CN104984397A

CN104984397A - 基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

Info

Publication number: CN104984397A
Application number: CN201510375809.7A
Authority: CN
Inventors: 胡杨; 何惠宇; 阿不力孜·阿布杜拉; 崔杰; 韩祥祯; 张蕾
Original assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-06-30
Also published as: CN104984397B

Abstract

本发明公开了基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用，通过分别构建携带人bFGF和BMP-2、GFP基因的重组慢病毒载体，基因转染BMSCs，建立起人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen-Ⅰ等成骨非特异性基因表达机制，通过将基因转染的BMSCs复合异种骨支架材料构建GFP标记的组织工程骨，回植颌骨缺损动物模型；克服单独基因转染带来的不足，获得解决组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中的难题——成血管及成骨功能，在口腔修复、骨移植治疗提供具有广阔应用前景的植骨材料，具有现实的价值和意义。

Description

基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域。具体的说，本发明涉及一种属于组织工程和生物制造技术领域。确切的说，本发明涉及一种组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中应用的技术领域。

背景技术

大面积骨缺损在临床上较为复杂，骨再生量要求大，如由外伤，感染产生的大段骨缺损的骨重建，肿瘤切除及骨骼畸形，或在何种情况下，再生过程中被破坏，包括股骨头缺血性坏死，萎缩性断裂和骨质疏松症。对于大面积骨缺损目前临床上常用的治疗措施主要是自体骨移植、异体骨移植(同种异体骨和异种异体骨)、无机生物材料、引导性骨再生及最近在国内外均较热门的骨组织工程技术。骨缺损的自行修复标准：用于研究的实验性骨缺损应大于实验动物自身自行愈合修复的范围，才能真实地反映修复材料或生长因子等对骨缺损的修复情况，这样的实验性骨缺损称为极限缺损，即在确定的研究时间内不可能自行愈合的最小缺损。一般认为同种异体骨移植是一种支架移植，用复合生长因子、成骨细胞、同种异体骨支架材料三者构建成为组织工程骨，将其植入缺损区，当宿主的毛细血管和纤维结缔组织长入同种异体骨支架的空隙内时，生长因子就开始促进成骨细胞诱导新骨生成。

组织工程的出现为骨缺损修复提供了新的治疗思路。组织工程是将种子细胞接种于各种支架材料上，细胞外基质的分泌和材料的吸收协调进行，最终形成由细胞和细胞外基质组成的与材料形状相同的新生组织，达到结构与功能的良好修复。目前骨组织工程的基础研究和临床应用进展迅速，有望解决传统骨缺损治疗方法中存在的问题，因此具有广阔的发展前景和临床应用价值。

目前，临床工作中，骨缺损的治疗方法有自体骨移植、异体或异种骨移植、人工合成骨替代品填充等，这些方法各有优缺点。对于非负重区骨缺损可以采用多种骨材料的填充，为填充式修复。但是对于负重区的骨缺损，由于存在应力分布，往往会导致填充的骨材料降解吸收，失去有效的力学支撑，所以对于负重区的骨缺损修复而言，提供有效的力学支撑的同时并能阻止宿主对植入物的吸收是修复的关键。自体骨移植被认为是骨缺损修复的金标准，这是因为自体骨具有卓越的成骨活性，能够有效的和植入骨周围组织有效整合；然而患者却需要承受自体骨取骨的手术打击，并且自体骨的可供骨量也十分有限，往往不能满足缺损修复的需求，并且供骨区的术后疼痛、感染、缺损畸形等并发症也会给患者带来额外的痛苦和损伤。

骨组织自我修复能力有限，较大范围骨缺损是临床口腔科及骨科领域疑难的课题，具有挑战性。传统的骨缺损治疗方法有自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植等，这些方法虽然在实验和临床治疗起到了一定的成果，但均因各种因素使其在临床应用受到一定限制：自体骨移植供体来源往往有限，而且手术时间长，并发症多；单纯同种异体骨植入后容易吸收，而且容易感染，排斥反应重；人工骨移植原材料孔隙率变异较大，成骨困难，而且来源有限。组织工程学应用种子细胞、生长因子和支架材料治疗骨缺损，不仅可避免供区损伤，也避免了供体骨吸收，同时还可降低免疫排斥反应，为骨缺损修复治疗开辟了一条崭新的道路。颌骨缺损是口腔颌面部的常见病，较大范围颌骨缺损，比如颌骨缺损区域约长3cm，宽0.5cm，高1.5cm的修复尤为临床治疗中的难点，亟需加以研究解决。

目前，由于bFGF使用剂量不一造成的实验结果差异受到越来越多研究者的注意。现阶段，实验及临床治疗中多采用添加不同浓度生长因子的方法以促进骨组织修复，然而存在免疫排斥、局部组织代谢而造成其有效浓度及功能受限。

近年来，颌骨缺损多伴随牙齿缺失、颜面软组织变形、缺损等症状，可影响患者口腔的咀嚼、吞咽、呼吸、面容等功能，进而严重影响患者的身心健康。然而，作为口腔修复治疗的基石之一，较大范围颌骨缺损的临床修复治疗确存在种种困难，首先，由于需要承受口腔咀嚼压力，要求颌骨缺损修复材料需具备一定的机械性能，承受咀嚼压力时不会碎裂。其次，其需具备良好的成血管及成骨活性，可在实验动物或人体内逐渐降解，不发生免疫排斥反应，最终被自体新生骨组织所代替。

骨组织工程中应用的材料有钙磷陶瓷、可降解有机高分子和生物衍生材料等。前两者生物相容性存在一定问题，降解产生的物质易于产生炎症和组织反应；后者生物相容性相对较好，且有一定的骨诱导能力，但力学性能相对较差，不适合用于承重骨缺损的修复。

骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞，BMSCs在体外稳定增殖且衰亡率低，在体内体外具有多向分化潜能，不同的诱导因子作用下可以向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可以分泌多种促血管生成因子和成骨因子等；然而，BMSCs自身成血管因子和成骨因子表达量较低，难以满足缺损区骨组织修复的需要，可通过基因转染及外源添加生长因子的方法，以增强其成血管和成骨功能。

现有国内外有关本领域的主要研究现状，较大体积颌骨缺损的修复难题在于骨缺损修复材料成血管化困难及成骨活性较低，临床上用于颌骨缺损修复的材料和方法存在着许多缺点，如造成供区的损伤、羟基磷灰石类材料成血管功能欠佳、异种骨支架材料等产品存在潜在免疫排斥反应、治疗效果欠佳等问题。因此，如何能够快速修复较大体积颌骨缺损，研发出成血管及成骨功能良好的组织工程骨，是临床上急需且具有重要的研究价值和治疗前景的方向。

发明内容

针对现有技术中组织工程骨领域研究的难题之一，较大体积的颌骨缺损的修复治疗存在成血管化、成骨化较缓慢的难题，本发明旨在于提供基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用，通过采用基因转染的方法，把人bFGF和BMP-2生长因子整合入种子细胞BMSCs的基因组，使得人bFGF和BMP-2因子在骨缺损区持续表达，增强本组织工程骨的成血管及成骨功能。而且，通过GFP标记的方法，探明该组织工程骨确切的存活及成骨功能，证实该组织工程骨可作为良好的修复材料，在较大体积颌骨缺损的修复治疗中，可获得较好的修复治疗效果。

本发明采用的主要技术方案：

本发明通过提供一种组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中应用，通过分别构建携带人bFGF和BMP-2、GFP基因的重组慢病毒载体，基因转染BMSCs，建立起人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨体系，探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen-Ⅰ成骨非特异性基因表达机制，通过将基因转染的BMSCs复合异种骨支架材料构建GFP标记的组织工程骨，回植颌骨缺损动物模型；通过采用改良低温锻烧法处理羊椎骨制得抗原性低、力学性能优良的异种骨支架材料，验证了人bFGF和BMP-2基因增强了BMSCs成骨及成血管能力，GFP标记反映了BMSCs的存活及功能状况。探究该组织工程骨成骨能力及修复颌骨缺损的机制，为临床较大面积颌骨缺损的修复治疗奠定理论基础，在口腔修复、骨移植治疗提供具有广阔应用前景的植骨材料，创造出显著的社会和经济效益。

本发明提供一种基因转染BMSCs的组织工程骨，组织工程骨通过以下技术步骤获得构建：

（1）构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体：分别构建携带人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒载体，建立基因转染技术，研究结果证实人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，初步探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen-Ⅰ成骨非特异性基因表达机制。

（2）人bFGF和BMP-2基因转染BMSCs，GFP基因转染BMSCs：将人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒株，添加到成骨方向诱导的BMSCs培养基中，经Blasticidin抗生素筛选，得到稳定表达目的基因的BMSCs。

（3）制备异种骨支架材料：采用经过高温微波煅烧工艺制备获得羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的异种骨支架材料，包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙构成，该支架适宜作为BMSCs附着、生长、增殖、代谢的微环境。

(4)构建GFP标记的组织工程骨:将上述步骤（2）基因转染的BMSCs消化，计数，制备细胞悬液，将异种骨支架材料用培养基润湿，将细胞悬液接种到异种骨支架材料上，细胞培养箱中孵育24小时，即制得GFP标记的组织工程骨。

经过上述构建GFP标记的组织工程骨可持续发挥成骨功能达三个月以上，其在支架材料表面及空隙中均匀分布，可有效发挥骨引导和骨诱导功能，可修复较大范围的颌骨缺损。

进一步，本发明详细提供一种基因转染BMSCs的组织工程骨，组织工程骨构建具体通过如下方法获得：

（1）BMSCs成骨方向诱导培养及鉴定：抽取羊骨髓，进行骨髓间充质干原代培养并行成骨诱导，RT-PCR检测BMSCs非特异性成骨基因mRNA水平表达，BMSCs向成骨诱导分化过程中，骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原在mRNA水平阶段性表达，BMSCs成功向成骨细胞分化。

（2）分别构建三个重组慢病毒载体、基因转染及鉴定：

构建人bFGF、BMP2、GFP- plenti6/V5-D-TOPO vector表达质粒，经基因测序证实无移码突变；在Lipofectamine 2000脂质体介导下，分别与三种包装质粒，共转染293T 细胞，获得bFGF-重组慢病毒株，BMP2-重组慢病毒株，GFP-慢病毒病毒株株；将三种病毒株感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选，得到稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，经Western-blot和倒置荧光显微镜检测bFGF、BMP2和GFP蛋白表达。

建立构建人bFGF、BMP2、GFP- 重组慢病毒株，获得稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，证实bFGF、BMP2和GFP基因表达，其确由骨髓间充质干细胞分化而来。

（3）基因转染的BMSCs成骨功能检测：通过实时定量PCR和ALP检测，bFGF/BMP2基因联合转染组 BMSCs，非特异性成骨基因表达量较高，具备较好的成骨及成血管能力。

（4）制备异种生物骨支架材料：选用成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30%H₂O₂浸泡12 h脱蛋白；经甲醇/氯仿按照体积比1∶1浸泡12 h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09 mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇.10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12 h，取出骨块干燥，经高温煅烧工艺，利用煅烧炉加热，煅烧温度达到1000℃时维持3 h煅烧后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co消毒、封装制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉主要矿物晶相为羟基磷灰石和β-磷酸三钙。

（5）制备羊颌骨缺损动物模型：采用1年龄的阿勒泰大尾羊6只，以速眠新0.15ml/kg肌注全麻，于双侧下颌骨第3前磨牙至第2磨牙近中切开分离牙龈、黏骨膜，拔出第3、4前磨牙及第一磨牙，暴露下颌骨颊舌侧骨面，分别用口腔种植用慢速手机的球钻和裂钻，制备长3cm，宽0.5cm，高1.5cm的缺损区；分层缝合手术切口，术后肌肉注射青霉素80万U 5d以预防感染。

（6）基因转染BMSCs的组织工程骨的构建：将基因转染的BMSCs，细胞浓度为1×10⁶/mL，与异种生物骨支架材料支架共培养24小时后，成功构建GFP标记的组织工程骨，GFP标记的组织工程骨回植羊颌骨缺损模型；胶原膜覆盖创面，严密拉拢缝合；术后注射青霉素，每日1次，连续3天。

经过上述制备的GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密，通过GFP标记的组织工程骨成功构建，证实种子细胞BMSCs处于存活及成骨功能状态，可促进新骨形成。

本发明通过上述披露和记载，通过分别构建携带人bFGF、BMP2和GFP基因的重组慢病毒载体，分别感染成骨方向诱导的BMSCs，弥补单一生长因子的功能不足。因为，bFGF生长因子的成血管功能较强，BMP2是具备强大的成骨功能，两者存在一定的协同作用，可增强BMSCs的成骨和成血管功能，从而促进骨缺损区域的新骨形成、骨重建及修复过程。目前，现有技术中种子细胞回植后，难以确定其是否存活、持续发挥成骨、成血管功能，区分其骨缺损修复过程是由骨缺损区成骨细胞主导，还是组织工程骨与骨缺损区成骨细胞联合主导的修复过程。GFP基因转染BMSCs，回植动物模型后，GFP表达可证实基因转染的BMSCs存活状态及成骨、成血管功能。

本发明通过采用携带人bFGF、BMP2基因的重组慢病毒载体，分别感染BMSCs，可以把bFGF、BMP2、GFP基因整合入BMSCs基因组中，使得BMSCs表达人bFGF、BMP2、GFP基因，并通过构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体，整合3个生长因子的优点，研究结果证实人bFGF和BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨及成血管功能，克服单独转染带来的不足，且可存活较长时间，持续表达bFGF、BMP2、GFP基因，持续发挥成骨及成血管功能，促进骨缺损区域骨组织新生及重建。

同时，本发明提供上述制备的组织工程骨在颌骨缺损修复中应用，实现对于骨缺损范围为长3cm，宽0.5cm,高1.5cm解决提供一种可预期的重要应用。

本发明采用的三种bFGF-重组慢病毒，BMP2-重组慢病毒，GFP-慢病毒病毒株都可通过市场公众途径购买获得。

进一步，本发明提供构建人bFGF的慢病毒载体，所述的bFGF- 慢病毒载体构建：请参看ViraPowerLentiviral Expression Systems说明书(invitrogen公司，美国)。收集慢病毒上清1mL/冻存管，-80 ℃冻存。

本发明上述所述的含人bFGF基因的慢病毒载体通过设计人 bFGF基因引物：据现有技术中习佳飞研究设计引物，用DNASTAR5.0软件对Genebank中记载的人bFGF基因序列进行比对。上游引物：5’CAC CAA CTG CAG ATG GCA GCC GGGAGC ATC 3’，下游引物：5’ACG CGT CGACTC AGC TCT TAG CAG ACA TTG GAA GAA3’，退火温度为55℃，扩增片段467 bp。bFGF基因具有如序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

RT-PCR扩增bFGF基因：Trizol法提取总RNA：称取100 mg流产胎儿胎盘组织，加1 mL trizol裂解细胞后，顺序加入氯仿、异丙醇、75%ethanol，DEPC- treated-Water溶解RNA，经紫外分光光度计测定RNA浓度及凝胶电泳检测纯度后，-80℃冰箱冻存备用。

cDNA 合成：以提取的总RNA为模板，oligo(dT)18 为末端引物通过反转录酶合成cDNA， RT-PCR条件：70℃，5 min， 37℃，5 min，1个循环；42 ℃ 60 min，1个循环；70℃，10 min，1个循环；cDNA合成完毕，-20℃冻存。

PCR扩增人bFGF基因：PCR条件：预变性95℃，3 min，1个循环；变性94℃ ，45s，55℃ ，45s，72℃、2min，30个循环；72℃，7min，1个循环；扩增出bFGF基因，片段约476 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行DNA测序，经DNASTAR5.0软件对Genebank中记载的人bFGF基因序列进行比对，基因序列完全一致。

离心柱纯化bFGF PCR产物：请参看大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书(天根公司，中国)；收集DNA的溶液经1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度后，-20℃冻存备用。

PCR和酶切鉴定重组质粒：PCR 鉴定bFGF-plenti6/V5 质粒：模板bFGFplenti6/V5 质粒1.0 μL，引物、PCR体系及退火温度参照本文PCR扩增人bFGF基因的方法。

PCR鉴定GFP-plenti6/V5质粒：模板GFP- plenti6/V5质粒1.0 μL，按照本文设计的GFP基因引物，PCR体系及退火温度参照GFP基因扩增方法。

酶切鉴定bFGF- plenti6/V5 质粒：酶切产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测后测序，经DNASTAR5.0软件比对，基因序列有2个碱基的无意义.

酶切鉴定GFP-plenti6/V5 质粒：方法参看酶切鉴定bFGF- plenti6/V5 质粒经测序阳性质粒，经DNASTAR5.0 软件比对，GFP 基因序列完全一致。0.8%的琼脂糖凝胶电泳图和测序图谱.

bFGF- 慢病毒载体构建请参看ViraPowerLentiviral Expression Systems说明书(invitrogen公司，美国)，收集慢病毒上清1mL/冻存管，-80℃冻存。

bFGF-慢病毒感染BMSCs：即转染前1 d，消化诱导培养第3代兔BMSCs并计数，1×10⁹ L^-1的浓度接种入六孔板，孵育过夜；转染当天，每细胞孔中加入1mL病毒液，再加入Polybrene 10 mg/L，孵育过夜；第3天，全换液，37℃，体积分数5%CO₂潮湿的孵箱孵育过夜；第4天，用含5 mg/L Blasticidin的培养基全换液，孵育过夜；以后每三四天换一次液(含Blasticidin的培养液)；第14~16天，经10~12 d的Blasticidin压力筛选后，可见数个大小不等的、分散的细胞团块。

RT-PCR方法检测bFGF基因mRNA水平表达：转染15 d后，分别取bFGF基因组和未转染组BMSCs， RNApreppure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA后(该试剂盒含DNase-Ⅰ可去除DNA污染)，紫外分光光度计测定浓度后，RT-PCR方法检测人bFGF基因在mRNA水平的表达，用兔β-actin基因作为内参，用ddH₂O分别稀释cDNA建立浓度梯度。未转染组，A0：用8 μL ddH₂O和2 μL cDNA混匀；A1： 5 μL A0和5 μL ddH₂O混匀，取1 μL作为模板；A2：5 μL A1和5 μL ddH₂O混匀，取1 μL作为模板；A3：5 μL A2和5 μLddH₂O混匀，取1 μL作为模板；这样建立了未转染组3个cDNA浓度梯度。转染组，B0：7 μL ddH₂O和3 μLcDNA混匀；参照以上方法建立转染组3个cDNA浓度梯度。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

Western-blot检测bFGF蛋白表达：样品制备：bFGF-慢病毒载体转染BMSCs为实验组，未转染组BMSCs作为对照组。细胞计数达1×10⁹ L^-1，1 mL裂解液中加入10 μL PMSF，冰上裂解30 min。离心后蛋白上清转移至-20℃冰箱冻存。

本发明上述所述的含GFP基因的慢病毒载体具有如序列表SEQ ID NO.3所示的碱基序列。

设计GFP基因引物：据GFP基因序列，用NCBI数据库中的 Primer-BLAST Tool设计引物。上游引物：CAC CAT GGT GAG CAA GGGCGA G，下游引物：CTG TAC AAG TAA AGCGGC CGC，退火温度为64 ℃，扩增片段723 bp。

PCR扩增GFP基因：模板GFP-PMSLV-Plazmid (德国哥廷根大学阿布力孜·阿布杜拉博士赠送)，PCR条件：预变性95℃3 min，1个循环；变性94℃，45 s，64℃，45 s，72℃，2 min，30个循环；72℃，7 min，1个循环，扩增GFP基因约723 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行DNA测序，经DNASTAR5.0软件比对，基因序列完全一致.

离心柱纯化GFP PCR产物：方法同本文离心柱纯化bFGF PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度后，-20℃冻存备用。

人bFGF 基因与plenti6/V5 Directional TOPOvector连接：胶回收后的bFGF 4 μL，Salt Solution 1 μL，plenti6/V5-D-TOPO vector 0.8 μL，总体积为5.8 μL，枪轻混匀，上PCR仪22.5℃，连接30 min后，-20℃连接过夜。

GFP基因与plenti6/V5 Directional TOPO vector连接：同人 bFGF基因与plenti6/V5 Directional TOPOvector连接过程。

制备感受态大肠杆菌：请参看高效制备感受态细胞试剂盒说明书(上海生工，中国)。bFGF-plenti6/V5 vector转化入大肠杆菌：冰上融化一管感受态大肠杆菌，加4 μL的TOPO Mix入菌管，孵育30 min；放入42℃干浴锅，热休克45~90 s，孵育2 min；放入37℃恒温箱，225 r/min，水平摇荡1 h；涂布菌液于固体培养基表面(含100 mg/L的Ampicillin)，倒置过夜；接种环沾取5~10个阳性克隆菌落，入液体培养基管(含100 mg/L的Ampicillin)，放入37℃恒温箱，225 r/min，水平摇荡过夜；GFP-plenti6/V5 vector转化入大肠杆菌：转化同本文bFGF-plenti6/V5 vector转化入大肠杆菌过程。抽提 bFGF- plenti6/V5质粒：请参看高纯度质粒小提中量试剂盒说明书 (天根公司，中国)。抽提GFP-plenti6/V5质粒：方法同本文抽提 bFGFplenti6/V5质粒过程。

GFP-慢病毒载体构建：方法同bFGF-慢病毒载体构建。

GFP-慢病毒感染BMSCs：方法同bFGF-慢病毒感染BMSCs。

本发明上述所述的含BMP2基因的慢病毒载体具有如序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

本发明通过BMSCs成骨方向诱导培养及鉴定，通过抽取羊骨髓，进行骨髓间充质干原代培养并行成骨诱导，RT-PCR检测BMSCs非特异性成骨基因mRNA水平表达，BMSCs向成骨诱导分化过程中，骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原在mRNA水平阶段性表达，获得结论BMSCs成功向成骨细胞分化，初步具有较好的成骨能力。

本发明分别通过构建三个重组慢病毒载体、基因转染及鉴定：构建人bFGF、BMP2、GFP- plenti6/V5-D-TOPO vector表达质粒，经基因测序证实无移码突变；在Lipofectamine 2000脂质体介导下，分别与三种包装质粒，共转染293T 细胞，获得bFGF-重组慢病毒，BMP2-重组慢病毒，GFP-慢病毒病毒株。将三种病毒株感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选，得到稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，经Western-blot和倒置荧光显微镜检测bFGF、BMP2和GFP蛋白表达，验证获得GFP-慢病毒载体转染效率为87.2%，得出结论，建立了构建人bFGF、BMP2、GFP- 重组慢病毒株，获得稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，证实bFGF、BMP2和GFP基因表达，其确由骨髓间充质干细胞分化而来。

本发明通过基因转染的BMSCs成骨功能检测，实时定量PCR检测成骨非特异基因OPN、OC和Collagen-Ⅰ基因mRNA表达量，对照组、bFGF、BMP-2以及bFGF/BMP-2联合组四组间Collagen -Ⅰ、OC、OPN基因在mRNA水平表达量上存在明显差异（P均<0.05），且具有交互作用（P <0.05）。3个非特异性基因在四个组间的表达量分别进行析因分析，结果显示bFGF/BMP-2联合组中，Collagen -Ⅰ和OC基因mRNA水平表达量明显高于其余三组，且差异具有统计学意义（P均<0.05）；碱性磷酸酶（ALP）检测表达量，bFGF/BMP2基因联合转染BMSCs， OD值结果 Sig=0.003，查表P < 0.05，认为组间差异有统计学意义。结果表明bFGF/BMP-2联合转染组，在3、6、9天细胞培养周期内，ALP表达明显高于其他三组。得出结论，bFGF/BMP2基因联合转染组，Collagen -Ⅰ和OC基因mRNA水平表达量明显高于其余三组，碱性磷酸酶的表达量也明显增高，该组BMSCs具备较好的成骨及成血管能力。

本发明以羊椎骨为原料，采用改良低温煅烧法制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，通过孔隙率测定（液体置换法）、扫描电镜观察、X射线衍射分析的方法，观测支架材料的化学成分及微观空间结构。制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种生物骨支架材料呈天然松质骨似的蜂窝状多孔结构，孔径与天然松质骨相似，大孔孔径范围为41.23-780.06 μm不等，孔隙内未见杂质影像，各个孔隙之间存在广泛的交通，大孔壁上可见大量微孔存在，孔壁表面粗糙，表面形貌为小梁状和山嵴状，并可见β-磷酸三钙斑片状结构散布，其主要矿物晶相为羟基磷灰石和β-磷酸三钙，是一种在颌骨缺损修复中应用良好的异种生物骨支架材料。

本发明通过GFP标记的组织工程骨回植及成骨检测，制备羊颌骨缺损模型，骨缺损范围为长3cm，宽0.5cm,高1.5cm。GFP标记的组织工程骨回植羊颌骨缺损模型，通过激光共聚焦显微镜、组织学等指标检测，GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密。得出结论：bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，术区周围聚集大量成软骨样、成骨样细胞、单核样细胞，其有增加的趋势，微血管样结构有所增加；中央区，支架材料进一步降解，吸收，有新生骨小梁结构出现，骨结构密度明显增强，证实了其成骨及成血管功能良好，可有效修复较大范围的颌骨缺损。

终上所述可见，本发明构建组织工程骨修复极限骨缺损的基本目的是：利用慢病毒载体将bFGF、BMP2及GFP基因转染至羊骨髓间充质干细胞，加载同种异体骨支架材料，植入大面积骨缺损区，同时观察4种材料修复羊髂骨极限骨缺损后4，8，12周的情况，观察碱性成纤维细胞生长因子、骨形态发生蛋白及绿色荧光蛋白基因转染的BMSCs，对极限骨缺损修复是否有促进作用。

本发明实验以基因转染的骨髓间充质干细胞作为种子细胞，选取具有多孔特性、良好的生物相容性和可降解性，以及一定机械强度的煅烧同种异体绵羊脊椎骨作为支架材料，体外构建组织工程骨修复绵羊髂骨极限缺损，观察及探讨组织工程骨的成骨能力，为修复极限骨缺损提供一种新方法，同时为组织工程领域提供相关物种的实验依据。

现有技术中，以往研究多采用质粒载体，由于其转染效率不高，且转染时需借助脂质体转染剂进行转染，转染具有细胞毒性，表达时间较短，操作复杂等难以应用于临床。慢病毒载体具有操作简便、表达时间长且稳定，感染谱较广的特点；本发明提供的基因转染BMSCs的组织工程骨在颌骨缺损修复中应用，该技术具有联合表达bFGF、BMP2及GFP基因的优点，增强BMSCs的成血管及成骨功能，促进较大体积颌骨缺损的修复，获得良好的修复效果。

因此，本发明构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体，感染成骨方向诱导的BMSCs后，可将目的基因整合入BMSCs基因组，持续表达目的基因，持续增强组织工程骨的成血管及成骨功能，从而获得较好的颌骨缺损修复效果。

通过实施本发明具体的内容，可以达到以下有益效果。

（1）现有技术中，单一bFGF、BMP2或GFP-重组慢病毒感染BMSCs，并不能获得解决“组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中的难题-成血管及成骨功能。因此，本发明构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体，研究结果证实本发明获得人bFGF和BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨及成血管功能，GFP基因转染BMSCs可证实组织工程骨存活及成骨功能状态；本发明提供的方法可克服单独基因转染带来的不足，获得解决“组织工程骨组织构建及其在颌骨缺损修复中应用”良好的技术效果。

（2）本发明通过构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体，证实了人bFGF和BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨及成血管功能；以GFP成功标记BMSCs，复合异种骨支架材料，成功构建GFP标记的组织工程骨，探究其修复机理。GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密。由此，实验组bFGF/BMP2/ BMSCs可持续表达bFGF和BMP2蛋白，促进发挥成血管及成骨功能。GFP标记的组织工程骨成功构建，证实种子细胞BMSCs处于存活及成骨功能状态，可促进新骨形成，有效修复颌骨缺损，具有良好的修复治疗效果。

（3）本发明制备的制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种生物骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的异种骨支架材料，主要由羟基磷灰石和β-磷酸三钙构成，与人体骨组织成分类似，支架表面呈天然松质骨的蜂窝状多孔结构，各个孔隙之间存在广泛的交通，大孔壁上可见大量微孔存在，孔壁表面粗糙；现阶段研究表明，该支架适宜作为BMSCs附着、生长、增殖、代谢的微环境，该异种骨支架材料可单独作为骨粉支架材料修复较小范围的颌骨缺损，对于应用于临床骨缺损类病例的修复治疗将具有重要的作用。

（4）GFP标记的组织工程骨中，临床颌骨缺损的修复材料，如羟基磷灰石或异种骨支架材料，多具有骨引导功能，而不具备BMP2和bFGF生长因子的骨诱导和成血管功能。因此，本发明构建BMP2、bFGF、GFP基因转染的组织工程骨，该组织工程骨可以长期联合表达BMP2和bFGF生长因子，持续促进骨缺损区修复，可以满足临床需求。通过激光共聚焦显微镜实验结果显示，GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可聚集形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密。GFP标记的组织工程骨成功构建，证实种子细胞BMSCs处于存活状态，可持续表达bFGF和BMP2蛋白，持续发挥成骨及成血管功能状态，可促进新骨形成，有效修复颌骨缺损，具有良好的修复治疗效果。

（5）重组慢病毒载体构建及基因转染BMSCs中，bFGF/BMP-2基因联合转染的BMSCs具备较好的成骨能力，其Collagen -Ⅰ和OC基因表达量最高，Collagen -Ⅰ表达量达0.0876±0.0155，OC基因表达量0.0020±0.0003，向成骨细胞分化能力及成骨能力超过单一转染组和未转染组BMSCs。

附图说明

图1显示为骨桥蛋白基因电泳图。

图2显示为骨钙素基因电泳图。

图3显示为Ⅰ型胶原基因电泳图。

图4显示为GFP在BMSCs转染效率(×40)。

图5显示为羊椎骨支架骨块及煅烧后骨粉。

图6显示为bFGF/BMP2/BMSCs爬附支架，48h，扫描电镜（500×）。

图7显示为bFGF/BMSCs爬附支架，48h，扫描电镜（500×）。

图8显示为BMP2/BMSCs爬附支架，48h，扫描电镜（500×）。

图9显示为GFP标记组织工程骨，3个月，（100×）。

图10显示为对照组，组织工程骨，3个月，（100×）。

图11显示为羊离体下颌骨。图中，左上角箭头为bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，右下角箭头为BMP2/BMSCs/支架组，左下角箭头为BMSCs/三维打印羊骨支架组，右上角箭头为bFGF/BMSCs/支架组。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明的结构组成及其工作模式与原理作进一步说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中，流产胎儿胎盘组织由新疆医学科大学第一附属医院提供。

选用的主要试剂： One Shot Stbl3TM ChemicallyCompetent E. coli kits，真核表达质粒载体pLenti6/V5-D-TOPO vector，慢病毒包装质粒pLP1 、pLP2 、pLP/VSVG plasmids ，Lipofectamine 2000脂质体转染剂，293-FTcell line(invitrogen公司，美国)；高效制备感受态细胞试剂盒(上海生工，中国)；大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒小提中量试剂盒、RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(天根公司，中国)；RevertAidTM FirstStrand cDNA Synthesis Kit ， Pfu DNAPolymerase (recombinant) 、限制性内切酶XhoⅠ、BamHⅠ(Fermentas公司，立陶宛) ；一抗为兔抗人成纤维细胞因子多克隆抗体(Santa Cruze，美国)；C4-Flag抗体（Origene公司，美国）；高糖DMEM培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，PBS粉剂，TRIzol?试剂：美国invitrogen公司、SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time)试剂盒：中国TaKaRa 公司、氯仿，异丙醇，体积分数75%乙醇：上海生工，二甲苯、伊红、苏木素、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等为国产分析纯、蒸馏水、2.5%戊二醛、10%福尔马林溶液等为新疆医科大学人体解剖教研室及电镜室提供。

采用的主要仪器：激光共聚焦显微镜TCSSP8，LAS AF 3.1.0（莱卡公司，德国），Steri-cycle CO2恒温培养箱(Thermo公司，美国)，IX71倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)，生物安全柜 (Thermo公司，德国)，ABIVeriti 梯度PCR仪(Gene公司，美国)，凝胶成像仪(BIO-RAD公司，美国)，Multifuge X1R离心机，ND-1000型微量紫外分光光度计(Thermo公司，德国)，HZD-C型空气浴振荡器（哈尔滨东联电子技术开发有限公司，中国），外科显微镜：新疆医科大学第一附属医院提供、显微手术器械：曹工牌，山东淄博善航医学工程研究所制造、常规手术器械：数码照相机：日本佳能50D数码照相机（微距2cm）、石蜡切片机：德国莱卡2135型、超薄切片机：瑞典LKB-2188型、全自动显微镜：厦门Motic BA600型、电冰箱：青岛海尔、电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司、MLS-3750型实验室用高压灭菌器：三洋电机国际贸易有限公司等。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：基因转染BMSCs的组织工程骨的构建

本发明提供一种基因转染BMSCs的组织工程骨的构建，通过以下技术步骤获得：

（1）构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体：分别构建携带人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒载体，建立基因转染技术，研究结果证实人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，初步探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen-Ⅰ等成骨非特异性基因表达机制。

（2）人bFGF和BMP-2基因转染BMSCs，GFP基因转染BMSCs：将携带人bFGF、BMP-2重组慢病毒的培养基，添加到成骨方向诱导的BMSCs中，在CO2恒温培养箱中孵育24小时，用含blasticidin抗生素的培养基筛选10天即可得到稳定表达人bFGF、BMP-2基因的细胞株。GFP基因的重组慢病毒株感染BMSCs的方法同前述。

（3）制备异种骨支架材料：采用经过高温微波煅烧工艺制备获得羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的异种骨支架材料，主要由羟基磷灰石和少量的β-磷酸三钙构成，该支架适宜作为BMSCs附着、生长、增殖、代谢的微环境。

(4)构建GFP标记的组织工程骨:将上述步骤（2）基因转染的BMSCs，消化、制备细胞悬液，以1×10⁶mL的浓度接种到异种骨支架材料在96孔板中用培养基润湿上，在CO₂恒温培养箱中孵育24小时，即成功构建GFP标记的组织工程骨；构建GFP标记的组织工程骨可持续发挥成骨功能达三个月以上，其在支架材料表面及空隙中均匀分布，可有效发挥骨引导和骨诱导功能，修复较大范围的颌骨缺损。

实施例二：基因转染BMSCs的组织工程骨的构建

本发明具体提供一种基因转染BMSCs的组织工程骨的构建方法，具体通过如下方法制备获得：

（2）分别构建三个重组慢病毒载体、基因转染及鉴定：

构建人bFGF、BMP2、GFP- plenti6/V5-D-TOPO vector表达质粒，经基因测序证实无移码突变；在Lipofectamine 2000脂质体介导下，分别与三种包装质粒，共转染293T 细胞，获得bFGF-重组慢病毒，BMP2-重组慢病毒，GFP-慢病毒病毒株；将三种病毒株感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选，得到稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，经Western-blot和倒置荧光显微镜检测bFGF、BMP2和GFP蛋白表达。

（3）基因转染的BMSCs成骨功能检测：通过实时定量PCR方法检测，bFGF/BMP2基因联合转染组BMSCs，具备较好的成骨及成血管能力。

（4）制备异种生物骨支架材料：选用健康成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30%H₂O₂浸泡12 h脱蛋白；1∶1甲醇/氯仿浸泡12 h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09 mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇.10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12 h，取出骨块干燥，经高温煅烧工艺，在煅烧温度达到1000℃时，维持3 h煅烧后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co消毒、封装制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉主要矿物晶相为羟基磷灰石和β-磷酸三钙。

（5）基因转染BMSCs的组织工程骨的构建：以GFP成功标记BMSCs，复合异种骨支架材料，成功构建GFP标记的组织工程骨，GFP标记的组织工程骨回植羊颌骨缺损模型，制备的GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密，通过GFP标记的组织工程骨成功构建，证实种子细胞BMSCs处于存活及成骨功能状态，可促进新骨形成。

实施例三：基因转染BMSCs的组织工程骨的构建

本发明详细提供一种基因转染BMSCs的组织工程骨，组织工程骨构建具体通过如下方法获得：

（2）分别构建三个重组慢病毒载体、基因转染及鉴定：

（4）制备异种生物骨支架材料：选用成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30%H₂O₂浸泡12 h脱蛋白；经甲醇/氯仿按照体积比1∶1浸泡12 h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09 mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇.10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12 h，取出骨块干燥，经高温煅烧工艺，在煅烧温度达到1000℃时维持3 h煅烧后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co消毒、封装制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉主要矿物晶相为羟基磷灰石和β-磷酸三钙。

实施例四：重组慢病毒载体的构建

1）PCR扩增bFGF、GFP基因和BMP-2基因

bFGF引物：

上游：5′-CACCAACTGCAGATGGCAGCCGGGAGCATC-3′，下游：5′-ACGCGTCGACTCAGCTCTTAGCAGACATTGGAAGAA3′。

GFP引物：

上游：5′-CACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3′下游：5′- CTG TACAAGTAAAGCGGCCGC3′。

BMP-2引物：

上游引物：5′-CACCATGGTGGCCGGGACCCGCTGT-3′下游：5′-TCAACTAGTCTTGTCGTCGTCGTCC-3′。

bFGF PCR条件：以提取的人胎盘总RNA为模板，oligo(dT)18 为末端引物通过反转录酶合成cDNA。 RT-PCR条件：以新和成的cDNA为模板，预变性95 ℃，3 min，1个循环；变性94 ℃，45 s，55 ℃，45 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃，7 min，1个循环；扩增出bFGF基因，片段约468bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行DNA测序。

GFP PCR条件：以GFP-PMSLV-Plazmid为模板，预变性95 ℃ 3 min，1个循环；变性94 ℃，45 s，64 ℃，45 s，72 ℃，2 min，30个循环；72 ℃，7 min，1个循环，扩增GFP基因约723 bp。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后进行DNA测序，

BMP-2PCR条件：以BMP-2-C4Flag-PMD19-T载体为模版，预变性95℃ 5min，1个循环；变性95℃ 50s，退火温度55℃ 90s，72℃ 1min，35个循环；72℃，15min，1个循环；扩增出BMP-2-C4Flag基因，片段约1330bp， 1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测后进行检测。

2）离心柱纯化bFGF、GFP 和BMP-2PCR产物

请参看大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书（天根公司，中国）。收集DNA的溶液经1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度后，-20 ℃冻存备用。

3）人bFGF 基因与plenti6/V5 Directional-TOPO-vector连接

胶回收后的bFGF 4 μL，Salt Solution 1 μL，plenti6/V5-D-TOPO vector 0.8 μL，总体积为5.8 μL，枪轻混匀，上PCR仪22.5 ℃，连接30 min后，-20 ℃连接过夜。

4） GFP和BMP-2基因与plenti6/V5 Directional-TOPO-vector连接

同人 bFGF基因与plenti6/V5 Directional-TOPO-vector连接过程。

5) 连接转化产物，提取质粒

参照pLenti6/V5 Directional TOPO?Cloning Kit说明书，将连接产物加入Stbl3感受态细胞进行转化，挑取5-10个阳性单克隆菌落于液体培养基中培养过夜，后用高纯度质粒小提中量试剂盒提取质粒，测序鉴定。

实验结果表明，基因测序结果，bFGF、BMP-2和GFP质粒均无移码突变，对比发现有99％的同源性，无移码突变，人 bFGF基因、BMP-2基因和GFP-plenti6/V5 Directional-TOPO-vector质粒构建成功。

6）bFGF、BMP2和GFP重组慢病毒载体构建

参照ViraPower Lentiviral Expression Systems说明书（invitrogen公司，美国）构建bFGF、GFP和BMP-2重组慢病毒载体。将制备好的bFGF、GFP和BMP-2慢病毒颗粒的重组病毒表达质粒，与三种包装质粒，在Lipofectamine 2000脂质体介导下，共转染293T 细胞，培养48h 后，分别收集含重组慢病毒颗粒的细胞上清液。分别用bFGF-慢病毒，BMP-2慢病毒，GFP-慢病毒病毒液感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选14天后，得到稳定表达的bFGF、BMP-2和GFP基因的细胞株。

实施例五：基因转染成骨方向诱导的BMSCs及成骨鉴定

1.1 骨髓间充质干细胞原代培养

4-6月龄阿勒泰大尾羊，髂骨区备皮，碘伏消毒皮肤，选16号骨穿针进行穿刺抽取约30 mL骨髓血以体积1∶5比例加入3%肝素钠内不间断颠倒混匀，迅速放入超净台，将骨髓血用无菌滤网过滤至50 mL离心管内，再以体积1∶1与DMEM-F12培养基（含1%青-链霉素Hepas 2.38 g/L，L-谷氨酰胺0.6 g/L，抗坏血酸0.05-0.06 g/L，体积分数10%胎牛血清）共4-6 mL，在25cm²细胞培养瓶内进行全骨髓培养法，入37 ℃，体积分数5%CO₂，恒温孵育箱内培养，每两三天进行半换液，直到血红细胞基本被培养基替代，镜下观察即可见细胞贴壁生长，此后每两三天全换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代或冻存。

1.2 骨髓间充质干细胞诱导培养

原代骨髓间充质干细胞培养5-7d后，将培养液换成诱导培养基（DMEM-F12培养基1%青-链霉素，Hepas 2.38 g/L，L-谷氨酰胺0.6 g/L，L-抗坏血酸0.05-0.06 g/L，β-甘油磷酸钠2.16 g/L，地塞米松4 μg/L，体积分数10%胎牛血清）。入37 ℃，体积分数5% CO₂，恒温孵育箱内培养，每两三天换液，待细胞融合达90%-95%时，1∶2-1∶3传代至两三代冻存备用。

1.3成骨方向诱导BMSCs成骨功能

RT-PCR检测成骨方向诱导BMSCs非特异性成骨基因mRNA水平表达，BMSCs第一代诱导分化的细胞表达Ⅰ型胶原，第二代诱导分化的细胞表达Ⅰ型胶原和骨桥蛋白，第三、四代诱导分化的细胞表达Ⅰ型胶原、骨钙素和骨桥蛋白。对照组未进行诱导分化的BMSCs第一代细胞表达Ⅰ型胶原和骨桥蛋白，第二、三、四代细胞仅表达Ⅰ型胶原。

骨桥蛋白基因聚合酶链反应产物片段长约259bp，琼脂糖凝胶电泳显示目的片段大小与Marker一致，参见附图1。骨钙素基因片段约394bp，与Marker一致，参见附图2。Ⅰ型胶原基因片段约290bp，与 Marker一致，参见附图3。测序结果显示：骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原基因有个别的碱基突变，但均无移码突变。

实验结果表明，形态学上，经诱导基培养后的BMSCs，细胞形态逐渐由长梭型向多边形改变。分子学上，BMSCs向成骨诱导分化过程中，骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原在mRNA水平阶段性表达，初步判明其具有较好的成骨能力。

实施例六：bFGF基因、BMP-2基因和GFP基因转染基因转染试验

将制备好的bFGF、BMP-2和GFP-plenti6/V5 Directional-TOPO-vector重组慢病毒表达质粒，与两种包装质粒和一种包膜质粒，在Lipofectamine 2000脂质体介导下，共转染293T 细胞，培养48h 后，分别收集含重组慢病毒颗粒的细胞上清液，-80℃保存备用。

转染前一至二天，接种成骨方向诱导的BMSCs入六孔板，待细胞90%-95%融合时，分别融化bFGF、BMP2和GFP重组慢病毒株，分别于相应细胞孔中加入1ml病毒液，再加入Polybrene 10ug/ml，前后摇动六孔板混匀，37℃，5%CO₂潮湿的孵箱孵育过夜。

24h后，用含5 ug/ml Blasticidin的培养基全换液，37℃，5%CO₂潮湿的孵箱孵育过夜；以后每3-4天换一次液（含Blasticidin的培养液）。经10-12天的Blasticidin压力筛选后，可见数个大小不等的、分散的细胞团块；未转染组细胞全部死亡。

人bFGF基因转染的BMSCs，测得浓度为1×10⁷ /ml，备用；人BMP-2基因转染的BMSCs，测得浓度为1×10⁷ /ml，备用；GFP基因转染的BMSCs，备用，为对照组。

基因转染后鉴定

1.1 Western-blot检测bFGF蛋白表达

样品制备：bFGF-慢病毒载体转染BMSCs为实验组，未转染组BMSCs作为对照组。细胞计数达1×10⁹ L-1，1 mL裂解液中加入10 μL PMSF，冰上裂解30 min。离心后蛋白上清转移至-20冰箱冻存。SDS-PAGE：取10 μL样品，煮沸5 min，离心5 min，上清以12%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳（12%SDS-PAGE）分离。电泳在稳流条件下进行，浓缩胶中为20 mA，分离胶中为50 mA。Western-blot检测：转膜在稳流条件下进行，4℃，4 h；封闭，4℃，过夜。使用Tween20-PBS稀释一抗（1∶2 000），以TBST稀释二抗（1∶1 000）（辣根酶标记羊抗兔IgG）。

1.2 Western-blot检测BMP2蛋白表达

样品制备：BMP-2慢病毒载体转染的BMSCs细胞计数达1×10⁷ L，0.5 mL裂解液中加入5 μL 蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min。离心后得到蛋白溶液，经过BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，后转移至-20冰箱冻存。SDS-PAGE：取20 μL样品，加入上样缓冲液，煮沸10 min，离心5 min，以10%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。Western-blot检测：转膜在稳流条件下进行，4 ℃，2 h；封闭，37℃，2h。使用PBST稀释一抗（1∶1500），4℃，过夜；次日以PBST稀释二抗（1∶2 000）（辣根酶标记山羊抗鼠IgG），37℃，2h；后用四氯乙萘酚进行显色，观察BMP-2-C4Flag蛋白。

实验结果表明，bFGF基因、BMP-2基因和GFP基因转染成功。bFGF-慢病毒载体转染BMSCs 15d后，Wertern-blot检测出bFGF蛋白表达，相对分子质量为17 KD 。BMP-2-慢病毒载体转染BMSCs后，Wertern-blot检测出BMP-2-C4Flag蛋白表达，相对分子质量为50KD。倒置荧光显微镜观测，对照组GFP-慢病毒感染BMSCs 48 h后，488 nm蓝色荧光，激发出绿色荧光的细胞。

实施例七：基因转染后，BMSCs的成骨功能

1.1 Trizol法提取RNA并逆转录为cDNA

用TRIzol 法提取对照组、bFGF、BMP-2以及bFGF/BMP-2联合组总RNA，1×10⁷ /ml密度的细胞加1 mL trizol裂解细胞后，顺序加入氯仿、异丙醇、75%ethanol，DEPC- treated-Water溶解RNA，用紫外分光光度计检测总 RNA的浓度和纯度，1%凝胶电泳显示RNA完整性。

两步法RT-PCR，顺序加入以下试剂：oligo（dT）18 Primer，总RNA模板，PCR仪设置70℃，5min，1个循环；5×Reaction buffer，RiboLockTMRibonuclease inhibitor，（10mM）dNTP Mix，RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcriptase。上PCR仪，37℃，5分钟，42℃，60min，70℃，10 min，1个循环，cDNA合成完毕。

1.2实时定量PCR引物及体系

引物由上海生工生物工程公司合成，OPN的扩增片段长度122bp，上游引物5'-CAGAGGCACCACATGACCAC-3'，下游引物 5'- CGAGTGAGCGAAAGACAGCA-3'；OC的扩增片段长度149bp，上游引物 5'- GATGCAGAGTCGGGCAAAG-3'，下游引物 5'-AGCTCACACACCTCCCTCCT -3'；Collagen-Ⅰ扩增片段长度290bp，上游引物5'-ACCTACCACTGCAAGAACAGCG-3'，下游引物5'-AAGCAGACAGAGCCGATGTCG-3'；管家基因β-actin扩增片段长度150bp，上游引物5'- GGCTCTCTTCCAGCCTTCCT-3'，下游引物5'- ATGCCAGGGTACATGGTGGT-3'。PCR反应产物，胶回收纯化后连接到PMD19-T载体，抽提质粒，测序鉴定。

实时定量PCR反应体系为25μl，Premix Ex Taq 12.5μl，cDNA 2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O 9.5μl；反应参数设置如下：OPN、OC、Collagen-Ⅰ和管家基因β-actin预变性，95℃ 3min，然后按95℃ 10s，58℃ 30s，进行40个循环。重复3次。

1.3成骨相关基因的检测

实时定量PCR检测非特异性成骨基因表达，将3个非特异性成骨基因看成整体，通过多元方差分析可得出，对照组、bFGF、BMP-2以及bFGF/BMP-2联合组四组间Collagen -Ⅰ、OC、OPN基因在mRNA水平表达量上存在明显差异（P均<0.05），且具有交互作用（P <0.05）；3个非特异性基因在四个组间的表达量分别进行析因分析，得出结果显示bFGF/BMP-2联合组中Collagen -Ⅰ和OC基因mRNA水平表达量明显高于其余三组，且差异具有统计学意义（P均<0.05）；但是OPN基因差异并不存在统计学意义（P >0.05），（见表1）。

电泳结果显示，Collagen -Ⅰ基因PCR反应产物片段约290bp，OC 基因PCR反应产物片段约149bp，OPN基因PCR反应产物片段约122bp，β-actin PCR反应产物片段约150bp，电泳凝胶显示各基因片段大小与Marker显示的条带一致。测序结果显示，四个基因全序列对比发现有99％的同源性。

实验结果显示，bFGF/BMP-2联合转染组，第4代BMSCs成骨基因OPN和Collagen-Ⅰ基因mRNA表达量较高，具备一定的成骨功能。

表1 四组间非特异性基因表达量比较()

4）碱性磷酸酶（ALP）检测

将重组慢病毒转染的四组羊BMSCs，分别为bFGF（c组）、BMP-2（d组）、bFGF/BMP-2（e组）、阴控对照组（f组），分别于第3、6、9天收集细胞上清液，入-80℃保存备用。按照 “南京建成生物工程研究所” ALP试剂盒，处理细胞培养基原液，之后加入96孔板，上酶标仪以520nm波长，进行OD值检测，通过检测OD值，得到各组均数标准差，组间比较采用单因素方差分析输入SPSS17.0统计软件进行分析，得出结果。数据以x±s表示，组内比较采用两两比较LSD-t 检验，P < 0.05为组间差异有统计学意义。

均数标准差结果输入SPSS 17.0统计软件计得F=0.046，P=0.956，P>0.05，F=0.751，P=0.29，P>0.05，两组组内在时间上差异无显著意义。组间两两比较c组与f组得F=31.603，P=0.03，P<0.05，认为差异具有统计学意义，说明bFGF基因转染组在3、6、9天细胞培养周期内，ALP表达高于无转染BMSCs组。c组bFGF与d组BMP-2两两比较Sig.=0.949，查表P>0.05，尚不能认为在3、6、9天细胞培养周期内，c组bFGF、d组BMP-2之间ALP表达水平不同。

实验结果显示， e组bFGF/BMP-2联合转染BMSCs的 OD值结果 Sig=0.003，查表P < 0.05，认为组间差异有统计学意义，说明bFGF/BMP-2联合转染羊BMSCs在3、6、9天细胞培养周期内，ALP表达明显高于其他三组。

实施例八： GFP-慢病毒载体转染效率的验证

分别收集GFP转染组和未经GFP转染组BMSCs（未经Blasticidin筛选），细胞浓度约为1×10⁹/mL，PBS洗3次，分别加入荧光标记（GFP）CD44抗体，避光标记20 min，PBS洗去未标记的抗体，流式细胞仪检测细胞表面抗原。收集GFP-慢病毒载体转染的BMSCs 1×10⁶ /ml 密度的细胞，终体积为500ul，3管，为实验组；选择未转染的BMSCs 1×10⁶ /ml 密度的细胞，终体积为500ul，1 管，为对照组，实验重复3 次。

实验结果显示，GFP-慢病毒载体转染组转染率为87.2%，GFP-慢病毒载体转染效率较高，是可靠的表达载体；未转染组为1.1%，参见附图4。

实施例九：异种生物骨支架材料的制备

选用健康成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体。随机分为3组，物理联合化学组，采用体积分数30%H₂O₂浸泡12 h脱蛋白；1∶1甲醇/氯仿浸泡12 h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09 mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇.10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12 h，取出骨块干燥。经PYRO高温微波煅烧炉程序，当炉内煅烧温度达到1000℃时，维持3 h。待煅烧完成后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co消毒、封装、备用。化学处理组，采用甲醇/氯仿、过氧化氢等化学制剂序列脱脂脱细胞脱蛋白同物理煅烧组的化学处理方法，不加煅烧步骤）；对照组，采集的羊椎骨骨松质块，直接置于室温自然晾干，参见附图5。

实验结果表明，化学处理组，骨块呈淡黄色，具有一定弹性，因为骨组织块中的胶原纤维并未去净。物理联合化学组，骨块呈乳白色，由于低温煅烧破坏了胶原纤维，骨块脆性增加，表面形成蜂窝状结构，表面孔隙具有一定的交通，具备支架材料立体交通特征，适宜作为组织工程骨支架材料。

实施例十：颌骨缺损模型的构建及GFP标记的组织工程骨回植

1.1建立颌骨缺损动物模型

通过动物医学伦理审查后，开始实施实验。选择雄性新疆哈萨克大尾羊15只（1年龄），体重221.5kg。随机分入4组，每组3只，分别为bFGF/BMP2/BMSCs组、bFGF/BMSCs组、BMP2/BMSCs组、GFP/BMSCs组、BMSCs组。利用阿勒泰大尾羊下颌切牙与磨牙之间天然无牙的牙槽骨部位，游标卡尺定点、测量，以慢速直机配球钻，修整牙槽骨远中和近中骨壁、颊舌侧骨壁，形成较大范围的颌骨缺损区（长3cm，宽0.5cm,高1.5cm），建立羊颌骨缺损动物模型。

制备羊颌骨缺损模型，骨缺损范围为长3cm，宽0.5cm,高1.5cm。GFP标记的组织工程骨回植羊颌骨缺损模型，通过激光共聚焦显微镜、组织学等指标检测，GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密。

现阶段实验结果显示，GFP标记的组织工程骨成功存活大3个月以上，且修复效果良好，可有效修复较大范围的颌骨缺损。

1.2构建GFP标记的组织工程骨，回植动物模型

1.2.1构建GFP标记的组织工程骨

将五组BMSCs消化、计数，调整细胞浓度为1×10⁵-1×10⁶/ml，复合羊椎骨煅烧陶瓷骨粉支架材料，37℃、5%CO₂孵箱内培养24h，成功构建组织工程骨，采用荧光倒置显微镜及扫描电镜观测，参见附图6-8。将GFP标记的组织工程骨回植动物模型，采用同体同颌对照，实验分组为bFGF/BMP2/BMSCs/支架组、bFGF/BMSCs/支架组、BMP2/BMSCs/支架组、GFP/BMSCs/支架组、BMSCs/支架组。

1.2.2回植动物模型

在已建立的羊颌骨缺损动物模型，全麻下口腔消毒，以氯胺酮15mg/kg静脉注射、速眠新0.04ml/kg（商品名）肌肉注射，全麻下在下颌行前庭区切口，暴露牙槽骨嵴顶的术区，用牙科慢速机，裂钻及球钻制造颌骨缺损（长3cm，宽0.5cm,高1.5cm），分别植入上述五组材料，多层粘膜缝合固定。游离粘膜，使粘膜无张力的情况下完全覆盖组织工程骨。缝合关闭创口。庆大霉素-生理盐水冲洗，术后7天内口腔清结，肌注庆大霉素8万u/d，预防感染，常规喂养。

1.3体内成骨观测

1.3.1激光共聚焦显微镜检测

分别于术后 1、2、3个月，采集标本GFP标记的组织工程骨标本。10% 甲醛溶液灌注后取移植的复合物，常规 10% 甲醛溶液固定 3 d，8%EDTA 脱钙 2-3 周（每 2 -3 天，更换脱钙液），10μm 厚切片，利用激光共聚焦显微镜（莱卡TCSSP8，LAS AF 3.1.0）观察移植组织工程骨功能状态。

实验结果显示，据目前观测时长，GFP标记的组织工程骨成活达3个月之久，GFP/ BMSCs“镶嵌”在异种骨支架材料表面或被包埋，与异种骨支架材料融为一体，其可聚集形成类似正常骨组织骨小梁的结构，与周围骨组织结合紧密。

GFP标记的组织工程骨成功构建，证实种子细胞BMSCs处于存活状态，可持续表达bFGF和BMP2蛋白，持续发挥成骨及成血管功能状态，可促进新骨形成，有效修复颌骨缺损，具有良好的修复治疗效果，参见附图9-10。

1.3.2 HE染色结果

分别于术后1、2、3个月末，处死动物，摘取下颌骨，参见附图11。将植骨区周围5mm以上，自体牙槽骨上用电钻锯出骨块，分别采集bFGF/BMP2/BMSCs/支架组、bFGF/BMSCs/支架组、BMP2/BMSCs/支架组、BMSCs/支架组，四组植骨区域标本。去尽软组织，将标本置于体积分数4%甲醛溶液中(pH=7.4，4 ℃)固定24 h，2%EDTA脱钙2-4周，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片，切片厚度5 μm，进行苏木精-伊红染色，光镜下观察。

4周末，bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，植入区可见成骨样细胞、破骨样细胞及骨小梁结构出现，大量纤维细胞及微血管样结构包绕支架材料（参见附图11中的箭头表示），表面粘膜组织有炎性细胞增生。bFGF/BMSCs/支架组，植入区可见少量成骨样细胞、破骨样细胞出现，周围主要为纤维细胞及微血管样结构包绕，表面有大量软骨化及炎性细胞增生。BMP2/ BMSCs/支架组，植入区有成骨样结构及骨小梁结构出现，周围少量纤维血管化结构，表面有软骨化及大量炎性细胞增生。BMSCs/支架组中央为未降解的支架材料，植入区周围可见纤维结缔组织样结构，表面有软骨化及大量炎性细胞增生。

8周末，bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，植入区可见逐渐增多的成骨样细胞，少量破骨样细胞，大量骨小梁结构出现及纤维血管样结构包绕支架材料（参见附图11中的箭头表示），表面粘膜组织完好覆盖。bFGF/BMSCs/支架组，植入区周围可见成骨样细胞、破骨样细胞出现，支架材料周围大量纤维组织包绕，（参见附图11中的箭头表示），微血管样结构有增加的趋势，表面纤维结缔组织覆盖。BMP2/ BMSCs/支架组，植入区可见成骨样结构及骨小梁结构有增多，周围少量纤维血管化结构，表面大量纤维结缔组织覆盖。BMSCs/支架组，植入区周围可见纤维结缔组织样结构，出现成骨样和破骨样细胞，中央为未降解的支架材料，（参见附图11中的箭头表示），降解进一步增大，植入区周围可见纤维结缔组织样结构，表面有软骨化及大量炎性细胞浸润。

12周末，bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，可见植入区及支架空隙周围有大量成骨样细胞出现，周围有纤维组织包绕，术区中央可见新生骨小梁结构及微血管样结构，骨结构密度明显增强，表面纤维结缔组织覆盖。bFGF/BMSCs/支架组，可见植入区及支架空隙周围有大量成骨样细胞及新生骨小梁结构出现，周围大量纤维组织及微血管样结构包绕，表面纤维结缔组织覆盖。BMP2/ BMSCs/支架组，植入区及支架空隙周围主要是成骨样细胞出现，术区中央可见新生骨小梁结构及微血管样结构，表面纤维结缔组织覆盖。BMSCs/支架组，结合区有成骨样结构及骨小梁出现，中央区出现大量肉芽样组织，内有大量炎性细胞、少量成纤维细胞、及巨噬样细胞及少量降解后的支架材料，表面仍有少量软骨化及炎性细胞浸润。

实验结果表明，随着观察时间的延长，bFGF/BMP2/BMSCs/支架组，植入区周围特别是术区周围大量成软骨样、成骨样细胞、单核样细胞有增加的趋势，微血管样结构有所增加；中央区材料进一步降解，吸收，有新生骨小梁结构出现，骨结构密度明显增强，组织工程骨成骨功能良好。

SEQ ID NO.1

<110> 新疆医科大学第一附属医院

<120> 基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

<130> 人类离体胎盘组织

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 468

<212> DNA

<213> 人类离体胎盘组织

<220>

<221> bFGF

<222> (1)..(468)

<400> 1

atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgcc 60

ttcccgcccg gccacttcaa ggaccccaag cggctgtact gcaaaaacgg gggcttcttc 120

ctgcgcatcc accccgacgg ccgagttgac ggggtccggg agaagagcga ccctcacatc 180

aagctacaac ttcaagcaga agagagagga gttgtgtcta tcaaaggagt gtgtgctaac 240

cgttacctgg ctatgaagga agatggaaga ttactggctt ctaaatgtgt tacggatgag 300

tgtttctttt ttgaacgatt ggaatctaat aactacaata cttaccggtc aaggaaatac 360

accagttggt atgtggcact gaaacgaact gggcagtata aacttggatc caaaacagga 420

cctgggcaga aagctatact ttttcttcca atgtctgcta agagctga 468

SEQ ID NO.2

<110> 新疆医科大学第一附属医院

<120> 基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

<130> 人类离体胎盘组织

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人类离体胎盘组织

<220>

<221> BMP

<222> (1)..(1323)

<400> 1

atggtggccg ggacccgctg tcttctagcg ttgctgcttc cccaggtcct cctgggcggc 60

gcggctggcc tcgttccgga gctgggccgc aggaagttcg cggcggcgtc gtcgggccgc 120

ccctcatccc agccctctga cgaggtcctg agcgagttcg agttgcggct gctcagcatg 180

ttcggcctga aacagagacc cacccccagc agggacgccg tggtgccccc ctacatgcta 240

gacctgtatc gcaggcactc aggtcagccg ggctcacccg ccccagacca ccggttggag 300

agggcagcca gccgagccaa cactgtgcgc agcttccacc atgaagaatc tttggaagaa 360

ctaccagaaa cgagtgggaa aacaacccgg agattcttct ttaatttaag ttctatcccc 420

acggaggagt ttatcacctc agcagagctt caggttttcc gagaacagat gcaagatgct 480

ttaggaaaca atagcagttt ccatcaccga attaatattt atgaaatcat aaaacctgca 540

acagccaact cgaaattccc cgtgaccaga cttttggaca ccaggttggt gaatcagaat 600

gcaagcaggt gggaaagttt tgatgtcacc cccgctgtga tgcggtggac tgcacaggga 660

cacgccaacc atggattcgt ggtggaagtg gcccacttgg aggagaaaca aggtgtctcc 720

aagagacatg ttaggataag caggtctttg caccaagatg aacacagctg gtcacagata 780

aggccattgc tagtaacttt tggccatgat ggaaaagggc atcctctcca caaaagagaa 840

aaacgtcaag ccaaacacaa acagcggaaa cgccttaagt ccagctgtaa gagacaccct 900

ttgtacgtgg acttcagtga cgtggggtgg aatgactgga ttgtggctcc cccggggtat 960

cacgcctttt actgccacgg agaatgccct tttcctctgg ctgatcatct gaactccact 1020

aatcatgcca ttgttcagac gttggtcaac tctgttaact ctaagattcc taaggcatgc 1080

tgtgtcccga cagaactcag tgctatctcg atgctgtacc ttgacgagaa tgaaaaggtt 1140

gtattaaaga actatcagga catggttgtg gagggttgtg ggtgtcgcct cgagtctaga 1200

gattacaagg atgatgacga taaaactaga gactacaaag acgatgatga caaaactaga 1260

gattataaag atgacgatga taagactaga gactacaagg acgacgacga caagactagt 1320

tga 1323

SEQ ID NO.3

<110> 新疆医科大学第一附属医院

<120> 基因联合转染BMSCs的组织工程骨构建及其应用

<130> GFP-PMSLV-Plazmid

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> GFP-PMSLV-Plazmid

<220>

<221> GFP

<222> (1)..(720)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

Claims

1.一种基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，组织工程骨通过以下技术步骤获得构建：

(1)构建人bFGF、BMP2、GFP重组慢病毒载体：分别构建携带人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒载体，建立基因转染技术，研究结果证实人bFGF/BMP2基因联合转染可增强BMSCs的成骨功能，初步探明bFGF/BMP2调控OPN和Collagen-Ⅰ成骨非特异性基因表达机制；

(2)人bFGF和BMP-2基因转染BMSCs，GFP基因转染BMSCs：将人bFGF、BMP2、GFP基因重组慢病毒株，添加到成骨方向诱导的BMSCs培养基中，经Blasticidin抗生素筛选，得到稳定表达目的基因的BMSCs；

(3)制备异种骨支架材料：采用经过高温微波煅烧工艺制备获得羊椎骨煅烧陶瓷骨粉作为异种骨支架材料，具有良好的孔隙率、低免疫原性的异种骨支架材料，包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙构成，该支架适宜作为BMSCs附着、生长、增殖、代谢的微环境；

(4)构建GFP标记的组织工程骨:将上述步骤(2)基因转染的BMSCs消化，计数，制备细胞悬液，将异种骨支架材料用培养基润湿，将细胞悬液接种到异种骨支架材料上，细胞培养箱中孵育24小时，即制得GFP标记的组织工程骨。

2.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的BMSCs成骨方向诱导培养及鉴定中，通过抽取羊骨髓，进行骨髓间充质干原代培养并行成骨诱导，RT-PCR检测BMSCs非特异性成骨基因mRNA水平表达，BMSCs向成骨诱导分化过程中，骨桥蛋白、骨钙素和Ⅰ型胶原在mRNA水平阶段性表达，BMSCs成功向成骨细胞分化。

3.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的bFGF、BMP2、GFP三个重组慢病毒载体、基因转染及鉴定中，构建人bFGF、BMP2、GFP-plenti6/V5-D-TOPO vector表达质粒，经基因测序证实无移码突变；在Lipofectamine 2000脂质体介导下，分别与三种包装质粒，共转染293T细胞，获得bFGF-重组慢病毒株，BMP2-重组慢病毒株，GFP-慢病毒病毒株株；将三种病毒株感染羊骨髓间充质干细胞，用blasticidin筛选，得到稳定表达的bFGF、BMP2和GFP基因的细胞株，经Western-blot和倒置荧光显微镜检测bFGF、BMP2和GFP蛋白表达。

4.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的基因转染的BMSCs成骨功能检测中，通过实时定量PCR和ALP检测，bFGF/BMP2基因联合转染组BMSCs，非特异性成骨基因表达量较高，具备较好的成骨及成血管能力。

5.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的制备异种生物骨支架材料，选用成年羊脊椎骨，去除表面骨皮质后切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，采用体积分数30％H₂O₂浸泡12h脱蛋白；经甲醇/氯仿按照体积比1∶1浸泡12h脱脂，处理重复3次，超声震荡仪清洗；干燥后，浸泡在0.09mol/L焦磷酸钠[Na₄P₂O₇.10H₂O]溶液中，70℃恒温水浴锅温浴12h，取出骨块干燥，经高温煅烧工艺，在煅烧温度达到1000℃时维持3h煅烧后，采用碾磨的方法制备成骨粉，60Co消毒、封装制备出羊椎骨煅烧陶瓷骨粉，制备的羊椎骨煅烧陶瓷骨粉主要矿物晶相为羟基磷灰石和β-磷酸三钙。

6.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的制备羊颌骨缺损动物模型中，采用1年龄的阿勒泰大尾羊6只，以速眠新0.15ml/kg肌注全麻，于双侧下颌骨第3前磨牙至第2磨牙近中切开分离牙龈、黏骨膜，拔出第3、4前磨牙及第一磨牙，暴露下颌骨颊舌侧骨面，分别用口腔种植慢速手机的球钻和裂钻，制备长3cm，宽0.5cm，高1.5cm的缺损区；分层缝合手术切口，术后肌肉注射青霉素80万U 5d以预防感染。

7.如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨，其特征在于，所述的基因转染BMSCs的组织工程骨的构建中，将基因转染的BMSCs，细胞浓度为1×10⁶/mL，与异种生物骨支架材料支架共培养24小时后，成功构建GFP标记的组织工程骨，GFP标记的组织工程骨回植羊颌骨缺损模型；胶原膜覆盖创面，严密拉拢缝合；术后注射青霉素，每日1次，连续3天。

8.一种如权利要求1所述的基因转染BMSCs的组织工程骨在颌骨缺损修复中应用。