CN105169487A - 一种具有生物活性的创面修复细胞膜片、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有生物活性的创面修复细胞膜片、其制备方法以及应用。该创面修复细胞膜片包括经生物活性玻璃浸提液培养的成纤维细胞及其细胞外基质；成纤维细胞培养于Nunc？HydroCell？UpCell培养皿，该创面修复细胞膜片由与Nunc？HydroCell？UpCell培养皿配套使用的聚合物膜制得。本发明的创面修复细胞膜片中的成纤维细胞能够迁移进入创面，促进创伤部位肉芽组织中胶原蛋白分泌和血管再生，最终促进创面修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术及创伤修复领域，尤其涉及具有生物活性的创面修复细胞膜片及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤创伤是临床高发疾病，可以分为急性创伤或者慢性创伤。人体对于创面有一定的自我修复能力，但是当创面面积过大或者创面局部环境紊乱例如血管被破坏，血供不足时，创面便无法正常修复，甚至造成长期难以愈合、反复发作的创口。
生物活性玻璃是一种硅基无机材料，在组织修复领域获得了很多应用。生物活性玻璃被证明可以促进体内外血管化，临床上也出现了基于生物活性玻璃粉末的创面修复产品。但是由于它粉末的性质，很难固定在创面位置。而且，生物玻璃产生局部碱性的化学环境，会造成病人的不适。
与此同时，已有广泛的文献报道了组织工程中运用人自身的细胞来修复人体组织的研究进展，利用细胞来进行组织修复已经取得了一些成果，这是利用外加细胞自身参与到修复过程中，利用其生长因子和蛋白等来进行组织的修复，但是其修复能力有限。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，发明人致力于开发既利用人体自身细胞，又利用生物活性玻璃促进创面修复的皮肤创伤敷料。本发明提供了一种具有生物活性的创面修复细胞膜片及其制备方法，以促进皮肤创面的修复。
一方面，本发明提供了一种具有生物活性的创面修复细胞膜片，该创面修复细胞膜片包括经生物活性玻璃浸提液培养的成纤维细胞及其细胞外基质；成纤维细胞培养于NuncHydroCellUpCell培养皿，创面修复细胞膜片由与NuncHydroCellUpCell培养皿配套使用的聚合物膜制得。NuncHydroCellUpCell(Nunc,ThermoScientific)是一种热敏性细胞培养皿，当温度在细胞培养温度37℃时，培养皿的表面是疏水性的，细胞会正常贴壁，而当温度低于32℃时，培养皿的表面变为亲水性的，细胞可从培养皿壁上脱落。
生物活性玻璃是含有CaO，P2O5，SiO2和Na2O的无机氧化物，其浸提液含有钙离子、磷离子和硅离子。
另一方面，本发明提供了一种制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，包括以下步骤：
步骤一、将生物活性玻璃粉体浸泡于无血清的成纤维细胞培养液，培养1天后无菌过滤收集，得到生物活性玻璃浸提液，该生物活性玻璃浸提液用成纤维细胞培养液稀释后待用；
步骤二、在NuncHydroCellUpCell培养皿中加入成纤维细胞的细胞悬浮液，用步骤一中制得的含有生物活性玻璃浸提液的成纤维细胞培养液进行细胞培养；
步骤三、移除NuncHydroCellUpCell培养皿中的培养液，加入预热的成纤维细胞培养液以避免细胞变干，在成纤维细胞上覆盖与所述NuncHydroCellUpCell培养皿配套使用的聚合物膜，室温下静置10至15分钟后，将聚合物膜揭起，制得具有生物活性的创面修复细胞膜片。
优选地，步骤一中，将1g生物活性玻璃粉体浸泡于5mL无血清的成纤维细胞培养液中，培养1天后无菌过滤收集，得到生物活性玻璃浸提液，该生物活性玻璃浸提液用成纤维细胞培养液稀释后待用。
优选地，生物活性玻璃浸提液与成纤维细胞培养液的稀释比例为1/32至1/256，更优选地为1/128。
优选地，步骤二中，成纤维细胞的细胞悬浮液含有2x105至3x105个成纤维细胞。
优选地，步骤二中，细胞培养的时间为3至7天。
优选地，步骤三中，预热的成纤维细胞培养液的体积为40μL至60μL，优选为50μL。
再一方面，本发明公开了一种具有生物活性的创面修复细胞膜片在创面修复中的应用。
经生物活性玻璃浸提液培养的成纤维细胞膜片具有明显的生物活性，能表达更多的细胞生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)以及细胞外基质中的胶原蛋白(CollagenI)以及纤维粘连蛋白(Fibronectin)。经生物活性玻璃浸提液培养的成纤维细胞及其细胞外基质能够促进动物全切创面处胶原蛋白沉积和血管再生，并且能促进创面收缩，明显地提高创面修复速度。由于生物活性玻璃细胞膜片具有促进血管生成的作用，其对慢性创伤的修复尤其具有良好的修复效果。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1示出了本发明的一个较佳实施例的创面修复效果；
图2示出了本发明的一个较佳实施例的创面收缩率结果；
图3示出了本发明的一个较佳实施例中对照细胞膜片和生物活性玻璃细胞膜片处理后的创面位置经人成纤维细胞表面蛋白染色后的结果；
图4示出了本发明的一个较佳实施例中胶原蛋白I在创面位置的免疫组化染色结果；
图5示出了本发明的一个较佳实施例的修复过程中血管再生情况。
具体实施方式
生物活性玻璃细胞膜片的制备
将1g生物活性玻璃粉体浸泡于5mL无血清成纤维细胞培养液，在本实施例中使用的是改良杜氏伊格尔培养基(DMEM，GIBCO)，在加湿的37℃/5％CO2培养箱中培养1天后用0.22μm滤器(Millipore)无菌收集过滤，并储存在4℃冰箱中待用。用成纤维细胞培养液以1/32,1/64,1/128及1/256比例稀释生物活性玻璃浸提液，在本实施例中使用的成纤维细胞培养液是改良杜氏伊格尔培养基+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素。在NuncHydroCellUpCell培养皿中加入含2x105至3x105个成纤维细胞的细胞悬浮液，分别用经稀释的生物活性玻璃浸提液和普通成纤维细胞培养液在加湿的37℃/5％CO2培养箱中培养3至7天。在本实施例中使用的成纤维细胞是人真皮成纤维细胞(HDF)。制备生物活性玻璃细胞膜片和对照细胞膜片，具体方法为：移除NuncHydroCellUpCell培养皿中的培养液，加入少量例如50μL预热的培养液以免细胞变干；之后，用与NuncHydroCellUpCell培养皿配套的聚合物膜放置于细胞表面，并在室温例如20至25℃下放置10至15分钟，以使细胞片层脱离培养皿壁，而贴附在聚合物膜上，将形成的细胞膜片分成均等部分待用。生物活性玻璃细胞膜片和对照细胞膜片的制备方法相同,区别仅在于前者用含生物活性玻璃浸提液的细胞培养液进行细胞培养,而后者用普通成纤维细胞培养液进行培养。
生物活性玻璃细胞膜片在收缩创面中的效果
在裸鼠(BALB/c,6-8周)背部制造两个直径1厘米的创面，将制备的细胞膜片施加到创面，并设置空白组阴性对照和施加0.1g基因重组人表皮生长因子(rhEGF)凝胶(PavayGenepharmaceuticalCo.Ltd)的阳性对照；所有裸鼠在第0天静脉注射甲基强的松龙(Depomedrol，Pfizer)(20mg/kg体重)以延缓创面愈合，3，7，14天后处死裸鼠，收集创面样本做切片分析。创面收缩率按下式计算：
创面收缩％＝100×(初始创面面积-目前创面面积)/初始创面面积
数据表示为平均值±标准偏差，三次独立试验用于统计分析。两组数据之间的统计显著性用学生t检验进行评价，当p<0.05(*)或者p<0.01(**)时，认为差异具有显著性。
附图1示出了用成纤维细胞培养液以1/128比例稀释生物活性玻璃浸提液后，培养成纤维细胞所制得的细胞膜片在创面收缩中效果。附图2示出了相应的创面收缩率结果。由图可知，在每个时间点(3，7，14天)，与阴性对照、阳性对照及对照细胞膜片相比，生物活性玻璃膜片均具有最高的创面收缩率，具有明显的修复效果。
生物活性玻璃细胞膜片在成纤维细胞迁移中的效果
创面样本在4％(质量/体积)多聚甲醛(PFA)中固定1天，石蜡包埋并切片，组织切片的厚度约为8μm。对于组织学分析，组织切片复水后与苏木精和伊红共同孵育。对于免疫组化染色，组织切片复水后与0.01M加热的柠檬酸钠(SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd,10019418)共同孵育以使抗原修复。0.3％H2O2/甲醇(体积比)用于渗透和灭活，随后用5％的牛血清蛋白(BSA,Sigma)进行封闭。封闭后，含有鼠抗-人成纤维细胞表面蛋白的第一抗体溶液被用于在室温下与样品共同孵育2小时。使用GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(GeneTech(Shanghai)Co.Ltd,China)作为第二抗体和显影剂。染色后，所有切片用显微镜(LeicaDM2500,德国)观察，并用CCD照相机(LeicaDFC420C)拍摄图像。
附图3示出了对照细胞膜片和生物活性玻璃细胞膜片(稀释比例为1/128)处理后的创面位置经人成纤维细胞表面蛋白染色后的结果，分别示出了处理第7天和第14天后的结果，以检测人成纤维细胞从细胞膜片迁移进入创面位置的情况。由图可知，相较于对照细胞膜片，经生物活性玻璃细胞膜片处理后的创面，有更多的成纤维细胞从细胞膜片迁移至创面内部，而在对照细胞膜片处理下，阳性染色成纤维细胞更多的停留在创面的表面，无明显的迁移。
生物活性玻璃细胞膜片刺激胶原蛋白I在创面沉积的效果
创面样本在4％(质量/体积)多聚甲醛(PFA)中固定1天，石蜡包埋并切片，组织切片的厚度约为8μm。对于组织学分析，组织切片复水后与苏木精和伊红共同孵育。对于免疫组化染色，组织切片复水后与0.01M加热的柠檬酸钠(SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd,10019418)共同孵育以使抗原修复。0.3％H2O2/甲醇(体积比)用于渗透和灭活，随后用5％的牛血清蛋白(BSA,Sigma)进行封闭。封闭后，含有兔抗-胶原蛋白I的第一抗体溶液被用于在室温下与样品共同孵育2小时。使用GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(GeneTech(Shanghai)Co.Ltd,China)作为第二抗体和显影剂。染色后，所有切片用显微镜(LeicaDM2500,德国)观察，并用CCD照相机(LeicaDFC420C)拍摄图像。
附图4示出了胶原蛋白I(CollagenI)在创面位置的免疫组化染色结果。由图可知，与阴性对照、阳性对照及对照细胞膜片相比，经生物活性玻璃细胞膜片(稀释比例为1/128)处理的创面位置，胶原蛋白I具有最高的染色强度，表明其具有在创面刺激胶原蛋白I沉积的作用。
生物活性玻璃细胞膜片在创面促进血管生成的效果
创面样本在4％(质量/体积)多聚甲醛(PFA)中固定1天，石蜡包埋并切片，组织切片的厚度约为8μm。对于组织学分析，组织切片复水后与苏木精和伊红共同孵育。对于免疫组化染色，组织切片复水后与0.01M加热的柠檬酸钠(SinopharmChemicalReagentCo.,Ltd,10019418)共同孵育以使抗原修复。0.3％H2O2/甲醇(体积比)用于渗透和灭活，随后用5％的牛血清蛋白(BSA,Sigma)进行封闭。封闭后，含有兔抗-CD31的第一抗体溶液被用于在室温下与样品共同孵育2小时。使用GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(GeneTech(Shanghai)Co.Ltd,China)作为第二抗体和显影剂。染色后，所有切片用显微镜(LeicaDM2500,德国)观察，并用CCD照相机(LeicaDFC420C)拍摄图像。
图5示出了移植细胞膜片后第14天时血管再生的情况。箭头表示经CD31染色的新生血管。可以看到，用生物活性玻璃细胞膜片(稀释比例为1/128)处理的创面位置，新生血管的密度明显高于未处理或用表皮生长因子凝胶处理的创面位置，并且显著地高于对照细胞膜片处理的创面位置。由此说明，生物活性玻璃细胞膜片能显著增强创面位置的血管生成，促进创面的修复。由于生物活性玻璃细胞膜片具有促进血管生成的作用，其对慢性创伤的修复尤其具有良好的修复效果。
本发明的创面修复细胞膜片能促进细胞生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)以及细胞外基质中的胶原蛋白以及纤维粘连蛋白(Fibronectin)的表达。细胞膜片中的成纤维细胞能够迁移进入创面，促进创伤部位肉芽组织中胶原蛋白分泌和血管再生，最终促进创面修复。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种具有生物活性的创面修复细胞膜片，其特征在于，所述创面修复细胞膜片包括经生物活性玻璃浸提液培养的成纤维细胞及所述成纤维细胞的细胞外基质；所述成纤维细胞培养于NuncHydroCellUpCell培养皿，所述创面修复细胞膜片由与所述NuncHydroCellUpCell培养皿配套使用的聚合物膜制得。
2.根据权利要求1所述的具有生物活性的创面修复细胞膜片，其特征在于，所述生物活性玻璃浸提液含有钙离子、磷离子和硅离子。
3.一种制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将生物活性玻璃粉体浸泡于无血清的成纤维细胞培养液，培养1天后无菌过滤收集，得到生物活性玻璃浸提液，所述生物活性玻璃浸提液用成纤维细胞培养液稀释后待用；
步骤二、在NuncHydroCellUpCell培养皿中加入成纤维细胞的细胞悬浮液，用步骤一中制得的含有所述生物活性玻璃浸提液的成纤维细胞培养液进行细胞培养；
步骤三、移除所述NuncHydroCellUpCell培养皿中的培养液，加入预热的成纤维细胞培养液，在所述成纤维细胞上覆盖与所述NuncHydroCellUpCell培养皿配套使用的聚合物膜，室温下静置10至15分钟后，将所述聚合物膜揭起，制得具有生物活性的创面修复细胞膜片。
4.根据权利要求3所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤一中，将1g所述生物活性玻璃粉体浸泡于5mL所述无血清的成纤维细胞培养液中，培养1天后无菌过滤收集，得到生物活性玻璃浸提液，所述生物活性玻璃浸提液用成纤维细胞培养液稀释后待用。
5.根据权利要求4所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述生物活性玻璃浸提液与所述成纤维细胞培养液的稀释比例为1/32至1/256。
6.根据权利要求4所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述生物活性玻璃浸提液与所述成纤维细胞培养液的稀释比例为1/128。
7.根据权利要求3所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述成纤维细胞的细胞悬浮液含有2x105至3x105个成纤维细胞。
8.根据权利要求3所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述细胞培养的时间为3至7天。
9.根据权利要求3所述的制备具有生物活性的创面修复细胞膜片的方法，其特征在于，所述步骤三中，所述预热的成纤维细胞培养液的体积为40μL至60μL。
10.一种根据权利要求1所述的具有生物活性的创面修复细胞膜片在创面修复中的应用。
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