TW201839126A - 前眼部相關細胞片、三維結構體、及它們的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供前眼部相關細胞片或三維結構體，其結構缺陷少，以保持細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質的狀態被回收。在用相對於水的上限或下限臨界溶解溫度為0~80℃的溫度回應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養細胞，根據需要使培養細胞層多層化，之後，(1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下，根據需要，(2)將所培養的前眼部相關細胞片或三維結構體緊密貼合在高分子膜上， (3)將其連同高分子膜一起剝離，由此製造前眼部相關細胞片或三維結構體。

Description

前眼部相關細胞片、三維結構體、及它們的製造方法

本發明涉及在生物學、醫學等領域中的前眼部相關細胞片、三維結構體、及它們的製造方法和使用它們的治療方法。

隨著醫療技術的顯著發展，近年來，用他人的器官替換難以治療的器官的器官移植得到了普遍化， 成為移植對象的器官十分多樣，包括皮膚、角膜、腎臟、肝臟、心臟等，並且術後的療程也變得格外良好，因此已被確立為醫療的一種技術，作為一個例子舉出角膜移植，約40年前在日本也設立了角膜銀行並開始了移植工作。但是，由於捐獻者人數很少，相對僅國內每年需要角膜移植的患者就有約2萬人來說，實際上能夠進行移植治療的患者只有其1/10，約2000人左右。現在的情況是儘管角膜移植的技術已被大致確立，但由於角膜捐獻不足的問題，所以需要尋找下一種醫療技術。

基於這樣的背景，從過去開始，將人工替代物和培養細胞使之組織化而成的移植物直接移植的技術受到關注。其代表性的例子可以舉出人工皮膚和培養皮膚。在這裡，使用合成高分子的人工皮膚具有產生排斥反應等的可能性，不宜作為移植用皮膚。另一方面，由於培養皮膚是將患者本人的部分正常皮膚培養到所希望的大小，因此使用它不需擔心排斥反應等，可以說是最自然的掩蔽劑。

一直以來，這樣的細胞培養是在玻璃表面上或在經過種種處理的合成高分子的表面上進行的。例如，經過如γ射線照射、矽塗布等表面處理的各種聚苯乙烯材質的容器等作為細胞培養用容器得到普及。使用這樣的細胞培養用容器培養、增殖的細胞，通過用胰島素之類的蛋白分解酶或化學藥品進行處理，而從容器表面被剝離、回收。

但是，實施如上所述的化學藥品處理來回收增殖的細胞時，處理工程繁雜，混入雜質的可能性大，並且增殖的細胞經過化學處理而轉化或受到損傷，細胞原有的機能受到損害，具有如上等缺點，為了克服上述缺點，至今有若干技術被提案。

日本專利特公平2-23191號公報中記載了可以移植角蛋白組織的膜的製造方法，其特徵為，在角蛋白組織的膜可以在容器表面上形成的條件下，在培養容器中培養源自人新生兒的角化表皮細胞，使用酶來剝離角蛋白組織的膜。具體而言，公開了這樣的技術：將3T3細胞作為飼養層使其增殖、多層化，使用作為蛋白質分解酶的分散劑來回收細胞片。但是，該公報中所記載的方法具有如下缺點： (1)分散劑源自菌，所回收的細胞片必須充分地洗淨。 (2)所培養的每種細胞其分散劑處理條件都不同，必須對該處理熟練。 (3)通過分散劑處理來培養的表皮細胞在病理學上被活化。 (4)通過分散劑處理，胞外基質被分解。 (5)因此移植了該細胞片的患處易受感染。

然而，作為本發明對象的角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、以及結膜上皮細胞等的前眼部相關細胞，其細胞／細胞間的結合不如皮膚細胞強，即使使用上述分散劑，培養後也無法作為整張細胞片進行剝離、回收。

為了解決該課題，最近提出，在除去了海綿層和上皮層的羊膜上培養角膜上皮細胞或結膜上皮細胞、並使之組織化，連同該羊膜一起作為移植用細胞片的技術(日本專利特開2001-161353號)。由於羊膜具有充分的膜強度，並且不具有抗原性，因此作為移植用細胞片的支持體比較合適，但是羊膜這種東西原先並不在眼內，為了更精密地構築眼內組織，還是希望製造僅用眼內的細胞就具有充分強度的細胞片。

本發明以解決上述現有技術中的問題為目標來進行。即，本發明的目的在於提供可以以保持細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質的狀態進行回收的結構缺陷少的前眼部相關細胞片或三維結構體。另外，本發明的目的在於提供一種不必使用分散劑等酶來進行處理，而可以通過改變環境溫度，將所培養、增殖的細胞容易地並且以作為整張細胞片具有充分強度的狀態從支持體表面剝離、回收的方法。

本發明人們為了解決上述課題，從各種角度加以探討，進行了研究開發。其結果發現，在用溫度回應性聚合物覆蓋基材表面的細胞培養支持體上培養前眼部相關細胞，並根據需要使培養細胞層多層化，之後，使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下，將所培養的前眼部相關細胞片或三維結構體緊密貼合於高分子膜上，將其連同高分子膜一起剝離，由此可以得到結構缺陷少的前眼部相關細胞片或三維結構體。本發明基於上述認識得以完成。

即，本發明提供可以以保持細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質的狀態回收的結構缺陷少的前眼部相關細胞片或三維結構體。

另外，本發明提供前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其特徵為，在用相對於水的上限或下限臨界溶解溫度為0~80℃的溫度回應性聚合物覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養細胞，根據需要按照常規方法使培養細胞層多層化，之後， (1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或在下限臨界溶解溫度以下， (2)將所培養的前眼部相關細胞片或三維結構體緊密貼合於高分子膜上， (3)將其連同高分子膜一起剝離。

並且，本發明提供三維結構體的製造方法，其特徵為，將用上述製造法得到的緊密貼合於高分子膜上的前眼部相關細胞片或三維結構體再次附著在細胞培養支持體、用溫度回應性聚合物覆蓋表面而成的細胞培養支持體、高分子膜、或其它細胞片等上，之後將緊貼著的高分子膜剝掉，通過重複上述操作來進行多層化。

並且，本發明提供用於治療缺傷和／或創傷達到深部的組織的上述前眼部相關細胞片或三維結構體。

另外，本發明提供一種治療方法，其特徵為，對缺損和/或創傷達到深部的組織，移植上述前眼部相關細胞片或三維結構體。

本發明還提供不僅在醫療領域，作為用於評價化學物質、毒物或藥品的安全性的細胞而有用的前眼部相關細胞片或三維結構體。

作為在本發明的前眼部相關細胞片或三維結構體的製造中適合使用的細胞可以列舉角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、結膜上皮細胞等、及上皮幹細胞，其種類不受任何限制。本發明中，所謂前眼部相關細胞片是表示：如上所述在活體中形成前眼部的各種細胞在培養支持體上以單層狀被培養，之後從支持體剝離的細胞片；所謂其三維結構體是表示：其各種表皮培養細胞片單獨或以組合的狀態被多層化而成的細胞片。

本發明的前眼部相關細胞片或三維結構體在培養時不受以分散劑、胰島素等為代表的蛋白質分解酶的損傷。因此，從基材剝離的前眼部相關細胞片或三維結構體，保持細胞與細胞間的橋粒結構，結構缺陷很少，並且強度高。由此，例如將所得到的前眼部相關細胞片或三維結構體以移植等為目標而使用的情況下，由於本發明的前眼部相關細胞片或三維結構體具有充分的強度，所以患處與外部完全隔離。另外，本發明的細胞片，在培養時所形成的細胞與基材間的基底膜類蛋白質也不會受到酶的破壞。因此，移植時能良好地與患處組織黏結，能夠實施效率良好的治療。對以上事實進行具體說明，在使用胰島素等常用的蛋白質分解酶時，細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質幾乎無法保持，因而，細胞成為各自分開的狀態被剝離。其中，關於作為蛋白質分解酶的分散劑，已知以這樣的狀態被剝離，即，對細胞與基材間的基底膜類蛋白質等破壞掉大部分、而對橋粒結構保持10~60%，所得到的細胞片強度很弱。相對於此，本發明的細胞片，是橋粒結構、基底膜類蛋白質皆殘留80%或80%以上狀態的細胞片，可以得到前述的種種效果。

如上所示，本發明的前眼部相關細胞片或三維結構體細胞兼具細胞與細胞間的橋粒結構和細胞與基材間的基底膜類蛋白質兩者，而且是高強度的細胞片，利用先有技術是完全無法得到的細胞片。

在細胞培養支持體中，用於覆蓋基材的溫度回應性聚合物，其在水溶液中的上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度在0~80℃，更優選在20℃~50℃。上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度若超過80 ℃，細胞就有死亡的可能性，因此不優選。另外，上限臨界溶解溫度或下限臨界溶解溫度若低於0℃，通常細胞的增殖速度極度降低，或細胞會死亡，因此也不優選。

本發明中使用的溫度回應性聚合物可以是均聚物或共聚物的任一類。這樣的聚合物可以列舉例如日本專利特開平2-211865號公報中記載的聚合物。具體而言，例如，由以下的單體單獨聚合或者共聚得到。所使用的單體，可以列舉例如(甲基)丙烯醯胺化合物、N-(或者N， N-二)烷基取代(甲基)丙烯醯胺衍生物、或者乙烯醚衍生物，對於共聚物，可以使用其中任意兩種或兩種以上。另外，也可以使用與上述單體以外的單體類的共聚，聚合物之間的接枝或共聚，或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不損害聚合物原有性質的範圍內進行交聯。

作為被實施覆蓋的基材，從通常用於培養細胞的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、有機玻璃等化合物開始，到通常能夠賦予形態的物質，例如上述之外的高分子化合物、陶瓷類等全都可以使用。

溫度回應性聚合物向支持體的覆蓋方法不受特別的限制，例如，可以按照日本專利特開平2-211865號公報中記載的方法進行。即，可以對基材和上述單體或高分子，利用電子束照射(EB)、γ射線照射、紫外線照射、等離子處理、電暈處理、有機聚合反應的任意種，或者利用塗布、混煉等物理吸附等進行所述覆蓋。

本發明中所示的支持體材料，其特徵為，表面有兩個區域：覆蓋有溫度回應性高分子的A區域，以及由 (1)覆蓋有與細胞親和性低的高分子的區域， (2)覆蓋有與A區域不同量的溫度回應性高分子的區域， (3)覆蓋有對與A區域不同的溫度回應的高分子的區域， 中的任意一個，或者(1)~(3)的任意2個或3個的組合構成的B區域這兩個區域。

其製造方法，只要是最終具有上述結構就不受任何限制，例如，可以列舉單獨或同時使用以下方法的方法：①在基材表面全部上首先製作B區域，然後遮住最終要成為B區域的部分後追加A區域的方法，或者相反先製成A再追加B的方法；②預先覆蓋A、B兩層，用超聲波或掃描型儀器削去某一層的方法；③將覆蓋物質平版印刷的方法等。

覆蓋區域的形態沒有任何限制，從上部觀察，可以舉出例如①由線和空白構成的圖案、②水滴狀的圖案、③格子狀的圖案、其它特殊形狀的圖案、或者混合有上述形狀的狀態的圖案，而不受任何限制，不過考慮到眼內各組織的狀態，優選②中的圓形圖案。

覆蓋區域的大小沒有任何限制，不過考慮到眼內各組織的大小、以及所培養的前眼部相關細胞片或三維結構體在剝離時的收縮，以圓形圖案使用其圓內的細胞的時候，該圓的直徑在5cm或5cm以下，優選在3cm或3cm以下，更優選在2cm或2cm以下，使用圓的外側的時候，該圓的直徑在lmm 或lmm以下，優選在3mm或3mm以下，更優選在5mm或5mm以下。

溫度回應性高分子的覆蓋量最好是0.3~6.0μg/cm² 的範圍，優選0.5~3.5μg/cm² ，更優選0.8~3.0μg/cm² 覆蓋量少於0.2μg/cm² 時，即使給與剌激，該高分子上的細胞也難以剝離，操作效率變得非常差，不優選。相反，覆蓋量在6.0μg/cm² 以上時，細胞難以附著在該區域，難以充分附著細胞。

本發明中的與細胞親和性低的高分子，只要是不使細胞附著的高分子就不受任何限制，例如，可以列舉聚丙烯醯胺、聚二甲基丙烯醯胺、聚乙二醇、纖維素等親水性高分子，或者矽酮高分子、氟高分子等的強疏水性高分子等。

本發明中，細胞的培養是在如上所述地製造的細胞培養支持體(例如，細胞培養皿)上進行的。覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有上限臨界溶解溫度時，培養基的溫度在該溫度以下，而覆蓋在基材表面上的前述聚合物具有下限臨界溶解溫度時，培養基的溫度在該溫度以上，除此之外，培養基的溫度不受特別的限制。但是，在導致培養細胞無法增殖的低溫區域、或導致培養細胞死亡的高溫區域中的培養顯然是不合適的。溫度以外的培養條件只要按照常規方法就可以，不受特別的限制。例如，對於使用的培養基，可以是添加有公知的胎牛血清( FCS) 等血清的培養基，另外也可以是不添加這類血清的元血清培養基。

本發明的方法中，按照前述方法，根據前眼部相關細胞片或三維結構體的使用目的來設定培養時間就可以。所培養的細胞從支持體材料剝離回收時，將所培養的前眼部相關細胞片或三維結構體緊密貼合在高分子膜上，通過將附著有細胞的支持體材料的溫度調節到支持體基材的覆蓋聚合物的上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，可以連同高分子膜一起進行剝離。另外，細胞片的剝離可以在培養細胞的培養液中進行，也可以在其它等滲液中進行，可以適應目的進行選擇。緊密貼合前眼部相關細胞片或三維結構體時所使用的高分子膜，可以列舉例如聚二氟乙烯(PVDF) 、聚丙烯、聚乙烯、纖維素及其衍生物、幾丁質(chitin)、殼聚糖(chitosan)、膠原蛋白、烏拉坦(urethane)等。

本發明中的三維結構體的製造方法不受特別的限定，例如，可以列舉通常所知的3T3細胞作為飼養層進行增殖、多層化的方法，或者利用上述緊貼在高分子膜上的表皮培養細胞片製造的方法等。具體而言，可以例示如下方法： (1)將與高分子膜緊密貼合的細胞片附著在細胞培養支持體上，之後加入培養基，將高分子膜剝離細胞片，然後附著其它與高分子膜緊密貼合的細胞片，通過重複這些操作，使細胞片多層化的方法。 (2)將與高分子膜緊密貼合的細胞片翻轉，以高分子膜一側固定於細胞培養支持體上，在細胞片一側附著其它的細胞片，之後加入培養基，將高分子膜剝離細胞片，然後附著其它細胞片，重複上述操作，使細胞片多層化。 (3)將與高分子膜緊密貼合的細胞片彼此之間以細胞片一側緊密貼合的方法。 (4)將與高分子膜緊密貼合的細胞片接觸到活體的患處，使細胞片附著於活體組織上之後，剝掉高分子膜，再重疊其它的細胞片的方法。

本發明中的三維結構體，不一定是僅由角膜上皮細胞形成。例如，也可以在由角膜上皮細胞形成的細胞片或三維結構體上，疊加進行同樣的操作製造的角膜內皮細胞片和/或結膜上皮細胞片。在使三維結構體更加接近活體內的前眼部組織的方面，這種技術極為有效。

為了達到高收穫率地剝離、回收前眼部相關細胞片或三維結構體的目的，可以單獨使用或者同時使用下述方法：或者輕敲或者晃動細胞培養支持體的方法，或用移液器攪拌培養基的方法等。另外，根據需要也可以用等滲液等沖洗培養細胞進行剝離回收。

根據上述方法得到的前眼部相關細胞片或三維結構體，與以往的方法得到的產品相比，不論在剝離性方面，還是在非侵襲性方面，都極為優良，強烈期待其在移植用角膜等的臨床應用。特別是，本發明的前眼部相關細胞的三維結構體與以往的移植細胞片不同，由於保持了基底膜類蛋白質，所以即使在移植時較深地切削患處組織，也能成活。可以認為，這是可以提高患處的治療效率、進一步可以減輕患者負擔的極其有效的技術。另外，本發明的方法中所使用的細胞培養支持體可以重複使用。 實施例

以下基於本發明的實施例進行進一步詳細說明，但這些實施例對本發明沒有任何限定。 實施例1 、2

在市售的聚苯乙烯製細胞培養皿(Becton Dickinson Labware公司製、FALCON 3001佩氏培養皿(Petri dish) (直徑3.5cm) )上，塗布0.10m140% (實施例1 )、50% (實施例2)N-異丙基丙烯醯胺單體的異丙醇溶液。在該塗佈面上蓋上帶有一個2cm直徑的孔的直徑3.5cm的金屬製掩模後，保持原狀地照射0.25MGy強度的電子束，將聚N-異丙基丙烯醯胺(PIPAAm)在培養皿表面上固定成圓形(島狀部分。掩模下的部分沒有受到電子束成為什麼都沒有覆蓋的海部分。)。然後剝下該金屬製掩模，塗佈0.10m1 20%的異丙醇溶液。然後，這次僅在該圓形部分放上直徑2cm的圓形金屬製掩模，保持原狀地照射0.25MGy強度的電子束，在圖形PIPAAm層的外側固定化聚丙烯醯胺。照射後取下金屬製掩模，用離子交換水洗淨培養皿，除去殘餘的單體和未與培養皿結合的PIPAAm，在淨化台內乾燥，用環氧乙烷氣體滅菌，得到細胞培養支持體材料。在這裡，島部分的PIPAAm的覆蓋量，根據在不使用掩模以外與上面完全相同的條件下製造的細胞培養支持體材料求得。其結果發現在該條件下，溫度回應性高分子在基材表面分別覆蓋1.6μg/cm² (實施例1 )、2.2μg/cm² (實施例2 )。在得到的細胞培養支持體材料上，通過常規方法培養正常兔角膜上皮細胞(使用培養基：Cornelis pack (Kurabo (股)製)、37℃、5％CO₂ 下)。其結果，角膜上皮細胞在兩種細胞培養支持體材料上都僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖。培養14 日後，在所培養的細胞的上面覆蓋直徑2cm的聚二氟乙烯(PVDF) 膜，輕輕地吸去培養基，通過連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘後冷卻，兩種細胞培養支持體材料上的細胞皆連同覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜都可以很容易地從兩種細胞片剝下來。並且，剝離下來的細胞片保持細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，且作為整張細胞片具有充分的強度。

另外，上述各實施例中"低溫處理"是在20 ℃下培養30分鐘的條件下進行，本發明中的"低溫處理"不限於這一溫度和時間。本發明中的"低溫處理"優選的溫度條件在0℃~30℃，優選的處理時間可為2分鐘~1小時。 實施例3

在實施例1的細胞培養支持體上，除將培養基換成含有絲裂黴素C的常用的保綠培養基(green's media) (DMEM+AB (用於製造飼養層)、用於源自人新生兒的角化表皮細胞)之外，用同樣的方法培養正常兔角膜上皮細胞。其結果，培養支持體材料上的角膜上皮細胞僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖，並且多層化。培養16天后，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘並冷卻，從而剝離多層化角膜上皮細胞。所剝離的多層化角膜上皮細胞(三維結構體)是圓形的，保持了細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，作為整張細胞片具有充分的強度。 比較例1 、2

除了將製造實施例1的細胞培養支持體時的單體溶液濃度分別變成5% (比較例1)、60% (比較例2 )以外，與實施例1同樣地製造細胞培養支持體材料。得到的細胞培養支持體上的覆蓋量分別為0.1μg/cm² (比較例1)、6.2μg/cm² (比較例2)。之後，按照與實施例1同樣的操作，嘗試培養、剝離正常兔角膜上皮細胞。其結果，比較例1的支持體上的細胞即使進行低溫處理也難以剝離，相反，在比較例2的支持體上難以附著細胞，難以使細胞充分增殖，兩者的細胞培養支持體作為培養基材全都不能令人滿意。 實施例4

按照常規方法從兔角膜回收角膜內皮細胞。在實施例1 的接合了聚異丙基丙烯醯胺(PIPAAm) 的培養皿上以2x10⁶ cells/cm² 的細胞密度進行接種，按照常規方法進行培養(使用培養基：含10% 胎牛血清的DMEM、37℃、5%CO₂ 下)。其結果，該角膜內皮細胞也僅在中心部的圓形部分正常地附著、增殖。10天后，在確認角膜內皮細胞成為鋪滿狀態之後，與實施例1同樣地在所培養的細胞上覆蓋直徑2cm的聚二氟乙烯(PVDF)膜，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20 ℃培養30分鐘並冷卻，從而將細胞與覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜可以很容易地從細胞片剝下來。並且，剝離下來的細胞片保持細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例5

在實施例2的細胞培養支持體材料的製造方法中，首先，將直徑2cm的圓形金屬製掩模放置於培養皿的中心，在周圍固定PIPAAm，然後覆蓋開有直徑2cm 的圓形孔的金屬製掩模，從而製造在中心部固定了聚丙烯醯胺的細胞培養支持體材料(與實施例1的內側高分子層和外側高分子層剛好相反)。孔外側的PIPAAm的覆蓋量為2.1μg/cm² 。然後，按照常規方法從兔眼回收結膜上皮細胞。在前面的接合了高分子的培養皿上以2 x10⁵ cells/cm² 的細胞密度進行接種，按照常規方法進行培養(使用培養基：含10%胎牛血清的MEM、37℃、5%CO₂ 下)。其結果，被接種的結膜上皮細胞僅在中心部分的周圍正常地附著、增殖。10天後，在確認結膜上皮細胞成為鋪滿狀態之後，與實施例1同樣地在所培養的細胞上覆蓋聚二氟乙烯(PVDF) 膜，輕輕地吸去培養基，連同細胞培養支持體材料一起在20℃培養30分鐘並冷卻，從而將細胞和覆蓋在其上的膜一起剝離。所覆蓋的膜可以很容易地從細胞片剝下來。並且，剝離下來的結膜上皮細胞片保持了細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例6

對不經冷卻而輕輕地除去培養基的實施例2 的培養皿主的角膜上皮細胞片，立即重疊實施例1中剝離下來的角膜上皮細胞片。之後，輕輕地加入實施例3中使用的培養基，剝去緊密貼合的高分子膜。以該狀態培養2天，從而得到角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體)。所得到的角膜上皮細胞的多層化細胞片通過與實施例3同樣地實施低溫處理，從支持體表面剝離。被剝離的角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體) ，作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例7

對不經冷卻而輕輕地除去培養基的實施例4 的培養皿上的角膜內皮細胞片，立即重疊實施例3中剝離下來的角膜上皮細胞的多層化細胞片。之後，輕輕地加入實施例3中使用的培養基，剝去緊密貼合的高分子膜。以該狀態培養2天，得到具有角膜內皮細胞層的角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體)。得到的角膜上皮細胞的多層化細胞片通過與實施例3同樣地實施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結構體保持了細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例 8

對不經冷卻而輕輕地除去培養基的實施例4 的培養皿上的角膜內皮細胞片，首先加入含有5%IV型膠原蛋白的培養基(除含有膠原蛋白以外，與實施例4的培養基同樣的培養基) ，按照原樣靜置20分鐘。之後，再次不經冷卻而輕輕地除去培養基。對殘留在培養皿上的角膜內皮細胞片，立即重疊實施例3中剝離的角膜上皮細胞的多層化細胞片。之後，輕輕地加入實施例3中使用的培養基，剝去緊密貼合的高分子膜。以該狀態培養2 天，得到具有角膜內皮細胞層的角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體)。得到的角膜上皮細胞的多層化細胞片通過與實施例3同樣地實施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結構體作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例9

對不經冷卻而輕輕地除去培養基的實施例5的培養皿上的開有孔的結膜上皮細胞片，立即放置實施例7中剝離的具有角膜內皮細胞層的角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體) ，並使其部分重疊。之後，輕輕地加入實施例3中使用的培養基，剝去緊密貼合的高分子膜。以該狀態培養2天，得到附著有結膜上皮細胞片、且具有角膜內皮細胞層的角膜上皮細胞多層化細胞片(三維結構體)。得到的三維結構體通過與實施例3 同樣地實施低溫處理，從支持體表面剝離。剝離下來的三維結構體作為整張細胞片具有充分的強度。 實施例10

按照常規方法，將實施例3中得到的角膜上皮細胞的多層化細胞片(三維結構體)移植給角膜上皮細胞部分缺損的兔子。此時，直接將角膜上皮細胞的多層化細胞片縫合在創傷部位。大約3周後拆線，結果發現角膜上皮細胞的多層化細胞片在眼球上良好地成活。

根據以上結果，使用本技術可以僅用原先位於眼內的細胞來製成具有充分強度的細胞片。這一事實就治療的效率化、由此減輕患者的負擔，並且構築更精密的組織方面來說，可以認為是一種極其有效的技術。 產業上的利用可能性 本發明的前眼部相關細胞片或三維結構體，不會像用分散劑處理的情況那樣分解上皮黏附素( E-cadherin )、層黏連蛋白5( laminin5) ，並且結構缺陷極少，強烈地期待其在皮膚移植等的臨床應用。因而，本發明是在細胞工學、醫用工學等的醫學、生物學等領域極為有用的發明。

Claims (16)

1. 一種前眼部相關細胞片或三維結構體，該前眼部相關細胞片或三維結構體結構缺陷少，保持了細胞與細胞間的橋粒結構、以及細胞與基材間的基底膜類蛋白質，以作為整張細胞片具有充分強度的狀態被回收。
2. 如請求項1之前眼部相關細胞片或三維結構體，其中，該前眼部相關細胞片或三維結構體未經蛋白質分解酶處理而從基材剝離。
3. 如請求項1或2之前眼部相關細胞片或三維結構體，其中所述前眼部相關細胞是角膜上皮細胞、角膜內皮細胞、結膜上皮細胞以及上皮幹細胞。
4. 如請求項1至3中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體，其中所述三維結構體是將角膜上皮細胞進行多層化培養而成的三維結構體。
5. 如請求項1至3中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體，其中所述三維結構體是至少由角膜上皮細胞片或其多層化物與角膜內皮細胞組合而成的。
6. 如請求項1至3中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體，所述三維結構體是在如請求項5脂三維結構體上進一步組合結膜上皮細胞而成的。
7. 一種前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其特徵為，在用相對於水的上限或下限臨界溶解溫度為0~80℃的溫度回應性高分子覆蓋基材表面而成的細胞培養支持體上培養細胞，根據需要按照常規方法使培養細胞層多層化，之後， (1)使培養液溫度在上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，進一步根據需要， (2)將所培養的前眼部相關細胞片或其多層化細胞片緊密貼合於高分子膜上， (3)將其連同高分子膜一起剝離。
8. 如請求項7之前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其使用表面具有兩個區域的細胞培養支持體，該兩個區域是：覆蓋有溫度回應性高分子的A 區域，以及由 (1)覆蓋有與細胞親和性低的高分子的區域， (2)覆蓋有與A區域不同量的溫度回應性高分子的區域， (3)覆蓋有對與A 區域不同的溫度回應的高分子的區域， 中的任意一個，或者(1)-(3)中的任意2個或3個的組合構成的B區域。
9. 如請求項7或8之三維結構體的製造方法，其包括：將如請求項7中得到的前眼部相關細胞片或三維結構體，再次附著到細胞培養支持體、用溫度回應性聚合物覆蓋表面的細胞培養支持體、高分子膜等上進行疊加，或者將如請求項7中得到的前眼部相關細胞片或三維結構體的一部分或全部附著到其它細胞片等上進行疊加。
10. 如請求項7至9中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其中所述剝離是未經蛋白質分解酶處理的。
11. 如請求項7至9中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其中所述溫度回應性聚合物是聚(N－異丙基丙烯醯胺)。
12. 如請求項7至9中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體的製造方法，其中所述高分子膜是經親水化處理的聚二氟乙烯。
13. 如請求項7至9中任一項之三維結構體的製造方法，其中所述其它細胞片是由角膜上皮細胞片及其多層化細胞片、角膜內皮細胞片、以及結膜上皮細胞片，以及如請求項4之製造方法製造的三維結構體中的一種或兩種或兩種以上構成。
14. 一種前眼部相關細胞片或三維結構體，是按照如請求項7至13中任一項之方法製造的。
15. 如請求項1至6及14中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體，其用於治療前眼部組織的一部分或全部損傷或缺損的患處。
16. 一種治療方法，其特徵為，對前眼部組織的一部分或全部損傷或缺損的患處，移植如請求項1至6及14中任一項之前眼部相關細胞片或三維結構體。