CN114601971A - 一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途，包括以下步骤：取动物松质骨进行脱脂脱蛋白处理，水洗干燥得到骨块A；将骨块A在焦磷酸钠溶液中浸泡处理，水洗干燥得到骨块B；将骨块B在大于600℃的温度条件下进行煅烧，得到骨块C；将骨块C进行研磨、筛选、清洗和干燥，得到骨颗粒；将骨颗粒在含有成骨相关蛋白的缓冲液中浸泡，再取出干燥得到诱导骨再生的天然复合骨填充材料。本发明天然复合骨填充材料取自动物松质骨，同时复合成骨相关蛋白，材料来源易得、生产工艺简单，生物相容性好，对细胞无不良刺激，材料没有细胞毒性，能显著促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化，可作为优良的骨替代材料。

Description

一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途。
背景技术
牙周炎是口腔科临床上十分常见的疾病，牙周组织因局部因素产生慢性炎症，由于患者缺乏牙周保护知识或者对牙周健康的不重视，炎症又未能得到及时治疗，导致炎症由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质，进而发展成为牙周炎。由于牙周长期慢性炎症的存在，周围的支持组织逐步被破坏，最终导致牙槽骨的丧失使牙齿脱落，严重影响患者的生活质量。据相关研究报道称，约有40％-60％的牙周炎患者在种植修复后存在骨量不足的现象。因此，为缓解牙槽骨骨量减少，提高种植牙修复效果，临床将各种填充材料应用于种植牙修复中。
目前市面上常用的填充材料主要有自体骨、同种异体骨、异种骨以及各种人工骨。但是自体骨移植存在第二术区、取骨量有限、并发症多等缺点，因此在临床应用上经常受到限制。同种异体骨虽然保留了多孔结构，并包含大部分细胞因子，但应用异体骨移植的安全性和有效性一直存在质疑。合成人工骨孔隙率较低、孔隙不均匀且容易造成免疫排异反应等。而异种骨
Figure BDA0003486305670000011
材料自获得美国食品药品监督管理局(FDA)许可应用于临床治疗以来，以其良好的理化性能(良好的孔隙结构、一定的抗压强度、可湿固化性)和生物相容性(炎症反应低、可激活成牙骨质细胞产生牙骨质)一直倍受国内外学者和临床医生的广泛关注，成为口腔种植体填充材料的首选，是近年来牙周炎和根尖周病治疗领域的一种非常具有前景的新型生物材料。尽管
Figure BDA0003486305670000012
骨填充材料是目前性能最佳的种植体填充材料，但其缺点也很明显，例如：存在免疫排异反应，缺乏生物活性，性能不太稳定，全进口价格极高(约6000元/克)。
因此，开发一种周期短、成本低、性能稳定、无免疫排异反应，且对牙槽骨具有明显的成骨诱导能力的天然复合骨填充材料是亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料及其制备方法和用途，解决了其他填充材料来源有限、存在免疫排异反应和生物相容性的问题。
为达到上述技术目的，本发明制备方法的技术方案是：
包括以下步骤：
(1)取动物松质骨进行脱脂脱蛋白处理，水洗干燥得到骨块A；
(2)将骨块A在焦磷酸钠溶液中浸泡处理，水洗干燥得到骨块B；
(3)将骨块B在大于600℃的温度条件下进行煅烧，得到骨块C；
(4)将骨块C进行研磨、筛选、清洗和干燥，得到骨颗粒；
(5)将骨颗粒在含有成骨相关蛋白的缓冲液中浸泡，再取出干燥得到诱导骨再生的天然复合骨填充材料。
进一步地，步骤(1)动物松质骨是取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨，先切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成4～6mm3块进行煮沸和干燥。
进一步地，步骤(1)脱脂脱蛋白处理是先在十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100的混合液中浸泡23～25小时，混合液中十二烷基硫酸钠的质量浓度为2.5％，曲拉通X-100的质量浓度为5％；再在30wt％双氧水中浸泡23～25小时；步骤(1)中水洗至中性。
进一步地，步骤(2)中浸泡处理是在0.1mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡11～13小时。
进一步地，步骤(3)中是在650～950℃下煅烧3.5～4.5小时。
进一步地，步骤(4)中筛选是筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒；步骤(4)中清洗是采用无水乙醇和水交替超声清洗三次。
进一步地，步骤(5)中，骨颗粒和成骨相关蛋白的质量比为10000:1；成骨相关蛋白包括碱性磷酸酶、α-降钙素基因相关肽、骨钙蛋白和RUNX2蛋白中的一种或多种。
进一步地，步骤(5)中浸泡是在37℃孵育24小时。
如上所述制备方法制得的诱导骨再生的天然复合骨填充材料。
如上所述诱导骨再生的天然复合骨填充材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
本发明天然复合骨填充材料取自动物松质骨，同时复合成骨相关蛋白，材料来源易得、生产工艺简单，所得骨填充材料孔径在40～400μm，具有良好的孔隙率。该天然复合骨填充材料含有成骨相关蛋白，在具备
Figure BDA0003486305670000031
骨填充材料良好的物化性能和生物相容性的同时，解决了
Figure BDA0003486305670000032
骨填充材料缺乏生物活性、自体骨骨量少以及同种异体骨安全性和有效性等问题；通过骨髓间充质干细胞与天然复合骨填充材料体外细胞试验，100mg/ml培养14天，存活率在80％以上，证明本发明制备的骨填充材料生物相容性好，对细胞无不良刺激，材料没有细胞毒性，能显著促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化。因此本发明研制的天然煅烧骨填充材料可作为优良的骨替代材料，构建组织化人工骨。
进一步地，本发明采用新型异种骨脱脂脱蛋白工艺(溶剂-煅烧法)，与
Figure BDA0003486305670000033
骨填充材料的传统工艺(酸碱-煅烧法)相比，实现骨粉纯度高、粒径均一、无免疫排异、生产周期短、成本低等优势。
进一步地，本发明以煅烧异种骨(去抗原牛骨或猪骨基质)为主要填充成分，来源广，成本低，所制得的天然复合骨填充材料成本在200元/克以下。
附图说明
图1是本发明天然复合骨填充材料以及
Figure BDA0003486305670000034
产品的实物图；
图2是本发明天然复合骨填充材料的红外谱图；
图3是本发明天然复合骨填充材料的X-ray衍射谱图；
图4是本发明天然复合骨填充材料和
Figure BDA0003486305670000035
在不同放大倍数下的扫描电镜图，其中(a)、(c)是本发明天然复合骨填充材料在200μm和500μm标尺下的扫描电镜图；(b)、(d)是
Figure BDA0003486305670000036
在200μm和500μm标尺下的扫描电镜图。
图5是本发明天然复合骨填充材料和
Figure BDA0003486305670000041
分别与骨髓间质干细胞共培养14天后的ALP染色图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有填充材料存在的价格昂贵，且来源有限以及可能产生免疫原性、对人体有一定的毒害性且不太稳定等问题，本发明提供了一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料和制备方法及其在慢性牙周炎引起的牙槽骨缺损修复中的用途。本发明制备方法包括以下步骤：
1、取新鲜一岁龄以下乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成4～6mm3小块进行煮沸、干燥；其中新鲜股骨优选脱离活体不超过3小时的股骨，优选乳牛股骨；
2、将干燥后的骨块先用体积比1：1(mL：mL)的5wt％十二烷基硫酸钠(SDS)和10wt％曲拉通X-100(TritonX-100)混合液浸泡23～25小时，再用30wt％双氧水浸泡23～25小时，最后用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥；其中浸泡时保证骨块被完全浸没即可；
3、将上述干燥后的骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡11～13小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥；进一步乳化油脂，防止骨块氧化发黄；
4、将上述处理干燥后的骨块，放入箱式煅烧炉中在650～950℃下煅烧，每次3.5～4.5小时；优选700～950℃；
5、将上述煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥；
6、将100mg上述干燥后的天然骨颗粒浸泡在2mL磷酸盐缓冲液中(含有一种或多种成骨相关蛋白，包括碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等，其总浓度为5μg/mL)，于37℃孵育24小时，然后用蒸馏水清洗骨颗粒，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
天然复合骨填充材料取自天然哺乳动物的股骨，同时复合多种成骨相关蛋白，材料来源易得、生产工艺简单，具有良好的孔隙率、一定的硬度和强度、较好的生物相容性及明显的骨诱导能力。解决了其他填充材料来源有限、孔隙结构不完整、容易造成免疫排异反应和生物相容性的问题。本发明提供的天然复合骨填充材料可用于治疗慢性牙周炎引起的牙槽骨、牙周组织缺损。
因此，本发明还提供了该天然复合骨填充材料在慢性牙周炎引起的牙槽骨缺损修复中的用途。本发明所述天然复合骨填充材料可填充于牙槽骨缺损处，其良好的孔隙结构起到诱导骨持续再生的作用；并且，所述天然复合骨填充材料利用羟基磷灰石无机成分(去抗原牛骨或猪骨基质)与成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)有机成分之间的无机-有机仿生组成协同作用，使其具有良好的生物相容性，其对骨移植领域，不仅仅在慢性牙周炎引起的牙槽骨缺损，在颌面外科、修复外科、骨外科等具有较强的成骨效果。
下面通过具体的对比例和实施例进行说明。
对比例1：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用0.5mol/L乙酸溶液和30％双氧水浸泡24小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中以2℃/min升温速率，在700℃下煅烧，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有5μg/mL成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，天然骨颗粒和成骨相关蛋白的质量比为10000：1，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
对比例2：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用0.5mol/L氢氧化钠溶液和30％双氧水浸泡24小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中以2℃/min升温速率，在700℃下煅烧，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
对比例3：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡24小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中以2℃/min升温速率，在600℃下煅烧，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
实施例1：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡24小时，混合液中SDS的质量浓度为2.5％，TritonX-100的质量浓度为5％；并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中在700℃下煅烧，以2℃/min升温速率，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
实施例2：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡24小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中在850℃下煅烧，以2℃/min升温速率，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
实施例3：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成5mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡24小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡12小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中在950℃下煅烧，以2℃/min升温速率，保温4小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、α-降钙素基因相关肽(CGRP)、骨钙蛋白(OCN)、RUNX2蛋白等)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料。
参见图1，本发明实施例1制得的天然复合骨填充材料与
Figure BDA0003486305670000071
产品外观相似，均为白色、大小均一，且具有一定孔隙结构的颗粒状物。
参见图2，为本发明实施例1所述骨填充材料及
Figure BDA0003486305670000081
产品的红外图谱，三种材料的谱图结果基本一致，在3500和3400cm-1处的特征吸收峰分别为Ca-OH和其表面吸附水的羟基的伸缩振动，在1049、604和567cm-1处的特征吸收峰分别为PO4 3-的伸缩振动和弯曲振动。结果表明本发明制得的天然复合骨填充材料(牛或猪复合骨粉)与
Figure BDA0003486305670000082
产品成分基本一致，均为高纯度的羟基磷灰石。但是，从图中可以看出牛或猪复合骨粉的吸收峰更强，杂峰更少，说明本发明制得的天然复合骨填充材料比
Figure BDA0003486305670000083
产品的纯度更高，处理工艺更好。
参见图3，为本发明实施例1所述骨填充材料及
Figure BDA0003486305670000084
产品的X射线衍射图谱，三种材料的谱图结果基本一致，在2θ＝25.8、31.8、32.9、34.0、39.8、46.6和49.4的特征吸收峰分别归属于羟基磷灰石的002、211、202、100、101、202和213晶面，结果表明本发明制得的天然复合骨填充材料(牛或猪复合骨粉)与
Figure BDA0003486305670000085
产品成分基本一致，均为高纯度的羟基磷灰石。但是，从图中可以看出牛或猪复合骨粉的特征吸收峰更全面，吸收峰更强，说明本发明制得的天然复合骨填充材料比
Figure BDA0003486305670000086
产品的结晶度更高，粒径更大。
参见图4，为本发明实施例1所述骨填充材料及
Figure BDA0003486305670000087
产品的扫描电镜图；结果表明本发明制得的天然复合骨填充材料(a和c)与
Figure BDA0003486305670000088
产品(b和d)，均具有完整三维网络状的松质骨结构。在结构上符合理想骨缺损填充材料要求。但是，从图中可以看出本发明制得的天然复合骨填充材料比
Figure BDA0003486305670000089
产品的粒径更均一，在300～400μm左右，更有利于材料的降解和新骨的生长。
参见图5，为本发明实施例1所述骨填充材料及
Figure BDA00034863056700000810
产品与骨髓间质干细胞共培养14天后的碱性磷酸酶(ALP)染色图，结果表明本发明制得的天然复合骨填充材料与
Figure BDA00034863056700000811
产品，对细胞无不良刺激，材料没有细胞毒性。但是，从图中可以看出牛复合骨粉的ALP颜色更深，增值分化的细胞数量更多，说明本发明制得的天然复合骨填充材料比
Figure BDA00034863056700000812
产品的生物相容性更好，可作为优良的骨替代材料，构建组织化人工骨。
综上，本发明所制备的天然复合骨填充材料通过红外光谱、X射线衍射和扫描电镜分析显示其主要成分为高纯度羟基磷灰石，且具有完整三维网络状的松质骨结构。在结构上符合理想骨缺损填充材料要求。通过骨髓间充质干细胞与天然复合骨填充材料体外细胞试验，证明本发明制备的骨填充材料生物相容性好，对细胞无不良刺激，材料没有细胞毒性，能显著促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化。因此本发明研制的天然煅烧骨填充材料可作为优良的骨替代材料，构建组织化人工骨。
对上述对比例1-3和实施例1-3中的脱脂脱蛋白工艺和煅烧温度进行性能测试，测试了其对骨髓间充质干细胞的增殖效果，经武汉协和医院口腔医学中心测试，其测试性能结果如表1所示。
表1：对比例1-3和实施例1-3所述天然复合骨填充材料性能测试表
Figure BDA0003486305670000091
实施例4：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成4mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡23小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡11小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中以2℃/min升温速率，在650℃下煅烧，保温4.5小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OCN)和RUNX2蛋白)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料，经测试无免疫排斥反应。
实施例5：
取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成6mm3小块进行煮沸、干燥。将干燥后的骨块先后用SDS和TritonX-100(1:1)混合液和30％双氧水浸泡25小时，并用蒸馏水清洗数次，至PH值为7后干燥。然后将骨块放入0.1mol/L焦磷酸钠溶液中浸泡13小时，并用蒸馏水清洗数次，干燥。接着将骨块，放入箱式煅烧炉中以2℃/min升温速率，在950℃下煅烧，保温3.5小时，冷却至室温。煅烧后的骨块用球磨机研磨，筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒，并用无水乙醇和水交替超声清洗三次，干燥。最后将0.25～1.0mm的天然骨颗粒浸泡在含有成骨相关蛋白(碱性磷酸酶(ALP))的磷酸盐缓冲液(PBS)中，于37℃孵育24小时，冷冻干燥得到天然复合骨填充材料，经测试无免疫排斥反应。
结合上述实施例以及测试，可知本发明至少具有以下创新点：
1、该天然复合骨填充材料含有多种成骨相关蛋白，在具备
Figure BDA0003486305670000101
骨填充材料良好的物化性能和生物相容性的同时，解决了
Figure BDA0003486305670000102
骨填充材料缺乏生物活性、自体骨骨量少以及同种异体骨安全性和有效性等问题。
2、该天然复合骨填充材料采用新型异种骨脱脂脱蛋白工艺(溶剂-煅烧法)，与
Figure BDA0003486305670000103
骨填充材料的传统工艺(酸碱-煅烧法)相比，实现骨粉纯度高、粒径均一、无免疫排异、生产周期短、成本低等优势。
3、该天然复合骨填充材料最佳的烧结温度为700℃，在满足骨粉无免疫原性的前提下，同时又保持了骨粉优良的孔隙结构，大大节约了生产时间和成本。
4、本发明提供了一种简单、高效、稳定、较为理想的天然复合骨填充材料的制备方法，并对传统的脱脂脱蛋白工艺进行了优化，解决了其他填充材料来源有限、孔隙结构不完整、存在免疫排异反应和生物相容性的问题。本发明天然复合骨填充材料主要用于牙槽骨的修补，尤其适用于牙槽嵴的扩展和重建治疗、填充牙周部位的骨缺损、填充拔牙窝、种植体周围炎症、牙周治疗和保持牙槽嵴形态等。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取动物松质骨进行脱脂脱蛋白处理，水洗干燥得到骨块A；
(2)将骨块A在焦磷酸钠溶液中浸泡处理，水洗干燥得到骨块B；
(3)将骨块B在大于600℃的温度条件下进行煅烧，得到骨块C；
(4)将骨块C进行研磨、筛选、清洗和干燥，得到骨颗粒；
(5)将骨颗粒在含有成骨相关蛋白的缓冲液中浸泡，再取出干燥得到诱导骨再生的天然复合骨填充材料。
2.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)动物松质骨是取新鲜一岁龄乳牛或猪的股骨，先切成片状骨块，进行皮质骨和松质骨分离，将松质骨切成4～6mm3块进行煮沸和干燥。
3.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)脱脂脱蛋白处理是先在十二烷基硫酸钠和曲拉通X-100的混合液中浸泡23～25小时，混合液中十二烷基硫酸钠的质量浓度为2.5％，曲拉通X-100的质量浓度为5％；再在30wt％双氧水中浸泡23～25小时；步骤(1)中水洗至中性。
4.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)中浸泡处理是在0.1mol/L的焦磷酸钠溶液中浸泡11～13小时。
5.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中是在650～950℃下煅烧3.5～4.5小时。
6.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(4)中筛选是筛选粒径为0.25～1.0mm的颗粒；步骤(4)中清洗是采用无水乙醇和水交替超声清洗三次。
7.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，骨颗粒和成骨相关蛋白的质量比为10000:1；成骨相关蛋白包括碱性磷酸酶、α-降钙素基因相关肽、骨钙蛋白和RUNX2蛋白中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的诱导骨再生的天然复合骨填充材料的制备方法，其特征在于，步骤(5)中浸泡是在37℃孵育24小时。
9.如权利要求1-8任一项所述制备方法制得的诱导骨再生的天然复合骨填充材料。
10.如权利要求9所述诱导骨再生的天然复合骨填充材料在制备骨缺损修复材料中的应用。
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