CN110755173A

CN110755173A - 一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片及制备方法

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Publication number: CN110755173A
Application number: CN201810845936.2A
Authority: CN
Inventors: 李亚婧; 黄文涛
Original assignee: SHAANXI BOAO REGENERATION MEDICAL CO Ltd
Current assignee: SHAANXI BOAO REGENERATION MEDICAL CO Ltd
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2018-07-27
Publication date: 2020-02-07

Abstract

本发明涉及一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，包括修复层、抗菌防渗和防粘连层，所述抗菌防渗和防粘连层铺展于修复层上；该抗菌防渗漏硬脑膜修补片的防渗防粘连层可在体内可以形成湿润的光滑凝胶面，一可以保护脑组织，避免瘢痕及癫痫的发生，二给创面提供了一个湿润愈合环境，利于保持细胞活力，加速创面愈合；修复层未进行交联，使其保留了天然的三维空间结构，利于细胞长入；另外，本发明提供的抑菌生物硬脑膜补片制备方法简单，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，原料来源广泛、价格低廉，为大规模生产降低成本。

Description

一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片及制备方法

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片及制备方法。

背景技术

硬脑膜是脑组织表面一层厚而坚韧的双层膜组织，是保护脑组织和防止脑脊液与外界交通的重要屏障。颅脑创伤、颅内肿瘤、脑血管疾病和先天性疾病等均会造成硬脑膜缺损，而不同原因引起的硬脑膜缺损如不及时修复，则会引起脑脊液渗漏和颅内感染，导致脑组织与周围组织粘连，出现癫痫等并发症。因此，为保护脑组织，恢复正常的生理解剖结构，使用人工修补材料重建硬脑膜成为目前临床的主要治疗手段。

目前，临床上使用的硬脑膜修复材料主要分为以下四个大类：①自体筋膜；②同种异体组织，③异种生物材料，④人工合成材料。每类材料均具有各自的优缺点，较为理想的硬脑膜修补材料应具备以下特点：①具有稳定的生物学惰性的，不引起急慢性炎症反应。②具有安全性，无毒性，无致癌、致畸作用，对生物膜型的人工脑膜要求不能传播潜在的已知或未知感染。③组织相容性好，无排斥反应。④致密性好，无渗透性，防止脑脊液漏，保护脑组织。⑤具有韧性，能够承受缝合。⑥能促使脑膜再生，不发生脑膜脑粘连。⑦使用方便，手术简单，易消毒灭菌。⑧取材广泛，价格低廉。

现有硬脑膜在临床上的应用主要分为缝合固定和非缝合固定，缝合固定会存在缝线部位感染、脑脊液渗漏、颅内感染等风险（如冠朗、脑膜建等产品），非缝合方式可以避免上述问题（如天新福、贝朗、DuraGen），但是目前大部分产品若要进行非缝合固定，仍需要额外配合使用生物胶，操作不便，并有化学残留风险。且目前国内产品如天义福（DuraMax）、冠昊(NormalGEN)、佰仁思（Dura scaffold）价格昂贵，均不能完全满足上述要求。

中国发明专利CN 1317297A公开了一种可吸收性的人工硬脑膜及其制备方法，其将含甘油、明胶和诺氟沙星的3％壳聚糖混合液，采用水平流涎或水平喷涂方法将其涂敷在聚乳酸网或无纺布上，经烘干、稀碱中和、蒸馏水冲洗、浸泡、干燥、分切、封装、消毒等步骤即得到不同厚度、不同规格的双层结构的人工硬脑膜。该法制备的硬脑膜材料生物相容性好，无毒，无抗原反应，抑菌，缝合时无脱边，为细胞生长可提供三维支架结构，在人内可缓慢吸收，然而其防渗漏性有限。

中国发明专利CN 103656749A公开了一种复合型可降解的抗菌人工用脑膜，该材料是通过将脱细胞膜状生物衍生材料制成海绵状胶原生物膜支架，再将其浸入壳聚糖与β-甘油磷酸钠复合物的混合溶液中，形成水凝胶与胶原生物膜融为一体，可免缝合固定。但该法制备的人工硬脑膜有损脱细胞基质的天然结构，减弱了生物膜材料易于引导新生组织长入的优点，增加了与颅盖骨之间的粘连，易引发癫痫病症。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题。

为此，本发明提供了一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，包括修复层、抗菌防渗和防粘连层，所述抗菌防渗和防粘连层铺展于修复层上。

所述抗菌防渗和防粘连层铺展与修复层经过涂覆、流延或静电纺丝技术铺展于修复层上。

所述抗菌防渗和防粘连层为生物多糖大分子的混合液制成。

所述的生物多糖大分子是指壳聚糖、壳聚糖衍生物、纤维素及纤维素衍生物中的任一种或多种混合而成。

所述修复层为脱细胞基质制成。

所述修复层选择的动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种。

上述抗菌防渗漏硬脑膜修补片的制备方法包括如下步骤：

步骤1：去除动物膜组织中多余的脂肪以及附属组织，并用纯化水或生理盐水反复清洗至去除血色；然后和有机试剂按照1:5～1:15（w/v）进行抽提，室温，100～140 rpm，震荡脱脂2～6h后，更换有机试剂继续震荡脱脂10～20h；弃去有机试剂，按1:20（w/v）加入纯化水，室温，100～120rpm，振荡清洗5～10次，10min/次，得脱脂后的动物膜组织；按1:2～1:10（w/v）的料液比向脱脂后的动物膜组织加入碱溶液，室温，100～120rpm，振荡20～60min，清洗，重复三次得到脱细胞基质；

步骤2：将天然高分子材料配制成浓度为0.5～2.0%的天然高分子材料溶液，在18～30℃条件下加入0.01～0.05% (w/v)交联剂EDC溶液，EDC溶液与所述天然高分子材料溶液的质量比为1:3～1:20，磁力搅拌30 ～ 180 min；

步骤3：将交联后的高分子溶液，按照涂层厚度为1.5~3mm的体积量，向脱细胞基质表面加入天然高分子材料溶液，涂覆法成膜，冰箱内静置60~180min，待其完全为水凝胶态和脱细胞基质融为一体；

步骤4：将上述水凝胶复合物放入冻干机中进行干燥24h，得到具有抗菌防渗漏的可吸收人工硬脑膜；

步骤5：将冻干后的硬脑膜补片裁切包装，辐照灭菌，备用。

所述步骤1中的有机试剂是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种。

所述步骤2中的天然高分子材料溶液是由0.5%的羧甲基纤维素钠和0.5%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液。

本发明的有益效果：本发明的提供的这种抗菌防渗漏硬脑膜修补片为双层结构，包括修复层和抗菌防渗防粘连层，可有效的防止脑脊液渗漏、减少颅内感染、保护脑组织，还可以诱导机体成纤维细胞及新生血管长入，促进机体组织再生；其中防渗防粘连层的原料易得，壳聚糖及其衍生物广泛存在于节肢动物(虾、蟹)的壳和真菌的细胞壁中，多年的临床应用表明其无毒无刺激、无免疫抗原、组织相容性好，体内可降解吸收，还具有抑菌、促进上皮细胞生长、价格低廉。纤维素及其衍生物在体内具有良好的生物相容性和可降解性，且在应用预防术后粘连中，表现出良好的效果，还可以促进伤口的愈合，来源广泛，价格低廉；防渗防粘连层为多孔结构，有利于细胞粘附生长，促进再生硬脑膜组织再生，利于伤口愈合；防渗防粘连层在体内遇血液和体液之后会形成水凝胶，与创面组织结合紧密，具有良好的密封性，可有效的防止脑脊液渗漏和降低颅内感染的风险，且可免于缝合，方便手术操作，节省手术时间；防渗防粘连层可在体内可以形成湿润的光滑凝胶面，一可以保护脑组织，避免瘢痕及癫痫的发生，二给创面提供了一个湿润愈合环境，利于保持细胞活力，加速创面愈合；修复层未进行交联，使其保留了天然的三维空间结构，利于细胞长入；另外，本发明提供的抑菌生物硬脑膜补片制备方法简单，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，原料来源广泛、价格低廉，为大规模生产降低成本。

以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1是抑菌生物硬脑膜补片涂层的扫描电镜图。

图2是抑菌生物硬脑膜补片的抑菌实验结果。

图3是抑菌生物硬脑膜补片在兔硬脑膜缺损试验中，防渗漏的大体实验效果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及实施例对本发明的具体实施方式、结构特征及其功效，详细说明如下。

实施例1

本发明提供一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，包括修复层、抗菌防渗和防粘连层，所述抗菌防渗和防粘连层铺展于修复层上。如图1所示，为抑菌生物硬脑膜补片涂层的扫描电镜图。

所述抗菌防渗和防粘连层铺展与修复层经过涂覆、流延或静电纺丝技术铺展于修复层上；和其他方法相比，涂覆法操作简便，浪费率较低，设备和人工成本低廉，与脱细胞基质融为一体达到双层复合结构的性能差异不显著，因此本发明首选最为节能的涂覆法。经过涂覆法制备的涂层可以达到密封不透水，防止脑脊液渗漏和降低颅内感染的风险，且湿润光滑的涂层贴附脑组织，可以减少缺损部位与周边组织的粘连，减少瘢痕的发生。

所述抗菌防渗和防粘连层为生物多糖大分子的混合液制成。

所述的生物多糖大分子是指壳聚糖、壳聚糖衍生物、纤维素及纤维素衍生物中的任一种或多种混合而成；本发明提供的抗菌防渗漏硬脑膜修补片，首选壳聚糖衍生物，或壳聚糖衍生物和纤维素衍生物的混合使用。主要原因有以下几个方面：一，壳聚糖衍生物的溶解性要优于壳聚糖；二，相同浓度的壳聚糖衍生物的抗菌性能要优于壳聚糖、纤维素和纤维素类衍生物；三，在溶解交联制备过程中发现，纤维素及衍生物不易与脱细胞基质融为一体，经冻干之后质地较硬，易于分层。综上所述，本发明的涂层优选为0.5%～3%的羧甲基壳聚糖或质量比为1:1~1:3的羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素钠的高分子混合溶液，在18～30℃条件下加入0.01～1% (w/v)交联剂EDC溶液，EDC溶液与所述天然高分子溶液的质量比为1:3～1:20，搅拌30～120 min。

所述修复层为脱细胞基质制成；修复层是通过组织预处理、有机试剂抽提脱脂、高低渗碱性溶液脱细胞去抗原制备。

实施例2

实施例1所述的抗菌防渗漏硬脑膜修补片的制备方法包括如下步骤：

步骤4：将上述水凝胶复合物放入冻干机中进行干燥24h，得到具有抗菌防渗漏的可吸收人工硬脑膜，冷冻干燥程序设定如表1所示；

表1 DRM冷冻干燥程序

冷冻控制

序号	设定温度（℃）	设定时间（min）	保持时间（min）
				第1阶段	0.0	5	60
第2阶段	-40.0	180	60

一次干燥

序号	设定温度（℃）	设定时间（min）	保持时间（min）	控制真空（mbar）
					第1阶段	-10.0	60	600	0.2000

解析干燥

序号	设定温度（℃）	设定时间（min）	保持时间（min）	控制真空（mbar）
					第1阶段	25.0	60	120	0.2000
第2阶段	25.0	60	240	0.0100

根据上述方法冻干的抗菌防渗防粘连可吸收人工硬脑膜，具有多孔结构和良好的生物相容性，壳聚糖衍生物具有抑菌、促进上皮细胞生长。该补片在使用后，伤口部位可有效的吸附体液和血液，随之以水凝胶形态封闭于缺损处，实现密不透水，有效防止脑脊液渗漏和减少颅内感染的发生；且湿润光滑的贴附于脑组织，可有效降低缺损部位与周围组织的粘连，减少瘢痕的形成；除此之外，多孔结构还有利于细胞粘附生长，促使自体成纤维细胞向胶原内部浸润，促进缺损部位的硬脑膜组织再生，提升伤口愈合性能。

步骤5：将冻干后的硬脑膜补片裁切包装，辐照灭菌，备用。

该产品在动物实验过程中呈良好的组织顺应性和贴附性，实验操作简便，节省时间，术后恢复良好，表现出理想的人工硬脑膜补片。

所述步骤1中的有机试剂是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种；向脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液是由重量比为1:1的氢氧化钠和氯化钠配制而成。利用上述步骤制备的脱细胞基质，胶原结构破坏较小，纤维结构呈有序疏松的排列，有利于成纤维细胞的长入、迁移、增殖和分化，为进一步形成新生硬脑膜组织提供了便利条件。

所述步骤2中的天然高分子材料溶液是由0.5%的羧甲基纤维素钠和0.5%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.05% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h。

上述步骤2的具体过程为：将羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖按照质量比2:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌30min。

上述步骤2的具体过程为：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为2.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.02% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h。

上述步骤2的具体过程为：将将羧甲基壳聚糖配制成浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.2% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌30min。

综上所述，该抗菌防渗漏硬脑膜修补片为双层结构，其中防渗防粘连层的原料易得，壳聚糖及其衍生物广泛存在于节肢动物(虾、蟹)的壳和真菌的细胞壁中，多年的临床应用表明其无毒无刺激、无免疫抗原、组织相容性好，体内可降解吸收，还具有抑菌、促进上皮细胞生长、价格低廉。纤维素及其衍生物在体内具有良好的生物相容性和可降解性，且在应用预防术后粘连中，表现出良好的效果，还可以促进伤口的愈合，来源广泛，价格低廉；防渗防粘连层为多孔结构，有利于细胞粘附生长，促进再生硬脑膜组织再生，利于伤口愈合；防渗防粘连层在体内遇血液和体液之后会形成水凝胶，与创面组织结合紧密，具有良好的密封性，可有效的防止脑脊液渗漏和降低颅内感染的风险，且可免于缝合，方便手术操作，节省手术时间；防渗防粘连层可在体内可以形成湿润的光滑凝胶面，一可以保护脑组织，避免瘢痕及癫痫的发生，二给创面提供了一个湿润愈合环境，利于保持细胞活力，加速创面愈合；修复层未进行交联，使其保留了天然的三维空间结构，利于细胞长入；另外，本发明提供的抑菌生物硬脑膜补片制备方法简单，能有效避免加工过程中产品受到污染，产品质量易于控制，原料来源广泛、价格低廉，为大规模生产降低成本。

实施例3

步骤一：动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。

步骤二：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120 rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120 rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。

步骤三：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对脱脂后的牛心包膜进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液配制的碱性高渗溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm震荡30 min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。

步骤四：涂层的制备是将0.5%的羧甲基纤维素钠和0.5%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.05% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，将交联后的混合液倒铺于步骤三制备的脱细胞基质（即牛心包膜的脱细胞基质）上，控制涂层厚度为2mm，涂覆法成膜。

步骤五：将从真空压缩机中取出的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质直接放进冷冻干燥机内，冻干程序设定为冷冻控制阶段为5h，升华干燥时间为11h，解析干燥时间为8h。

步骤六：内层采用三层复合铝箔纸，外层采用PET泡壳，双层包装。

步骤七、灭菌：产品采用r-射线辐照灭菌，辐照剂量为＞15KGy，以杀灭可能存在的外源性或者动物源性病毒及病菌。

步骤八、经检验后即得成品。

实施例4

步骤一~步骤三同实施例3。

步骤四：涂层的制备是将羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖按照质量比2:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌30min，将交联后的混合液倒铺于步骤三制备的脱细胞基质（即牛心包膜的脱细胞基质）上，控制涂层厚度为3mm，涂覆法成膜。

步骤八、经检验后即得成品。

实施例5

步骤一~步骤三同实施例3。

步骤四：涂层的制备是将羧甲基壳聚糖配制成浓度为2.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.02% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，将交联后的混合液倒铺于步骤三制备的脱细胞基质（即牛心包膜的脱细胞基质）上，控制涂层厚度为2mm，涂覆法成膜。

步骤八、经检验后即得成品。

实施例6

步骤一~步骤三同实施例3。

步骤四：涂层的制备是将羧甲基壳聚糖配制成浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.2% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌30min，将交联后的混合液倒铺于步骤三制备的脱细胞基质（即牛心包膜的脱细胞基质）上，控制涂层厚度为2mm，涂覆法成膜。

步骤八、经检验后即得成品。

实施例7

用实施例5制备的抑菌防渗漏硬脑膜补片做抑菌实验。

用涂布棒将各菌株（白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌）接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10⁸CFU/ml）和霉菌悬液（10⁶CFU/ml），备用。

然后称取涂层样品1g，加入纯化水200ml，使用均质器均质成浓度为0.5%的均一溶液，并配制150ml相应的液体培养基。将配好的样品溶液和培养基121℃灭菌15min，然后分别量取8ml、4ml、2ml该溶液于试管中，加液体培养基至20ml混合均匀，配成不同浓度。再冷却后用无菌移液管取菌悬液200ul加入试管中，轻轻地震荡均匀；用分光光度计在600nm波长下测定试样的初始吸光度值，然后放入37℃溶液的恒温培养箱内培养24h、48h后测定试样的吸光度值，以吸光度值的变化来反应菌液浊度，并且以不加涂层溶液的培养基作为对照。

依据结果可以看出，本发明提供的抑菌防渗漏硬脑膜补片，不同浓度的样品对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌等菌种均具有一定的抑菌率，具体实验结果如图2所示。

实施例8

用实施例5制备的抑菌防渗漏硬脑膜补片应用于兔硬脑膜防渗漏试验中。

对实验动物经2.5%戊巴比妥钠（1ml/kg）耳静脉注射麻醉，俯卧位固定于手术台上。术前注射青霉素预防感染，剃顶部头毛，以碘酒、酒精消毒，铺无菌巾。头顶正中偏后位置，取颅骨中线直切口长约5cm，切开头皮，暴露颅骨冠状缝及矢状缝。去除顶骨、部分额骨及枕骨，于左右两侧剪除缺损约0.5mm的硬脑膜缺损，一侧直接贴附制备的抑菌防渗漏硬脑膜补片，一侧做空白对照；然后于颅骨中线钻一小孔，透明导管通过小孔置入蛛网膜下腔，见脑脊液从导管中反流，缓慢推入美蓝溶液，实验重复5次，观察左右两侧美蓝溶液的漏液情况。

结果发现，本发明提供的抑菌防渗漏硬脑膜补片直接贴附于缺损部位，密封效果良好，防渗漏效果显著，具体大体照如图3所示，其中，图A：硬脑膜缺损制造示意图；图B：实验组贴附本产品示意图；图C：美蓝溶液推入第5s示意图；图D：美蓝溶液推入第10s示意图。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：包括修复层、抗菌防渗和防粘连层，所述抗菌防渗和防粘连层铺展于修复层上。

2.如权利要求1所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述抗菌防渗和防粘连层铺展与修复层经过涂覆、流延或静电纺丝技术铺展于修复层上。

3.如权利要求1所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述抗菌防渗和防粘连层为生物多糖大分子的混合液制成。

4.如权利要求3所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述的生物多糖大分子是指壳聚糖、壳聚糖衍生物、纤维素及纤维素衍生物中的任一种或多种混合而成。

5.如权利要求1所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述修复层为脱细胞基质制成。

6.如权利要求1所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述修复层选择的动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种。

7.如权利要求1所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于，该抗菌防渗漏硬脑膜修补片的制备方法包括如下步骤：

步骤5：将冻干后的硬脑膜补片裁切包装，辐照灭菌，备用。

8.如权利要求7所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述步骤1中的有机试剂是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种。

9.如权利要求7所述的一种抗菌防渗漏硬脑膜修补片，其特征在于：所述步骤2中的天然高分子材料溶液是由0.5%的羧甲基纤维素钠和0.5%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液。