CN106310373A - 一种生物修复膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物修复膜及其制备方法，通过对动物源膜组织脱细胞去抗原处理后于其外涂覆可吸收止血的天然高分子材料涂层，解决现有生物型修复膜存在的力学强度差、缝合点有脑脊液渗漏风险、减弱促进组织再生修复性能、降解后有残毒、生物相容性差，易引起修补材料与脑组织粘连及诱发其他并发症的缺陷，具体是通过预处理、有机试剂脱脂、碱液脱细胞去抗原、制备涂层、真空压缩后冻干、包装和消毒的处理工艺过程，完成该生物修复膜的制备。该生物修复膜具有止血、抗菌、粘合性能，保留了天然的三维空间结构，具有良好的力学性能、生物相容性、组织生长诱导性、降解无毒、原料来源广泛和价格低廉的优点，易于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种生物修复膜及其制备方法。
背景技术
神经外科每年有大量因脑（脊）膜损伤而需要修复的病例，这主要集中于肿瘤切除后、外伤以及因其他原因引起的硬（脊）脑膜缺损，若不及时或不适当的修复，常引起脑脊液渗漏、硬膜组织粘连以及神经组织瘢痕，严重者会导致癫痫。
目前国内外已有多种“外科补片”供应临床需要，而市场上最常见的硬脑（脊）膜替代材料是异种材料，基于组织工程学原理的以动物组织为原料的细胞外基质是主要发展方向。
中国专利CN 200510120796.5公开了生物型外科补片，一种动物组织经过非醛类固定剂交联固定和试剂封闭抗原处理获得的可用于修复的生物型硬脑膜。经过实验研究发现，经过交联固定处理的材料降解速度较慢，长时间存在于人体体内易引发细胞毒性，生物相容性差，而且交联后牛心包膜虽强度较大，但是弹性性能较差，而且需要缝合固定。
中国专利申请 201310203594.1公开了一种硬脑膜生物修补片及其制备方法。该修补片采用近交系动物的小肠粘膜下层组织为原料，去除细胞成分和DNA成分，完整保留细胞外基质成分和结构，并具有微孔结构。该硬脑膜生物修补片为4～12层的小肠粘膜，利用激光微孔技术打孔，孔径为0.5～2.0mm，孔间隔为0.5～1.0cm。该补片的孔径增加了组织的透气性，但是该补片需要缝合才可以与组织严密贴附，缝合过程中的缝合位点会造成脑脊液漏现象发生。
中国专利申请201310659823.0（公开号103656749A）公开了复合型可降解的抗菌人工用脑膜，该材料是通过将脱细胞膜状生物衍生材料制成海绵状胶原生物膜支架，再将其浸入可降解高分子混合溶液中，形成水凝胶与胶原生物膜融为一体。该法制备的人工硬脑膜有损脱细胞基质的天然结构，减弱了生物膜材料易于引导新生组织长入的优点，且降解速率和新生速率不匹配，增加了与颅盖骨之间的粘连，易引发癫痫病症。
综合上述专利可知，单纯脱细胞基质在硬脑膜替代材料中存在需要缝合，延长手术时间，缝合位点有脑脊液渗漏等风险。而通过共混方法将脱细胞组织材料与其他材料联用，虽在一定程度上增强了该材料的可降解性和防渗漏性，但同时也改变了脱细胞基质的天然结构，减弱了其优良的促进组织再生修复性能。经过交联固定的材料虽在一定程度上增加了机械强度，但其在生物体内长时间不能降解，长期存在于人体内会引起细胞毒性，存在安全隐患。另外，临床脑外科手术常伴随出血，如果渗血未能得到有效控制，会引起修补材料与脑组织的粘连以及其他并发症，严重情况会危及患者生命。
因此，如何有效克服现有硬脑膜产品力学强度差的缺点，并提供止血、防粘连、降解速率与硬脑膜新生速率匹配的硬脑膜产品是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是解决现有生物修复膜存在的力学强度差、缝合点有脑脊液渗漏的风险、减弱促进组织再生修复性能、降解后有残毒、生物相容性差，易引起修补材料与脑组织粘连及诱发其他并发症等的缺陷，而提供一种具有防漏液、止血、防粘连性能，不需要缝合而能封闭创面并保持良好的力学性能，产品生物相容性好，无免疫排斥反应，对组织无不良刺激；可降解吸收，降解速率与硬脑/脊膜修复速率相匹配的、适合于硬脑/脊膜修复的生物修复膜及其制备方法。
一种生物修复膜，包括经脱细胞去抗原处理后的动物膜组织层，及涂覆于其表面的可吸收止血的天然高分子材料涂层；
其中，所述动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种；
所述天然高分子材料是纤维蛋白胶、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸中的任一种或多种。
所述生物修复膜的厚度为0.7～1.8mm，单位面积比重为0.5～8 mg/cm2，拉伸强度为2.7MPa ～3.5 MPa。
一种生物修复膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、动物膜组织预处理：去除动物膜组织中多余的脂肪以及附属组织，并用纯化水或生理盐水反复清洗至去除血色；
步骤二、脱脂：动物膜组织和有机试剂按照1:5～1:15（w/v）进行抽提，室温，100～140 rpm，震荡脱脂2～6h后，更换有机试剂继续震荡脱脂10～20h；弃去有机试剂，按1:20（w/v）加入纯化水，室温，100～120rpm，振荡清洗5～10次，10min/次，得脱脂后的动物膜组织；
步骤三、脱细胞去抗原处理：1）、按1:2～1:10（w/v）的料液比，向步骤二的最终产物脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液；
2）、室温，100～120rpm，振荡20～60min，弃去碱性水溶液；
3）、纯化水冲洗至中性，按1:2～1:10（w/v）的料液比加入纯化水，室温，100～120rpm，震荡20～60 min；
重复操作1）～3）1至5次后，按料液比1:20（w/v）加入纯化水，室温，100～120rpm，振荡清洗5～15次，5～15 min/次，得脱细胞基质；
步骤四、制备涂层：将所述天然高分子材料配制成浓度为0.2～3.0%的天然高分子材料溶液，在18～30℃条件下加入0.01～1% (w/v)交联剂EDC溶液，EDC溶液与所述天然高分子材料溶液的质量比为1:3～1:20，搅拌30 ～ 180 min后，将其添加到所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，得表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质；
步骤五、冷冻干燥：将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中压缩，10～30 min后，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，再将其放进冷冻干燥机内进行冻干；
步骤六、包装；
步骤七、灭菌：通过辐照、电子束或环氧乙烷灭菌，杀灭可能存在的外源性或者动物源性病毒及病菌。
上述制备涂层中的利用旋涂技术进行成膜分为以下两个阶段：
第一阶段是低速阶段，150～200r/min条件下将天然高分子材料溶液滴加在低速旋转的脱细胞基质上，滴加的天然高分子材料溶液厚度为1～4mm，当滴加完溶液后，开始计时，旋涂10～20s；
第二阶段是扩展阶段，将旋涂速度调整到1500～3500r/min，旋涂时间为10～30s。
步骤五中的冻干过程是：将冷冻干燥机设定为从室温降低到-40℃，降温时间为60
min，在-40℃稳定2h，然后用1h从-40℃升温到-20℃，在-20℃稳定8 h，再用4 h从-20℃匀速升温至25℃；
冷冻干燥持续时间为16 h。
上述步骤五中需要向制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质的表面平铺一层可食用胶原基质薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面后，再将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中。
上述有机试剂是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种。
上述步骤三中，向脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液是由重量比为1:1的氢氧化钠和氯化钠配制而成。
上述步骤三中，向脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液是浓度0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液。
上述天然高分子材料是纤维蛋白胶、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸中的任一种或多种。
上述步骤四的具体过程是：将0.2%的羧甲基纤维素钠和2%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，将交联后的混合液倒铺于所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，先以180r/min的转速旋转15s，再以2000r/min的转速旋转20s。
上述步骤四的具体过程是：将血浆冻存于-80℃，之后再与-4℃进行解冻，待解冻完全之后置于离心管中，4000～5000
r/min离心5～15
min，弃去上清液得到浓缩的天然纤维蛋白胶沉淀；接着将蛋白胶沉淀倒铺在所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，先以180r/min转速旋转10s，再以2500r/min的转速旋转15s。
上述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖和透明质酸配按照质量比5:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.05% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1h，利用旋涂技术进行成膜；先以160r/min转速旋转20s，再以速度是2000r/min，旋转25s。
上述步骤四的具体过程是：将羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖按照质量比2:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜；先以180r/min的转速旋转20s，再以3000r/min的转速，旋转15s。
上述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为2.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.02%
(w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，利用旋涂技术进行成膜, 先以180r/min的转速，旋转20s，再以2500r/min转速旋转25s。
上述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.2%
(w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜，先以180r/min的转速旋转20s，再以2500r/min转速旋转30s。
上述动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种。
与现有产品相比，本发明的硬脑/脊膜修复生物膜的优点在于：
1）本产品实现了将可降解材料与异种材料的有效结合，不仅具备了天然高分子的止血、抗菌和粘合性能，也具备了脱细胞基质良好的力学性能、生物相容性、组织生长诱导性和降解性的优点。
2）脱细胞基质未进行交联，使其保留了天然的三维空间结构；另外，脱细胞基质材料体与涂层结构和降解时间的差异化，可以很好的同时满足硬脑/脊膜修复过程中止血、防粘连、组织再生和抗压不同要求，有利于硬脑膜的愈合。
3）本发明采用的旋涂技术是分为两个阶段：低速阶段和扩展阶段，前者能降低涂层溶液和脱细胞基质之间的表面张力，使其结合更加紧密，而后者可以制备排列有序的均一涂层结构，制备的涂层力学强度优，较流延成膜或者刮涂成膜增加0.8～1.2倍。
4）本发明采用真空压缩的方法使得涂层和脱细胞基质的结合更加紧密，可有效去除溶液中的气泡，冻干后产品表面平整，为良好的力学性能打好基础。
5）本发明制备的硬脑/脊膜修复生物膜操作简单、原料来源广泛、易裁切而且价格低廉，为大规模生产降低成本。
附图说明
图1为硬脑/脊膜修复生物膜双层结构的截面电镜扫描图；
图2是涂层面的电镜扫描图；
图3是脱细胞基质的电镜扫描图；
图4为采用实施例一制备的硬脑/脊膜修复生物膜对兔硬脑膜进行缺损修复术后2 周取材的大体图；
图5是与图4对应的2周取材的组织学染色图；
图6是采用实施例3所制备的硬脑膜生物型修复膜修复兔硬脑膜缺损术后4周取材的大体图；
图7是与图6对应的4 周取材的组织学染色照片；
图8为采用实施例5所制备的硬脑膜生物型修复膜修复兔硬脑膜缺损术后4 周取材的大体图；
图9是与图8对应的4周取材的组织学染色照片。
图中：1、涂层面；2、脱细胞基质。
具体实施方式
为了解决现有生物型修复膜或修补片存在的力学强度差、缝合点有脑脊液渗漏的风险、减弱促进组织再生修复性能、降解后有残毒、生物相容性差，易引起修补材料与脑组织粘连及诱发其他并发症等缺陷，本实施例提供一种具有防漏液、止血、防粘连性能，不需要缝合而能封闭创面并保持良好的力学性能，产品生物相容性好，无免疫排斥反应，对组织无不良刺激；可降解吸收，降解速率与硬脑/脊膜修复速率相匹配的、适合于硬脑/脊膜修复的生物修复膜及其制备方法。
其中，生物修复膜是由天然可吸收止血材料与异种脱细胞材料复合而成，这种组合材料更贴近天然硬脑/脊膜组织，具有防漏液、止血、防粘连性能，不需要缝合而能封闭创面并保持良好的力学性能，产品生物相容性好，无免疫排斥反应，对组织无不良刺激；可降解吸收，降解速率与硬脑/脊膜修复速率相匹配，从而有效克服现有硬脑/脊膜修复产品存在的力学强度差、缝合点有脑脊液渗漏的风险、减弱了促进组织再生修复性能、降解后有残毒、生物相容性差，易引起修补材料与脑组织粘连及诱发其他并发症等缺陷。
为此，本实施例中提及的天然可吸收止血材料为天然高分子材料，如纤维蛋白胶、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸等。这些材料具有良好的胶粘性、抗菌性和止血性能，能够严密粘附于组织，更符合硬脑/脊膜密闭的生理要求，也能达到止血、防粘连的效果。并且还具有趋化、促细胞有丝分裂、良好的组织生长诱导作用，能够促进创面组织快速再生，降解速度与组织再生速度相匹配。
而异种脱细胞材料则是由动物源性组织经脱细胞去抗原处理后所得，在其上添加天然高分子材料涂层改性制备成前述的生物型修复膜，具有独特的双层功能结构。如图1所示，其中1所指为疏松面，是涂层面即天然高分子材料凃层，2为致密面，是脱细胞基质层。结合图2和图3，可以明显看出生物修复膜的微观结构和孔径形态，涂层面疏松，动物原材料面致密。
这里的动物源性组织具体是指动物膜组织，如牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜，具有一定的弹性和韧性，能起到加强固定和隔离防粘连作用，确保颅内压较大时不会对脑组织有伤害性的冲击，并且其生物相容性、厚度和降解性各方面上都优于其他材料。
上述动物膜组织脱细胞去抗原后即其脱细胞基质结构紧密，厚度为0.4～1.0mm，体内降解时间为3～6m；与该脱细胞基质外的天然高分子材料涂层的结构疏松，厚度为0.3mm～0.8mm，体内降解时间为4～6周。
两层材料（脱细胞基质和天然高分子材料涂层）具有的不同结构组成及降解性能，满足了硬脑/脊膜修复过程中止血、防粘连、促进组织再生和抗压的不同要求。
上述生物修复膜经以下步骤制备而成：
步骤一、动物膜组织预处理：去除动物膜组织中多余的脂肪以及附属组织，并用纯化水或者生理盐水反复清洗去除血色。
步骤二、脱脂：脱细胞基质和有机试剂按照1:5～1:15的（重量体积比w/v）进行抽提，室温100～140 rpm震荡脱脂2～6 h后，更换有机试剂继续震荡脱脂10～20h；弃去有机试剂，按1:20料液比（重量体积比：w/v）加入纯化水，室温100～120rpm 振荡清洗5～10次，10min/次。有机溶剂可以是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种。
步骤三、脱细胞去抗原处理：按料液比1:2～1:10（重量体积比：w/v）加入氢氧化钠和氯化钠(1:1)配制的碱性水溶液，室温120rpm振荡20～60min；弃去碱性水溶液，纯化水冲洗3次至中性；再按料液比1:2～1:10（重量体积比）加入纯化水，室温100～120rpm震荡20～60 min。重复上述步骤1～5次后，按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗5～15次，5～15 min/次。
不难看出，此步骤中，动物膜组织的去抗原处理是通过在高浓度碱性溶液对细胞进行病毒灭活，然后在反复的高低浓度碱溶液中进行脱细胞处理，该处理方法让溶液更能够充分的与细胞接触，从而更容易去除细胞；除此之外，该方法操作简便，利用碱溶液进行脱细胞处理，没有引入任何有机试剂，避免了任何试剂可能导致的低毒性。本发明采用脱细胞基质具有良好的生物相容性、厚度和力学性能，且未进行交联，保留了天然胶原纤维的三维空间结构，避免了传统交联后难降解、易造成细胞毒性的缺点。
步骤四、天然高分子材料涂层（简称涂层）的制备：
将天然高分子材料溶解于纯化水中，配制成浓度为0.2～3.0%的溶液，于18～30℃条件下加入0.01～1% (w/v)交联剂EDC溶液，EDC溶液与高分子溶液的质量比为1:3～1:20，搅拌30～180 min后利用旋涂技术进行成膜。得表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质。
旋涂技术中制备涂层分为以下两个阶段：第一阶段是低速阶段，150～200r/min条件下将溶液滴加在低速旋转的脱细胞基质上，滴加的溶液厚度为1～4mm。当滴加完溶液后，开始计时，旋转时间为10～20s；第二阶段是扩展阶段，将旋涂速度调整到1500～3500r/min，旋凃时间为10～30s。
本步骤中，天然高分子材料溶液的配制只需纯化水即可，实验操作简单，不需要中和清洗步骤，也不需要使用强酸强碱有机试剂，缩短了实验时间，为大生产节约了资源。
另外，本步骤采用分阶段旋涂技术制备的涂层结构均匀而致密，力学强度优。首先低速旋转会让溶液慢慢浸润脱细胞基质表面，降低了溶液和脱细胞基质之间的表面张力，使两者结合更加紧密；再通过扩展阶段使溶液在旋涂仪上旋转，并在离心力的作用下使溶液沿着脱细胞基质表面径向扩展，在此高速旋转的过程中，脱细胞基质表面和溶液粘性层之间的剪切力和惯性力逐渐达到平衡，涂层的结构均匀且相对较为致密，分子间有序堆积，增加了涂层的拉伸强度。
经试验研究，旋转速度在1500～3500r/min时，样品的拉伸强度不低于3Mpa，较流延成膜或者刮涂成膜增加0.8～1.2倍。
步骤五、冷冻干燥：是将制备好的复合材料（即表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质）放进真空压缩机中10 ～ 30 min后，再将样品放进冷冻干燥机内进行冻干。冻干程序设定为从室温降低到-40℃，降温时间为60 min，在-40℃稳定2 h，然后用1 h从-40℃升温到-20℃，在-20℃稳定8 h，再用4h从-20℃匀速升温至25℃，总的冷冻干燥时间为16 h，产品的厚度为0.5 mm～3.0 mm。
本步骤通过真空压缩，一方面有效去除溶液中的气泡，避免了因结构不均导致的力学强度欠缺，经试验验证，制备的结构均一产品的力学强度是结构不均产品的0.3～0.8倍；另一方面让涂层和脱细胞基质结合紧密，无分层，避免了使用粘连剂，且增加了产品的透气性。
另外，本发明制备的用于硬脑/脊膜修复的生物修复膜不仅保留了脱细胞基质的三维空间结构，同时涂层遇体液、血液会形成凝胶与组织边缘缺损部位紧密结合，无需缝合，能有效降低渗血和粘连风险。
涂层具有组织生长诱导性，结构相对于脱细胞基质较为疏松，能引导缺损处细胞的长入，同时减免了动物源性组织与损伤神经组织直接接触所导致的传染病风险，如疯牛病。
而脱细胞基质主要是起到保护脑组织防止外界感染的作用，并且提供了可供细胞长入并最终分泌胶原蛋白的三维支架。
4～6周后，涂层被降解完全，而长入涂层的新生成纤维细胞转移至脱细胞基质的三维支架中，和已经长入脱细胞支架结构中的成纤维细胞一起分化成为I型胶原蛋白，进而衍生成了新的硬脑/脊膜，且随着脑/脊组织的修复,3～6月剩余材料被逐渐被代谢排除体外。
步骤六、包装：产品进行包装，易于运输和保存，同时避免外界污染。
步骤七、灭菌：辐照、电子束或环氧乙烷灭菌；本步骤采用r-射线辐照灭菌，辐照剂量为15～30 KGy，以杀灭可能存在的外源性或者动物源性病毒及病菌。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
以下各实施例中选用的动物膜组织选择有资质的屠宰厂，选用健康的牛或猪，从屠宰厂运到公司的时间不能超过12h，这样才能保证牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜的质量。
实施例
1
硬脑/脊膜修复用生物修复膜是以牛源性生物材料为基质，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对脱脂后的牛心包膜进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液配制的碱性高渗溶液，室温120 rpm振荡30
min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm震荡30
min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：
涂层的制备是将0.2%的羧甲基纤维素钠和2%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，将交联后的混合液倒铺于步骤三制备的脱细胞基质（即牛心包膜的脱细胞基质）上，利用旋涂技术进行成膜，在低速阶段，转速为180r/min旋转时间为15s；在扩展阶段，是将旋涂速度调整到2000r/min，旋凃时间为20s。其中，涂层的厚度为0.6 mm，涂层的单位面积比重为2～7 mg/cm2。
接着，向涂层表面平铺一层可食用薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min (抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空。
步骤五、冻干：将从真空压缩机中取出的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质直接放进冷冻干燥机内，冻干程序设定为从室温降低到-40℃，降温时间为130min，在-40℃稳定2h，然后用1h从-40℃匀速升温到-20℃，在-20℃稳定6h，再用14h从-20℃匀速升温至25℃。
步骤六、包装：采用双层聚四氟乙烯袋子包装。
步骤七、灭菌：产品采用r-射线辐照灭菌，辐照剂量>15KGy，以杀灭可能存在的外源性或者动物源性病毒及病菌。
步骤八、经检验后即得成品。
所制备的生物修复膜的各项参数是：厚度为0.8～1.5mm，单位面积比重为2～7 mg/cm2（因为脱细胞基质的厚度是不均匀），拉伸强度不小于2.8 MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，湿态下膜的拉伸强度不低于4kpa，吸血量为自身重量的15倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易修剪，操作方便；用于兔的硬脑膜缺损修复动物实验，如图4、5所示，可以看出硬脑膜上缺损处没有明显的缺损痕迹，已经与周围组织生长融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生，图4中圆圈部位为缺损修复区域；MASSON照片中有无明显炎症反应，有大量结缔组织生成，可见材料与脑组织周围融合，愈合生长较快。
实施例
2
硬脑/脊膜修复用生物修复膜以牛源性生物材料为基质，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对细胞进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm震荡30
min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：涂层的制备是将血浆冻存于-80℃，之后再与-4℃进行解冻，待解冻完全之后置于离心管中，4000 ～ 5000
r/min离心5～15
min，弃去上清液得到浓缩的天然纤维蛋白胶沉淀；将蛋白胶沉淀倒铺在脱细胞后的牛心包膜上，利用旋涂技术进行成膜。在低速阶段，转速为180r/min旋转时间为10s；在扩展阶段，是将旋涂速度调整到2500r/min，旋凃时间为15s。
接着向涂层表面平铺一层可食用薄膜（如胶原基质薄膜），拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min(抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，最后将样品即真空压缩后的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质从真空压缩机中取出放进冷冻干燥机中进行冻干。其中，涂层的厚度为0.7mm，涂层的单位面积比重为2～8 mg/cm2，拉伸强度为3.5 MPa。
真空压缩机真空压缩是为了达到天然高分子材料涂层和牛心包膜的脱细胞基质层结合紧密的效果，但同时在真空环境中可避免样品污染，利用旋涂技术进行成膜可以达到涂层表面均一性；纤维蛋白胶无组织毒性、是一种生物蛋白制剂、具有良好的生物相容性，其优异的粘连性与封闭功能适用于固定和封闭分离周围神经末端，保护暂时失去信号传导的神经纤维，利于吻合手术的进行，同时可以有效地防止液体渗漏，减少术后炎症反应。
所制备的生物修复膜的各项参数是：单位面积比重为2～8
mg/cm2（因为脱细胞基质的厚度是不均匀），厚度为0.7～1.2mm，拉伸强度不小于3.0 MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，吸血量为自身重量的10倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易操作。
用于兔硬脑膜缺损修复动物实验，结果显示修复区域生长较好，无粘连，无脑脊液渗漏，具体参见图6和图7，可以看出硬脑膜上缺损处没有明显的缺损痕迹，已经与周围组织生长融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生，图6中圆圈部位为缺损修复区域；照片中有大量结缔组织生成，可见材料与周围组织融合，愈合生长较快，无明显炎症反应。
实施例
3
硬脑/脊膜修复用生物修复膜是以猪源性生物材料为基质，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的猪腹膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的猪。撕去猪腹膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将猪腹膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗猪腹膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在猪腹膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对细胞进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm震荡30
min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：将羧甲基壳聚糖和透明质酸配按照质量比5:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.05%
(w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜，具体参数为：低速阶段，转速为160r/min旋转时间为20s，在扩展阶段的旋涂速度是2000r/min，旋凃时间为25s，制备的涂层的厚度为0.5 mm，涂层的单位面积比重为1 ～ 6 mg/cm2。
接着向涂层表面平铺一层可食用薄膜（如胶原基质薄膜），拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min (抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，最后将样品即真空压缩后的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质从真空压缩机中取出放进冷冻干燥机中进行冻干。
其余步骤同前述实施例，不再重复。
制备的生物修复膜的各项参数是：厚度为0.9～1.5mm，单位面积比重为1～6mg/cm2（因为脱细胞基质的厚度是不均匀），拉伸强度不小于2.8 MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，湿态下膜的拉伸强度不低于3.6kpa，吸血量为自身重量的28倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易操作；用于兔硬脑膜缺损修复动物实验，结果显示修复区域生长较好，无粘连，无脑脊液渗漏；与不加涂层的牛心包相比，修复速度较快，周围组织无明显炎症反应，具体参见图6和图7，可以看出硬脑膜上缺损处没有明显的缺损痕迹，已经与周围组织生长融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生，图6中圆圈部位为缺损修复区域；照片中有大量结缔组织生成，可见材料与周围组织融合，愈合生长较快，无明显炎症反应。
实施例
4
硬脑/脊膜修复用生物修复膜是以牛源性生物材料为基质，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对细胞进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm震荡30
min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：将羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖按照质量比2:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下向脱细胞基质加入0.1%
(w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜，具体参数为：低速阶段，转速为180r/min旋转时间为20s，在扩展阶段的旋涂速度是3000r/min，旋凃时间为15s。涂层的厚度为0.45 mm，单位面积为2 ～7mg/cm2。
接着向涂层表面平铺一层可食用薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min (抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，最后将样品即表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质从真空压缩机中取出放进冷冻干燥机中进行冻干。
其余步骤类似，不再重复。
所制备的生物修复膜的参数是：厚度为0.7～1.2mm，单位面积比重为0.5～5 mg/cm2（因为脱细胞的牛心包膜的厚度是不均匀），拉伸强度不小于2.7MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，湿态下膜的拉伸强度不低于3kpa，吸血量为产品自身重量的22倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易操作。
用于兔硬脑膜缺损修复动物实验，结果显示修复区域生长较好，无粘连，无脑脊液渗漏；与不加涂层的牛心包膜相比，修复速度较快，周围组织无明显炎症反应。
实施例
5
以牛源性生物材料制备生物修复膜，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对细胞进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120
rpm震荡30 min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为2.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下向脱细胞基质中加入0.02% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜, 具体参数为：低速阶段的转速为180r/min，时间为20s，在扩展阶段的旋涂速度是2500r/min，旋凃时间为25s。涂层的厚度为0.65 mm，单位面积为2 ～ 6 mg/cm2。
接着向涂层表面平铺一层可食用薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min (抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，最后从真空压缩机中取出放进冷冻干燥机中进行冻干。
其余步骤类似，不再重复。
所制备生物修复膜的参数是：厚度为1.1～1.8mm，单位面积比重为2～6 mg/cm2（因为脱细胞的牛心包膜的厚度是不均匀），拉伸强度不小于3.2 MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，湿态下膜的拉伸强度不低于3.4kpa，吸血量为自身重量的26倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易操作。
用于兔硬脑膜缺损修复动物实验，结果显示修复区域生长较好，无粘连，无脑脊液渗漏；与不加涂层的脱细胞后的牛心包膜相比，修复速度较快，周围组织无明显炎症反应，具体参见图8和图9，可以看出硬脑膜上缺损处没有明显的缺损痕迹，已经与周围组织生长融合，没有粘连和脑脊液渗漏现象发生，图8中的圆圈部位为缺损修复区域；照片中有大量结缔组织生成，可见材料与周围组织融合，愈合生长较快，无明显炎症反应。
实施例
6
以牛源性生物材料制备生物修复膜，经如下步骤制作而成；
步骤一、动物膜组织预处理：选用的牛心包膜指的是选择有资质的屠宰厂，并选用健康的牛。撕去牛心包膜上附带的容易撕掉的脂肪，然后将牛心包膜平铺在不锈钢盘上，用卡片将剩余脂肪刮除，将边缘难以去除脂肪或杂质的部位剪掉；加入纯化水反复清洗牛心包膜，至表面无血色及其他附着物。
步骤二、脱脂：在通风橱中按料液比1:8的比例（重量体积比）加入异丙醇，室温120
rpm震荡脱脂4 h，更换异丙醇，继续室温120
rpm震荡脱脂11 h；弃去异丙醇，纯化水冲洗附着在牛心包膜及乐扣盒表面的异丙醇，按1:20料液比（重量体积比）加入纯化水，室温120rpm振荡清洗5次，10min/次。
步骤三、脱细胞：通过在碱性溶液(1mol NaOH)中对细胞进行病毒灭活，然后再按料液比1:10（重量体积比）加入由0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液，室温120 rpm振荡30 min；弃去碱性高渗溶液，纯化水冲洗三次，按料液比1:10（重量体积比）加入纯化水，室温120
rpm震荡30 min；重复上述步骤一次；按料液比1:20（重量体积比）加入纯化水，室温120 rpm振荡清洗10次，10 min/次。
步骤四、涂层和脱细胞基质复合材料的制备：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下向脱细胞基质中加入0.2% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜，低速阶段的转速为180r/min，时间为20s，在扩展阶段的旋涂速度是2500r/min，旋凃时间为30s。涂层的厚度为0.55 mm，单位面积比重为0.5～4 mg/cm2。
接着向涂层表面平铺一层可食用薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面，然后将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中真空压缩30
min (抽真空和排放真空的时候都需要缓慢进行，防止排放真空液体飞溅)，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，最后从真空压缩机中取出放进冷冻干燥机中进行冻干，产品形貌见图1。
其余步骤类似，不再重复。
所制备的生物修复膜的参数是：厚度为1.0～1.5mm，单位面积比重为0.5～4 mg/cm2（因为脱细胞的牛心包膜的厚度是不均匀），拉伸强度不小于3.0 MPa（用流延成膜法制备出来的样品拉伸强度不大于2Mpa）。渗水率为零，复水时间小于5min，湿态下膜的拉伸强度不低于2.0kpa，吸血量为自身重量的22倍；蛋白含量不低于70%，脂肪含量小于1%，羟脯氨酸含量大于70%，细菌内毒素小于2.15EU/件，无热源，无致敏无刺激，无毒性；不用缝合，易操作；用于兔硬脑膜缺损修复动物实验，结果显示修复区域生长较好，无粘连，无脑脊液渗漏；与不加涂层的牛心包相比，修复速度较快，周围组织无明显炎症反应。
综上，不难看出，以上各实施例提供的用以修复硬脑/脊膜用的生物修复膜及其制备方法，通过在脱细胞后的动物源性胞组织外制备可吸收止血的天然高分子材料涂层，解决了现有生物型修复膜存在的力学强度差、缝合点有脑脊液渗漏的风险、减弱促进组织再生修复性能、降解后有残毒、生物相容性差，易引起修补材料与脑组织粘连及诱发其他并发症等的缺陷，具体是通过预处理、有机试剂脱脂、碱液脱细胞去抗原、制备涂层并利用旋涂技术进行成膜、真空压缩冻干、包装和消毒的处理工艺过程，完成该生物型修复膜的制备，该生物型修复膜具有止血、防漏液、抗菌、防粘连性能，保留了天然的三维空间结构，具有组织生长诱导性、不需要缝合而能封闭创面并保持良好的力学性能，产品生物相容性好，无免疫排斥反应，对组织无不良刺激；可降解吸收且无毒，降解速率与硬脑/脊膜修复速率相匹配，原料来源广泛和价格低廉的优点，易于大规模生产。
Claims (17)
1.一种生物修复膜，其特征在于：包括经脱细胞去抗原处理后的动物膜组织层，及涂覆于其表面的可吸收止血的天然高分子材料涂层；
所述动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种；
所述天然高分子材料是纤维蛋白胶、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸中的任一种或多种。
2.如权利要求1所述的生物修复膜，其特征在于：所述生物修复膜的厚度为0.7～1.8mm，单位面积比重为0.5～8 mg/cm2，拉伸强度为2.7MPa ～3.5 MPa。
3.一种权利要求1所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、动物膜组织预处理：去除动物膜组织中多余的脂肪以及附属组织，并用纯化水或生理盐水反复清洗至去除血色；
步骤二、脱脂：动物膜组织和有机试剂按照1:5～1:15（w/v）进行抽提，室温，100～140 rpm，震荡脱脂2～6h后，更换有机试剂继续震荡脱脂10～20h；弃去有机试剂，按1:20（w/v）加入纯化水，室温，100～120rpm，振荡清洗5～10次，10min/次，得脱脂后的动物膜组织；
步骤三、脱细胞去抗原处理：1）、按1:2～1:10（w/v）的料液比，向步骤二的最终产物脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液；
2）、室温，100～120rpm，振荡20～60min，弃去碱性水溶液；
3）、纯化水冲洗至中性，按1:2～1:10（w/v）的料液比加入纯化水，室温，100～120rpm，，震荡20～60 min；
重复操作1）～3）1至5次后，按料液比1:20（w/v）加入纯化水，室温，100～120rpm，，振荡清洗5～15次，5～15 min/次，得脱细胞基质；
步骤四、制备涂层：将所述天然高分子材料配制成浓度为0.2～3.0%的天然高分子材料溶液，在18～30℃条件下加入0.01～1% (w/v)交联剂EDC溶液，EDC溶液与所述天然高分子材料溶液的质量比为1:3～1:20，搅拌30 ～ 180 min后，将其添加到所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，得表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质；
步骤五、冷冻干燥：将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中压缩，10～30 min后，停止压缩，静置2 h，然后排除真空，再将其放进冷冻干燥机内进行冻干；
步骤六、包装；
步骤七、灭菌：通过辐照、电子束或环氧乙烷灭菌，杀灭可能存在的外源性或者动物源性病毒及病菌。
4.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述制备涂层中的利用旋涂技术进行成膜分为以下两个阶段：
第一阶段是低速阶段，150～200r/min条件下将天然高分子材料溶液滴加在低速旋转的脱细胞基质上，滴加的天然高分子材料溶液厚度为1～4mm，当滴加完溶液后，开始计时，旋涂10～20s；
第二阶段是扩展阶段，将旋涂速度调整到1500～3500r/min，旋凃时间为10～30s。
5.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：步骤五中的冻干过程是：将冷冻干燥机设定为从室温降低到-40℃，降温时间为60 min，在-40℃稳定2h，然后用1h从-40℃升温到-20℃，在-20℃稳定8 h，再用4 h从-20℃匀速升温至25℃；
冷冻干燥持续时间为16 h。
6.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：所述步骤五中需要向制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质的表面平铺一层胶原基质薄膜，拉紧并将四周固定于模具下面后，再将制备好的表面涂覆有天然高分子材料涂层的脱细胞基质放进真空压缩机中。
7.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：所述有机试剂是无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙醚、甲醇、氯仿和石油醚中的任一种。
8.如权利要求3所述的生物型修复膜的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，向脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液是由重量比为1:1的氢氧化钠和氯化钠配制而成。
9.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：所述步骤三中，向脱脂后的动物膜组织中加入碱性水溶液是浓度0.25mol/L的NaOH溶液和1M NaCl溶液。
10.如权利要求3所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：所述天然高分子材料是纤维蛋白胶、羧甲基纤维素钠、羧甲基壳聚糖、透明质酸中的任一种或多种。
11.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将0.2%的羧甲基纤维素钠和2%的羟丙基甲基纤维配成混合的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1%
(w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，将交联后的混合液倒铺于所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，先以180r/min的转速旋转15s，再以2000r/min的转速旋转20s。
12.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将血浆冻存于-80℃，之后再与-4℃进行解冻，待解冻完全之后置于离心管中，4000～5000 r/min离心5～15 min，弃去上清液得到浓缩的天然纤维蛋白胶沉淀；接着将蛋白胶沉淀倒铺在所述脱细胞基质上，利用旋涂技术进行成膜，先以180r/min转速旋转10s，再以2500r/min的转速旋转15s。
13.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖和透明质酸配按照质量比5:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.05% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1h，利用旋涂技术进行成膜；先以160r/min转速旋转20s，再以速度是2000r/min，旋转25s。
14.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将羧甲基纤维素和羧甲基壳聚糖按照质量比2:1配制浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.1% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜；先以180r/min的转速旋转20s，再以3000r/min的转速，旋转15s。
15.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为2.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.02% (w/v)交联剂EDC，搅拌1 h，利用旋涂技术进行成膜, 先以180r/min的转速，旋转20s，再以2500r/min转速旋转25s。
16.如权利要求10所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤四的具体过程是：将羧甲基壳聚糖配制成浓度为1.0%的均一溶液，在室温下，磁力搅拌作用下加入0.2% (w/v)交联剂EDC溶液，搅拌1 h，利用旋涂技术成膜，先以180r/min的转速旋转20s，再以2500r/min转速旋转30s。
17.如权利要求3至16中任一权利要求所述的生物修复膜的制备方法，其特征在于：所述动物膜组织是牛心包膜、牛腹膜、猪心包膜、猪腹膜、猪肠系膜和筋膜中的任一种。
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