CN110478528B - 一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型的促组织修复材料的制备方法及其应用，特别是可用于骨缺损和修复治疗，属于组织工程和再生医学领域。复合支架采用的是TGF‑β3‑壳聚糖‑骨胶原蛋白微球、含生物活性类人胶原蛋白的壳聚糖海绵混合冻干制备的复合支架。该复合支架具有生物相容性好，能促进损伤组织周围细胞增殖、粘附和募集体内的干细胞，适应于细胞生长及成骨分化等特点。同时本发明中，牙周膜干细胞与支架材料能够紧密结合，有助于细胞在支架材料中的良好生长，使其具有更强的成骨分化能力，能够更好地应用于骨缺损的治疗。在骨组织工程和再生医学领域，尤其是骨缺损治疗和修复等方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程和再生医学领域，更具体地提供一种新型的促组织修复材料、其制备方法及其应用，特别是可用于骨缺损和修复治疗。
背景技术
骨缺损是指由于创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等造成的骨结构完整性被破坏的疾病，是临床上常见的症状。通常，严重的骨缺损无法自行愈合和修复，必须借助骨修复材料才能得到有效的恢复。近年来，骨组织再生工程技术的快速发展为骨缺损的治疗和修复提供了新的途径。目前的研究表明，常见的骨组织缺损和修复的替代材料主要有天然高分子材料、人工合成高分子、无机材料、纳米材料等。上述材料各有其优缺点。其中用于骨组织工程材料的天然高分子材料主要有胶原、纤维蛋白、藻酸盐琼脂糖、壳聚糖等，它们均具有良好的生物相容性和可降解性，对人体的副作用小。根据材料的各种特性，将两种或两种以上的材料进行混合制备出性能更加优良的复合材料是骨组织工程生物支架发展的重要方向。
生物医用领域中，壳聚糖支架是一种成熟支架，已用于生物医学研究多年。具有可以给细胞的生长提供空间，使其在支架上生长、繁殖，最终形成具有一定功能的器官的特点。
在骨组织工程中，细胞-支架材料的构建是一个重要环节，常由于支架的粘附性、促生长和增殖特性以及生物相容性或者种子细胞的选择不当等原因造成骨缺损和修复的失败。同时，生长因子在支架中的意义也不容忽视，生长因子的类型和释放顺序对骨缺损后的修复意义重大。
发明内容
本发明的目的是在于针对组织工程中生物支架材料和种子细胞选择、细胞-支架复合材料制备方法、细胞-支架复合材料与组织生物相容性等方面存在的问题，提出了一种基于hPDLSC和TGF-β3微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵复合支架的制备方法及其在骨缺损治疗和修复方面的应用。
更具体地，本发明提供了以下各项：
1.一种复合促组织修复材料(复合支架)，其包含：
第一组织修复材料，所述第一组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞生长或增殖)的第一活性剂；和
分散/包埋在所述第一组织修复材料中的多个颗粒，所述颗粒由第二组织修复材料组成，所述第二组织修复材料含有/涂布有促组织修复(细胞分化)的第二活性剂，
其中所述第一活性剂与所述第二活性剂不同，并且所述第一活性剂从所述第一组织修复材料的释放要早于(或释放速度要大于)所述第二活性剂从所述第二组织修复材料的释放，和/或所述复合促组织修复材料顺序释放所述第一活性剂和所述第二活性剂。
2.根据以上1所述的复合促组织修复材料，其中：
1)所述复合促组织修复材料是用于骨组织修复；
2)所述第一组织修复材料和所述第二组织修复材料相同或不同，并且彼此独立地选自天然高分子材料、人工合成高分子材料、无机材料、纳米材料或它们的组合，优选具有生物相容性和可降解性，更优选选自胶原、纤维蛋白、藻酸盐琼脂糖和壳聚糖，最优选壳聚糖，其中所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖(海绵状)，而所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成所述颗粒，优选所述颗粒为球形(微球)；
3)所述第一组织修复材料和/或所述第二组织修复材料还可以含有一种或多种促组织修复的另外的活性剂；和/或
4)所述第一活性剂用于组织修复的早期阶段如细胞生长或增殖阶段，并且所述第二活性剂用于组织修复的中期或后期阶段如细胞分化阶段。
3.根据以上1或2所述的复合促组织修复材料，其中所述复合促组织修复材料还包括或贴附有用于组织修复的种子细胞，其可为已分化的组织细胞(如成骨细胞)或者未分化的干细胞，优选干细胞，如骨髓基质干细胞、骨膜干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和牙周膜干细胞。
4.根据以上1-3中任一项所述的复合促组织修复材料，其中：
1)所述复合促组织修复材料是骨组织修复材料；
2)所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖，所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成微球；
3)所述第一活性剂为促进骨细胞生长或增殖的细胞因子，优选EGF(表皮生长因子)，更优选类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白；
4)所述第二活性剂为促进骨细胞分化的细胞因子，优选TGF-β(转化生长因子-β)和BMP-2，更优选TGF-β3；
5)所述第二组织修复材料还含有骨胶原蛋白；
6)所述种子细胞为牙周膜干细胞；和/或
7)所述复合促组织修复材料顺序释放EGF和TGF-β(优选TGF-β3)。
5.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其中所述第二组织修复材料为TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球，其通过包括以下步骤的方法(乳化法)制备：
1)制备水相和油相，其中水相包括壳聚糖(CS)醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液，油相为液体石蜡、石油醚和span 80的混合物；
2)将壳聚糖(CS)醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液混合均匀，之后逐滴加入所述油相中，搅拌均匀后加入戊二醛进行交联，之后静置过夜，离心去上清；
3)将沉淀依次用有机溶剂和水漂洗，得到壳聚糖-骨胶原蛋白微球；和
4)将得到的壳聚糖-骨胶原蛋白微球与TGF-β3溶液充分浸泡后冻干得到TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球。
6.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其中所述第一组织修复材料为含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备：
1)制备所述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的溶液，优选所述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和
2)将壳聚糖溶液通过冷冻干燥得到壳聚糖海绵，将其充分浸泡于上述类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的溶液中，之后冻干得到含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖。
7.根据以上4所述的复合促组织修复材料，其通过包括以下步骤的方法制备：将以上5中定义的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球的溶液与以上6中定义的含有类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的壳聚糖充分混合，之后冷冻干燥。
8.根据以上3所述的复合促组织修复材料，其中所述种子细胞为人牙周膜干细胞(hPDLSC)，优选原代牙周膜干细胞，并且将其接种至所述复合促组织修复材料上。
9.根据以上1-8中任一项所述的复合促组织修复材料在制备用于组织缺损治疗或修复、特别是骨缺损治疗或修复的药物或试剂盒中的应用。
10.根据以上9所述的应用，其中通过外科手术方法将所述复合促组织修复材料移植到组织缺损部位、特别是骨缺损部位。
因此，本发明中提供了一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球-含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。
通过TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球与含类人胶原-EGF融合蛋白海绵复合的方式，能够实现EGF和TGF-β3的顺序释放。早期含类人胶原-EGF融合蛋白能够为复合支架提供较优的生物相容性，其中类人胶原结构能促进牙周膜干细胞在支架材料上粘附伸展，EGF结构能促进牙周膜干细胞的增殖。后期释放TGF-β3能够促进牙周膜干细胞的成骨分化能力，能够更好地应用于骨缺损的治疗。
附图说明
图1为本发明的壳聚糖支架外观及扫描电子显微镜下的形态结构；
图2为本发明的复合壳聚糖支架材料蛋白顺序释放情况；
图3为本提取的牙周膜干细胞外观图；
图4为提取的牙周膜干细胞流式细胞术鉴定图；
图5为提取的牙周膜干细胞成脂肪分化图；
图6为提取的牙周膜干细胞成软骨分化图；
图7为本发明提取的牙周膜干细胞在复合支架上活/死细胞染色图；
图8为本发明的牙周膜干细胞与复合支架材料修复颅骨损伤大鼠CT图；和
图9为本发明的牙周膜干细胞与复合支架材料修复颅骨损伤大鼠愈合结果统计图。
具体实施方式
本发明提出了一种hPDLSC-TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵复合支架，其生物相容性较好，能够顺序释放EGF和TGF-β3，并且能够适应细胞生长及成骨分化，制备方法相对简单，在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前期。
根据本发明的含类人胶原-EGF融合蛋白兼具类人源胶原与EGF的生物活性，能够促进细胞的粘附、增殖、迁移作用(中国专利CN104098701B(201410352444.1))。EGF具有促进牙周膜干细胞成骨分化的潜能。
在一个优选实施方案中，本发明的类人胶原-EGF融合蛋白为中国专利CN104098701B(201410352444.1)中权利要求1所述的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其包括第一区和第二区；其中所述第一区位于所述融合蛋白的C-末端，并且所述第二区位于所述融合蛋白的N-末端，其中所述第一区为人胶原蛋白的氨基酸序列，所述第二区为人表皮细胞生长因子EGF；并且所述第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是(GGGS)n，其中n＝1～5的整数。最优选地，所述类人胶原-EGF融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
MHHHHHHNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELRGGGSGGGSGGGSMTSGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASHHHHHH(SEQ ID NO.1)(粗体下划线部分为EGF)
转化生长因子-β是一个多肽生物因子超家族，在胚胎发育、骨改建、细胞增殖分化等方面起到重要的作用。研究发现，BMP-2和TGF-β3能显著上调骨特异性标志物RUNX-2和OSX的表达水平，且TGF-β3可增强BMP-2的成骨功能，认为TGF-β3可能是促进骨形成的启动因子。同时TGF-β3是一种同源双链多肽蛋白，在骨组织中含量丰富，它可以促进牙周膜细胞的有丝分裂和蛋白合成，下调ALP活性、OC的合成、矿化结节的形成等成骨表型的表达。
近年来研究者从成人第三磨牙的牙周组织中成功分离培养出一种新的间充质干细胞-牙周膜干细胞，它是一种具有多向分化潜能，参与免疫调节、诱导免疫耐受、并具有组织修复能力的干细胞。Yunpeng Zhang等(Zhang Y,Xing Y,Jia L,et al.An In VitroComparative Study of Multisource Derived Human Mesenchymal Stem Cells forBone Tissue Engineering.Stem cells and development 2018；27:1634-1645.Liu J,YuF,Sun Y,et al.Concise reviews:Characteristics and potential applications ofhuman dental tissue-derived mesenchymal stem cells.Stem cells2015；33:627-638)证明牙周膜干细胞与骨髓间充质干细胞比较后发现，它们具有相似的细胞形态和流式细胞谱，并且都具有克隆形成能力及多向分化能力，然而，不同的是牙周膜干细胞较骨髓间充质干细胞相比，具有更高的增殖能力及抗凋亡能力，并且在骨诱导培养基中显示了更高的矿化能力。更重要的是，从人体提取骨髓间充质干细胞的过程是一种有创性的，并且给患者带来巨大的痛苦；而牙周膜干细胞的获得相比就简单便捷，临床治疗中的一些丢弃的牙齿都可以作为干细胞库的可靠来源。
在一个实施方案中，本发明提供了一种新型的促组织修复材料，其特征在于：所述修复材料是由TGF-β3壳聚糖/骨胶原蛋白微球,含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵以及所使用的种子细胞人牙周膜干细胞组成的。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架的制备方法，具体包括以下步骤。
TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球的制备：
(1)采用乳化法制备微球，水相：1-3w％的壳聚糖(CS)醋酸水溶液和浓度为1-4mg/mL的骨胶原蛋白水溶液，油相：14mL液体石蜡，10mL石油醚，0.72mL span 80；
(2)分别取1-4mL CS溶液和1mL骨胶原蛋白溶液(CS溶液：骨胶原蛋白溶液(v/v)＝1-4:1)，混合均匀后逐滴加入油相中，磁力搅拌1500r/min，混匀后，加入1.5mL的25％的戊二醛在35℃下进行交联，之后静置过夜，3500g离心去上清；
(3)将沉淀依次用石油醚洗涤3次，甲醇洗涤2次，丙酮洗涤1次，异丙酮洗涤1次，乙醇洗涤1次，蒸馏水洗涤2次漂洗，得到壳聚糖/骨胶原蛋白微球；
(4)在低温下，将壳聚糖/骨胶原蛋白微球与TGF-β3溶液充分浸泡后冻干得TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球；
(5)最后冷冻干燥收集，显微镜观察。
含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：
(1)含类人胶原-EGF融合蛋白的制备方法同专利CN 104098701B(201410352444.1)所述；
(2)将浓度为1-3w％的壳聚糖溶液通过冷冻干燥的方法得到壳聚糖海绵，再于低温下将冻干的壳聚糖海绵充分浸泡于(1)中的含类人胶原-EGF融合蛋白溶液中，最后在冷冻干燥机中冻干得到含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。
TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：将以上得到的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球(溶液)与以上得到的含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵充分混合后真空冷冻干燥得到TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：
(1)用含有10w％胎牛血清的MEM培养基制备1×105个/mL的hPDLSC悬液，并接种于24孔板的无菌复合材料TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵上，每孔加入hPDLSC细胞悬液1mL；
(2)将24孔板置于37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养一周后进行细胞与复合支架的特征鉴定。
本发明的另一目的是提供一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架的应用。
本发明还提供了一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架的应用，具体包括以下步骤：
(1)复合支架的制备：复合支架的制备方法根据本发明所提供的一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架的制备方法进行；
(2)骨缺损部位准备：骨缺损主要有感染、疾病和创伤等引起；
(3)复合支架移植：通过外科手术的方式将与所述步骤(1)中制备的与缺损部位大小适中的复合支架移植到步骤(2)的骨缺损部位，缝合伤口、固定支架移植部位、消毒；
(4)复合支架对骨缺损的治疗和修复效果鉴定：通过物理方法、支架移植部位组织结构、组织切片等方法鉴定复合支架及其对骨缺损的治疗和修复效果。
本发明所提供的另一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架的应用，具体包括以下步骤：
(1)细胞-复合支架的制备：细胞-复合支架的制备方法根据所诉的本发明所提供的一种用于骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法进行；
(2)骨缺损部位准备：骨缺损主要有感染、疾病和创伤等引起；
(3)细胞-支架复合材料移植：通过外科手术的方式将步骤(1)中制备的与缺损部位大小适中的细胞-支架复合材料移植到骨缺损部位，缝合伤口、固定细胞-支架移植部位、消毒；
(4)细胞-复合支架对骨缺损的治疗和修复效果鉴定：通过物理方法、支架移植部位组织结构、组织切片等方法鉴定细胞-复合支架及其对骨缺损的治疗和修复效果。
本发明具有实质性特点和显著性进步。本发明针对在骨组织工程中的支架、种子细胞以及细胞-支架复合支架制备等方面存在的问题，采用TGF-β3微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵制备的复合支架，具有降解速度适中、生物相容性良好、能够顺序释放EGF和TGF-β3以适应于细胞在支架材料上粘附，生长和成骨分化。同时使用健康人牙周膜提取的具有多分化潜能、增殖能力强、安全性相对较好、来源较为丰富的牙周膜干细胞作为种子细胞，并基于二者特征发明了种子细胞与TGF-β3微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵制备的复合支架的制备方法。本发明方法属于骨组织工程和再生医学技术，在骨组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
实施例
本发明提供的复合支架材料中所用试剂、材料或仪器均可由市场购得。除非另外指出或明显矛盾，百分比为重量百分比。
下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案，实施例仅为了更好理解本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球的制备：
(1)采用乳化法制备微球，水相：2w％的壳聚糖(郑州科瑞精细化工有限公司，分子量3.6KD，脱乙酰度50％)(CS)醋酸水溶液和浓度为4mg/mL的骨胶原蛋白(东莞汉朔建元生物科技有限公司)水溶液，油相：14mL液体石蜡，10mL石油醚，0.72mL span 80；
(2)分别取4mL CS溶液和1mL骨胶原蛋白溶液(CS溶液：骨胶原蛋白溶液(v/v)＝4:1)，混合均匀后逐滴加入油相中，磁力搅拌1500r/min，混匀后，加入1.5mL的25％的戊二醛在35℃下进行交联，之后静置过夜，3500g离心去上清；
(3)将沉淀依次用石油醚(3)，甲醇(2)，丙酮(1)，异丙酮(1)，乙醇(1)，蒸馏水(2)漂洗，得到壳聚糖/骨胶原蛋白微球；
(4)在低温下，将壳聚糖/骨胶原蛋白微球与TGF-β3(广州暨南大学医药生物技术研究开发中心，1μg/mL)溶液充分浸泡后冻干得TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球；
(5)最后冷冻干燥收集，显微镜观察。
实施例2
含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：
(1)含类人胶原-EGF融合蛋白的制备方法同专利CN 104098701B(201410352444.1)所述；
(2)将浓度为2w％的壳聚糖溶液通过冷冻干燥的方法得到壳聚糖海绵，再于低温下将冻干的壳聚糖海绵充分浸泡于(1)中的含类人胶原-EGF融合蛋白溶液(12μg/mL)中，最后在冷冻干燥机中冻干得到含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。
实施例3
TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：
将实施案例1中得到的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球(溶液)(0.4-1mL)与实施案例2中得到的含类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵(2～10mg)充分混合后真空冷冻干燥得到TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵。
本发明中制备的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架外观形状如附图1所示。附图1，A和附图1，B分别为支架外观(宏观)与扫描电镜下的本发明的复合支架的结构(微观)特征图。经孔径分析、孔隙率分析、吸水率分析，制备的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架孔径分布均匀，孔径大小为100μm-300μm，孔隙率约为91.8％，贯通性好有利于物质交换，适宜于种子细胞在支架材料上附着、生长和增殖。
实施例4
TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架药效学试验：
具体步骤如下:
(1)将实施例3中得到的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架浸泡在无血清的新鲜培养基(MEM,Giboc,美国)中，在预定时间点(1天，3天，7天，14天，21天，28天和35天)，收集含有EGF和TGF-β3的上清液，并加入等体积的新鲜培养基；
(2)通过特异性酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)(人转化生长因子β3(TGF-β3)ELISA Kit,武汉华美生物工程有限公司)分别检测各时间点TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架浸泡液中TGF-β3，EGF释放量。
本发明中制备的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架蛋白释放情况如附图2所示。附图2，A和附图2，B分别为EGF和TGF-β3的释放情况。在早期，附着在壳聚糖海绵上的EGF具有较高的释放，有利于种子细胞在支架材料上的粘附/贴附与增殖。在后期壳聚糖微球中TGF-β3的释放有利于种子细胞的成骨分化。
实施例5
牙周膜干细胞的原代分离及鉴定(参见Saito MT,Silverio KG,Casati MZ,Sallum EA,Nociti FH,Jr.Tooth-derived stem cells:Update and perspectives.Worldjournal of stem cells 2015；7:399-407.Wei K,Xie Y,Chen T,et al.ERK1/2signalingmediated naringin-induced osteogenic differentiation of immortalized humanperiodontal ligament stem cells.Biochemical and biophysical researchcommunications2017；489:319-325.Yao S,Zhao W,Ou Q,Liang L,Lin X,WangY.MicroRNA-214Suppresses Osteogenic Differentiation of HumanPeriodontalLigament Stem Cells by Targeting ATF4.Stem cellsinternational 2017；2017:3028647.)：
本实施例的牙周膜干细胞来源于人第三磨牙(智齿)的牙周膜组织，按照上述参考文献，具体分离及鉴定如下步骤。
(1)牙周膜干细胞的分离提取：把牙齿置于含双抗(100mg/mL链霉素和100U/mL青霉素)的PBS中，转移至实验室，把牙齿置于75％乙醇中消毒1min后，加入10mL含双抗的PBS洗两遍。用无菌手术刀片刮取牙根1/3区域的牙周膜组织，置于PBS中，800g离心3min，去上清。加入10-20倍牙周膜组织体积的I型胶原酶，置于37℃，每5min震荡摇匀，15-25min后，800g离心10min，去上清，加入完全培养基(含10％血清的MEM培养基)吹打均匀后接种在12孔板中，3天换液一次，细胞融合达到70-80％后，室温条件下，0.25％胰蛋白酶消化2分钟，1000rpm/min离心5min，弃除上清，吹打沉淀，混匀后以1:3比例传代，每3天换液1次，取第三代牙周膜干细胞进行观察。附图3为分离的牙周膜干细胞形态图。
(2)牙周膜干细胞流式鉴定：取步骤(1)P3代牙周膜干细胞，待其生长至汇合度80～90％时，胰酶消化后收集细胞，取两个流式管，每管1×106个细胞，用染色缓冲液(体积百分数10％FBS+体积百分数90％PBS)洗两遍，每管加入200uL染色缓冲液，样品加入下列7个抗体CD90，CD166，CD105CD44，CD34，HLA-DR，和CD45(BD Biosciences,美国)各5uL。阴性对照不加抗体，常温孵育20min，用染色缓冲液重洗两遍，后用500uL PBS重悬，用流式细胞仪采集20000个样本，检测其表面标志物CD90，CD166，CD105CD44，CD34，HLA-DR，和CD45的表达情况。附图4为分离的牙周膜干细胞流式细胞鉴定结果。
(3)牙周膜干细胞的成脂分化鉴定：取步骤(1)第三代牙周膜干细胞以3000个/cm2密度接种于6孔板中，分化组加入成脂分化培养液，成脂分化培养液为1.0μg/mL地塞米松、5μg/mL胰岛素、0.5mmol/L IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)和60μmol/L吲哚美辛，对照组加入完全培养液，2-3天更一次培养基。诱导分化3周，吸弃细胞培养液，0.01M PBS冲洗3次，4％多聚甲醛固定30min，0.01M PBS冲洗3次，吸干后油红染色15min，蒸馏水冲洗后显微镜下观察见串珠状圆形透明脂滴形成；
(4)牙周膜干细胞的成软骨分化鉴定：取步骤(1)第三代牙周膜干细胞以3000个/cm2密度接种于6孔板中，分化组加入成软骨分化培养液，成软骨培养液为MEM基础培养基中加入10μg/mL ITS-X，10ng/mL TGF-β3，1.0μg/mL地塞米松，5.35μg/mL亚酸油，10％胎牛血清，1％谷氨酸，1％青霉素或链霉素，对照组加入完全培养液。培养4周后检测成软骨分化情况。PBS缓冲液冲洗2-3遍，4％多聚甲醛室温避光条件下固定30min，弃去固定液，蒸馏水清洗3遍后，每孔加入2mL阿利新蓝染色液室温避光条件下染色15-20min后吸弃，蒸馏水漂洗数遍，显微镜下拍照观察。
提取的牙周膜干细胞如图附图3，A，B所示，本实验通过酶解组织块法对原代细胞进行提取分离，培养3-10天后如附图3，A所示，并向四周呈放射状贴壁生长，细胞自组织块游离出后，培养4-7天后可见多个呈长梭形、多角形等形态的原代细胞。经纯化培养后细胞均呈长梭形，胞浆丰富、胞核呈圆形并居于细胞中央，如附图3，B所示。
P3代牙周膜干细胞流式鉴定结果如附图4所示。结果显示人间充质细胞表面阳性标记物(97.7％)、CD166(98.7％)、CD44(99.4％)、CD90(98.6％)在hPDLSCs表面呈现高表达，造血干细胞及白细胞表面阴性标记物CD34(0.07％)、CD45(0.07％)和HLA-DR(0.38％)在hPDLSCs表面呈现低表达。所分离提取的牙周膜干细胞纯度较高。
P3代牙周膜干细胞成脂分化结果如附图5所示。附图5，A为对照组，附图5，B为成脂诱导组。结果显示hPDLSCs经体外成脂诱导后，油红O染色后镜下可见成簇状、体积大小不一、大多聚集分布的红色圆形脂滴，而对照组染色后未见脂滴，证明分离获得的牙周膜间充质干细胞有较好的成脂分化能力。
P3代牙周膜干细胞成软骨分化结果如附图6所示。附图6，A为对照组，附图6，B为成软骨诱导组。hPDLSCs经体外成软骨诱导后进行阿利新蓝染色，与对照组相比，诱导组镜下可见大面积深浅不一的蓝色组织，这表明牙周膜干细胞细胞向软骨细胞分化。
实施例6
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵的制备：
(1)将上述实施例3中制备好的、经过无菌处理的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架置于细胞培养24孔板中；
(2)用10％胎牛血清的MEM培养基混悬实施例5中制备的种子细胞，并调整细胞浓度为每毫升1×105个；
(3)将步骤(2)中的牙周膜干细胞接种到步骤(1)中24孔板中的无菌复合支架上，每孔接种种子细胞1mL；
(4)将步骤(3)中的24孔板置于37℃、5％CO2、90％湿度条件下培养，每2天更换一次培养液，共培养7天。
实施例7
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架的生物相容性评价：
(1)将实施案例6中的hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架培养7天后，小心吸走24孔板中的培养基；
(2)其中一部分24孔板中加入2mL戊二醛溶液固定细胞，冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜下观察细胞在支架上的形态及生长和粘附情况；
(3)剩余24孔板中用染色缓冲液重复洗涤细胞，加入Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染染色液AM-PI对支架上细胞进行染色，荧光显微镜下观察细胞在支架材料上的活死状态。
牙周膜干细胞在TGF-β3/EGF/CS支架材料上生长存活状态如附图7所示。Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂(上海翊圣生物科技有限公司)是一种分别对活细胞及死细胞进行双重荧光标记的染色试剂，成功标记后可使活细胞发绿色荧光而死细胞发红色荧光，以此进行活细胞和死细胞水平的分析。附图7为牙周膜干细胞在TGF-β3/EGF/CS支架材料上培养7天后Calcein-AM/PI双染色的结果(图7，A绿色荧光代表存活的细胞，图7，B的红荧光代表死亡的细胞，图7，C为图7，A与图7，B的叠加图)，结果显示牙周膜干细胞在TGF-β3/EGF/CS支架材料上生长状态良好，细胞结构完整，细胞在材料上充分粘附伸展，且活细胞数目远多于死细胞，说明TGF-β3/EGF/CS支架材料适合牙周膜干细胞的粘附定植，生物相容性好。
实施例8
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架对SD大鼠颅骨缺损的治疗和修复作用
包括以下步骤和方法：
(1)细胞-复合支架的制备：按照实施例6中提供的方法制备细胞-复合支架；
(2)SD大鼠颅骨缺损制备：SD大鼠颅骨缺损制备方法为手术造模，SD大鼠(8周龄SPF级)(广东省实验动物中心)进行实验，腹腔注射1％的戊巴比妥钠(40mL/kg)进行全身麻醉，去颅顶毛，四肢固定于手术台，碘伏彻底消毒，逐层切开分离颅顶皮肤，肌肉及骨膜，使用5mm牙科钻，在颅骨左右两侧各造出直径5mm的圆形缺损，左边不做处理，右边为植入材料。
(3)实验分为2个处理组。每组6只：A组颅骨左边用牙科钻造成直径5mm的圆形缺损，不进行治疗，右边用牙科钻造成直径5mm的圆形缺损，植入本发明的TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架填充缺损，然后缝合伤口，消毒。B组颅骨左边用牙科钻造成直径5mm的圆形缺损，不进行治疗，右边用牙科钻造成直径5mm的圆形缺损，植入本发明的hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架填充缺损，然后缝合伤口，消毒；
(4)3个月后观察、检测2组骨缺损部位的治疗和修复情况，骨缺损部位的治疗修复情况采用CT和组织切片等方法进行分析。
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架对SD大鼠颅骨缺损的治疗和修复效果如附图8所示。颅骨左侧缺损均为空白对照组，缺损后不进行治疗。附图8，A右侧缺损为TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架植入组。附图8，B右侧缺损为hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架组。由CT结果可知，在治疗3个月时，对照组新生骨量十分少，缺损部位仍有大量的空缺部分。而hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架植入组颅骨缺损部位有大量的新生骨，且新生骨的体积和厚度与周围正常骨相近。hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架植入组相较于其他组，颅骨缺损的治疗和修复效果显著提高。
hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架对SD大鼠颅骨缺损的治疗和修复效果统计结果如附图9所示(control表示对照，TGF-β3/类人胶原-EGF/CS表示本发明的复合支架/复合促组织修复材料，TGF-β3/类人胶原-EGF/CS+hPDLSCs表示接种了hPDLSC的本发明的复合支架/复合促组织修复材料)。附图9，A中BV指感兴趣区域中被定义为骨组织的体积(mm3)，即代表新生骨的体积。结果显示，hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架植入组新生骨体积显著性高于其他各组，新生的骨体积明显。附图9，B，骨体积分数(BV/TV)表示骨组织体积与组织体积比值(新生骨体积相较与损伤前完整骨体积之比)，可直接反应骨量变化情况，结果显示hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架植入组新生骨面积较缺损面积比例最高，新生骨量体积显著高于其他各组，具有最佳的治疗和修复效果。
以上实施例说明，本发明提供的hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架制备方法及利用本发明提供的方法制备的hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架能够对骨缺损进行有效治疗和修复，本发明提供的hPDLSC-TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球-类人胶原-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵支架的制备方法在骨组织工程和再生医学领域，尤其是骨缺损治疗和修复方面具有广阔的应用前景。
本发明公开了一种用于骨缺损治疗和修复的复合支架，本领域技术人员可以借鉴本文内，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明的技术。
Claims (11)
1.一种复合促组织修复材料，其包含：
第一组织修复材料，所述第一组织修复材料含有/涂布有促组织修复的第一活性剂；和
分散或包埋在所述第一组织修复材料中的多个颗粒，所述颗粒由第二组织修复材料组成，所述第二组织修复材料含有或涂布有促组织修复的第二活性剂，
其中所述第一活性剂与所述第二活性剂不同，并且所述第一活性剂从所述第一组织修复材料的释放要早于所述第二活性剂从所述第二组织修复材料的释放，和/或所述复合促组织修复材料顺序释放所述第一活性剂和所述第二活性剂，其中：
1)所述复合促组织修复材料是骨组织修复材料；
2)所述第一组织修复材料是未交联的壳聚糖，所述第二组织修复材料是交联壳聚糖并且形成微球；
3)所述第一活性剂为促进骨细胞生长或增殖的细胞因子，其为类人胶原蛋白-EGF融合蛋白，由此形成含有类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的壳聚糖海绵；
4)所述第二活性剂为促进骨细胞分化的细胞因子，其为TGF-β3；
5)所述第二组织修复材料还含有骨胶原蛋白，由此形成TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球；和
6)所述复合促组织修复材料顺序释放EGF和TGF-β3。
2.根据权利要求1所述的复合促组织修复材料，其中所述复合促组织修复材料还包括或贴附有用于组织修复的种子细胞，其可为已分化的组织细胞或者未分化的干细胞，所述干细胞选自骨膜干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和牙周膜干细胞。
3.根据权利要求1所述的复合促组织修复材料，其中所述复合促组织修复材料还包括或贴附有用于组织修复的种子细胞，其可为已分化的组织细胞或者未分化的干细胞，所述干细胞为骨髓基质干细胞。
4.根据权利要求2所述的复合促组织修复材料，其中：
所述种子细胞为牙周膜干细胞。
5.根据权利要求1所述的复合促组织修复材料，其中所述第二组织修复材料为TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球，其通过包括以下步骤的方法制备：
1)制备水相和油相，其中水相包括壳聚糖醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液，油相为液体石蜡、石油醚和span 80的混合物；
2)将壳聚糖醋酸水溶液和骨胶原蛋白水溶液混合均匀，之后逐滴加入所述油相中，搅拌均匀后加入戊二醛进行交联，之后静置过夜，离心去上清；
3)将沉淀依次用有机溶剂和水漂洗，得到壳聚糖-骨胶原蛋白微球；和
4)将得到的壳聚糖-骨胶原蛋白微球与TGF-β3溶液充分浸泡后冻干得到TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球。
6.根据权利要求5所述的复合促组织修复材料，其中所述第一组织修复材料为含有类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的壳聚糖，其通过包括以下步骤的方法制备：
1)制备所述类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的溶液，所述类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列；和
2)将壳聚糖溶液通过冷冻干燥得到壳聚糖海绵，将其充分浸泡于上述类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的溶液中，之后冻干得到含有类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的壳聚糖。
7.根据权利要求6所述的复合促组织修复材料，其通过包括以下步骤的方法制备：将TGF-β3-壳聚糖-骨胶原蛋白微球的溶液与含有类人胶原蛋白-EGF融合蛋白的壳聚糖充分混合，之后冷冻干燥。
8.根据权利要求2所述的复合促组织修复材料，其中所述种子细胞为人牙周膜干细胞(hPDLSC)，并且将其接种至所述复合促组织修复材料上。
9.根据权利要求8所述的复合促组织修复材料，其中所述种子细胞为原代牙周膜干细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的复合促组织修复材料在制备用于组织缺损治疗或修复的药物或试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述组织缺损是骨缺损。
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