CN114870089B - 载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用 - Google Patents

载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了载有MSCs的PCL‑胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用，涉及鼓膜修复生物材料技术领域。所述支架由鱼胶原蛋白、聚己内酯(PCL)、间充质干细胞(MSCs)、甲基丙烯酸明胶(Gelma)组成，所述支架具有径向的纤维结构符合生理鼓膜的解剖特点，能够更好的引导细胞的迁移和增殖，所述支架具有较大的孔隙率，能够为细胞的附着、生长和增殖提供较大的表面积，且支架中含有的胶原蛋白和Gelma为细胞的生存提供很好地环境，有效维持细胞活力；所述支架具有与鼓膜相似的厚度和相似的机械性能，能够有效减少鼓膜穿孔尺寸，促进慢性鼓膜穿孔的愈合。所述支架在大鼠TM穿孔模型的TM再生中具有显著优势，提供了一种新的用于制备治疗鼓膜穿孔的修复材料。

Description

载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架及应用
技术领域
本发明涉及鼓膜修复生物材料技术领域，具体涉及载有MSCs的PCL-胶原蛋白 /Gelma双径向复合支架及应用。
背景技术
鼓膜(tympanic membrane，TM)是一种半透明的菲薄结构，由角质化的鳞状 上皮外层、纤维状中层和粘膜内层三层结构组成。造成鼓膜穿孔的最常见病因有 外伤、中耳炎和鼓膜置管术遗留的造口等。虽然大多数急性鼓膜穿孔是可以自愈 的，但面积较大的穿孔或慢性穿孔需要外科手术干预才能修复。穿孔的鼓膜如果 不能及时愈合，失去了阻挡外界细菌进入中耳的有效屏障，中耳感染的几率将大 大增加，严重者还有引起耳溢液、传导性听力下降甚至形成胆脂瘤等，造成严重的并发症。鼓膜穿孔的自愈通过上皮细胞的移行而完成，但常缺少纤维中间层， 相较于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、传声性能不理想、较易形成内陷袋， 并且在一定的气压伤时有再次穿孔的可能。修复穿孔鼓膜主要存在三个问题：(1) 缺乏支架结构；(2)新生血管生成能力弱和生长因子分泌不足；(3)细胞外基质的缺乏导致细胞对新膜黏附力弱。
目前，治疗鼓膜穿孔的方式主要是鼓膜成形术和鼓室成形术，手术治疗中虽 有多种修补材料可供医生选择，如耳软骨、颞肌筋膜、耳小叶脂肪、耳屏软骨等 字体材料和透明质酸、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖等人工材料，但这些材料往 往只提供机械支撑作用，缺乏促血管生成或细胞增殖作用，因此术后新生鼓膜无 法复制天然鼓膜的纤维解剖学和振动声学特性，所以重建类似原声鼓膜的三层结构是十分必要的。
随着组织工程学和再生医学的发展，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)这一新型辅助材料的应用，在鼓膜穿孔治疗中显示出了巨大潜能。但目前 关于MSCs用于治疗鼓膜再生的研究较少，对于MSCs在治疗鼓膜穿孔方面的有效性有待完善和评价。因此，本发明旨在提供载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma 双径向复合支架用于鼓膜穿孔治疗并评价其有效性。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径 向复合支架及其应用，所述支架作为修复材料用于治疗鼓膜穿孔的治疗，所述支 架能够有效促进穿孔鼓膜的愈合，为治疗鼓膜穿孔提供了一种新的修复材料。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一方面，本发明提供了载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架， 所述支架主要由鱼胶原蛋白、聚己内酯(PCL)、间充质干细胞(MSCs)、甲基丙 烯酸明胶(Gelma)组成；所述支架按照以下步骤制备得到：
(1)制备纺丝液：将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％ 胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液 (v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；
(2)制备仿生PCL支架：将步骤(1)得到的PCL纺丝液通过静电纺丝法获 得仿生的PCL支架；静电纺丝时，使用自定义的收集器，针与收集器之间的电压 为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤 压，PCL沉积在自定义的收集器上，随后得到仿生的PCL支架，将打印出的支架 在酒精中消毒24小时，之后用PBS溶液清洗三遍，再用含有胚牛血清的高糖培养 基清洗一遍，随后干燥并剪成椭圆形的仿生PCL支架备用；
(3)制备含有MSCs的Gelma溶液：使用离心机将第七代的MSCs离心，离 心条件为1000转/min，5min；将离心出来的MSCs加入到预热37℃的Gelma溶液 中，制备出含有MSCs的Gelma细胞悬液；
(4)制备载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架：将步骤 (3)得到的细胞悬液转入带有细针头的注射器中，以步骤(2)得到的仿生PCL 支架的中心为起点，椭圆形的边界为终点，将细胞悬液以径向的方式注射到支架 上，之后用405nm的光源照射10s将细胞悬液固化在支架上，最终得到载有MSCs 的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架。
另一方面，本发明还提供了MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架的 应用，所述支架用于制备治疗鼓膜穿孔的修复材料。
(三)有益效果
本发明提供了一种载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架 (简称为D-PCOLG支架)，所述支架具有径向的纤维结构符合生理鼓膜的解剖特 点，能够更好的引导细胞的迁移和增殖，促进慢性鼓膜穿孔的愈合；所述支架具 有较大的孔隙率，能够为细胞的附着、生长和增殖提供较大的表面积，且支架中 含有的胶原蛋白和Gelma为细胞的生存提供很好地环境，有效维持细胞活力；所 述支架具有与鼓膜相似的厚度和相似的机械性能，在治疗鼓膜穿孔大鼠4周后可 有效将穿孔尺寸减少50.41％左右，治疗效果明显优于其他支架。D-PCOLG支架在 大鼠TM穿孔模型的TM再生中具有显著优势，提供了一种新的用于制备治疗鼓膜穿孔的修复材料。
附图说明
图1为自定义收集器结构示意图，具体的为由图钉的针尖充当电极，螺丝帽 的圆形边缘充当环形电极，将图钉套入到螺丝帽中制成自定义收集器。
图2为a支架(图2A)、b支架(图2B)、c支架(图2C)、d支架(图2D)、 e支架(图2E)的SEM图像。
图3分别a、b、c、d、e的五种支架经过活死细胞染色后的荧光显微镜拍摄图 像，其中活细胞呈绿色，死细胞呈红色。
图4为e支架HE染色图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实 施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实 施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本 领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属 于本发明保护的范围。
实施例1
载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架，照以下步骤制备得到：
(1)制备纺丝液：将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％ 胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；
(2)制备仿生PCL支架：将步骤(1)得到的PCL纺丝液通过静电纺丝法获 得仿生的PCL支架；静电纺丝时，使用自定义的收集器，针与收集器之间的电压 为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤 压，PCL沉积在自定义的收集器上，随后得到仿生的PCL支架，将打印出的支架 在酒精中消毒24小时，之后用PBS溶液清洗三遍，再用含有胚牛血清的高糖培养 基清洗一遍，随后干燥并剪成椭圆形的仿生PCL支架备用；所述自定义的收集器 结构如图1所示，具体的为由图钉的针尖充当电极，螺丝帽的圆形边缘充当环形 电极，将图钉套入到螺丝帽中制成自定义收集器；
(3)制备含有MSCs的Gelma溶液：使用离心机将第七代的MSCs离心，离 心条件为1000转/min，5min；将离心出来的MSCs加入到预热37℃的Gelma溶液 中，制备出含有MSCs的Gelma细胞悬液；
(4)制备载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架：将步骤 (3)得到的细胞悬液转入带有细针头的注射器中，以步骤(2)得到的仿生PCL 支架的中心为起点，椭圆形的边界为终点，将细胞悬液以径向的方式注射到支架 上，之后用405nm的光源照射10s将细胞悬液固化在支架上，最终得到载有MSCs 的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架。
为进一步评价和验证本发明复合支架在治疗鼓膜穿孔中的有效性和可行性， 现提供以下动物实验进行说明。
1材料与方法
1.1实验材料
a、随机的PCL支架；b、随机的PCL胶原支架；c、具有纯仿生的PCL支架； d、仿生的PCL胶原支架；e、实施例1所制备载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma 双径向结构复合支架(简称为D-PCOLG支架)；f、海奥修复膜。
a、随机的PCL支架的制备：
将PCL溶解于六氟异丙醇/乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分 比为8％的PCL纺丝液；静电纺丝时，不采用自定义收集器，针与转筒之间的电压为18kV，流速为0.3mL/h，针与转筒之间的距离为10cm，采用27号针用于挤压， 转筒上收集的电纺PCL即为a支架。
b、随机的PCL胶原支架的制备：
将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％胶原蛋白的乙酸溶 液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得 到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；静电纺丝的方法同上。
c、具有纯仿生的PCL支架的制备：
将PCL溶解于六氟异丙醇/乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得到含有质量百分 比为8％的PCL纺丝液；静电纺丝时，采用自定义收集器，针与收集器之间的电压为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤 压，收集器上收集的电纺PCL即为c支架。
d、仿生的PCL胶原支架的制备：
将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt％胶原蛋白的乙酸溶 液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液(v/v＝9/1)，最终制备得 到含有质量百分比为8％的PCL纺丝液；静电纺丝时，采用自定义收集器，针与收集器之间的电压为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用 27号针用于挤压，收集器上收集的电纺PCL即为d支架。
1.2建造创伤性鼓膜穿孔大鼠模型
选取70只体型和健康状况无显著差异的雄性SD大鼠，将上述大鼠安置在温 度为22℃、湿度为50％、环境噪声为40dB的房间内，所有动物实验均按照伦理 委员会的规定进行。对上述大鼠腹腔注射4％水合氯醛(10mL/kg)用于全身麻醉， 在显微镜下检查所有大鼠耳朵，其中出现耳中积液的耳朵不包括在研究范围内； 用聚维酮碘溶液对耳道进行消毒，使用无菌23号针头手动创建鼓膜穿孔模型，涉 及鼓膜的前下和后下两个方面，以实现鼓膜穿孔(50％紧张部)而不损坏骨链；随 后以明胶海绵分别蘸取丝裂霉素C 0.4mg/mL和氢化可的松10mg/mL，依次局部湿 敷鼓膜穿孔边缘各10分钟，每天一次，连续3天；术后肌注氨苄青霉素150mg/kg 连续，以预防感染；观察穿孔的鼓膜8周不愈合表明鼓膜穿孔建模成功。
1.3分组与支架植入治疗
将建模成功的70只大鼠平均分为7组，每组10只，分别为对照组、a支架组、 b支架组、c支架组、d支架组、e支架组、f支架组。其中，对照组不做任何的特 殊治疗处理；a支架组、b支架组、c支架组、d支架组、e支架组、f支架组分别 用相应的a支架、b支架、c支架、d支架、e支架、f支架对大鼠进行手术修补。 具体手术方法为：对大鼠腹腔注射4％水合氯醛(10mL/kg)用于全身麻醉，用聚 维酮碘溶液对耳道进行消毒，先将浸有1％洁霉素滴眼液的明胶海绵充填鼓室，以相应大小的修补材料自穿孔处内衬与鼓膜残缘的鼓室面，将修补材料完全覆盖鼓 膜穿孔，外耳道以前述抗生素明胶海绵填塞，术后肌内注射氨苄青霉素150mg/kg， 连续注射5天以预防感染。观察各组大鼠鼓膜愈合情况。
1.4观察指标
1.4.1支架表面形态及构想特征
采用扫描电子显微镜(SEM)用于评估a支架、b支架、c支架、d支架、e 支架的表面形态和结构。具体方法为将冷冻干燥后的a支架、b支架、c支架、d 支架、e支架的横截面用金和银溅射涂覆，样品在5.0kV的工作电压下成像。
1.4.2孔隙率
a支架、b支架、c支架、d支架、e支架都被切成等体积约(10mmx5mm)， 这些支架的孔隙率通过使用液体置换方法进行评估。具体方法为：将制备的干支 架置于确定体积(V1)的乙醇中10分钟使空隙完全填满，支架浸入后体积记录为 V2，去除支架后，剩余的乙醇体积记为V3。根据以下等式计算孔隙率：
支架的孔隙率(％)＝{(V1-V3)/(V2-V3)}×100
1.4.3机械性能
为了测量a支架、b支架、c支架、d支架、e支架的拉伸性能，分别将a支 架、b支架、c支架、d支架、e支架切成小条(10×40mm)；拉力测试使用拉力 试验机进行，在0.5mms-1拉伸速度下，记录支架的应力-应变曲线，所有值均 表示为均数±标准差。
1.4.4支架的生物相容性评价
细胞培养及接种：将第7代的传代鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在含有低葡 萄糖(Gibco；USA)、补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco)、1％青霉素和链霉素 (Lonza)的DMEM生长培养基中培养，并在含5％CO2的湿空气中于37℃下培养。 将a支架、b支架、c支架、d支架、e支架分别浸入乙醇中30分钟进行消毒，支 架每侧进行15分钟的紫外线照射；然后将它们分别在培养基中漂洗三次，以去除 支架上残留的乙醇；最后将MSCs分别接种于a支架、b支架、c支架、d支架、e 支架上，在上述的条件下继续培养24小时，24小时后初次更换培养基后，每2天 更换一次培养基直到使用为止。用PBS洗涤2次，即可用于进一步实验。
活死细胞染色：将上述接种MSCs细胞的5种PCL支架用PI及MI溶于PBS 中制成的试剂对细胞进行染色；并使用荧光显微镜拍摄图像，活细胞呈绿色，死 细胞呈红色。
1.4.5细胞活力的测定
骨髓间充质干细胞分别接种在五种支架上并培养1、3和5天。使用胰蛋白酶 将细胞从支架中分离，并在96孔板中按照阿尔玛蓝(yeasen)的说明书分析评估细胞活力。具体操作为：向细胞中加入配制好的100％还原型阿尔玛蓝试剂(阿尔 玛蓝溶液：细胞培养基＝1:10)，然后将细胞放入培养箱中孵育8小时。取上清液于 96孔板中并在分光光度计中进行吸光度检测，在560nm、600nm处测量吸光度值。
1.4.6耳内镜检查
在a支架、b支架、c支架、d支架、e支架、f支架植入4周后，对每组大 鼠用数字耳镜(MacroView；Welch Allyn)进行TM形态学检查，并使用ImageJ 软件得出每只耳朵的穿孔大小(穿孔面积/紧张部面积×100(％)。愈合率定 义为每组完全闭合的鼓膜数量与穿孔鼓膜总数的比率。对于治愈的鼓膜，计算 并比较各组的愈合时间。观察者通过这些方式来评估各组鼓膜的愈合情况和愈合快慢。
1.4.7组织病理学检测
每组5只动物被安乐死，采集鼓膜组织并在4％多聚甲醛中固定，在4℃ 下过夜，用14％乙二胺四乙酸脱钙，脱水，包埋，切片。切片用苏木精和伊红 染色进行组织学评估。进行Masson三色染色以观察胶原形态，并使用Picrosirius红色染色试剂盒(Abcam)对TMs的胶原进行染色，及免疫组织化 学。
2结果
2.1支架的表面形态及构象特征
在将支架应用于鼓膜穿孔之前，对5种支架大的表面形态进行了电镜下观 察，所述5种支架具体指：a、随机的PCL支架；b、随机的PCL胶原支架；c、 具有纯仿生的PCL支架；d、仿生的PCL胶原支架；e、D-PCOLG支架。使用SEM 图像评估复合支架纤维的厚度，结果如图2所示；a，b，c，d支架的直径是约80nm， 无显著差异。从结果可知，与a、b支架相比，c、d、e支架具有更大的孔隙率， 能够为细胞的渗入提供足够的空间，同时e支架具有径向的纤维结构符合生理鼓 膜的解剖特点，能够更好的引导细胞的迁移和增殖，且由于表面载有细胞Gelma 导致e支架表面凹凸不平。
2.2孔隙率
支架的孔隙率与表面积成正比，即支架具有足够高的孔隙率，就能够为细胞 的附着、生长和增殖提供较大的表面积。表1为a、b、c、d、e的五种支架的孔隙 率结果。分别对比a支架与b支架，c支架与d支架的孔隙率可知，胶原的PCL支架的孔隙率有所降低，这是由于胶原蛋白沉积在PCL网格中所导致的；分别对 比a支架与c支架，b支架与d支架的孔隙率可知，仿生的PCL支架可以略微提 高支架的孔隙率；d支架的孔隙率与e支架的相比没有显著差异，该结果表面细胞 Gelma的存在并不会影响支架的孔隙率，e支架即D-PCOLG支架能够为细胞的附 着、生长和增殖提供较大的表面积。
表1a、b、c、d、e的五种支架的孔隙率
a支架 b支架 c支架 d支架 e支架
孔隙率(％) 81.05±5.71 69.87±9.00 85.95±7.64 78.51±8.24 81.28±8.30
2.3机械性能
要用于再生TM，组织替代物应具有适当的机械强度，以便在手术期间进行处 理。表2为a、b、c、d、e的五种支架的模量结果。从表2结果可知，c支架的弹 性会较低于a支架，加入胶原蛋白的b支架和d支架的弹性要明显优于没有加入 胶原蛋白的a支架和c支架；但总体来说，e支架的模量最大，即e支架的弹性最 好，这是由于胶原蛋白及Gemla同时为支架提供较高的强度，且e支架的弹性最 接近鼓膜的弹性。
表2a、b、c、d、e的五种支架的模量
a支架 b支架 c支架 d支架 e支架
模量(MPa) 1.7±0.2 2.1±0.4 0.7±0.6 2.5±0.3 3.1±0.5
2.4活死细胞染色
对a、b、c、d、e的五种支架进行活-死细胞染色以评估其生物相容性，用以 验证支架为细胞存活建立有利微环境的假设。结果如图3所示，5种支架上的细胞 存活率都在90％以上；a支架和c支架上的细胞数量都分别显著小于b支架和d 支架，这是因为纯PCL支架细胞粘附性差、低生物活性和低表面性能；而含有胶 原蛋白的PCL支架细胞附着良好，细胞数量无显著差异，这是因为胶原蛋白是细 胞外基质的主要结构蛋白，在位置细胞外基质的生物学和结构完整性方面起主导作用，并不断重塑生理功能。此外，a、c支架上的活细胞是随机、无序排列，而b、 d、e支架上的活细胞是径向排列的，这是由于纤维排列呈径向性，有利于细胞的 迁移与增殖，促进慢性鼓膜穿孔的愈合。
2.5细胞活力
五种支架上的细胞活力按照阿尔玛蓝(yeasen)说明书所提供计算公式计算， 在a、b、c、d、e的五种支架中，e支架中分离出的细胞的活力最高，为81％±6， 这是由于胶原蛋白和Gelma都可以为细胞的生存提供很好地环境；相反，a与c 支架的细胞活力最低，为67％±11左右，这是由于PCL支架上细胞粘附性差；b 与d支架则由于其存在胶原蛋白，为78％±4左右，细胞活性略低于e支架。
2.6耳内镜检查
为了证实D-PCOLG支架的疗效，开发并评估了鼓膜穿孔模型，大鼠鼓膜穿孔 模型至少维持8周。在应用D-PCOLG支架之前，比较了各组大鼠模型的穿孔的大小，各组之间不存在显著差异。在消除与初始条件相关的偏差后，将海奥修复膜 (标记为f支架)和a、b、c、d、e五种支架分别应用于TM穿孔模型，以比较其 愈合性能。在第4周时，由a、b、c、d、e、f六种支架治疗的大鼠鼓膜穿孔的尺 寸减小程度结果如表3所示。从表3结果中可以看出，c、d支架(即仿生性的PCL 支架)的治疗效果要明显优于a、b支架(即随机性的PCL支架)；总体对比下D-PCOLG支架(即e支架)治疗效果最好，略优于海奥修复膜(即f支架)，治疗 鼓膜穿孔大鼠4周后穿孔尺寸减少程度最大，这是因为D-PCOLG支架相比于海奥 修复膜，该支架具有与鼓膜相似的厚度和相似的机械性能，更好的促进细胞的生长和恢复。
表3 a、b、c、d、e、f六种支架治疗鼓膜穿孔大鼠4周后穿孔尺寸减少程度
2.7组织病理学检测
组织学检查显示再生的新鼓膜愈合良好，e支架的大鼠新生鼓膜局部增厚，纤 维层明显再生，明显优于其他支架的治疗效果，e支架的HE染色如图4所示。
3结论
根据以上实验结果，本申请所述的载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向 结构复合支架(简称为D-PCOLG支架)具有径向的纤维结构符合生理鼓膜的解剖 特点，能够更好的引导细胞的迁移和增殖，促进慢性鼓膜穿孔的愈合；所述支架 具有较大的孔隙率，能够为细胞的附着、生长和增殖提供较大的表面积，支架中 含有的胶原蛋白和Gelma为细胞的生存提供很好地环境，有效维持细胞活力；所 述支架具有与鼓膜相似的厚度和相似的机械性能，在治疗鼓膜穿孔大鼠4周后可 有效将穿孔尺寸减少50.41％左右，治疗效果明显优于其他支架，以上结果可以说明，D-PCOLG支架在大鼠TM穿孔模型的TM再生中具有显著优势，为治疗鼓膜 穿孔提供了一种新的应用支架。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以 对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同 替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技 术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架，其特征在于，所述支架包括鱼胶原蛋白、聚己内酯（PCL）、间充质干细胞（MSCs）、甲基丙烯酸明胶（Gelma）；所述支架按照以下步骤制备得到：
（1）制备纺丝液：
将鱼胶原蛋白在乙酸中溶解，制成混有质量分数为2wt%胶原蛋白的乙酸溶液；将PCL溶解于六氟异丙醇/含有胶原蛋白的乙酸溶液中，其中六氟异丙醇与含有胶原蛋白的乙酸溶液的体积比为9：1，最终制备得到含有质量百分比为8%的PCL纺丝液；
（2）制备仿生PCL支架：
将步骤（1）得到的PCL纺丝液通过静电纺丝法获得仿生的PCL支架；静电纺丝时，使用自定义的收集器，针与收集器之间的电压为18kV，流速为0.3mL/h，针与收集器之间的距离为10cm，采用27号针用于挤压，PCL沉积在自定义的收集器上，随后得到仿生的PCL支架，将打印出的支架在酒精中消毒24小时，之后用PBS溶液清洗三遍，再用含有胚牛血清的高糖培养基清洗一遍，随后干燥并剪成椭圆形的仿生PCL支架备用；
（3）制备含有MSCs的Gelma溶液：
使用离心机将第七代的MSCs离心，离心条件为1000转/min，5min；将离心出来的MSCs加入到预热37℃的Gelma溶液中，制备出含有MSCs的Gelma细胞悬液；
（4）制备载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架：
将步骤（3）得到的细胞悬液转入无菌的20mL注射器中，以步骤（2）得到的仿生PCL支架的中心为起点，椭圆形的边界为终点，将细胞悬液以径向的方式注射到支架上，之后用405nm的光源照射10s将细胞悬液固化在支架上，最终得到载有MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向结构复合支架。
2.如权利要求1所述的MSCs的PCL-胶原蛋白/Gelma双径向复合支架的应用，其特征在于，所述支架用于制备治疗鼓膜穿孔的修复材料。
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