテアーゼなどの酵素を
用い、pH７の条件で処理することにより、タンパク質層
が分解される。当然のことであるが、かかるタンパク質
の分解は、適当な条件で制御しなければ、コラーゲンか
らなる緻密層の形態をも破壊するので、適当な温度と時
間を制御条件として、緻密層の形態学的条件等の保全、
残存を図らなければならない。次の工程として、超音波
洗浄を施す。超音波洗浄により、緻密層に付着する上皮
層、繊維芽細胞層などの分解物が除去され、緻密層から
なる膜状の材料を得ることができる。

【００１４】このようにして得られた膜状物は、このま
までも使用可能であるが、コラーゲンまたはゼラチンを
含浸させ、それらのタンパク分子間に架橋反応を生起さ
せて膜材に強度を付与することが好ましい。この処理に
より、膜材の強度が向上することによって、その後の操
作が容易になる。

【００１５】一般に、架橋反応は、コラーゲンまたはゼ
ラチンを含浸させた膜材を紫外線照射、電子線照射、放
射線照射などの物理的エネルギーを負荷することにより
生起させることができるが、そのためには特別の照射装
置が必要となる。また、化学的架橋はホルムアルデヒ
ド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類の使用が不可
欠であるため、薬品の取り扱いが面倒である。本発明者
等はコラーゲンまたはゼラチンを含浸させた膜状物を 1
00〜140 ℃、好ましくは 120℃近辺に加熱することによ
り架橋反応を生起させることができることを見い出し
た。また、膜状物単独で多層積層したものを 100〜140
℃、好ましくは 120℃近辺で加熱することにより層間を
接合、硬化させることができることを見い出した。後者
の場合、緻密層の膜材以外のいかなる材料をも使わない
ため、簡単な加熱装置だけで本発明を達成することがで
きるという優位点がある。

【００１６】本発明で使用する緻密層の膜材は、それ自
体コラーゲンであるが、このコラーゲン分子内のアミノ
基の全量に架橋反応を施した場合でも、十分な強度が得
られないが、積層枚数を増やすか、または別途コラーゲ
ンまたはゼラチンを含浸、付与させて架橋反応量を高め
必要強度を得るようにできる。

【００１７】本発明で膜材に付与するコラーゲンとは、
動物由来の抽出精製したコラーゲンであって、そのテロ
ペプタイドを除去したコラーゲンを云い、かつ、好まし
くはヒト由来の抽出精製したコラーゲンであって、さら
に好ましくは、ヒト胎児膜由来のコラーゲンである。

【００１８】本発明で膜材に付与するゼラチンとは、日
本薬局方に示す注射用精製ゼラチンであって、とくに好
ましくはヒト由来コラーゲンから製造する局方・注射用
精製ゼラチンと同等の品質のゼラチンである。

【００１９】緻密層膜材にコラーゲンまたはゼラチンを
含浸させて、その後、緻密層膜のコラーゲン分子間を架
橋すると同時に、含浸したコラーゲンまたはゼラチンの
タンパク分子間を架橋することにより、膜材のタンパク
分子間の架橋密度を極度に向上して、膜材の物理的強度
を著しく強化させることができる。その結果、緻密層の
みを架橋した膜材に比較して格段にその物理的強度が向
上していることがわかった。

【００２０】以上のようにして得られた緻密層からなる
膜材を成形体にするには、膜状物を細断し、撚りを加え
るなどの操作で糸状物または紐状物とすることができ、
さらにこれを使用して支持棒の回りに巻きつけるか、ま
た円形に編み立て、表面にコラーゲンまたはゼラチンを
塗布して固めるかしてホース状またはチューブ状の成形
体の医用材料を得ることができる。ホース状またはチュ
ーブ状の成形体の医用材料は本発明の人工神経鞘として
使用することができる。

【００２１】本発明で使用している膜材から中空糸また
は中空糸束を製造する方法の一例を示す。緻密層の膜材
を表面不活性の芯材繊維に巻きつけてから、表面にコラ
ーゲンまたはゼラチンを含浸させ、加熱して膜材の強度
を向上させた後、芯材繊維を引き抜くことによって中空
糸を得る。

【００２２】芯材繊維は加工後、膜材から引き抜くた
め、膜材と親和性に乏しいものが好ましく、例えばテフ
ロン（登録商標）繊維を使用するのが好ましい。また天
然繊維は親水性であるためそのままでは不適であるが、
繊維表面を撥水加工などの処理で疎水性になっていれば
使用できる。繊維径はその直径が賦形される中空糸の内
径となるため適度な径の繊維が選ばれる。本発明の実施
態様としては、外径２mmのテフロンロッドを使用した
が、これに限定されることはない。

【００２３】また、芯材繊維を複数本並べ、芯材繊維の
１本ごとにジグザグになるよう膜材を縫うように通し、
余った膜材を芯材繊維列の片側に折り曲げて重ね合わせ
る。この際、芯材繊維は上下から張力をかけておくと操
作がやりやすい。膜材と一体となった芯材繊維を余った
膜材を重ね合わせた面を上にして、ガラス板のような平
面上に置き、水を噴霧して形をなじませ、風乾させる。
この上からコラーゲン水溶液またはゼラチン水溶液を塗
布し、十分になじませた後、 120℃で24時間、熱処理し
てコラーゲンまたはゼラチンを硬化させた。芯材繊維を
引き抜くと中空部が複数並んだスダレ状の中空糸が得ら
れる。

【００２４】以下、実施例により本発明をさらに詳細に
説明する。

【００２５】

【実施例１】［膜材の調製］ヒト由来の羊膜を室温で生
理食塩水を用いて繰り返し洗浄した。目視観察において
除血、脱血が確認できるまで手動で洗浄した。次いで、
局方精製水の流水中で、周波数 40KHz、室温で12時間超
音波洗浄を行った。除血、脱血後の羊膜を 0.1％局方塩
化ベンザルコニウム水溶液中に浸漬し、室温で24時間静
置した。次いで、0.05％アジ化ナトリウムを加えた0.01
％フィシンの 0.2Ｍリン酸緩衝液中に浸漬し、室温で24
時間静置した。これらの操作により、羊膜の上皮層、繊
維芽細胞層を溶解除去した。得られた膜物を取り出し、
局方精製水を流しながら、室温、周波数 40KHzで揺動し
つつ超音波洗浄を行い、実質的に無細胞の緻密層からな
る膜材を得た。得られた膜材を無菌の減圧乾燥機中、35
℃、12時間乾燥させて、目的とする膜材を得た。

【００２６】

【実施例２】(1) 中空糸の調製 外径２mmのテフロン製ロッドに実施例１で得られた膜材
を湿潤状態で７〜８層巻きつけた。 120℃で熱風乾燥
後、２％のゼラチン水溶液を塗布し、 120℃、24時間加
熱して架橋、硬化させた後、テフロン製ロッドを引き抜
き、内径２mm、長さ90mmのチューブを得た。このチュー
ブを長さ１cm程度に切り、移植片とした。

【００２７】(2) 移植 ラットの坐骨神経から１cm弱の長さを切り取り、両断端
を９ー０の縫合糸を用いて上記移植片の両端に縫合した
（図１）。その後、チューブの内の空気を除いた。移植
後１週間から４週間の期間を観察した。

【００２８】(3) 観察 ラットはグルタルアルデヒドとパラホルムアルデヒドと
の混合液で固定した。移植片とともに坐骨神経を取り出
し、常法通りオスミウム酸で後固定し、エタノールで脱
水後エポキシ樹脂に包埋した。移植片の中間部と、移植
片から５mmレベルの遠位宿主神経との２点から標本を採
り、横断または縦断切片を作り、トルイジンブルー染色
によって組織学的に神経の再生状態を評価した。また、
必要な場合は電子顕微鏡で調べた。

【００２９】２週間以降から再生軸索の伸長がはっきり
と分かった。まず、ほとんどが無髄神経で、一部有髄神
経が見られた。３週間からは多くの有髄神経が現れ、４
週間では有髄神経がチューブの内腔を埋めていた（図２
ａ，２ｂ）。この時期は宿主側にも再生軸索が多く見ら
れ、良好な再生であることが明らかであった（図２ｃ，
２ｄ）。

【００３０】

【実施例３】(1) 中空糸の調製 外径２mmのテフロン製ロッドに実施例１で得られた膜材
を湿潤状態で10〜11層巻きつけた。 120℃で熱風乾燥
後、２％のゼラチン水溶液を塗布し、 120℃、24時間加
熱して架橋、硬化させた後、テフロン製ロッドを引き抜
き、内径２mm、長さ90mmのチューブを得た。このチュー
ブを長さ１cm程度に切り、移植片とした。

【００３１】(2) 移植と観察 実施例２と同様の操作を行った。移植片の厚みが実施例
２で使用したチューブと異なっていたが、ほぼ実施例２
と同様の結果であった（図３ａ，３ｂ）。厚みが４〜５
層の相違では大きな影響はないといえる。

【００３２】

【実施例４】(1) 中空糸束の調製 外径１mmのテフロン製ロッドに実施例１で得られた湿潤
状態の膜材を４〜５層巻きつけたものを５本束にした上
から、さらに膜材を４〜５層巻きつけ、 120℃で熱風乾
燥後、２％のゼラチン水溶液を塗布し、 120℃、24時間
加熱処理して架橋した後、テフロン製ロッドを引き抜
き、内径１mm、長さ90mmの中空糸５本束のチューブを得
た。このチューブを長さ１cm程度に切り、移植片とし
た。 (2) 移植と観察 実施例２と同様に操作した。再生は比較的良好であっ
た。１mmの内径の細い管にそれぞれ神経が再生している
ことが観察された（図４ａ，４ｂ，４ｃ）。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、事故等により切断した
末梢神経を良好に再生することができるため、障害が残
り、日常生活に支障を生じている人達に対して多大な貢
献をするものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】膜材から得られたチューブの移植の模式図であ
る。

【図２】実施例２の移植３週間後の顕微鏡写真である。 図２ａ …… 移植片中間部の写真（９０倍） 図２ｂ …… ２ａの拡大写真（３６０倍） 図２ｃ …… 遠位宿主神経の写真（９０倍） 図２ｄ …… ２ｃの拡大写真（３６０倍）

【図３】実施例３の移植３週間後の顕微鏡写真である。 図３ａ …… 移植片中間部の写真（９０倍） 図３ｂ …… ３ａの拡大写真（３６０倍）

【図４】実施例４の移植３週間後の顕微鏡写真である。 図４ａ …… 移植片中間部の写真（３６倍） 図４ｂ …… ４ａの一部の神経束の拡大写真（１８０
倍） 図４ｃ …… ４ｂの拡大写真（３６０倍）

フロントページの続き (72)発明者 中川 徳三 神奈川県鎌倉市西鎌倉２丁目20番10号 Ｆターム(参考） 4C081 AB12 BA12 BC01 CC04 CD122 CD152 CD34 DA03 DC14 4C097 AA14 BB01 CC01 DD15 EE18 EE19 FF17

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 上皮層、基底膜層、緻密層、繊維芽細胞
   層にて構成される生体結合組織膜から、上皮層および繊
   維芽細胞層等の細胞質層を溶解、除去することにより得
   られる無細胞質である緻密層または緻密層および基底膜
   層であって、その特徴とするマトリックス構造を保全し
   た医用材料の膜材またはその膜材を使用して得られる成
   形体から構成される中空糸または中空糸束を生体内に移
   植し、人工神経鞘として用いることを特徴とする末梢神
   経再生方法。
2. 【請求項２】 人工神経鞘の材料となる膜材または膜材
   の成形体がヒト由来の胎児膜から得られることを特徴と
   する請求項１記載の末梢神経再生方法。
3. 【請求項３】 人工神経鞘の材料となる膜材または膜材
   の成形体を加熱処理によりタンパク分子間に架橋反応を
   施してあるか、または、膜材または膜材の成形体がコラ
   ーゲンまたはゼラチンを含浸させた膜材または膜材の成
   形体であって、加熱処理によりそれらのタンパク分子間
   に架橋反応を施してあることを特徴とする請求項１記載
   の末梢神経再生方法。