CN111849881A - 一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法，包括以下步骤：(1)取温度敏感培养皿或温度敏感培养板，加入浸润液浸湿后，吸除浸润液；(2)将冻存的脂肪干细胞或培养的脂肪干细胞接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，培养，制备脂肪干细胞膜片；(3)获取脂肪干细胞膜片；(4)脂肪干细胞膜片进行再培养。本发明的方法中，温皿或温皿板不需要包被，可以采用冻存细胞直接接种，细胞膜片与温皿的分离速度快，完整度高，如此可以节省步骤和时间，提高制备效率。

Description

一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法

技术领域

本发明属于干细胞再生医学技术领域，涉及一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法，尤其涉及一种可直接贴附于损伤患处的温度敏感培养皿制备人脂肪干细胞膜片的方法。

背景技术

干细胞是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物组各个织器官的原始细胞。在修复机体、器官移植、医学美容等众多领域都有极高的应用价值。干细胞研究已成为生命科学领域的重大热点。

人体脂肪干细胞多来源于通过美容抽脂手术而获得脂肪组织，在经过化学酶或机械分离后可得到脂肪血管基质成分，再将其脂肪血管基质成分进一步分离提纯、培养扩增后即可得到脂肪干细胞。目前脂肪干细胞除在临床面部美容、乳房填充、整形外科及抗衰老应用外，在机体组织器官损伤、修复的许多临床前研究实验中均已证明脂肪干细胞具有修复损伤细胞的功能，可促进细胞再生。人体脂肪组织储量丰富、获取方便，且并不涉及伦理道德问题，脂肪干细胞有望成为组织工程和器官再生的重要种子细胞。

脂肪干细胞在体外培养时，经特殊培养条件可诱导分化为临床治疗所需的不同细胞。例如，在培养基中添加3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素，地塞米松，吲哚美辛等可诱导分化为脂肪细胞，加入丁基羟基苯甲醚，丙戊酸，胰岛素Forskolin，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，维生素、B27等可诱导分化为神经细胞；也可应用市场购买的诱导试剂盒按照说明进行细胞诱导操作。

脂肪干细胞的临床应用主要通过局部填充、静脉注射或经立体定向手术将诱导分化的脂肪干细胞移植进脑组织特定功能核团。脂肪干细胞的临床作用机制为：脂肪干细胞具有自我更新与多向分化潜能，通过实验室分离培养可以在体外稳定增殖，在添加不同的特定诱导物质条件下，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞等，脂肪干细胞还具有非常好的细胞因子分泌功能可促进血管生成和免疫调控。当脂肪干细胞移入人体后，可通过旁分泌作用调节损伤组织周围的微环境，从而起到促进损伤组织愈合、实现组织修复再生。

细胞膜片制备技术，是通过物理的方法将在特殊处理过的培养皿上扩增融合的细胞从培养皿底壁分离，获得完整膜片状细胞结构的一种技术。与传统胰酶消化收集细胞的方法相比，运用该技术收集到的细胞保留了体外培养过程中分泌的胞外基质、建立的细胞-基质连接以及细胞间连接等结构。细胞膜片技术无须支架材料和酶消化，通过刺激细胞外基质分泌形成致密细胞膜片组织，能100％将细胞保留在病灶组织部位，有效地修复组织缺损和改善器官功能。

细胞膜片可通过多种方法收获。日本学者Okano等提出利用温度敏感型培养皿获得细胞膜片，还有文献报道在培养的细胞中添加不同浓度的维生素C也可收获细胞膜片。温度敏感型培养皿主要由特殊的温度敏感材料聚N-异丙基丙烯酰胺(poly N-isopropylacrylamide，PIPAAm)经过特殊处理后结合在培养皿底面，由于其表面分子链上同时具有亲水性基团酰胺基(-CONH-)和疏水性的异丙基[-CH(CH3)2-]，所以当温皿在37℃细胞培养时皿中的材料为疏水性，细胞处于正常贴壁状态，当温皿离开37℃培养温度至32℃时，温皿中的敏感材料变为亲水性，贴附于培养皿底部的细胞即可自动脱壁并依靠其自身分泌的细胞外基质extracellular matrix(ECM)而形成具有二维结构的完整膜性细胞片。

这种基于在温度敏感型培养皿内培养收获的细胞膜片，其优势为；避免了细胞收获时消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时导致细胞膜蛋白的损伤，而细胞膜蛋白的变异会致使细胞发生功能障碍或功能缺失，这会减弱干细胞在治疗医学上的应用潜能。采用这种降温回收细胞的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白无损共同脱附，有效的保护了细胞膜蛋白和相关受体，从而保证了细胞的生理功能和细胞更强的功能特性。同时也为组织修复和再生医学领域开创了新的研究方向“细胞膜片工程”。

目前采用温皿制备干细胞膜片的制备方法中，不足之处在于：其一，温皿都需要进行包被，具体方法是采用含有粘附功能强的试剂，如血清、明胶、黏连蛋白等进行包被，包被时间长，降低了制备效率，也增加了污染风险；其二，细胞需要经过复苏再培养，需要时间较长；其三，在获取细胞膜片时，细胞膜片与温皿的分离速度和完整性有待进一步改善。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中存在的至少一个问题，提供一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法。本发明的方法中，温皿或温皿板不需要包被，可以采用冻存细胞直接接种，细胞膜片与温皿的分离速度快，完整度高，如此可以节省步骤和时间，提高制备效率，降低污染风险。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法，包括以下步骤：

(1)取温度敏感培养皿或温度敏感培养板，加入浸润液浸湿后，吸除浸润液；

(2)将冻存的脂肪干细胞或培养的脂肪干细胞接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，培养，制备脂肪干细胞膜片；

(3)获取脂肪干细胞膜片；

(4)脂肪干细胞膜片进行再培养。

目前采用温皿制备干细胞膜片的制备方法中，温皿需要进行包被，具体方法是采用含有粘附功能强的试剂，如血清、明胶、黏连蛋白等进行包被，包被时间约8-48h，包被时间长，降低了制备效率，也增加了污染风险。

本发明的方法中，温度敏感培养皿或温度敏感培养板不需要进行包被，只需要采用浸润液浸湿后，吸除浸润液即可，处理时间短，还可以保证细胞贴壁的均匀性，提高制备效率。

温度敏感培养皿具有单个接种空间，每次可以制备单个细胞膜片；温度敏感培养板为具有多个接种空间的结构，例如六孔板，可以同时制备多个细胞膜片，从而提高制备细胞膜片的数量和效率。

进一步的方案，步骤(1)中，所述浸润液包括完全培养基，所述完全培养基由GibcoDMEM/F-12或α-MEM或高糖DMEM或低糖DMEM基础培养基、5％～10％AventaCELL-Helios血清替代物以及5ng/ml-10ng/ml EGF组成。

本发明采用不含有血清的完全培养基作为浸润液，浸湿温度敏感培养皿或温度敏感培养板后吸除，可以避免细胞贴壁不均匀，且处理时间短，降低污染风险。

需要说明的是，除了浸润液外，本发明中其他步骤涉及到的完全培养基，其成分与如上所述的完全培养基相同。

本发明步骤(2)中，可以将培养的脂肪干细胞接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，也可以将冻存的脂肪干细胞直接接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，同样能够制备得到优良的细胞膜片，且冻存的细胞直接接种节省了细胞复苏再培养的时间，提高了制备细胞膜片的效率。具体可采用下述两种方案制备细胞膜片：

方案一

将培养的脂肪干细胞接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，制备细胞膜片，具体包括：

步骤a、脂肪干细胞分离：

1)去除人体脂肪组织上层油脂及下层血性肿胀液，将脂肪组织与生理盐水混合，离心，去除离心后的脂肪上层油脂和底层血性液体；

2)重复上述步骤，获取中层纯脂肪组织；

3)按体积比例加入注射用胶原酶溶液混匀后，放入37℃震荡水浴中消化分解；

4)加入生理盐水，再次离心，留取底部的细胞沉淀；

5)将细胞沉淀加入生理盐水，再次离心去除上层溶液，留取底部的细胞沉淀：

6)重复上述步骤，得到的沉淀为脂肪血管基质成分；

步骤b、脂肪干细胞培养：

1)将得到的脂肪血管基质成分加入完全培养基重悬，取样计数；

2)按照密度为3000～10000cells/cm2的接种量将细胞接种至培养瓶，置于培养箱中静置培养；

3)培养48h后换液，去除未贴壁细胞，此后每72h换液1次；

4)当细胞融合度至80％-90％，进行细胞传代；

5)弃去原培养液，加入BI重组酶消化细胞，镜下观察细胞接近圆形，轻轻拍打，终止消化，取样计数；

6)接种于培养瓶中此时细胞计为P0代；

7)重复步骤4)-6)以获得足够的细胞；传代后的细胞冻存备用。

在上述培养体系下获得的脂肪干细胞，其CD73、CD90、CD105表达量＞95％，CD34、CD45、HLA-DR表达量＜2％；PGE2分泌量＞2000pg/106cells；且具有成脂、成骨的能力。

制备脂肪干细胞膜片的方法包括：

取融合度达到80％-90％的P3-P5细胞，弃去原培养液，消化液消化后以1200r/min、5min离心计数；按照5×106-1×107个/ml细胞的浓度将细胞接种于温度敏感培养皿或温度敏感培养板的各个孔中；在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；优选培养8-12h。

方案二

将冻存的脂肪干细胞直接接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，制备细胞膜片，具体包括：

从液氮中取出冻存脂肪干细胞快速复苏，细胞数量明确时直接接种于温度敏感培养皿或温度敏感培养板中；在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；优选培养8-12h。

所述的冻存脂肪干细胞快速复苏的方法为：将液氮中取出的细胞，快速放入已预加热37℃-38℃的恒温水浴锅中，快速晃动冻存管，使细胞快速溶解，一般在30秒左右完成。

进一步的方案，冻存脂肪干细胞的冻存液为DMSO和人血清白蛋白注射液的混合液，DMSO和人血清白蛋白注射液的体积比为5:95。

采用方案一或方案二制备的脂肪干细胞膜片，都可以通过以下获取方法进行获取。

进一步的方案，步骤(3)中，获取脂肪干细胞膜片方法包括：

1)将温度敏感培养皿或温度敏感培养板中的培养基吸弃，轻轻加入预冷后的清洗液A；

2)将温度敏感培养皿或温度敏感培养板放置于水平摇床上，震荡；

3)细胞膜片将从边缘开始皱缩，慢慢全部脱离呈漂浮状；

4)将细胞膜片转移至普通培养皿或培养板中；

5)用清洗液B洗涤细胞膜片。

进一步的方案，所述的清洗液A为不含有钙离子和镁离子的PBS溶液。

进一步的方案，所述的清洗液B为完全培养基或含有1mmol/L CaCl2和0.5mmol/LMgCl2的PBS溶液。

钙镁离子是细胞膜的主要组成成分，参与细胞粘附等功能。将细胞膜片与温皿分离时，加入预冷的不含钙镁离子的PBS溶液，可以减弱细胞膜粘附作用，使细胞膜片容易脱离培养物。当细胞膜片脱离、收获后，用含钙镁离子PBS溶液或者完全培养基进行洗涤，恢复了细胞膜片表面的粘附功能，使膜片细胞之间结合更加紧密，可以更好的保护细胞膜片的功能，并易于移植贴敷。

本发明加入预冷后的清洗液A后，将温度敏感培养皿或温度敏感培养板放置于水平摇床上，震荡；使用摇床可以加快细胞膜片与温皿分离速度和分离程度，不需要使用其他工具辅助吹打卷曲脱离，如吸管、移液枪等，进一步提高细胞膜片的完整程度。

进一步的方案，步骤(4)中，脂肪干细胞膜片进行再培养的过程包括：脂肪干细胞膜片洗涤后，重新放置到培养箱中培养；然后用清洗液C洗涤。

优选的，所述的清洗液C为含有1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2的PBS溶液。

细胞膜片转移到普通培养皿后，重新放置培养箱中培养15-30分钟，可以增加细胞间的紧密连接，使细胞膜片更紧实不松散；含有1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2的PBS溶液，洗涤细胞膜片3-5次，可以将培养基洗净，也可以更好的保护细胞膜片的功能，并易于移植贴敷。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

1、脂肪干细胞是贴壁生长方式，细胞膜片的制备避免了治疗移植前细胞收获时，细胞经消化胰酶及分散酶对细胞进行消化时细胞膜蛋白的损伤而使细胞功能缺失，减弱了对受损组织的修复效果；采用这种温度应答培养皿、使用预冷的试剂回收细胞膜片的方式，可以使细胞与细胞外基质蛋白没有损伤，且可以一起完全保留的脱离培养皿，从而有效的保护了细胞膜蛋白和其相关受体，保证了移植细胞的生理功能和更强的功能特性。

将通过本发明得到的细胞膜片可直接贴敷于受损的机体组织处，不用通过静脉回输经血液循环后到达受损患处，从而不会发生细胞丢失，使细胞100％保留在病灶处，通过细胞旁分泌的作用调节损伤组织周围的微环境，从而起到促进损伤组织愈合、实现组织修复再生。

2、本发明的方法中，温度敏感培养皿或温度敏感培养板不需要进行包被，只需要采用不含有血清的完全培养基作为浸润液浸湿后，吸除浸润液即可，处理时间短，既能够保证细胞贴壁的均匀性，又能够节约时间，降低污染的风险，提高制备细胞膜片的效率。

3、本发明的方法中，可以将冻存的脂肪干细胞直接接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，同样能够制备得到优良的细胞膜片，且冻存的细胞直接接种节省了细胞复苏再培养的时间，提高了制备细胞膜片的效率。

4、本发明的方法中，加入预冷后的清洗液A后，将温度敏感培养皿或温度敏感培养板放置于水平摇床上，震荡；使用摇床可以加快细胞膜片与温皿分离速度和分离程度，进一步提高细胞膜片的完整度。另外，在细胞膜片与温皿分离时，加入预冷的不含钙镁离子的PBS溶液，可以减弱细胞膜粘附作用，使细胞膜片容易脱离培养物。当细胞膜片脱离、收获后，用含钙镁离子PBS溶液或者完全培养基进行洗涤，恢复了细胞膜片表面的粘附功能，使膜片细胞之间结合更加紧密，可以更好的保护细胞膜片的功能，并易于移植贴敷。

附图说明

附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为分离的人源脂肪组织图；

图2为离心后的脂肪组织图；

图3为显微镜下培养的脂肪细胞图；

图4为35mm温度敏感培养皿示意图；

图5为温度敏感培养皿六孔板示意图；

图6为35mm人源脂肪干细胞膜片图；

图7是放置在温度敏感培养皿中的人源脂肪干细胞膜片的示意图，其中，1为细胞膜片；2为温度敏感培养皿；

图8是脂肪干细胞膜片的应用场景示例之一，皮肤损伤修复；

图9是脂肪干细胞膜片的应用场景示例之二，缺血性心衰大鼠细胞膜片移植。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例中，完全培养基由Gibco DMEM/F-12基础培养基、8％AventaCELL-Helios血清替代物以及8ng/ml EGF组成。

基于温度敏感培养皿制备人脂肪干细胞膜片的方法，包括以下步骤：

步骤a、脂肪干细胞分离：

1)去除抽取的人体脂肪组织上层油脂及下层血性肿胀液，将脂肪组织与生理盐水混合(如图1所示)，脂肪与生理盐水的体积比为1:1，离心(离心后的脂肪组织如图2所示)，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体；

2)重复上述步骤3遍，获取中层纯脂肪组织；

3)按体积比例加入用生理盐水配制的注射用胶原酶溶液，混匀后，放入37℃震荡水浴中消化分解；

4)加入生理盐水，再次离心，留取细胞沉淀；

5)将细胞沉淀加入生理盐水，再次离心去除上层溶液，留取底部细胞沉淀：

6)重复上述步骤，得到的沉淀为脂肪血管基质成分。

步骤b、脂肪干细胞培养：

1)将得到的脂肪血管基质成分加入完全培养基重悬，取样计数；

2)按照密度为3000cells/cm2的接种量将细胞接种至培养瓶，置于培养箱中静置培养；

3)培养48h后换液，去除未贴壁细胞，此后每72h换液1次；

4)当细胞融合度至80％-90％，进行细胞传代；

5)弃去原培养液，加入BI重组酶消化细胞，镜下观察细胞接近圆形，轻轻拍打，终止消化，取样计数；

6)接种于培养瓶中此时细胞计为P0代；

7)重复步骤4)-6)以获得足够的细胞；传代后的细胞冻存于液氮中。

步骤c、脂肪干细胞膜片制备

1、将培养的细胞消化后接种

1)取温度敏感培养皿(如图4所示)加入完全培养基，使培养基完全覆盖温度敏感培养皿，可放置于培养箱中也可室温超净工作台中；

2)取融合度达到80％-90％的P3-P5细胞，弃去原培养液，消化液消化后以1200r/min、5min离心计数；

3)将温皿中的培养基吸去，按照5×106个/ml的细胞浓度接种于35mm的温度敏感培养皿中，在培养箱中37℃，5％CO2静置培养8h；

步骤d、脂肪干细胞膜片获取

1)将温皿中的培养基吸弃，轻轻加入预冷后的PBS溶液(不含Ca2+和Mg2+)；

2)将温皿放置于水平摇床上，加快细胞膜片与培养皿的脱离速度；

3)细胞膜片将从温皿边缘开始皱缩，慢慢全部脱离培养皿呈漂浮状；

4)将细胞膜片转移至普通培养皿中；

5)用完全培养基洗涤细胞膜片3次。

步骤e脂肪干细胞膜片再培养

1)洗好的细胞膜片重新放置培养箱中培养30分钟

2)用含有Ca2+和Mg2+的PBS溶液，洗涤细胞膜片5次。

实施例2

本实施例中，完全培养基由低糖DMEM基础培养基、10％AventaCELL-Helios血清替代物以及10ng/ml EGF组成。

基于温度敏感培养板制备人脂肪干细胞膜片的方法，包括以下步骤：

步骤a、脂肪干细胞分离：

1)去除抽取的人体脂肪组织上层油脂及下层血性肿胀液，将脂肪与生理盐水混合，脂肪与生理盐水的体积比为1:1，离心，去除离心后脂肪上层油脂和底层血性液体；

2)重复上述步骤3遍，获取中层纯脂肪组织；

3)按体积比例加入用生理盐水配制的注射用胶原酶溶液，混匀后，放入37℃震荡水浴中消化分解；

4)加入生理盐水，再次离心，留取细胞沉淀；

5)将细胞沉淀加入生理盐水，再次离心去除上层溶液，留取底部细胞沉淀：

6)重复上述步骤，得到的沉淀为脂肪血管基质成分。

步骤b、脂肪干细胞培养：

1)将得到的脂肪血管基质成分加入完全培养基重悬，取样计数；

2)按照密度为10000cells/cm2的接种量将细胞接种至培养瓶，置于培养箱中静置培养；

3)培养48h后换液，去除未贴壁细胞，此后每72h换液1次；

4)当细胞融合度至80％-90％，进行细胞传代；

5)弃去原培养液，加入BI重组酶消化细胞，镜下观察细胞接近圆形，轻轻拍打，终止消化，取样计数；

6)接种于培养瓶中此时细胞计为P0代；

7)重复步骤4)-6)以获得足够的细胞；传代后的细胞冻存于液氮中。

步骤c、脂肪干细胞膜片制备

1、将培养的细胞消化后接种

1)取温度敏感培养板(如图5所示)，在每个孔中加入完全培养基，使培养基完全覆盖温度敏感培养板的各孔，浸润，可放置于培养箱中也可室温放置在超净工作台中；

2)取融合度达到80％-90％的P3-P5细胞，弃去原培养液，消化液消化后以1200r/min、5min离心计数；

3)将温度敏感培养板中的培养基吸去，按照8×106个/ml的细胞浓度接种于温度敏感培养板的每个孔中，在培养箱中37℃，5％CO2静置培养12h；

步骤d、脂肪干细胞膜片获取

1)将温度敏感培养板中的培养基吸弃，轻轻加入预冷后的PBS溶液(不含Ca2+和Mg2+)；

2)将温度敏感培养板放置于水平摇床上，加快细胞膜片与培养皿的脱离速度；

3)细胞膜片将从温度敏感培养板边缘开始皱缩，慢慢全部脱离培养皿呈漂浮状；

4)将细胞膜片转移至普通培养皿中；

5)用完全培养基洗涤细胞膜片3次。

步骤e脂肪干细胞膜片再培养

1)洗好的细胞膜片重新放置培养箱中培养15分钟

2)用含有Ca2+和Mg2+的PBS溶液，洗涤细胞膜片3次。

本实施例采用温度敏感培养板可一次获得6张细胞膜片且比单皿更好操作，可以提高制备细胞膜片的数量和效率。

实施例3

本实施例中，完全培养基由α-MEM基础培养基、5％AventaCELL-Helios血清替代物以及5ng/ml EGF组成。

基于温度敏感培养皿制备人脂肪干细胞膜片的方法，包括以下步骤：

步骤a、脂肪干细胞膜片制备

1)取温度敏感培养皿加入完全培养基，使培养基完全覆盖温度敏感培养皿，可放置于培养箱中也可室温超净工作台中；

2)从液氮中取出冻存脂肪干细胞快速复苏，冻存液为DMSO和人血清白蛋白注射液的混合液，DMSO和人血清白蛋白注射液的体积比为5:95；按照1×107个/ml细胞的浓度将细胞直接接种于温度敏感培养皿或温度敏感培养板中；在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养，培养10h。

步骤b、脂肪干细胞膜片获取

1)将温皿中的培养基吸弃，轻轻加入预冷后的PBS溶液(不含Ca2+和Mg2+)；

2)将温皿放置于水平摇床上，加快细胞膜片与培养皿的脱离速度；

3)细胞膜片将从温皿边缘开始皱缩，慢慢全部脱离培养皿呈漂浮状；

4)将细胞膜片转移至普通培养皿中；

5)用含有Ca2+和Mg2+的PBS溶液洗涤细胞膜片3次。

步骤e脂肪干细胞膜片再培养

1)洗好的细胞膜片重新放置培养箱中培养15分钟

2)用含有Ca2+和Mg2+的PBS溶液，洗涤细胞膜片5次。

实施例1-3制备的人源脂肪干细胞膜片的示意图如图6和图7所示，细胞膜片可直接贴敷于受损的机体组织处，不用通过静脉回输经血液循环后到达受损患处，从而不会发生细胞丢失，使细胞100％保留在病灶处，通过细胞旁分泌的作用调节损伤组织周围的微环境，从而起到促进损伤组织愈合、实现组织修复再生。

人源脂肪干细胞膜片在临床上可以应用于多种场景，例如，如图8所示，用于皮肤损伤修复；如图9所示，缺血性心衰大鼠细胞膜片移植进行修复。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (10)

1.一种基于温皿制备人源脂肪干细胞膜片的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取温度敏感培养皿或温度敏感培养板，加入浸润液浸湿后，吸除浸润液；

(2)将冻存的脂肪干细胞或培养的脂肪干细胞接种至温度敏感培养皿或温度敏感培养板中，培养，制备脂肪干细胞膜片；

(3)获取脂肪干细胞膜片；

(4)脂肪干细胞膜片进行再培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浸润液包括完全培养基，所述完全培养基由Gibco DMEM/F-12或α-MEM或高糖DMEM或低糖DMEM基础培养基、5％～10％AventaCELL-Helios血清替代物以及5ng/ml-10ng/ml EGF组成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，脂肪干细胞通过以下步骤培养获得：

步骤a、脂肪干细胞分离：

1)去除人体脂肪组织上层油脂及下层血性肿胀液，将脂肪组织与生理盐水混合，离心，去除离心后的脂肪上层油脂和底层血性液体；

2)重复上述步骤，获取中层纯脂肪组织；

3)按体积比例加入注射用胶原酶溶液混匀后，放入37℃震荡水浴中消化分解；

4)加入生理盐水，再次离心，留取底部的细胞沉淀；

5)将细胞沉淀加入生理盐水，再次离心去除上层溶液，留取底部的细胞沉淀：

6)重复上述步骤，得到的细胞沉淀为脂肪血管基质成分；

步骤b、脂肪干细胞培养：

1)将得到的脂肪血管基质成分加入完全培养基重悬，取样计数；

2)按照密度为3000～10000cells/cm2的接种量将细胞接种至培养瓶，置于培养箱中静置培养；

3)培养48h后换液，去除未贴壁细胞，此后每72h换液1次；

4)当细胞融合度至80％-90％，进行细胞传代；

5)弃去原培养液，加入BI重组酶消化细胞，镜下观察细胞接近圆形，轻轻拍打，终止消化，取样计数；

6)接种于培养瓶中此时细胞计为P0代；

7)重复步骤4)-6)以获得足够的细胞；传代后的细胞冻存备用。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，制备脂肪干细胞膜片的方法包括：

取融合度达到80％-90％的P3-P5细胞，弃去原培养液，消化液消化后以1200r/min、5min离心计数；按照5×106-1×107个/ml细胞的浓度将细胞接种于温度敏感培养皿或温度敏感培养板的各个孔中；在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；优选培养8-12h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，制备脂肪干细胞膜片的方法包括：

从液氮中取出冻存脂肪干细胞快速复苏，细胞数量明确时直接接种于温度敏感培养皿或温度敏感培养板中；在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养；优选培养8-12h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，冻存脂肪干细胞的冻存液为DMSO和人血清白蛋白注射液的混合液，DMSO和人血清白蛋白注射液的体积比为5:95。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，获取脂肪干细胞膜片方法包括：

1)将温度敏感培养皿或温度敏感培养板中的培养基吸弃，轻轻加入预冷后的清洗液A；

2)将温度敏感培养皿或温度敏感培养板放置于水平摇床上，震荡；

3)细胞膜片将从边缘开始皱缩，慢慢全部脱离呈漂浮状；

4)将细胞膜片转移至普通培养皿或培养板中；

5)用清洗液B洗涤细胞膜片。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的清洗液A为不含有钙离子和镁离子的PBS溶液。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的清洗液B为完全培养基或含有1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2的PBS溶液。

10.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，脂肪干细胞膜片进行再培养的过程包括：脂肪干细胞膜片洗涤后，重新置于培养箱中培养；然后用清洗液C洗涤。

优选的，所述的清洗液C为含有1mmol/L CaCl2和0.5mmol/L MgCl2的PBS溶液。

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