CN101564555A

CN101564555A - 一种组织工程骨移植物及其构建方法

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Publication number: CN101564555A
Application number: CNA2009101076242A
Authority: CN
Inventors: 王大平; 何春耒; 熊建义; 刘黎军; 徐小平; 陆伟; 彭亮权; 刘建全; 李文翠; 朱伟民; 周可; 欧阳侃; 胡波
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2009-05-27
Filing date: 2009-05-27
Publication date: 2009-10-28
Anticipated expiration: 2029-05-27
Also published as: CN101564555B

Abstract

一种组织工程骨移植物及其构建方法，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料是采用溶胶－絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano－HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。本发明所述的一种组织工程骨，包括由骨髓间充质干细胞、含BMP－2目的基因的腺病毒、纳米羟基磷灰石通过一定的工序、方法构建的具有一定空间结构及生物活性的仿生人工骨。本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损。

Description

一种组织工程骨移植物及其构建方法

技术领域

本发明涉及骨缺损的一种修复材料，属于生物医学组织工程中用基因增强骨组织工程技术构建仿生人工骨的技术领域，具体涉及一种仿生人工骨的构建及应用。

背景技术

由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织缺损是临床面临的难题之一，植骨术是解决这一问题的主要方法。植骨术主要分为自体来源植骨术、同种异体或异种植骨术。这两种方法的弊端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反应等。近年来随着组织工程学科的发展，利用组织工程学原理和方法构建的组织工程骨移植可以改进上述弊端，组织工程为骨缺损的修复带来美好的前景。骨组织工程研究主要有4方面：支架材料、种子细胞、细胞因子、临床使用。组织工程化骨作为骨修复材料的替代物可以避免生物源修复材料的缺陷。将生物相容性好的有骨传导能力的并在体内可生物降解的支架材料与具有强大诱骨活性的细胞因子结合可以使骨缺损修复材料拥有骨传导和诱导的双重特性，在迅速成骨的同时植入材料逐渐降解，为骨缺损的修复提供了全新的思路和方法。

骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓中，现证实MSCs至少可向9种以上成熟细胞分化，其中包括成骨细胞及内皮细胞，分化多向性提示它可能成为细胞治疗和组织工程人工骨构建的理想种子细胞，因此，骨髓MSCs成为骨组织工程理想的种子细胞。

骨形态发生蛋白(BMP)于1965年由Urist首次发现以来，人们发现BMP家族有20多个成员，BMP具有独特的诱导成骨活性，在修复骨质缺损和促进骨折愈合等方面可以发挥重要作用。骨形态发生蛋白的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，国内外学者对BMP和rhBMP做的大量研究结果表明，BMP-2被认为具有最高的生物活性，是最具有前途的骨诱导蛋白，能促使原位和异位成骨，被认为是最具有前途的骨诱导物质，美国食品和药物管理局2004年正式批准BMP-2用于临床治疗长骨骨折，但由于天然BMP-2在体内含量极微，半衰期短，提取困难，使得对BMP-2的进一步研究和应用受到局限。采用BMP-2的基因治疗手段，可在一定时期内获得持续的成骨效应，随着分子生物学、生物化学、组织科学、基因科学等多方面知识的飞速发展，针对上面的阐述，利用BMP2转基因诱导成骨可实现一定时间内的BMP2持续表达，实现了克服BMP-2直接应用的不足。

纳米生物技术是目前国际生物技术领域的最前沿的研发热点，纳米技术以其新颖、独特的思路和首批研究成果的问世，同样在医学科学技术界引起巨大的反响。近年来在骨组织工程中，有关纳米羟基磷灰石(Nano-HA)材料学的研究在国际上得到迅速发展，完整的科学体系正在形成。Nano-HA具有与人体骨组织相似的无机成分(钙、磷)能制备出不同形状、孔隙率和降解率的产品，羟基磷灰石纳米粒子引入到非亲水性的可生降解聚酯基体材料中去，就有可能得到能被降解，力学性能较好，骨诱导性能优越的新型骨修复材料。英国的Bonfield成功地合成了模拟骨骼亚结构的纳米物质，该物质可取代目前骨科常用的合金材料。它的主要成份是经与聚乙烯混合和压缩后的羟基磷灰石网(骨骼的主要成份)，其物质特征正好符合理想的骨骼替代物的模数匹配，而且不易骨折，并能与正常骨组织连接紧密，显示出了明显的正畸应用优势。

发明内容

本发明涉及用腺病毒介导下将BMP-2基因导入骨髓间充质干细胞复合Nano-HA体外构建仿生人工骨，经实验证实细胞复合前后可高效表达BMP-2并促进其增殖分化；转基因细胞复合Nano-HA支架中扫描电镜见细胞贴附生长良好，细胞可持续分泌表达BMP-2。用上述方法构建的仿生人工骨植入桡骨缺损模型可以很好的修复桡骨节段性骨缺损。我们通过实验证实缺损模型12周时骨折完全愈合，皮质骨连续，髓腔再通。本研究结果表明，利用骨髓间充质干细胞作为运载BMP-2的工具，其主要是通过软骨化骨的方式诱导成骨，是治疗节段性骨缺损的理想方法。

骨形态发生蛋白-2属于β-转化生长因子(Transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成员之一，在胚胎发生和发育，组织与细胞的增殖分化等方而起着重要作用^]，BMP-2的高效诱导成骨活性已被越来越多的实验证实，天然BMP-2在体内含量极微，半衰期短，难以在体内维持持续的促成骨效应。随着分子生物学技术的发展，基因治疗应用于临床已有了可行性。而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最广泛的就是腺病毒(adenovirus，Ad)载体，针对上面的阐述，为了克服为采用BMP基因治疗大段骨缺损奠定基础。本发明利用腺病毒表达载体(Ad-BMP2)介导的BMP2转基因方法来解决BMP-2释放的问题，经过试验证实被认为是有效的手段。其应用于转基因组织工程骨治疗骨缺损的应用，用于解决临床上因骨缺损及骨创伤引起的骨修复问题。

其具体技术方案为：

一种组织工程骨移植物，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。

所述支架材料纳米羟基磷灰石是孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上的多孔活性材料，并且所得孔隙为连通孔隙。

所述的种子细胞是取自于骨髓，经分离、扩增经体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞，细胞密度为1×10⁶～5×10⁶个/ml。

所述的种子细胞是转染了腺病毒载体的骨髓间充质干细胞，所述腺病毒载体为E1区和E3区缺失的第三代复制缺陷型重组腺病毒载体。

所述腺病毒载体含有人BMP基因。

所述腺病毒载体的BMP基因是人BMP-2。

所述腺病毒载体MOI(转染比率)为100，转染后细胞能够高效表达BMP基因并分泌大量细胞因子骨形态发生蛋白-2。

本发明所述的一种组织工程骨，包括由骨髓间充质干细胞、含BMP-2目的基因的腺病毒、纳米羟基磷灰石通过一定的工序、方法构建的具有一定空间结构及生物活性的仿生人工骨。为实现上述目的，本发明提供一种新型组织工程骨的构建方法。

本发明上述的一种新型组织工程骨的构建方法技术方案如下：

1.采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石(Nano-HA)。

2.采用Gateway_TM技术构建了一种含人BMP-2重组腺病毒载体及其构建方法，具体参考专利号200810068539.5.

3.采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞。

4.采用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。

上述构建方法中，采用密度梯度离心法联合贴壁法分离与培养骨髓间充质干细胞：

(1)3％戊巴比妥钠1mL/kg耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下，用18号骨髓穿刺针，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液3～4mL。

(2)上述骨髓液加入等量的L-DMEM离心去掉脂肪层，取沉淀，用4mL培养基重新悬浮，轻轻铺于等量Percoll(1.073g/ml)分离液上离心，以细口吸管吸取云雾状细胞悬液层，将所得细胞接种于含10％FBS的培养液中，放置37℃、体积分数5％的CO2培养箱饱和湿度下培养。孵育48h后更换培养液，去除RBC、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细胞。

上述构建方法中，所述的纳米羟基磷灰石通过下列的步骤构建：

A、Nano-HA人工骨材料粉末制备

(1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，加入一定量的氨水，调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤.

(2)将沉淀物在80～120℃干燥，在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到粉末粒径小于100nm、与人体骨组织成份相似的纳米级粉末。

B、Nano-HA人工骨的制备

(1)在粉末中加入蒸馏水调和成膏状，于木模内造型，得到的坯体在80～150℃干燥，在900～1300℃温度下烧结2～4小时，即得到预成型坯形状的Nano-HA人工骨，倒置显微镜、扫描电镜显示材料：孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上的多孔活性材料。

上述构建方法中，所述的仿生人工骨通过以下步骤构建：

(1)Nano-HA置入6孔板中，含10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时吸除培液37℃、5％CO₂培养箱培养24h。

(2)把转染细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附4小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液37℃、5％CO₂培养箱继续培养2-3d换液一次。

本发明采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，大大提高了分离的成功率。

本发明的细胞因子BMP-2采用腺病毒表达载体(Ad-BMP2)介导的BMP2转基因方法来解决BMP-2释放的问题，可以最大限度的发挥BMP-2的作用时间，

本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损。

附图说明

图1为本发明实施例组织工程骨移植物结构示意图；

图2为本发明实施例Nano-HA人工骨于倒置显微镜下(×400)；

图3为本发明实施例复合后Nano-HA人工骨扫描电镜下观察(SEM，×1000)；

图4为本发明实施例A组12周时植入物扫描电镜(SEM，×1000)；

图5为本发明实施例A组12周X线；

其中：1.支架材料、2.种子细胞、3.腺病毒载体。

具体实施方式

以下通过实施例来描述本发明，应该指出的是，所列举的实施例不应理解对发明的限制。

如图所示：一种组织工程骨移植物，包括支架材料1和转染了腺病毒载体3的种子细胞2，所述种子细胞2粘附于所述支架材料1上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料1是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。

转基因仿生人工骨在动物骨缺损修中的应用：

1、动物实验手术操作

1.选用盐酸氯胺酮注射液20mg/kg，由耳缘静脉注入麻醉。

2.右侧前臂常规脱毛，消毒，手术铺巾。

3.取前臂桡侧中段作2cm纵形切口，暴露桡骨干，在距桡骨近端2.5cm处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨做成2cm的骨缺损动物模型。

4.生理盐水冲洗伤口后按不同的组别分别植入A组：Nano-HA+rBMSC+Ad-BMP-2、.B组、：Nano-HA+rBMSC、C组：单纯Nano-HA，空白对照组则不填充任何材料，依层次缝合伤口、D组：空白对照组。

5.局部肢体不作内、外固定，伤口不予包扎。

6.麻醉清醒后放入笼内常规喂养，术后三天每天80万单位青霉素肌注抗炎。

观察指标及方法

1.一般情况及大体标本

术后观察兔的饮食、活动、伤口反应，4周、8周、12周取材观察植入材料的表面情况、成骨和炎症反应等。取出标本后观察骨缺损连接情况、骨端骨痂生长情况。

2.X线检查

术后4周、8周、12周进行试验肢体的X线摄片检查。

3.生物力学检测

各组在4周、8周、12周各时间点分别随机取4只动物处死后，切取术侧完整桡骨标本，剔净骨膜及软组织后在858miniBionix力学测试机上行三点抗弯试验。

4.扫描电镜观察

处死动物后取出桡骨全段，从各材料组各个时期标本中随机取出2个标本，截取骨缺损部位及与材料交界处两端各0.5cm，用3％戊二醛固定后用利刀从中间剖开，脱水、临界点干燥、喷金镀膜后在扫描电镜(SEM)下观察骨与材料界面相容性情况及骨缺损修复情况。

结果

1.一般情况及大体标本

术后实验动物饮食、活动正常，无伤口感染，术后1周左右伤口一期愈合，伤口缝线自行脱落，肢体活动正常，无受限及跛行。

2.X线表现

实验组A组：4周时材料部分降解，材料与骨组织融合，骨痂形成；8周时材料进一步降解，骨质与材料接触界限模糊；12周时材料降解完毕，髓腔完全再通，塑形完全，骨缺损修复(图31～34)；B组、C组骨缺损修复效果欠佳；D组：骨缺损未得到修复。

3.力学分析

各时期试验组标本在三点弯曲试验中，测得的弯曲强度数据统计学分析显示：A、B、C组各组组内比较，4周＜8周＜12周，差异均有统计学意义(P＜0.05)；4周、8周、12周各组间比较，A组＞B组＞C组差异有统计学意义(P＜0.01)；表明A组材料的成骨能力优于B组和C组材料，而同一材料植入骨缺损处后随着时间的增长，其力学强度也随之增强。

4.扫描电镜观察

A组：4周时材料出现降解，材料与正常骨质间出现间隙，间隙内有骨痂产生充填；8周：材料进一步降解，但材料与正常骨质“融合”，其间产生大量新生类骨组织；12周时，材料降解完全，骨缺损区被新生板层状骨组织充填，骨缺损完全修复。B、C组可见材料吸收欠佳，新生骨量少。

Claims

1.一种组织工程骨移植物，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，其特征在于：所述的支架材料是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述支架材料纳米羟基磷灰石是孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上的多孔活性材料，并且所得孔隙为连通孔隙。

3.根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述的种子细胞是取自于骨髓，经分离、扩增经体外传代为第3代的骨髓间充质干细胞，细胞密度为1×10⁶～5×10⁶个/ml。

4.根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述的种子细胞是转染了腺病毒载体的骨髓间充质干细胞，所述腺病毒载体为E1区和E3区缺失的第三代复制缺陷型重组腺病毒载体。

5.根据权利要求4所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述腺病毒载体含有人BMP基因。

6.根据权利要求5所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述腺病毒载体的BMP基因是人BMP-2。

7.根据权利要求5所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于：所述腺病毒载体MOI转染比率为100，转染后细胞能够高效表达BMP基因并分泌大量细胞因子骨形态发生蛋白-2。

8.一种组织工程骨移植物构建方法，其特征在于：支架材料是采用溶胶-絮凝法制备，细胞支架载体复合物采用负压抽吸制备，Nano-HA制备包括以下步骤：

A、Nano-HA人工骨材料粉末制备

(1)将硝酸钙与磷酸铵的水溶液进行化学合成，加入一定量的氨水，调整溶液的pH值为8～13，添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间，使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤；

(2)将沉淀物在80～120℃干燥，在600～800℃温度下烧结2～3小时，得到粉末粒径小于100nm、与人体骨组织成份相似的纳米级粉末；

B、Nano-HA人工骨的制备

(1)在粉末中加入蒸馏水调和成膏状，于木模内造型，得到的坯体在80～150℃干燥，在900～1300℃温度下烧结2～4小时，即得到预成型坯形状的Nano-HA人工骨，倒置显微镜、扫描电镜显示材料：孔隙直径为100～250μm、孔隙率为90％以上的多孔活性材料；

其细胞支架载体复合物采用负压抽吸制备，其步骤如下：

(1)Nano-HA置入6孔板中，含10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时吸除培液37℃、5％CO₂培养箱培养24h，

(2)把转染细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37℃孵箱中保持10分钟后，放入37℃、5％CO2培养箱中贴附2小时后缓慢加入1.5ml DMEM培养液37℃、5％CO₂培养箱继续培养2-3d换液一次。

9.根据权利要求8所述的一种组织工程骨移植物构建方法，其特征在于：骨髓间充质干细胞是采用密度梯度离心法联合贴壁法获得，包括以下步骤：

(1)3％戊巴比妥钠1mL/kg耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下，用18号骨髓穿刺针，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液3～4mL；

(2)上述骨髓液加入等量的L-DMEM离心，取沉淀，用4mL培养基重新悬浮，轻轻铺于等量Percoll(1.073g/ml)分离液上离心，以细口吸管吸取云雾状细胞悬液层，将所得细胞接种于含10％ FBS的培养液中，放置37℃、体积分数5％的CO2培养箱饱和湿度下培养；孵育48h后更换培养液，去除RBC、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的骨髓干细胞。