CN111150882B - 银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架及其制备方法与应用 - Google Patents

银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的一种银纳米线‑矿化胶原共组装仿生支架材料，所述银纳米线‑矿化胶原共组装仿生支架材料是一种三维多孔支架，所述三维多孔支架由银纳米线、包裹于银纳米线(AgNW)表面的胶原纤维交织而成，还包括填充于胶原纤维内的纳米羟基磷灰石。本发明还提供了上述银纳米线‑矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法。本发明银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架中银纳米线表面包裹的胶原分子可降低材料的生物毒性、避免影响相容性和成骨性能；当表面胶原分子在体内降解时，部分暴露的银纳米线可有效抑制植入处细菌生存，实现骨修复/抗菌双模治疗。

Description

银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架(IMC/AgNWs)及其制备方法，还提供了该银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料在制备治疗和/或预防感染性骨缺损修复药物中的应用。
背景技术
牙周炎、种植体周围炎、颌骨骨髓炎等颌面部感染性疾病导致的颌面部骨缺损，是目前口腔临床治疗中的一大难题。目前，使用人工骨替代材料是骨缺损治疗的有效方案。但现有人造骨材料，只起到有限的物理支撑效果，不能真正实现骨组织结构和功能的再生，尤其是骨胶原排列与血管形成；同时，颌面部属有菌环境，骨缺损区域易发生感染，因此，提升骨替代材料的抗菌性能是优化骨缺损修复效果的关键。
发明内容
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架(IMC/nano-Ag)及其制备方法，还提供了该银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料在制备治疗和/或预防感染性骨缺损修复药物中的应用。
技术方案：本发明提供了银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料，所述银纳米线- 矿化胶原共组装仿生支架材料是一种三维多孔支架，所述三维多孔支架由银纳米线、包裹于银纳米线(AgNW)表面的胶原纤维交织而成，还包括填充于胶原纤维内的纳米羟基磷灰石。
本发明还提供了上述银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，步骤如下：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：将PVP溶液加热，恒温搅拌，加入氯化银溶液反应；再加入硝酸银溶液反应；冷却至室温，加入去离子水与乙醇混合溶液，离心，即得银纳米线(AgNW)溶液；
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的自下而上自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG进行浓缩，将胶原溶液与步骤(1)制得的银纳米线(AgNW)溶液混合，透析，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔支架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌成悬浮液，冷冻干燥，得到三维海绵状的胶原支架；再在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基) 碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中交联3-5h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔支架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔框架浸入到矿化液中矿化处理，得矿化材料；
(5)纳米羟基磷灰石的有序结晶沉积：在步骤(4)制的的含钙磷离子的矿化材料中加入聚丙烯酸形成纳米羟基磷灰石，在热动力学控制条件下逐渐进入胶原内部，并实现在胶原内部的有序排列；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)产物用双蒸水冲洗，冻干，即得银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架。
步骤(1)中，PVP溶液、氯化银溶液、硝酸银溶液的溶剂分别独立的为醇类溶剂，优选地为乙二醇，二乙二醇、戊二醇、丁二醇、乙醇、甲醇；PVP溶液加热温度至150-190℃； PVP溶液与氯化银溶液的反应时间为3-10min；再加入硝酸银溶液的反应时间为 10-60min；反应体系中，PVP、氯化银、硝酸银的质量比为0.1-0.5：0.01-0.05：0.03-0.15。
步骤(1)中，离心速度为6000-10000r/min，离心时间为3-10min，重复1-3次；或者离心采用以下程序：先采用6000-10000r/min离心3-10min，再采用800-1200r/min 离心10-20min。
步骤(2)中，反应前，调整银纳米线(AgNW)溶液的浓度至5-15mg/mL；I型鼠尾原胶原溶液浓缩后浓度为4.0-5.0mg/mL；银纳米线(AgNW)溶液和I型鼠尾原胶原溶液用量为使混合后的I型鼠尾原胶原溶液浓度调整至0.3-1.0mg/mL；浓缩采用的 PEG的分子量为1000-12000；透析条件为：36-38℃透析20-28h,透析液为30mM Na2HPO4、 10mM KH2PO4、200mM KCl(pH＝7)溶液。
步骤(3)中，交联反应时间为(3-5h)。
步骤(3)中，1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的配置方法为：将1g的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到99mL 80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
步骤(4)中，矿化液中包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀；其中，硅酸盐包括：136.9mM NaCl、2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4、1.25mM的K2HPO4·3H2O、3.08mM的Na3N、溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.0-8.0；硅酸盐水门汀在矿化液中的含量为0.001～10g；三维多孔框架与矿化液的用量比为0.01～1g：1～100mL。
步骤(5)中，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mM～1mM；反应24-168h。
本发明还提供了上述银线-矿化胶原共组装仿生支架材料在制备治疗和/或预防感染性骨缺损修复药物中的应用。
有益效果：本发明中胶原分子、纳米羟基磷灰石和银纳米线可以在K+及碱性环境中共组装：其中纳米羟基磷灰石先与胶原分子共组装，并在胶原纤维内部有序排列，形成矿化胶原纤维；矿化胶原纤维进一步包裹于银纳米线表面，最终交织形成具有三维多孔结构的银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架。银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架中银纳米线表面包裹的胶原分子可降低材料的生物毒性、避免影响相容性和成骨性能；当表面胶原分子在体内降解时，部分暴露的银纳米线可有效抑制植入处细菌生存，实现骨修复/抗菌双模治疗。
本发明中胶原分子可以在K+及碱性环境中纤维化组装为三维支架，纳米羟基磷灰石能进入到胶原体系中进行共组装并在胶原纤维内部有序排列，形成三维胶原支架材料；同时AgNW被胶原分子包裹形成银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架，一方面可降低毒性、避免影响相容性和成骨性能，另一方面在体内表面胶原分子降解后银线露出起到抗菌的作用。
组织工程学要求生物材料需要具备的首要条件是有良好的生物相容性，细胞与材料间具备良好的相互作用以促进新骨再生，在大鼠感染性颅骨缺损和兔下颌拔牙窝模型中，本发明的银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架可在无成骨细胞和成骨因子存在下诱导大量新骨及骨髓血管的生长，再生效果堪比自体移植骨。
该支架制备过程简便易行，有利于实现工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明中银纳米线-矿化胶原的形貌及扫描(SEM)电镜图(上)及能谱图(下)。
图2为本发明在不同基底材料培养细胞增殖时间变化图。
图3为本发明中银纳米线—矿化胶原的抗菌能力测定图；其中，左上图为IMC组抗菌能力图，右上图为IMC/nano-Ag组抗菌能力图，下图为细胞计数结果。
图4为本发明中不同植入材料成骨、成血管及炎症相关因子表达情况；左上图为OCN表达结果图；右上图为BMP-2表达结果图；左中图为VEGF表达结果图；右中图为PDGF 表达结果图；左下图为TNF-α表达结果图；右下图为iNOS表达结果图。
图5为本发明中不同植入材料修复大鼠感染性颅骨缺损图。
图6为本发明中不同植入材料修复大鼠感染性颅骨缺损micro-CT及HE、Masson图。
图7为本发明中不同植入材料修复兔下颌拔牙窝图。
图8为本发明中不同植入材料修复兔下颌拔牙窝图micro-CT图及HE、Masson图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，使用的原料及采购来源如下：
鼠尾I型原胶原溶液(BD Bio-sciences)、透析袋(3500Da,Invitrogen,Paisly,UK)、PAA(M.W.72，2000，5000)(Sigma-Aldrich,USA)、磷酸缓冲液(Gibco,Invitrogen,Paisly,UK)、PVP粉末(Aladdin)、氯化银粉(Aladdin)末及甘氨酸(Sigma-Aldrich， USA)。
实施例1
制备银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的方法，具体步骤如下：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：称取0.334g的PVP粉末置于三口烧瓶中，加入17mL乙二醇，磁力搅拌溶解并加热到170℃；称取0.025g的氯化银粉末置于 1mL的乙二醇中；将氯化银的乙二醇溶液迅速注入到170℃的PVP溶液中；5min后，称预先称取的0.110g的硝酸银的乙二醇溶液，在10min内注入到三口烧瓶中， 170℃下继续反应30min，整个反应过程中需要持续的磁力搅拌；反应结束后，待溶液自然冷却至室温，加入适量的去离水与乙醇，8000r/min的速度离心5min并重复离心1次，接着1000r/min离心15min并重复三次，即得银纳米线(AgNW)溶液；离心后的AgNWs分散在水中，以便后续表征及使用；
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的bottom-up自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG 10000进行浓缩，使其浓度达4.5mg/mL；将浓缩的I型鼠尾原胶原溶液与10mg/mL AgNW混合，使其浓度达到0.5mg/mL，之后用PBS透析，37℃24小时，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔框架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌得到悬浮液，注入到模具中冷冻干燥，得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中进一步交联 4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔框架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔材料浸入到矿化液中矿化处理，得矿化处理液；矿化液包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀，矿化液的磷酸盐部分包含136.9mM NaCl,2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4,1.25mM的K2HPO4·3H2O,以及 3.08mM的Na3N,溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.4；矿化液中硅酸盐水门汀的含量为0.001～10g，矿化液的体积为1～100mL，提供持续不断释放的钙离子；
(5)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在矿化处理液中加入聚丙烯酸，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mM～1mM，每三天换一次矿化液；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)得到的三维材料使用双蒸水冲洗，冻干，即得到银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架。
实施例2
所述制备银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架材料的方法；具体步骤如下：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：称取0.334g的PVP粉末置于三口烧瓶中，加入17mL乙二醇，磁力搅拌溶解并加热到170℃；称取0.025g的氯化银粉末置于1 mL的乙二醇中。将氯化银的乙二醇溶液迅速注入到170℃的PVP溶液中；5min后，称预先称取的0.110g的硝酸银的乙二醇溶液，在10min内注入到三口烧瓶中， 170℃下继续反应30min，整个反应过程中需要持续的磁力搅拌；反应结束后，待溶液自然冷却至室温，加入适量的去离水与乙醇，8000r/min的速度离心5min并重复离心1次，接着1000r/min离心15min并重复三次，即得银纳米线(AgNW)溶液；离心后的AgNWs分散在水中，以便后续表征及使用
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的bottom-up自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG 10000进行浓缩，使其浓度达4.5mg/mL；将 I型鼠尾原胶原溶液与10mg/mL AgNWs混合，使其浓度达到0.5mg/mL，之后用PBS 透析，37℃24小时，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔框架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌得到悬浮液，注入到模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中进一步交联 4小时，随后用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔框架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔材料浸入到矿化液中矿化处理，得矿化处理液；矿化液包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀，矿化液的磷酸盐部分包含136.9mM NaCl,2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4,1.25mM的K2HPO4·3H2O,以及 3.08mM的Na3N,溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.4；矿化液中硅酸盐水门汀的含量为0.001～10g，矿化液的体积为1～100mL，提供持续不断释放的钙离子；
(5)羟基磷灰石的有序结晶沉积：在矿化液中加入聚丙烯酸，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mM～1mM，每三天换一次矿化液；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)得到的三维材料使用双蒸水冲洗，冻干，即得到银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架。
实施例3
银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，步骤如下：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：将PVP溶液加热，恒温搅拌，加入氯化银溶液反应；再加入硝酸银溶液反应；冷却至室温，加入去离子水与乙醇混合溶液，离心，即得银纳米线(AgNW)溶液；
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的自下而上自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG进行浓缩，将胶原溶液与步骤(1)制得的银纳米线(AgNW)溶液混合，透析，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔支架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌成悬浮液，冷冻干燥，得到三维海绵状的胶原支架；再在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基) 碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中交联，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔支架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔框架浸入到矿化液中矿化处理，得矿化材料；
(5)纳米羟基磷灰石的有序结晶沉积：在步骤(4)制的的含钙磷离子的矿化材料中加入聚丙烯酸形成纳米羟基磷灰石，在热动力学控制条件下逐渐进入胶原内部，并实现在胶原内部的有序排列；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)产物用双蒸水冲洗，冻干，即得银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架。
步骤(1)中，PVP溶液、氯化银溶液、硝酸银溶液的溶剂为乙醇；PVP溶液加热温度至150℃；PVP溶液与氯化银溶液的反应时间为10min；再加入硝酸银溶液的反应时间为60min；反应体系中，PVP、氯化银、硝酸银的质量比为0.1：0.05：0.03；离心采用以下程序：先采用10000r/min离心3min，再采用1200r/min离心10min。
步骤(2)中，反应前，调整银纳米线(AgNW)溶液的浓度至5mg/mL；I型鼠尾原胶原溶液浓缩后浓度为4.0mg/mL；银纳米线(AgNW)溶液和I型鼠尾原胶原溶液用量为使混合后的I型鼠尾原胶原溶液浓度调整至0.3mg/mL；浓缩采用的PEG的分子量为1000；透析条件为：36-38℃透析20h,透析液为30mM Na2HPO4、10mM KH2PO4、200mM KCl(pH＝7)溶液。
步骤(3)中，交联反应时间为3h；1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的配置方法为：将1g的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC) 加入到99mL 80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
步骤(4)中，矿化液中包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀；其中，硅酸盐包括：136.9mM NaCl、2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4、1.25mM的K2HPO4·3H2O、3.08mM的Na3N、溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.0-8.0；硅酸盐水门汀在矿化液中的含量为0.001～10g；三维多孔框架与矿化液的用量比为0.01～1g：1～100mL。
步骤(5)中，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mM；反应24h。
实施例4
银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，步骤如下：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：将PVP溶液加热，恒温搅拌，加入氯化银溶液反应；再加入硝酸银溶液反应；冷却至室温，加入去离子水与乙醇混合溶液，离心，即得银纳米线(AgNW)溶液；
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的自下而上自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG进行浓缩，将胶原溶液与步骤(1)制得的银纳米线(AgNW)溶液混合，透析，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔支架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌成悬浮液，冷冻干燥，得到三维海绵状的胶原支架；再在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基) 碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中交联，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔支架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔框架浸入到矿化液中矿化处理，得矿化材料；
(5)纳米羟基磷灰石的有序结晶沉积：在步骤(4)制的的含钙磷离子的矿化材料中加入聚丙烯酸形成纳米羟基磷灰石，在热动力学控制条件下逐渐进入胶原内部，并实现在胶原内部的有序排列；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)产物用双蒸水冲洗，冻干，即得银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架。
步骤(1)中，PVP溶液、氯化银溶液、硝酸银溶液的溶剂为戊二醇；PVP溶液加热温度至190℃；PVP溶液与氯化银溶液的反应时间为3min；再加入硝酸银溶液的反应时间为10min；反应体系中，PVP、氯化银、硝酸银的质量比为0.5：0.01：0.15；离心采用以下程序：先采用6000r/min离心10min，再采用800r/min离心20min。
步骤(2)中，反应前，调整银纳米线(AgNW)溶液的浓度至15mg/mL；I型鼠尾原胶原溶液浓缩后浓度为5.0mg/mL；银纳米线(AgNW)溶液和I型鼠尾原胶原溶液用量为使混合后的I型鼠尾原胶原溶液浓度调整至1.0mg/mL；浓缩采用的PEG的分子量为12000；透析条件为：36-38℃透析28h,透析液为30mM Na2HPO4、10mM KH2PO4、200mM KCl(pH＝7)溶液。
步骤(3)中，交联反应时间为5h；1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的配置方法为：将1g的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC) 加入到99mL 80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
步骤(4)中，矿化液中包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀；其中，硅酸盐包括：136.9mM NaCl、2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4、1.25mM的K2HPO4·3H2O、3.08mM的Na3N、溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.0-8.0；硅酸盐水门汀在矿化液中的含量为0.001～10g；三维多孔框架与矿化液的用量比为0.01～1g：1～100mL。
步骤(5)中，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为1mM；反应168h。
试验例1银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的性能测试
供试材料：银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架(实施例1制备)
方法：
1.采用扫描电镜(SEM)观察不同胶原支架的微观形貌(图1)。将实施例1制备得到的的支架材料经梯度酒精脱水(50％-100％)，并冻干，喷金后，在15kV电压下观察。结果显示，银纳米线可以与矿化胶原共组装，能谱图显示支架材料除了具有矿化胶原的 Ca、P、C、N、O等元素外，也可以检测到Ag的存在。
2.细胞增殖：用Cell Counting Kit估计活细胞的数量(图2)。在固定的时点，去除孔板内培养基，用PBS清洗三次，将CCK-8检测试剂与a-MEM培养基1：10混合后加入到不同组，在37℃孵育4h，孵育后将样本移至96孔板，用酶标仪在450nm处读出吸光度值，每组重复三次，取平均值，结果显示0.5mg/mL IMC/nano-Ag具有很好的生物相容性，效果与对照组持平，而1mg/mL IMC/nano-Ag则抑制了细胞生长。
3.抑菌效果测定：采用二倍稀释法测定IMC/nano-Ag最低抑菌浓度(图3)。将金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌悬液稀释至不同浓度，分别接种在不同基底上，37℃培养 24h，孵育后将样本移至96孔板，用酶标仪在600nm处读出吸光度值，每组重复三次，取平均值，结果显示0.0325mg/mL浓度以上的IMC/nano-Ag具有很好的抗菌性能，0.5 mg/mL IMC/nano-Ag的抗菌效果与其基本持平。
4.体外成骨、成血管、抗炎相关因子的表达：用realtime PCR检测成骨(OCN、BMP-2)、成血管(VEGF、PDGF)、抗炎(TNF-α、iNOS)相关因子表达情况(图4)。将人牙周膜干细胞(hPDLSCs)接种在不同支架材料上，分别进行成骨诱导、炎症诱导7天、14天后提取RNA，逆转录及实时定量PCR，反应结束后通过观察产物熔解曲线是否呈现单峰,判断PCR产物的特异性。确定各基因Ct值,即PCR产物荧光强度呈现线性增加时的初始循环数。以GAPDH表达水平为内参照,评估被测基因相对表达水平,即目的基因Ct值与内参GAPDH Ct值相减,获得△Ct值,通过公式2-△Ct获得目的基因mRNA相对于GAPDH的表达水平。设定对照组与实验组时,实验组基因mRNA相对于对照组的表达量公式为2-△△Ct＝2-(△Ct实验组-△Ct对照组)。实验数据以三次独立实验的均数±标准差表示,利用SPSS 13.0软件进行方差分析,以P＜0.05判定有统计学差异。
结果表明，IMC/nano-Ag在体外成骨诱导后，成骨、成血管相关因子表达明显上调；同时，经过炎症诱导后，IMC/nano-Ag表现出明显的抑制炎症效果。
以上结果表明，本发明的这种银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架具有合成简单，成本低，塑形方便，生物相容性良好、成骨、成血管、抗菌抗炎性能良好等特点。
试验例2大鼠感染性颅骨缺损修复的实施方案
1.建立动物模型(图5)：为测试具有不同纳米结构胶原支架的骨再生功能，在Sprague-Dawley(SD)大鼠的颅骨部位建立了5mm直径的临界尺寸感染性骨缺损模型。将15只6-8周的雄性SD大鼠随机分为三组，其中两组分别植入天然去细胞的骨基质三维矿化胶原支架(IMC)和银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架(IMC/nano-Ag)材料，最后一组为阴性对照组，不植入任何材料。SD大鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒铺巾；切开头部皮肤，分离肌层，暴露颅骨骨面；使用种植机(W&H) 1200转/min配合环形骨钻(外径5mm)磨除全层骨组织(图5)，无菌生理盐水冷却，压迫止血，缺损区涂抹3*105CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液；分别取IMC、IMC/nano-Ag 支架材料，修剪边缘使之适合缺损大小，植入缺损部位，用6-0型手术缝合线缝合皮肤。
2.Micro-CT扫描(图6)：术后12周后，用过量的戊巴比妥(100mg/kg)使SD 大鼠进入深度麻醉中实施安乐死，分离出SD大鼠的颅骨并用含有10％福尔马林的PBS 固定，利用MicroCT(Bruker，USA)扫描缺损区域(电压80V，电流500uA，分辨率为 18.4um)获得大鼠颅骨的连续图像，IMC/nano-Ag组缺损部位几乎完全被纤维状骨结构长满，包括缺损的中心部位，IMC组只有有限的新骨形成并限制在缺损边缘位置，缺损中心几乎无新骨形成，而在未经处理的阴性对照组，则完全无新骨的形成。
3.缺损区的组织化学染色检查(图6)：将SD大鼠颅骨放入含有10％EDTA的蔗糖溶液中进行脱钙8周，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，因组织切片机切片，厚度5μm，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色，封片，显微镜下观察缺损区骨组织的微观结构。IMC/nano-Ag组处理的缺损区均大量新骨生成，新生骨之间可见大量的新生血管，在IMC组只有缺损区边缘可见新骨形成，新生骨区域可见血管和骨髓的生成。缺损区组织切片Masson染色结果显示，IMC/nano-Ag支架材料完全降解，缺损区域被新生骨充满。IMC组可见部分未降解材料，支架间隙被细胞及新生血管充满。
试验例3兔下颌拔牙窝骨缺损修复的实施方案
1.建立动物模型(图7)：为测试具有不同纳米结构胶原支架的骨再生功能，在拔除兔右侧下颌第一前磨牙后植入不同支架材料。将9只2-2.5kg的雌性大耳白兔随机分为三组，其中两组分别植入天然去细胞的骨基质三维矿化胶原支架(IMC)和银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架(IMC/nano-Ag)材料，最后一组为阴性对照组，不植入任何材料。兔用2％戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，固定，消毒铺巾；放置开口器，分离牙龈，挺松右下颌第一前磨牙并拔除(图7)；分别取IMC、IMC/nano-Ag支架材料，修剪边缘使之适合拔牙窝大小，植入骨缺损部位，开放拔牙窝。
2.Micro-CT扫描(图8)：术后8周，用过量的戊巴比妥(200mg/kg)使兔进入深度麻醉中实施安乐死，分离出兔的右侧下颌骨并用含有10％福尔马林的PBS固定，利用MicroCT(Bruker，USA)扫描缺损区域(电压80V，电流500uA，分辨率为18.4um) 获得兔下颌骨的连续图像，IMC/nano-Ag组拔牙窝几乎完全被松质骨结构长满，包括缺损的中心部位，表面骨皮质光滑连续。IMC组拔牙窝内充满松质骨，但表面骨皮质不连续。而在未经处理的阴性对照组，拔牙窝内只可见少量松质骨，表面无骨皮质形成。
3.缺损区的组织化学染色检查(图8)：将兔下颌骨放入含有10％EDTA的蔗糖溶液中进行脱钙12周，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，因组织切片机切片，厚度5μm，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色，封片，显微镜下观察缺损区骨组织的微观结构。IMC/nano-Ag组处理的拔牙窝内材料几乎完全降解，局部可见新生骨岛，表面排列着立方状的成骨细胞以及多核破骨细胞，其内部的纤维与骨细胞的排列趋势呈同心圆状，类似环形骨单位；组织中还出现类似骨髓腔的结构，其中含有成骨细胞、间充质细胞、淋巴细胞和大量毛细血管与红细胞。
综合试验例1～3可得出，本发明所提出的银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架可用于硬组织如颅骨，颌骨，长骨等缺损的修复；IMC/nano-Ag可以诱导宿主细胞实现良好的体内骨再生。该制备IMC/nano-Ag的方法简便、快捷，此材料不仅可以作为良好的支架材料，而且可以直接作为骨替代材料用于骨组织修复。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：
(1)银纳米线(AgNW)的制备：将PVP溶液加热，恒温搅拌，加入氯化银溶液反应；再加入硝酸银溶液反应；冷却至室温，加入去离子水与乙醇混合溶液，离心，即得银纳米线(AgNW)溶液；
(2)银纳米线-胶原共组装：采用热动力学控制的自下而上自组装模式，将提取并纯化的I型鼠尾原胶原溶液采用PEG进行浓缩，将胶原溶液与步骤(1)制得的银纳米线(AgNW)溶液混合，透析，即得共组装银纳米线-胶原；
(3)三维多孔支架的合成：将步骤(2)得到的共组装银纳米线-胶原离心、搅拌成悬浮液，冷冻干燥，得到三维海绵状的胶原支架；再在含有1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)的乙醇溶液中交联3-5h，再用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到三维多孔支架；
(4)三维多孔材料的矿化：将步骤(3)得到的三维多孔框架浸入到矿化液中矿化处理，得矿化材料；
(5)纳米羟基磷灰石的有序结晶沉积：在步骤(4)制的的含钙磷离子的矿化材料中加入聚丙烯酸形成纳米羟基磷灰石，在热动力学控制条件下逐渐进入胶原内部，并实现在胶原内部的有序排列；
(6)银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架的合成：将步骤(5)产物用双蒸水冲洗，冻干，即得银纳米线—矿化胶原共组装仿生支架。
2.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，PVP溶液、氯化银溶液、硝酸银溶液的溶剂分别独立的为醇类溶剂；PVP溶液加热温度至150-190℃；PVP溶液与氯化银溶液的反应时间为3-10min；再加入硝酸银溶液的反应时间为10-60min；反应体系中，PVP、氯化银、硝酸银的质量比为0.1-0.5：0.01-0.05：0.03-0.15。
3.根据权利要求2所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：所述醇类溶剂包括乙二醇、二乙二醇、戊二醇、丁二醇、乙醇、甲醇。
4.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，离心速度为6000-10000r/min，离心时间为3-10min，重复1-3次；或者离心采用以下程序：先采用6000-10000r/min离心3-10min，再采用800-1200r/min离心10-20min。
5.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，反应前，调整银纳米线(AgNW)溶液的浓度至5-15mg/mL；I型鼠尾原胶原溶液浓缩后浓度为4.0-5.0mg/mL；银纳米线(AgNW)溶液和I型鼠尾原胶原溶液用量为使混合后的I型鼠尾原胶原溶液浓度调整至0.3-1.0mg/mL；浓缩采用的PEG的分子量为1000-12000；透析条件为：36-38℃透析20-28h,透析液为30mM Na2HPO4、10mM KH2PO4、200mM KCl溶液，其中KCl溶液的pH为7.0。
6.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，交联反应时间为(3-5h)。
7.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的配置方法为：将1g的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)加入到99mL 80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
8.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，矿化液中包含磷酸盐和I型白色硅酸盐水门汀；其中，硅酸盐包括：136.9mM NaCl、2.7mM的KCl,8.3mM的Na2HPO4、1.25mM的K2HPO4·3H2O、3.08mM的Na3N、溶剂为水，用HCl和NaOH将溶液pH调节为7.0-8.0；硅酸盐水门汀在矿化液中的含量为0.001～10g；三维多孔框架与矿化液的用量比为0.01～1g：1～100mL。
9.根据权利要求1所述的银纳米线-矿化胶原共组装仿生支架材料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，所述聚丙烯酸分子量区间1720～2265，同时使所述聚丙烯酸在矿化液中浓度保持为0.2mM～1mM；反应24-168h。
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