KR101508772B1

KR101508772B1 - 전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체, 및 그들의 제조법

Info

Publication number: KR101508772B1
Application number: KR1020057014139A
Authority: KR
Inventors: 마사유키 야마토; 데루오 오카노
Original assignee: 가부시키가이샤 셀시드
Priority date: 2003-02-06
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2015-04-14
Also published as: EP1598417A4; ES2475290T3; CN1742081A; EP2267115B1; US8642338B2; KR101203434B1; EP2230298A1; WO2004070023A1; KR20050116127A; EP2267115A1; KR20110034050A; AU2003207288A1; CN100436577C; US20060240552A1; EP1598417A1; EP2267115B8

Abstract

세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지된 상태로 회수되는 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제공하는 것. 물에 대한 상한 또는 하한 임계 용해 온도가 0∼80℃ 인 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 세포를 배양하고, 필요에 따라 배양 세포층을 중층화시키고, 그 후

(1) 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고, 필요에 따라,

(2) 배양한 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 고분자막에 밀착시키고,

(3) 그대로 고분자막과 함께 박리함으로써 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제조한다.

데스모솜 구조, 전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체

Description

전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체, 및 그들의 제조법{ANTERIOR OCULAR -ASSOCIATED CELL SHEET, THREE-DIMENSIONAL CONSTRUCT AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은, 생물학, 의학 등의 분야에서의 전안부 관련 세포 시트, 3 차원 구조체, 및 그들의 제조법 및 그들을 이용한 치료법에 관한 것이다.

의료 기술의 현저한 발전에 의해, 최근, 치료 곤란해진 장기를 남의 장기와 바꾸려고 하는 장기 이식이 일반화되어 왔다. 대상이 되는 장기도 피부, 각막, 신장, 간장, 심장 등으로 실로 다양하고, 또한, 수술 후의 경과도 현격히 좋아지고, 의료의 1 기술로서 이미 확립되어 있다. 일례로서 각막 이식을 들면, 약 40 년 전에 일본에도 아이뱅크가 설립되어 이식 활동이 시작되었다. 그러나, 아직도 기증자수가 적고, 일본에서만도 각막 이식이 필요한 환자가 연간 약 2 만명이 나오고 있는데 반하여, 실제로 이식 치료를 실시할 수 있는 환자는 약 1/10 인 2000 명 정도일 뿐이라고 전해지고 있다. 각막 이식이라는 거의 확립된 기술이 있음에도 불구하고, 기증자 부족이라는 문제 때문에, 더욱더 의료 기술이 요구되고 있는 것이 현상이다.

이러한 배경 아래, 이전부터, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려고 하는 기술이 주목되고 있다. 그 대표적인 예로서, 인공 피부 및 배양 피부를 들 수 있을 것이다. 여기서, 합성 고분자를 사용한 인공 피부는 거절 반응 등이 생길 가능성이 있고, 이식용 피부로서는 바람직하지 않다. 한편, 배양 피부는 본인의 정상인 피부의 일부를 원하는 크기까지 배양한 것이기 때문에, 이것을 사용하더라도 거절 반응 등의 걱정이 없고, 가장 자연스러운 마스킹제라고 할 수 있다.

종래, 그와 같은 세포 배양은, 유리 표면상 또는 여러 가지의 처리를 실시한 합성 고분자의 표면 상에서 실시되고 있다. 예를 들어, 폴리스티렌을 재료로 하는 표면 처리, 예를 들어 γ선 조사, 실리콘 코팅 등을 실시한 여러 가지의 용기 등이 세포 배양용 용기로서 보급되고 있다. 이러한 세포 배양용 용기를 사용하여 배양ㆍ증식한 세포는, 트립신과 같은 단백 분해 효소나 화학 약품에 의해 처리함으로써 용기 표면에서 박리ㆍ회수된다.

그러나, 전술한 바와 같은 화학 약품 처리를 실시하여 증식한 세포를 회수하는 경우, 처리 공정이 번잡해지고, 불순물 혼입의 가능성이 많아지는 것, 및 증식한 세포가 화학적 처리에 의해 변성 또는 손상되어 세포 원래의 기능이 손상되는 예가 있는 것 등의 결점이 지적되고 있다. 이러한 결점을 극복하기 위해서, 지금까지 몇개의 기술이 제안되어 있다.

일본 특허공보 평2-23191호에는, 인간 신생아 유래 각화 표피 세포를, 케라틴 조직의 막이 용기의 표면 상에 형성되는 조건 하에, 배양 용기 중에서 배양하고, 케라틴 조직의 막을, 효소를 사용하여 박리시키는 것을 특징으로 하는 케라틴 조직의 이식 가능한 막을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 구체적으로는, 3T3 세포를 피더레이어로서 증식, 중층화시켜, 단백질 분해 효소인 디스파아제를 사용하여 세포 시트를 회수하는 기술이 개시되어 있다. 그러나, 해당 공보에 기재되어 있는 방법은 다음과 같은 결점을 갖고 있었다.

(1) 디스파아제는 균 유래의 것으로, 회수된 세포 시트를 충분히 세정할 필요성이 있음.

(2) 배양된 세포마다 디스파아제 처리의 조건이 다르고, 그 처리에 숙련이 필요함.

(3) 디스파아제 처리에 의해 배양된 표피 세포가 병리학적으로 활성화됨.

(4) 디스파아제 처리에 의해 세포외 매트릭스가 분해됨.

(5) 그로 인해 그 세포 시트가 이식된 환부는 감염되기 쉬움.

그러나, 본 발명의 대상으로 하는 각막 상피 세포, 각막 내피 세포, 및 결막 상피 세포 등의 전안부 관련 세포는, 피부 세포만큼 세포ㆍ세포 사이의 결합이 강하지 않고, 상기 디스파아제를 갖더라도, 배양 후 1 장의 시트로서 박리, 회수할 수는 없었다.

이러한 과제를 해결하기 위해서, 최근 스폰지층과 상피층을 제거한 양막(羊膜) 상에서, 각막 상피 세포나 결막 상피 세포를 배양, 조직화시켜 그 양막마다 이식용 세포 조각으로 하는 기술이 고안되었다 (일본 공개특허공보 2001-161353호). 양막이 충분한 막강도를 가지고 있는 것, 또한 항원성을 가지고 있지 않는 면에서, 이식용 세포 조각의 지지체로서 안성맞춤이지만, 양막이라는 것이 원래 안내에 없고, 보다 정밀하게 안내 조직을 구축해 가기 위해서는, 역시 안내의 세포만으로 충분한 강도를 가진 시트를 제작하는 것이 요구되고 있다.

본 발명은, 상기 기술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 의도하여 이루어진 것이다. 즉, 본 발명은 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지된 상태로 회수되는 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 디스파아제와 같은 효소로 처리하지 않고 환경 온도를 변화시킴으로써, 배양ㆍ증식시킨 세포를 용이하고, 또한 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태로 지지체 표면에서의 박리ㆍ회수가 가능해지는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 개시

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해서, 여러 가지 각도에서 검토를 더하여, 연구 개발을 실시하였다. 그 결과, 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 전안부 관련 세포를 배양하고, 필요에 따라 배양 세포층을 중층화시켜, 그 후, 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고, 배양한 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 고분자막에 밀착시켜, 그대로 고분자막과 함께 박리시킴으로써, 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체가 얻어지는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 지견에 기초하여 완성된 것이다.

즉, 본 발명은 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지된 상태로 회수되는 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은 물에 대한 상한 또는 하한 임계 용해 온도가 0∼80℃ 인 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 세포를 배양하고, 필요에 따라 통상적인 방법에 의해 배양 세포층을 중층화시켜, 그 후

(1) 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고,

(2) 배양한 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 고분자막에 밀착시키고, 및

(3) 그대로 고분자막과 함께 박리하는

것을 특징으로 하는 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기 제조법에서 얻어진 고분자막에 밀착된 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 다시 세포 배양 지지체, 온도 응답성 폴리머로 표면을 피복한 세포 배양 지지체, 고분자막, 또는 다른 세포 시트 등에 부착시키고, 그 후, 밀착된 고분자막을 벗기는 조작을 반복함으로써 중층화시키는 것을 특징으로 하는 3 차원 구조체의 제조법을 제공한다.

또, 본 발명은, 심부까지 결손 및/또는 손상된 조직을 치료하기 위한 상기 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제공한다.

또한, 본 발명은, 심부까지 결손 및/또는 손상된 조직에 대하여, 상기 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 이식하는 것을 특징으로 하는 치료법을 제공한다.

또, 본 발명은 의료 분야 뿐만 아니라, 화학 물질, 독물, 또는 의약품의 안전성 평가용 세포로서 유용한 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 제공한다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제작에 사용되는 바람직한 세포로서 각막 상피 세포, 각막 내피 세포, 결막 상피 세포 등, 및 상피 줄기 세포를 들 수 있지만, 그 종류는 조금도 제약되는 것이 아니다. 본 발명에 있어서, 전안부 관련 세포 시트란, 상기한 바와 같이 생체에서의 전안부를 형성하는 각종 세포가 배양 지지체 상에서 단층 형상으로 배양되고, 그 후, 지지체에 의해 박리된 시트를 의미하고, 그 3 차원 구조체란, 그 각종 표피 배양 세포 시트가 단독 또는 조합된 상태로 중층화된 시트를 의미한다.

본 발명에서의 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는 배양시에 디스파아제, 트립신 등으로 대표되는 단백질 분해 효소에 창상을 받지 않는 것이다. 그로 인해, 기재로부터 박리된 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조가 유지되고, 구조적 결함이 적으며, 또한 강도가 높은 것이다. 이것은, 예를 들어, 얻어진 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 이식 등을 목적으로 이용한 경우, 본 발명의 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는 충분히 강도를 가지고 있는 것이기 때문에, 환부는 외부와 완전히 격리된다. 또한, 본 발명의 시트는 배양시에 형성되는 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질도 효소에 의한 파괴를 받고 있지 않다. 이것은, 이식시에 있어서 환부 조직과 양호하게 접착할 수 있고, 효율적인 치료를 실시할 수 있게 된다. 이상의 내용을 구체적으로 설명하면, 트립신 등의 통상의 단백질 분해 효소를 사용한 경우, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질 등은 거의 유지되어 있지 않고, 따라서, 세포는 개별적으로 분리된 상태가 되어 박리된다. 그 중에서, 단백질 분해 효소인 디스파아제에 대해서는, 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질 등을 거의 파괴하지만, 데스모솜 구조에 대해서는 10∼60% 유지한 상태로 박리시킬 수 있는 것으로 알려져 있지만, 얻어지는 세포 시트는 강도가 약한 것이다. 이에 대하여, 본 발명의 세포 시트는 데스모솜 구조, 기저막 모양 단백질 모두 80% 이상 잔존된 상태의 것으로, 전술한 바와 같은 여러 가지의 효과를 얻을 수 있는 것이다.

본 발명에서의 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는, 이상에 나타내는 바와 같이, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조 및, 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질 쌍방을 구비하고, 게다가 강도가 높은 시트이며, 종래 기술에서는 전혀 얻어지지 않은 것이다.

세포 배양 지지체에 있어서 기재의 피복에 사용되는 온도 응답성 폴리머는, 수용액 중에서 상한 임계 용해 온도 또는 하한 임계 용해 온도 0℃∼80℃, 보다 바람직하게는 20℃∼50℃ 를 갖는다. 상한 임계 용해 온도 또는 하한 임계 용해 온도가 80℃ 를 초과하면 세포가 사멸할 가능성이 있기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 상한 임계 용해 온도 또는 하한 임계 용해 온도가 0℃ 보다 낮으면 일반적으로 세포 증식 속도가 극도로 저하하거나, 또는 세포가 사멸하기 때문에, 역시 바람직하지 않다.

본 발명에 사용하는 온도 응답성 폴리머는 호모폴리머, 코폴리머 중 어느 것이라도 된다. 이러한 폴리머로서는, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 폴리머를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 이하의 모노머의 단독 중합 또는 공중합에 의해서 얻어진다. 사용할 수 있는 모노머로서는, 예를 들어, (메트)아크릴아미드화합물, N-(혹은 N,N-디)알킬치환(메트)아크릴아미드 유도체, 또는 비닐에테르 유도체를 들 수 있고, 코폴리머의 경우에는, 이것들 중에서 임의의 2종 이상을 사용할 수 있다. 또한, 상기 모노머 이외의 모노머류와의 공중합, 폴리머 끼리의 그래프트 또는 공중합, 또는 폴리머, 코폴리머의 혼합물을 사용해도 된다. 또한, 폴리머 원래의 성질을 손상시키지 않는 범위에서 가교하는 것도 가능하다.

피복을 실시할 수 있는 기재로서는, 통상 세포 배양에 사용되는 유리, 개질 유리, 폴리스티렌, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 화합물을 비롯하여, 일반적으로 형태 부여가 가능한 물질, 예를 들어, 상기 이외의 고분자 화합물, 세라믹스류 등 전부 사용할 수 있다.

온도 응답성 폴리머의 지지체로의 피복 방법은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-211865호에 기재되어 있는 방법에 따르면 된다. 즉, 이러한 피복은, 기재와 상기 모노머 또는 폴리머를, 전자선 조사 (EB), γ선 조사, 자외선 조사, 플라즈마 처리, 코로나 처리, 유기 중합 반응 중 어느 하나에 의해, 또는 도포, 혼련 등의 물리적 흡착 등에 의해 실시할 수 있다.

본 발명에서 나타나는 지지체 재료란, 온도 응답성 폴리머가 피복된 A 영역과,

(1) 세포와 친화성이 낮은 고분자가 피복되어 있는 영역,

(2) A 영역과 다른 양의 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있는 영역,

(3) A 영역과 다른 온도에 응답하는 고분자가 피복되어 있는 영역

모두, 또는 (1)∼(3) 중 임의의 2 개 또는 3 개의 조합으로 이루어지는 B 영역의 2 영역을 표면에 가지는 것을 특징으로 하는 것이다.

그 제조법으로서는, 최종적으로 상기의 구조를 갖는 것이면 조금도 제약되는 것이 아니지만, 예를 들어, ① 기재 표면상 전체에 우선 B 영역을 제작하고, 그 후, 최종적으로 B 영역이 되는 부분을 마스크하여 A 영역을 상승시키는 방법, 또는 그 A, B 를 반대로 한 방법, ② 미리 A, B 의 2 층을 피복해 두고, 초음파 또는 주사형 기기에 의해 어느 층을 깎는 방법, ③ 피복 물질을 오프셋 인쇄하는 방법 등을 단독 또는 병용하는 방법을 들 수 있다.

피복 영역의 형태는, 상부에서 관찰하여 예를 들어, ① 라인과 스페이스로 이루어지는 패턴, ② 물방울 모양의 패턴, ③ 격자 형상의 패턴, 기타 특수한 형태의 패턴, 혹은 이들이 혼합되어 있는 상태의 패턴을 들 수 있고, 조금도 한정되는 것이 아니지만, 안내의 각 조직의 상태를 고려하여, ② 의 원형상의 패턴의 것이 바람직하다.

피복 영역의 크기는 조금도 한정되는 것이 아니지만, 안내의 각 조직의 크기, 및 배양한 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 박리하였을 때, 수축하는 것을 고려하고, 원형상의 패턴으로 그 원내에 있는 세포를 사용하는 경우, 그 원의 직경은 5㎝ 이하, 3㎝ 이하가 바람직하고, 2㎝ 이하가 더욱 바람직하다. 원의 외측을 사용하는 경우에는, 그 원의 직경은 1㎜ 이하, 3㎜ 이하가 바람직하고, 5㎜ 이하가 더욱 바람직하다.

온도 응답성 폴리머의 피복량은, 0.3∼6.0㎍/㎠ 의 범위이면 되고, 0.5∼3.5㎍/㎠ 이 바람직하고, 0.8∼3.0㎍/㎠ 이 더욱 바람직하다. 0.2㎍/㎠ 보다 적은 피복량일 때, 자극을 주더라도 해당 고분자 상의 세포는 박리하기 어렵고, 작업 효율이 현저히 나빠져서 바람직하지 않다. 반대로 6.0㎍/㎠ 이상이면, 그 영역에 세포가 부착하기 어렵고, 세포를 충분히 부착시키는 것이 곤란해진다.

본 발명에서의 세포와 친화성이 낮은 고분자란, 세포가 부착하지 않은 것이면 조금도 제약되는 것이 아니지만, 예를 들어, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스 등의 친수성 고분자, 또는 실리콘 고분자, 불소 고분자 등의 강소수성 고분자 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 세포의 배양은 전술한 바와 같이 하여 제조된 세포 배양 지지체상 (예를 들어, 세포 배양 접시) 로 실시된다. 배지 온도는, 기재 표면에 피복된 상기 폴리머가 상한 임계 용해 온도를 갖는 경우에는 그 온도 이하, 또한 상기 폴리머가 하한 임계 용해 온도를 갖는 경우에는 그 온도 이상이면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 배양 세포가 증식하지 않은 저온역, 또는 배양 세포가 사멸하는 고온역에서의 배양이 부적절한 것은 물론이다. 온도 이외의 배양 조건은, 통상적인 방법에 따르면 되고, 특별히 제한되는 것이 아니다. 예를 들어, 사용하는 배지에 대해서는, 공지된 소 태아 혈청 (FCS) 등의 혈청이 첨가되어 있는 배지이어도 되고, 또한, 이러한 혈청이 첨가되어 있지 않은 무혈청 배지이어도 된다.

본 발명의 방법에 있어서는, 상기 방법에 따라서, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 사용 목적에 맞추어 배양 시간을 설정하면 된다. 배양한 세포를 지지체 재료로부터 박리 회수하기 위해서는, 배양된 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 고분자막에 밀착시켜, 세포의 부착된 지지체 재료의 온도를 지지체 기재의 피복 폴리머의 상한 임계 용해 온도 이하로 함으로써, 그대로 고분자막과 함께 박리할 수 있다. 또, 시트를 박리하는 것은 세포를 배양하고 있는 배양액에 있어서 실시하는 것도, 그 외의 등장액에 있어서 실시하는 것도 가능하고, 목적에 맞추어 선택할 수 있다. 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 밀착시킬 때에 사용하는 고분자막으로서는, 예를 들어, 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF), 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 셀룰로오스 및 그 유도체, 키틴, 키토산, 콜라겐, 우레탄 등을 들 수 있다.

본 발명에서의 3 차원 구조체의 제조법은 특별히 한정되는 것이 아니지만, 예를 들어, 일반적으로 알려져 있는 3T3 세포를 피더레이어로서 증식, 중층화시키는 방법, 혹은 상기의 고분자막에 밀착된 표피 배양 세포 시트를 이용함으로써 제조하는 방법 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 방법이 예시된다.

(1) 고분자막과 밀착된 세포 시트를 세포 배양 지지체에 부착시켜, 그 후 배지를 가함으로써 고분자막을 세포 시트로부터 벗기고, 그리고 추가로 별도의 고분자막과 밀착된 세포 시트를 부착시키는 것을 반복함으로써 세포 시트를 중층화시키는 방법.

(2) 고분자막과 밀착된 세포 시트를 반전시켜 세포 배양 지지체 상에서 고분자막측으로 고정시키고, 세포 시트 측에 별도의 세포 시트를 부착시키고, 그 후 배지를 첨가함으로써 고분자막을 세포 시트로부터 벗기고, 다시 별도의 세포 시트를 부착시키는 조작을 반복함으로써 세포 시트를 중층화시키는 방법.

(3) 고분자막과 밀착된 세포 시트끼리를 세포 시트측에서 밀착시키는 방법.

(4) 고분자막과 밀착된 세포 시트를 생체의 환부에 대고, 세포 시트를 생체 조직에 부착시킨 후, 고분자막을 벗기고, 다시 별도의 세포 시트를 포개는 방법.

본 발명에서의 3 차원 구조체는, 반드시 각막 상피 세포만으로 이루어지는 것이 아니어도 된다. 예를 들어, 각막 상피 세포로 이루어지는 세포 시트 또는 3 차원 구조체에, 동일하게 조작하여 제작한 각막 내피 세포 시트 및/또는 결막 상피 세포 시트를 포개는 것도 가능하다. 생체 내의 전안부 조직에 의해 가까운 것으로 함으로써 이러한 기술은 매우 유효하다.

전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 고수율로 박리, 회수하는 목적으로, 세포 배양 지지체를 가볍게 때리거나, 흔드는 방법, 더욱이는 피펫을 사용하여 배지를 교반하는 방법 등을 단독, 또는 병용하여 사용해도 된다. 또한, 필요에 따라서 배양 세포는 등장액 등으로 세정하여 박리 회수해도 된다.

상술한 방법에 의해 얻어진 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는, 종래 방법에 의해 얻어진 것에 비하여, 박리성의 점에서도 비침습성의 점에서도 매우 우수하고, 이식용 각막 등의 임상 응용이 매우 기대된다. 특히, 본 발명의 전안부 관련 세포의 3 차원 구조체는 종래의 이식 시트와는 달리, 기저막 모양 단백질을 유지하고 있기 때문에, 이식시에 환부 조직을 깊게 깎더라도 생착된다. 이것은, 환부의 치료 효율의 향상, 더욱이는 환자 부담의 경감도 도모되어 매우 유효한 기술이라고 생각된다. 또, 본 발명의 방법에 있어서 사용되는 세포 배양 지지체는 반복 사용이 가능하다.

이하에, 본 발명을 실시예에 따라서 더욱 자세히 설명하지만, 이들은 본 발명을 조금도 한정하는 것이 아니다.

실시예 1, 2

시판된 폴리스티렌제 세포 배양 접시 (벡톤ㆍ디킨슨ㆍ랩웨어 (Becton Dickinson Labware)사 제조 팔콘(FALCON) 3001 페트리디슈 (직경 3.5㎝) 상에, N-이소프로필아크릴아미드모노머를 40% (실시예 1), 50% (실시예 2) 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.10㎖ 도포하였다. 그 도포면 상에 직경 2㎝ 의 구멍을 1 개 가지는 직경 3.5㎝ 의 금속제 마스크를 얹고, 그대로의 상태로 0.25MGy 강도의 전자선을 조사하고, 배양 접시 표면에 N-이소프로필아크릴아미드폴리머 (PIPAAm) 를 원형상 (섬 형상의 부분. 마스크 아래의 부분은 전자선이 맞닿지 않고 조금도 피복되지 않은 해(海) 부분이 된다.) 에 고정화하였다. 다음으로, 그 금속제 마스크를 떼고, 20% 가 되도록 이소프로필알코올에 용해시킨 것을 0.10㎖ 도포하였다. 그리고, 이번에는 그 원형 부분에만 직경 2㎝ 의 원형의 금속제 마스크를 두고, 그대로의 상태로 0.25MGy 강도의 전자선을 조사함으로써, 원형 PIPAAm 층의 외측에 아크릴아미드폴리머를 고정화하였다. 조사 후, 금속제 마스크를 떼고, 이온 교환수에 의해 배양 접시를 세정하고, 잔존 모노머 및 배양 접시에 결합하지 않은 PIPAAm 를 제거하고, 클린 벤치 내에서 건조하여, 에틸렌옥사이드 가스로 멸균시킴으로써 세포 배양 지지체 재료를 얻었다. 여기서 섬 부분의 PIPAAm 의 피복량은, 마스크를 사용하지 않고 상기와 거의 동일 조건으로 제작한 세포 배양 지지체 재료로부터 구하였다. 그 결과, 이 이 조건 아래라면, 기재 표면에 온도 응답성 폴리머가 1.6㎍/㎠ (실시예 1), 2.2㎍/㎠ (실시예 2) 피복되는 것을 알았다. 얻어진 세포 배양 지지체 재료 상에서, 통상적인 방법에 의해 정상 토끼 각막 상피 세포를 배양하였다 (사용 배지: 콜네팩(쿠라보(주) 제조. 37℃, 5% CO₂하). 그 결과, 어느 세포 배양 지지체 재료 상의 각막 상피 세포에 있어서도 중심부의 원형 부분에만 정상으로 부착되어, 증식하였다. 배양 14일 후, 배양한 세포 위에 직경 2㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막을 덮고, 배지를 천천히 흡인하고, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각시킴으로써, 어느 세포 배양 지지체 재료 상의 세포도 그 덮은 막과 함께 박리되었다. 덮은 막은 어느 세포 시트로부터도 용이하게 벗길 수 있었다. 또한, 박리된 세포 시트는 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되고, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

또, 상기 각 실시예에 있어서, 「저온 처리」는 20℃ 에서 30 분 인큐베이트라는 조건 하에서 실시되었지만, 본 발명에 있어서「저온 처리」는 이들의 온도 및 시간에 한정되지 않는다. 본 발명에서의「저온 처리」로서 바람직한 온도 조건은 0℃∼30℃ 이고, 바람직한 처리 시간은 2 분∼1 시간이다.

실시예 3

실시예 1 의 세포 배양 지지체 상에서, 배지를 마이트마이신 C 를 함유하는 통상의 그린 등의 배지 (DMEM+AB (피더레이어 제작용), 인간 신생아 유래 각화 표피 세포용). 로 변경하는 것 이외에는 동일한 방법으로 정상 토끼 각막 상피 세포를 배양시켰다. 그 결과, 배양 지지체 재료 상의 각막 상피 세포는 중심부의 원형 부분에만 정상적으로 부착되어, 증식하고, 또 중층화하였다. 배양 16 일 후, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각시킴으로써 중층화 각막 상피 세포가 박리되었다. 박리된 중층화 각막 상피 세포 (3 차원 구조체) 는, 원형으로 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되고, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

비교예 1, 2

실시예 1 의 세포 배양 지지체를 제조할 때의 모노머 용액을 5% (비교예 1), 60% (비교예2) 로 하는 것 이외에는 실시예 1 과 동일하게 세포 배양 지지체 재료 를 제조하였다. 얻어진 세포 배양 지지체 상의 피복량은, 각각 0.1㎍/㎠ (비교예 1), 6.2㎍/㎠ (비교예 2) 이었다. 그 후, 실시예 1 과 동일한 조작으로 정상 토끼 각막 상피 세포를 배양, 박리를 시도하였다. 그 결과, 비교예 1 의 지지체 상의 세포는 저온 처리하더라도 박리하기 어렵고, 반대로 비교예 2 의 지지체 상에 세포가 부착되기 어렵고, 세포를 충분히 증식시키는 것이 곤란하고, 어느 세포 배양 지지체도 배양 기재로서 바람직한 것이 아니었다.

실시예 4

토끼 각막으로부터 각막 내피 세포를 통상적인 방법에 따라서 회수하였다. 실시예 1 의 폴리이소프로필아미드 (PIPAAm) 를 그래프트화 배양 접시 상에 2×10⁶ cells/㎠ 의 세포 밀도로 파종하고, 통상적인 방법에 따라서 배양하였다 (사용 배지: 10% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM, 37℃, 5% CO₂ 하). 그 결과, 이 각막 내피 세포에 있어서도 중심부의 원형 부분에만 정상으로 부착되어 증식하였다. 10 일 후, 각막 내피 세포가 콘플루엔트가 된 것을 확인한 후, 실시예 1 과 동일하게 배양한 세포의 위에 직경 2㎝ 의 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막을 덮고, 배지를 천천히 흡인하여, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각시킴으로써, 세포가 그 덮은 막과 함께 박리되었다. 덮은 막은 세포 시트로부터 용이하게 벗길 수 있었다. 또한, 박리된 세포 시트는, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되고, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 5

실시예 2 의 세포 배양 지지체 재료의 제조법에 있어서, 우선 직경 2㎝ 의 원형의 금속제 마스크를 배양 접시의 중심에 두고, PIPAAm 을 주위에 고정화하여, 다음으로 직경 2㎝ 용의 원형의 구멍을 뚫은 금속제 마스크를 덮음으로써 폴리아크릴아미드를 중심부에 고정화한 세포 배양 지지체 재료 (실시예 1 의 내측의 고분자층과 외측의 고분자층이 반대인 것이 된다.) 를 제조하였다. 구멍의 외측의 PIPAAm 의 피복량은 2.1㎍/㎠ 이었다. 다음으로, 토끼의 눈보다 결막 상피 세포를 통상적인 방법에 따라서 회수하였다. 상기의 그래프트화 배양 접시 상에 2×10⁵cells/㎠ 의 세포 밀도로 파종하고, 통상적인 방법에 따라서 배양하였다 (사용 배지: 10% 소 태아 혈청을 함유하는 MEM, 37℃, 5% CO₂ 하). 그 결과, 파종된 결막 상피 세포는 중심부의 주위에만 정상으로 부착되어 증식하였다. 10 일 후, 결막 상피 세포가 콘플루엔트가 된 것을 확인한 후, 실시예 1 과 동일하게 배양한 세포의 위에 폴리비닐리덴디플루오라이드 (PVDF) 막을 덮고, 배지를 천천히 흡인하여, 세포 배양 지지체 재료마다 20℃ 에서 30 분 인큐베이트하여 냉각시킴으로써, 세포는 그 덮은 막과 함께 박리되었다. 덮은 막은 세포 시트로부터 용이하게 벗길 수 있었다. 또한, 박리된 결막 상피 세포 시트는, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 6

냉각시키기 않고 천천히 배지를 제거한 실시예 2 의 배양 접시 상의 각막 상피 세포 시트에 대하여, 실시예 1 에서 박리된 각막 상피 세포 시트를 즉시 포개었다. 그 후, 실시예 3 에서 사용한 배지를 천천히 넣고, 밀착된 고분자막을 벗겼다. 이 상태로 2 일간 배양함으로써, 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 얻었다. 얻어진 각막 상피 세포의 중층화 시트는 실시예 3 과 동일하게 저온 처리를 실시함으로써 지지체 표면에서 박리하였다. 박리된 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 는, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 7

냉각시키지 않고 천천히 배지를 제거한 실시예 4 의 배양 접시 상의 각막 내피 세포 시트에 대하여, 실시예 3 에서 박리된 각막 상피 세포의 중층화 시트를 즉시 포개었다. 그 후, 실시예 3 에서 사용한 배지를 천천히 넣고, 밀착된 고분자막을 벗겼다. 이 상태로 2 일간 배양함으로써, 각막 내피 세포층을 갖는 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 얻었다. 얻어진 각막 상피 세포의 중층화 시트는 실시예 3 과 동일하게 저온 처리를 실시함으로써 지지체 표면에서 박리하였다. 박리된 3 차원 구조체는, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 8

냉각시키지 않고 천천히 배지를 제거한 실시예 4 의 배양 접시 상의 각막 내 피 세포 시트에 대하여, 우선 5% IV 형 콜라겐용 함유 배지 (콜라겐이 함유되는 것 이외에는 실시예 4 의 배지와 동일한 것.) 을 넣고, 그대로 20 분간 정치시켰다. 그 후, 다시 냉각시키지 않고 천천히 배지를 제거하였다. 배양 접시의 위에 남겨진 각막 내피 세포 시트에 대하여, 실시예 3 에서 박리된 각막 상피 세포의 중층화 시트를 즉시 포개었다. 그 후, 실시예 3 에서 사용한 배지를 천천히 넣고, 밀착된 고분자막을 벗겼다. 이 상태로 2 일간 배양함으로써, 각막 내피 세포층을 갖는 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 얻었다. 얻어진 각막 상피 세포의 중층화 시트는 실시예 3 과 동일하게 저온 처리를 실시함으로써 지지체 표면에서 박리하였다. 박리된 3 차원 구조체는, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 9

냉각시키지 않고 천천히 배지를 제거한 실시예 5 의 배양 접시 상의 구멍을 뚫은 결막 상피 세포 시트에 대하여, 실시예 7 에서 박리된 각막 내피 세포층을 갖는 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 즉시 일부 포개어 두었다. 그 후, 실시예 3 에서 사용한 배지를 천천히 넣고, 밀착된 고분자막을 벗겼다. 이 상태로 2 일간 배양함으로써, 결막 상피 세포 시트가 부착된 각막 내피 세포층을 갖는 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 얻었다. 얻어진 3 차원 구조체는 실시예 3 과 동일하게 저온 처리를 실시함으로써 지지체 표면에서 박리하였다. 박리된 3 차원 구조체는, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 것이었다.

실시예 10

실시예 3 에서 얻어진 각막 상피 세포의 중층화 시트 (3 차원 구조체) 를 각막 상피 세포부를 결손시킨 토끼에게 통상적인 방법에 따라서 이식하였다. 그 때, 각막 상피 세포의 중층화 시트를 직접, 창상부로 봉합하였다. 약 3 주간 후, 발사한 결과, 각막 상피 세포의 중층화 시트는 안구에 양호하게 생착되어 있었다.

이상의 결과로부터, 본 기술에 의하면, 원래, 안내에 있는 세포만으로 충분한 강도를 가진 시트의 제작이 가능한 것을 알았다. 이것은, 치료의 효율화에 의한 환자의 부담 경감, 또한, 한층 더 정밀한 조직의 구축화에 있어서 매우 유효한 기술이라고 생각된다.

본 발명의 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체는, 디스파아제 처리에서의 경우와 같이 E-카드헤린, 라미닌 5 를 분해하지 않고, 게다가 구조 결함이 매우 적기 때문에, 피부 이식 등의 임상 응용이 매우 기대된다. 따라서, 본 발명은 세포 공학, 의용 공학 등의 의학, 생물학 등의 분야에서의 매우 유용한 발명이다.

Claims

세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태에서 회수되는 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포만으로 구성되는 전안부 관련 세포 시트로서,

상기 전안부 관련 세포가 각막 내피 세포인, 전안부 관련 세포 시트.
제 1 항에 있어서,

단백질 분해 효소에 의한 처리를 실시하지 않고 기재로부터 박리된, 전안부 관련 세포 시트.
세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태에서 회수되는 구조 결함이 적은 전안부 관련 세포만으로 구성되는 3차원 구조체로서,

상기 전안부 관련 세포가 각막 내피 세포인, 3 차원 구조체.
삭제
적어도 각막 상피 세포 시트 또는 그의 중층화 시트와 각막 내피 세포 시트가 조합된 3 차원 구조체로서,

상기 각막 내피 세포 시트는 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태에서 회수되는 구조 결함이 적은 각막 내피 세포만으로 구성되는 것인, 3차원 구조체.
적어도 각막 상피 세포 시트 또는 그의 중층화 시트, 각막 내피 세포 시트, 및 결막 상피 세포 시트가 조합된 3 차원 구조체로서,

상기 각막 내피 세포 시트는 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태에서 회수되는 구조 결함이 적은 각막 내피 세포만으로 구성되는 것인, 3차원 구조체.
물에 대한 상한 또는 하한 임계 용해 온도가 0∼80℃ 인 온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 전안부 관련 세포를 배양하고, 전안부 관련 세포 시트 또는 그의 중층화 시트를 형성시키고, 그 후

(1) 배양액 온도를 상한 임계 용해 온도 이상 또는 하한 임계 용해 온도 이하로 하고,

(2) 전안부 관련 세포 시트 또는 그의 중층화 시트를, 세포배양 지지체로부터 박리하는 것을 특징으로 하는, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법으로서,

(1) 의 공정 후이고, 또한 (2)의 이전에 배양한 전안부 관련 세포 시트 또는 그 중층화 시트를 고분자막에 밀착시키고, 그리고

(2) 의 박리는, 고분자막과 밀착한 전안부 관련 세포 시트 또는 그의 중층화 시트를, 그대로 고분자막과 함께 세포배양 지지체로부터 박리하도록 하는 것에 의해 수행되고,

여기서, 고분자막이 친수화 처리가 실시된 폴리비닐리덴디플루오라이드이고,

상기 전안부 관련 세포가 각막 내피 세포인,

전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법.
제 7 항에 있어서,

온도 응답성 폴리머로 기재 표면을 피복한 세포 배양 지지체 상에서 전안부 관련 세포를 배양하고, 전안부 관련 세포의 중층화 시트를 형성시킨, 3 차원 구조체의 제조법.
삭제
제 7 항에 있어서,

세포 배양 지지체로서, 온도 응답성 폴리머가 피복된 A 영역과,

(1) 세포와 친화성이 낮은 고분자가 피복되어 있는 영역,

(2) A 영역과 다른 양의 온도 응답성 폴리머가 피복되어 있는 영역,

(3) A 영역과 다른 온도에 응답하는 고분자가 피복되어 있는 영역

중 어느 하나, 또는 (1)∼(3) 중 임의의 2 개 또는 3 개의 조합으로 이루어지는 B 영역의 2 영역을 표면에 가진 것을 이용하는 것을 특징으로 하는, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법.
제 7 항 또는 제 10 항에서 있어서,

제 7 항에서 얻어진 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체를 다시 세포 배양 지지체, 온도 응답성 폴리머로 표면을 피복한 세포 배양 지지체, 고분자막 등에 부착시켜, 포개어 맞추어 가는 것, 또는 다른 세포 시트 등에 일부, 또는 전부를 부착시켜, 포개어 가는 것을 포함하는, 3 차원 구조체의 제조법.
제 7 항 또는 제 10 항에 있어서,

박리가 단백질 분해 효소에 의한 처리가 실시되지 않은, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법.
제 7 항 또는 제 10 항에 있어서,

온도 응답성 폴리머가, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)인, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체의 제조법.
삭제
제 11 항에 있어서,

다른 세포 시트가, 각막 상피 세포 시트 및 그 중층화 시트, 및 결막 상피 세포 시트, 및 3 차원 구조체 중의 1 종 또는 2 종 이상의 것으로 이루어지고,

상기 3차원 구조체는, 세포, 세포 사이의 데스모솜 구조, 및 세포, 기재 사이의 기저막 모양 단백질이 유지되어, 1 장의 시트로서 충분히 강도를 가진 상태에서 회수되는 구조 결함이 적은 각막 상피 세포를 중층화시킨 것인,

3 차원 구조체의 제조법.
제 7 항에 기재된 제조법에 의해 제조되는, 전안부 관련 세포 시트 또는 3 차원 구조체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

전안부 조직의 일부 또는 전부를 손상 또는 결손된 환부에 대한 치료용인, 전안부 관련 세포 시트.
제 2 항에 있어서, 고분자막으로서 친수화 처리가 실시된 폴리비닐리덴디플루오라이드를 상기 전안부 관련 세포 시트 또는 3차원 구조체에 밀착시키고, 전안부 관련 세포가 상기 고분자막과 밀착된 그대로 기재로부터 박리되는, 전안부 관련 세포 시트.