CN108926743A - 一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，通过二元组装制备具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料的方法分为两步：首先制备纳米羟基磷灰石；在胶原矿化过程中通过透析缓慢进入并沉积于胶原纤维表面；在体外通过各项参数的控制完成对天然骨矿化胶原纤维的模拟；再完全复制天然骨化学成分及周期性等级结构的前提下，三维矿化胶原支架具有合适的机械强度，能够招募宿主细胞实现成骨分化。具严格等级结构的三维矿化胶原支架材料还具备优良的成血管能力，不加任何生物制剂如成骨因子或重组蛋白的情况下，单独利用三维多孔胶原支架材料实现活体动物试验中骨缺损的修复。

Description

一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用
技术领域
本发明涉及骨组织修复材料制备与治疗领域，具体是一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用。
背景技术
传统意义上通常以生物材料结合成骨细胞及成骨蛋白为一种强有力的手段来修复骨缺损，这种方法的缺点是高成本和伴随着外源性细胞和生长因子带来的副作用，如呼吸效应、异位骨形成、移植点的原位骨吸收，及可能导致的癌症发病率增高等。因此开发利用身体自主再生能力，通过召集宿主细胞来诱导骨形成的骨诱导型生物材料仍然是临床亟待解决的问题。而这项技术的关键在于发展一种目标特异性的生物支架材料以模拟天然骨的等级结构和表面形貌为招募宿主细胞提供合适的微环境，最终完成从结构到功能上的骨再生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三维矿化胶原支架材料及其骨再生应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，包括以下步骤：
1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；
2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；
3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；
4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
作为本发明进一步的方案：在步骤1)中，胶原来源为动物的皮及肌腱组织。
作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，根据中间体自由能的计算得出聚丙烯酸的分子量区间在1720～2265之间，浓度在0.1～100mg/mL之间。
作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，A液的CaCl2浓度为1～100mM，聚丙烯酸的质量浓度为0.1～100mg/mL；B液的K2HPO4浓度为1～100mM；A液与B液的体积比为1：10～10：1。
作为本发明进一步的方案：在步骤2)中，TBS缓冲液的配制方法为：2.42g的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和8g的NaCl溶于1L的去离子水中，最后用HCl调节溶液pH为7.4。
作为本发明进一步的方案：在步骤3)中，所述的I型胶原的浓度为0.1～10mg/mL，透析环境中羟基磷灰石的质量为0.1～100mg。
作为本发明进一步的方案：在步骤4)中，所述的EDC溶液的配置方法为：将1g的EDC加入到99mL80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
作为本发明进一步的方案：所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中胶原分子可以在K+及碱性环境中纤维化组装为三维支架，纳米羟基磷灰石能通过透析袋进入到胶原体系中进行共组装并在胶原纤维内部有序排列，形成具严格等级性拓补结构的三维胶原支架材料，该材料能通过改变干细胞共价锚定密度来调节干细胞分化。组织工程学要求生物材料需要具备的首要条件是有良好的生物相容性，细胞与材料间具备良好的相互作用以促进新骨再生，HIMC能提供与天然骨类似的微环境便于细胞的生长及分化，在小鼠和小型猪的临界骨缺损模型中，HIMC可在无成骨细胞和成骨因子存在下诱导大量新骨及骨髓血管的生长，再生效果堪比自体移植骨，HIMC为受损区域骨再生提供了新的设计和构建高度活性的骨组织修复材料的思路。该制备过程简便易行，绿色环保，有利于实现工业化大规模生产。
附图说明
图1为本发明中天然骨、HIMC及NIMC的形貌及扫描(SEM)和透射(TEM)电镜图。
图2为本发明中天然骨、HIMC及NIMC的原子力显微镜(AFM)图及力学模式。
图3为本发明中天然骨、HIMC及NIMC的的AFM力学形貌图和杨氏模量对比。
图4为本发明在不同基底材料培养细胞增殖时间变化。
图5为本发明中细胞染色实验确定不同基底上细胞形貌和分支点数目及纵横比。
图6为本发明中不同基底上Runx2及VEGF表达，及不同基底上免疫荧光染色。
图7为本发明中不同植入材料的形貌和micro-CT图像，及大鼠下颌骨修复手术模式。
图8为本发明中不同植入材料的修复效果micro-CT图像及再生骨体积，HIMC材料可媲美DCBM材料；缺损区HE染色图像。
图9为本发明中不同植入材料修复效果截面图，及大鼠下颌骨修复区的HE、Masson、TRAP染色图像。
图10为本发明中不同植入材料修复区Runx2及CD31免疫染色图像及定量结果。
图11为本发明中不同植入材料修复区Osx及VEGFR-1免疫组织化学染色图像。
图12为本发明中小型猪颅骨缺损修复模式图。
图13为本发明中术中缺损的建立和材料植入(a)；术后12周螺旋CT扫描，上面观(b)和前面观(c)。
图14为本发明中术后12周缺损区分别植入HIMC及HA组的HE染色图，HIMC组明显有新骨形成及血管化，而HA组则有大量支架残留。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
材料及其购买来源：
牛肌腱
透析袋(3500Da，Invitrogen，Paisly，UK)
PAA(M.W.2000)(Sigma-Aldrich，USA)
磷酸缓冲液(Gibco，Invitrogen，Paisly，UK)
甘氨酸(Sigma-Aldrich，USA)
HA(东博生物科技有限公司，中国)
本发明实施例中，具严格等级结构的三维矿化胶原支架(HIMC)的制备：
实施例1
(1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织，常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L，将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物，在粗提物中加入NaCl至浓度为2M进行盐析，低温离心分离出沉淀后再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于分子量为1000的透析袋中，分别在0.1M乙酸溶液中、去离子水中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；
(2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸(MW＝2000)溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液，将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液，在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中，反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，12000r/min离心6分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mLpH＝7.4的灭菌PBS溶液，涡旋震荡溶解；
(3)胶原矿化：取10mg的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，使其浓度为5mg/mL，将胶原溶液放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤(2)所得的30mL羟基磷灰石的PBS溶液中，在湿润的环境中于37℃下透析一周，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，并保证透析环境的pH值呈弱碱性，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；
(4)三维多孔框架的合成：将步骤(3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架，为确保稳定的微环境，再使用含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联20小时，采用质量百分浓度为1％的甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
其中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。
实施例2
(1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织，常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L，将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物，在粗提物中加入NaCl至浓度为2M进行盐析，低温离心分离出沉淀后再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于分子量为1000的透析袋中，分别在0.1M乙酸溶液中、去离子水中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；
(2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸(MW＝2000)溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液，将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液，在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中。反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，12000r/min离心6分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mLpH＝7.4的灭菌PBS溶液，涡旋震荡溶解；
(3)胶原矿化：取5mg的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，使其浓度为2mg/mL，将胶原溶液放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤(2)所得的30mL羟基磷灰石的PBS溶液中，在湿润的环境中于37℃下透析一周，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，并保证透析环境的pH值呈弱碱性，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；
(4)三维多孔框架的合成：将步骤(3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架，为确保稳定的微环境，再使用含有1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联20小时，采用质量百分浓度为1％的甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
其中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。
试验例1具严格等级结构的三维矿化胶原支架的性能测试
供试材料：具严格等级结构的三维矿化胶原支架(实施例1制备)
方法：
1.采用扫描电镜(SEM)观察不同胶原支架的微观形貌(图1)。将实施例1制备得到的的支架材料经梯度酒精脱水(50％－100％)，并冻干，喷金后，在15kV电压下观察。
2.采用透射电镜(TEM)观察不同胶原支架的纳米显微结构(图1)。将组装完成的胶原支架用3.7％福尔马林固定4h，梯度酒精脱水(30％－100％)，树脂包埋后切成90－110nm厚度切片，附在铜网上进行观察，从图1结果可以看出，本发明采用新的仿生法合成的HIMC不仅复制了天然骨组织的化学成分(Ca/P＝1.67)，更重要是重现了天然骨矿化胶原的等级结构即纳米板状晶体在纤维内形成的横纹结构D＝67nm。
3.原子力显微镜(AFM)测量不同矿化胶原支架的力学性能(图2，3)。采用BrukerMultiMode 8SPM在peak-force tapping模式下，以1.0Hz的扫描速率和200mV的振幅设定点定量测定支架材料的纳米机械性能，在室内常规环境和Tris-HCl缓冲液(10mMTris-HCl，50mMNaCl，pH 7.4)中分别进行测量。在室内常规环境下的测量中，采用硬度高的RTESP悬臂(弹性常数为25.89N/m)，因为硬度较高低的悬臂粘附力较大；在缓冲液进行测量时，采用中等硬度的悬臂，其弹性常数为0.975N/m；采用Derjaguin–Muller–Toporov(DMT)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量。每组选用2个样本，每个样本选择5个图，每个图中选10个点，这样每组共100个数据，并采用Kruskal-Wallis方差分析。
结果显示天然矿化胶原如天然去细胞的骨基质(DCBM)具有周期性波浪状的波峰-波谷状形貌，波峰高度为14.18±1.61nm(图2a)。HIMC也具备这样的波峰波谷的形貌，其高度图显示波峰振幅为14.35±2.55nm，与天然矿化胶原类似，而具有非等级结构的矿化胶原支架(NIMC)不具备这样的形貌，其上均匀分布的纳米羟基磷灰石晶体使得NIMC的表面相对平整，振幅高度为4.08±2.31nm。据报道，能够被干细胞感知并相互作用的材料表面最小起伏为8nm，如此一来，100％的NIMC表面都在整联蛋白的接触范围内，而对于DCBM和HIMC来说，表面形貌对于整联蛋白受体的识别会下降到62.89±3.86％和62.08±4.08％的范围。如图2b锚定密度与黏附力的关系为：
w＝48EIΔZ/L3
其中，W为负载在干细胞上的作用力，E为杨氏模量，L为锚定点的相互距离，I是转动惯量。锚定密度的减小相当于锚定距离的增加。根据公式，细胞在DCBM和HIMC上的机械回复值分别为2.35±0.40和2.04±0.41，相当接近，这个数据是NIMC的三分之一左右，因此HIMC对于促进干细胞分化有提升作用，图3所示的AFM机械性能地形图进一步显示HIMC的杨氏模量稍低于DCBM，而NIMC则与二者存在显著差异。
4.细胞增殖：用CellTiter 96Aqueous One Solution估计活细胞的数量(图4)。先建立MG 63细胞的校准曲线，以便从吸光指数估计活细胞的数量，在固定的时点，去除孔板内培养基，用PBS清洗三次，将MTS检测试剂与无血清的a-MEM培养基1：5混合后加入到不同组，在37℃孵育3h，孵育后将样本移至96孔板，用酶标仪在490nm处读出吸光度值，每组重复三次，取平均值，结果显示HIMC具有很好的生物相容性，效果与DCBM持平，而纤维外矿化的胶原(EMC)则抑制了细胞生长。
5.免疫荧光染色：测试不同矿化胶原的纳米结构对于细胞形态的影响(图5，6)。将鼠骨髓间质干细胞(rBMSCs)接种在不同基底上接触24h，用含3.7％甲醛的PBS溶液固定10分钟，之后用2mg/L的鬼笔环肽染色45分钟，在用去离子水洗涤数次后，在光镜下观察，细胞形状是模拟干细胞分化的细胞内反应，为观察细胞形态，用鬼笔环肽为细胞支架进行染色，结果如图5显示，附着在添加DCBM的rBMSCs和HIMC材料上的细胞均具有许多应力纤维横贯细胞，而NIMC材料上的细胞只具备轴向应力纤维分布在细胞两极的边缘位置。细胞形状可随附着材料表面纳米形貌改变：在具有等级性纳米结构表面细胞呈现高度分支的、延展性形态；而在不具备等级性纳米结构表面的细胞展现出非延展性的极性形态。应力纤维的形成及分支化的延展形态提供了更多的细胞与细胞间的接触面积，从而提高细胞分化能力。
为测试不同矿化胶原的成骨和成血管功能，将rBMSCs接种在不同基底上接触7天，用含3.7％甲醛的PBS溶液固定10分钟。细胞和组织切片与第一抗体如Runx2(ab23981，Abcam公司)、VEGF(ab1316，Abcam公司)和CD 31(ab32457，Abcam公司)按1:100的比例稀释后于室温下共同培育90分钟，第二抗体用Alexa Fluor 488(1:200；Thermo Fisher公司)或Alexa Fluor 568(1:200；Thermo Fisher公司)进行标记，在室温下培养1小时使之与第一抗体结合，在PBS洗涤三次后，将细胞和组织切片用含有细胞核染色剂DAPI的固定剂封固，并用蔡司公司LSM-710型扫描显微镜进行观察，附着在添加DCBM的rBMSCs和HIMC材料上的细胞通过正调节mRNA基因表达水平和runt相关转录因子2(Runx2，造骨新生和骨形成中的一种早期转录因子)的正染色实验，在没有成骨细胞的作用下HIMC展示了高度的成骨分化能力，作为修复骨缺损的有效手段，骨移植物应当促进细胞的成骨分化并同时诱导血管化形成，通过mRNA的表达水平和免疫荧光检测法对血管内皮生长因子(VEGF，一种有效的血管生成因子)进行染色实验，来判断具有不同纳米结构矿化胶原的成血管化能力，如图6所示，VEGF的表达在DCBM和HIMC组都很高，而在NIMC组则很低，BMSCs作为一种多相细胞群能够分化为不同的组织，如骨、软骨、脂肪组织、及提供造血功能的网状基质，细胞自身即可产生Runx2和VEGF，因此可以调控骨再生和血管化。结果表明，HIMC可放大干细胞扩增及多级分化潜力。
以上结果表明，本发明的这种具严格等级结构的骨样矿化胶原，具有合成简单，成本低，塑形方便，免疫原性低，机械性能及生物相容性良好等特点，在干湿状态下的机械性能(图2、3)及生物相容性(细胞增殖，分化，成骨能力(图4、5、6))均优于NIMC，而且，这种新的具严格等级结构的矿化胶原的机械性能与骨组织类似。
试验例2小鼠颌骨缺损修复的实施方案
1.建立动物模型(图7)：为测试具有不同纳米结构胶原支架的骨再生功能，在Sprague-Dawley(SD)大鼠的下颌骨部位建立了5mm直径的临界尺寸骨缺损模型。将20只六周大的雄性SD大鼠随机分为四组，其中三组分别植入天然去细胞的骨基质(DCBM)、具严格等级结构的三维矿化胶原支架(HIMC)和非等级三维矿化胶原支架(NIMC)材料，最后一组为阴性对照组，不植入任何材料。SD大鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒铺巾；于颈部至颌下L形切口，分离肌层，暴露下颌骨骨面；使用种植机(W&H)1200转/min配合环形骨钻(外径4.8mm)于下颌升支磨除全层骨组织(图7)，无菌生理盐水冷却，压迫止血；分别取DCBM、HIMC、NIMC胶原支架材料，修剪边缘使之适合缺损大小，植入缺损部位，用6-0型手术缝合线分层缝合肌肉，皮肤。
2.Micro-CT扫描(图8)：术后12周后，用过量的戊巴比妥(100mg/kg)使SD大鼠进入深度麻醉中实施安乐死，分离出SD大鼠的下颌骨并用含有10％福尔马林的PBS固定，利用Inveon型显微CT(SIEMENS，USA)扫描缺损区域(电压80V，电流500uA，分辨率为18.4um)获得大鼠下颌骨的连续图像，使用Acquisition Workplace与Inveon Research Workplace软件进行重建与数据分析，计算缺损区骨体积，每个样品重复测三次，使用SPSS对数据进行方差分析。
干细胞与材料间界面是动态的，干细胞和生物材料间通过“平等交换”实现干细胞固有的调节作用。生物材料可以通过表面纳米形貌来调节干细胞的形状、黏附和分化，HIMC通过模拟体内细胞支撑位(如细胞外基质)的结构及机械性能，使得基质细胞能够召集更多宿主细胞用以骨再生。在不加任何生物制剂如成骨因子或重组蛋白的情况下，单独利用三维多孔胶原支架材料对SD大鼠的下颌骨部位进行5mm临界尺寸骨缺损的修复实验，自体移植骨作为修复骨缺损的金标准，使用孔隙率为92.12±1.86％的DCBM为修复物用来作为阳性对照实验。结果显示HIMC组在移植手术12周后，SD大鼠下颌骨部位的缺损部位几乎完全被纤维状骨结构长满，包括缺损的中心部位，这个结果与DCBM组类似，HIMC组新骨再生的体量为25.5±3.4mm3，仅略微少于负载了BMSCs的HIMC(31.6±3.4mm3)，而NIMC组只有有限的新骨形成并限制在缺损边缘位置，而在未经处理的阴性对照组，则完全无新骨的形成。
3.缺损区的组织化学染色检查(图9，10)：将SD大鼠下颌骨放入含有10％EDTA的蔗糖溶液中进行脱钙8周，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，因组织切片机切片，厚度5μm，二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色，封片，显微镜下观察缺损区骨组织的微观结构。DCBM组和HIMC组处理的缺陷区均大量新骨和骨髓生成，而在NIMC组只有少量新骨形成，且完全没有血管和骨髓的生成，用TRAP(Sigma-Aldrich)对切片进行染色以观察破骨细胞是否存在于修复区骨组织中。结果如图7-9所示，图7为未矿化胶原(Col)组缺损区组织切片染色结果，可见材料基本降解完全，新生骨主要位于缺损边缘，中心区仅有少量成骨，下颌骨缺损区的微观结构可通过HE染色和Masson染色来观察。结果如图9显示，HIMC组的新生下颌骨组织的微结构与天然骨组织类似。
NIMC组缺损区组织切片染色结果显示，材料基本降解完全，新生骨主要位于缺损边缘，中心区仅有少量成骨。组缺损区组织切片Masson染色结果显示，有部分未降解支架材料存在，支架间隙被细胞及新生血管充满；局部可见新生骨岛，表面排列着立方状的成骨细胞以及多核破骨细胞，其内部的纤维与骨细胞的排列趋势呈同心圆状，类似环形骨单位；组织中还出现类似骨髓腔的结构，其中含有成骨细胞、间充质细胞、淋巴细胞和大量毛细血管与红细胞。
以上结果表明，本发明的三维矿化胶原支架可用于硬组织如颅骨，颌骨，长骨等缺损的修复，由于其微观结构与天然骨组织类似，此材料不仅可以作为良好的支架材料，而且可以直接作为骨替代材料用于骨组织修复。
4.免疫组织化学染色(图11)：将脱钙并水化的组织切片置于两步检毒箱(中山金桥生物科技有限公司，北京)中实施免疫组织化学染色。每组中选取6个组织切片进行抗原修复处理，用0.125％胰蛋白酶和20μg/mL蛋白酶K与5％牛血清蛋白共同孵育过夜，并加入Osx(1:800；ab22552，Abcam)和VEGFR-1(1:400；ab51872，Abcam)抗体进行共孵育，随后用辣根过氧化酶交联的次级抗体进行孵化，以二氨基联苯胺为发色团，着色切片用蔡司光学显微镜进行观察。
5.统计分析：所有细胞和动物实验的数据均以平均标准偏差(±)的形式表示，以单向方差分析法由Tukey事后检验分析确定α＝0.05。
骨缺损修复是一种动态的祖细胞引导的组织形态过程，需要协调修复部位骨形成和血管化。为探索成骨细胞自分泌和旁分泌因子的互相作用，对骨母细胞和内皮细胞相关因子进行染色以评估材料的成骨和血管化效果；Runx2免疫荧光染色实验表明DCBM组和HIMC组较之NIMC组在修复区有更强的强度；Osx转录因子标记着软骨和骨膜开始成骨分化；从免疫组织化学染色结果得出DCBM组和HIMC组的Osx转录因子正染色结果明显优于NIMC组；骨再生过程中Runx2和Osx表达的增加都反映了HIMC材料的骨诱导性能，并激活了更多的骨形成细胞；可植入性骨组织修复材料的血管化能力也标记着功能性骨组织的成功再生；通过对CD31(血小板内皮细胞粘附分子-1)的免疫荧光染色和VEGFR-1(血管化中内皮细胞产生的高亲和受体VEGF)的免疫组织化学染色实验来表明修复区新生骨组织的血管化程度；实验结果表明在DCBM组和HIMC组均有血管内皮细胞的产生。发明人发现HIMC具有增强血管化的能力从而促进骨缺损区的新骨再生，其效果堪比自体移植骨；早期研究发现组织和器官在遭受病理学创伤后，BMSCs可以从远端的骨髓迁移到创伤处通过分化为特定的细胞类型来修复组织；发明人发现HIMC材料可以招募宿主BMSCs至缺损位并促进成骨分化，新生骨区域具有内部骨髓外部骨的双组成结构，与天然颌骨类似。
试验例3小型猪颅骨缺损修复的实施方案
1.建立动物模型(图12)：为测试具有不同纳米结构胶原支架的骨再生功能，在实验用小型猪的颅骨部位建立了临界尺寸骨缺损模型。9只22个月大的雄性实验用贵州小香猪，平均体重为54.1kg，随机分为三组，单独饲养这些小型猪，喂给食物和水，在术前禁食大于12小时，用6mg/kg氯胺酮和0.6mg/kg甲苯噻嗪进行麻醉，在每只小型猪的颅骨位置制造两个2cm宽×3cm长×0.5cm高的骨缺损区域，这18组骨缺损被随机分为两组，分别为实验组和对照组，其中不植入任何材料的为阴性对照组，数量为N＝6，加入羟基磷灰石(HA，有限公司东博生物科技)组为对照组，数量为N＝6，加入HIMC为实验组，数量为N＝6，移植手术12周后，对所有小型猪实施安乐死，并取出颅骨去除软组织后用含有10％福尔马林的PBS保存。
2.Micro-CT扫描(图13)：利用Inveon型显微CT(SIEMENS，USA)扫描缺损区域(电压80kV，电流500mA，分辨率为18.4um)获得小型猪颅骨的连续图像。使用AcquisitionWorkplace与Inveon Research Workplace软件进行重建与数据分析，计算缺损区骨体积与组织体积比(BV/TV)，及骨密度(BMD)每个样品重复测三次，设置灰度值为400～1200之间以消除骨体积上残余胶原支架的影响，并得到准确的BV/TV值，通过软件对HIMC组及HA组的缺损深度进行测量，统计结果显示HIMC组术后的缺损深度(4.46±1.48mm)有明显的减少；HA组支架材料占据缺损的主要区域，缺损深度(7.44±1.99mm)明显大于HIMC组缺损。通过Micro-CT对缺损区域新生骨量进行半定量测量并统计，测量结果显示阴性对照组(21.1±4.4％)成骨量最少，HIMC组(45.2±17.7％)的新生骨量要高于HA组(29.3±7.7％)新生骨量，差异有统计学意义(P＜0.05)，表明12周后，HIMC组缺损区域已大部分修复，明显优于HA组。
3.缺损区的组织化学染色检查(图14)：将小型猪颅骨放入含有10％EDTA的蔗糖溶液中进行脱钙8周，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，因组织切片机切片，厚度5μm。二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红(HE)染色和Masson三色染色，封片，显微镜下观察，用形态计量学手段，用残余支架面积除以缺陷区面积计算残余支架材料的百分数，在Masson三色染色后，可观察到蓝色为再生骨区、胶原纤维或类骨质，红色为成熟骨。在HIMC组中缺损的中央区域有明显的新生骨及血管形成，同时没有明显的支架材料残留，并且在组织结构方面与天然骨相似；在HA组中可以观察到部分新生骨形成，但是结构混乱，新生骨之间连接较少，并且残留的支架材料占据了缺损的大部分空间，新生的血管组织不明显；在对照组中，新生骨主要出现在缺损的边缘，且新生骨量较少，缺损中央区域被软组织占据(由于样本体积较大，软组织已在样本处理时被去除)，新生骨结构与HIMC组相似。
4.免疫组织化学染色：将脱钙并水化的组织切片置于两步检毒箱(中山金桥生物科技有限公司，北京)中实施免疫组织化学染色。每组中选取6个组织切片进行抗原修复处理，用0.125％胰蛋白酶和20μg/mL蛋白酶K与5％牛血清蛋白共同孵育过夜，并加入Runx2(1:300；orb10256，Biorbyt)、Osx(1:300；PA5-40509，Thermofisher Scientific)和转录生长因子TGF-β(1:200；LS-C10852，LSBio)抗体进行共孵育。随后用辣根过氧化酶交联的次级抗体进行孵化，以二氨基联苯胺为发色团，着色切片用蔡司光学显微镜进行观察。
5.统计分析：所有细胞和动物实验的数据均以平均标准偏差(±)的形式表示，以单向方差分析法由Tukey事后检验分析确定α＝0.05。
如图14所示，由HIMC填充的缺陷区在术后12周后长满了新的胶原纤维和具有骨细胞和血管的完全正常的骨结构。
在大鼠及小型猪的骨修复模型中，HIMC组均显示有骨结构和圆形或方形骨母细胞的产生。这证明等级错列的纳米结构有助于骨髓形成和胶原支架上骨原细胞的转移。酸性磷酸酶(TRAP)实验验证修复区域是否有类破骨细胞的产生。在DCBM组和HIMC组均有阳性TRAP信号。TRAP阳性的类破骨细胞及骨母细胞的共存意味着骨修复区的重塑。
综合试验例1～3可得出，本发明所提出的三维矿化胶原支架可用于硬组织如颅骨，颌骨，长骨等缺损的修复；在没有任何生物制剂负载的情况下，HIMC为细胞分化提供了有利的微环境，诱导宿主细胞实现体内骨再生，功能类似于骨髓腔的原生骨器官；该制备HIMC的方法简便、快捷，植入该材料进行骨再生还可避免与细胞移植和生长因子相关的障碍；由于其微观结构与天然骨组织类似，此材料不仅可以作为良好的支架材料，而且可以直接作为骨替代材料用于骨组织修复。
以上的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。

Claims (9)

1.一种三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)I型胶原的提取：称取1kg的牛肌腱用碎肉机切碎并清洗过后，加入大量的丙酮浸泡1天去除表面脂肪组织；常温干燥后加入2L的0.5M的乙酸溶液在4℃下搅拌1天，向体系中加入100g的胃蛋白酶继续搅拌2天并不断补充新的乙酸溶液直至总体积为5L；将混合物用纱布粗滤，得到的滤液为胶原粗提物；在粗提物中加入NaCl进行盐析，分离出沉淀再用0.5M的乙酸溶液溶解，反复三次后将所得溶液置于透析袋中进行透析，最后冷冻干燥得到高纯I型胶原；
2)纳米羟基磷灰石的制备：将66mg的CaCl2·2H2O及25mg的聚丙烯酸溶于50mL的TBS缓冲液中得到A液；将48mg的K2HPO4·3H2O加入到50mL的TBS缓冲液中得到B液；在40℃水浴中将A液逐滴滴加到B液中；反应完成后在该混合液中加入大量无水乙醇，8000～12000r/min离心5～10分钟，去掉上清液，在羟基磷灰石沉淀中加入50mL的灭菌PBS溶液，使其pH＝7.4，震荡使其完全溶解；
3)胶原矿化：取一定量的I型胶原溶于0.5M的乙酸溶液中，并放入截留分子量为10000的透析袋中，并将透析袋置于步骤2)所得的羟基磷灰石的PBS溶液中；在湿润的环境中于37℃下透析六天，每三天换一次羟基磷灰石的PBS溶液，随后在去离子水中透析三天进行清洗去掉多余的盐，每天换一次水；
4)三维多孔框架的合成：将步骤3)得到的矿化胶原离心、搅拌形成一种可铸形的悬浮液，注入到圆柱形或长方形的模具中冷冻干燥得到三维海绵状的胶原支架；为确保稳定的微环境，再使用重量比1％的1-乙基(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺盐酸盐在80％的乙醇中进一步交联4小时，随后用甘氨酸溶液与去离子水交替冲洗，冻干，即得到具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
2.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤1)中，胶原来源为动物的皮及肌腱组织。
3.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，根据中间体自由能的计算得出聚丙烯酸的分子量区间在1720～2265之间，浓度在0.1～100mg/mL之间。
4.根据权利要求3所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，A液的CaCl2浓度为1～100mM，聚丙烯酸的质量浓度为0.1～100mg/mL；B液的K2HPO4浓度为1～100mM；A液与B液的体积比为1：10～10：1。
5.根据权利要求4所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤2)中，TBS缓冲液的配制方法为：2.42g的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和8g的NaCl溶于1L的去离子水中，最后用HCl调节溶液pH为7.4。
6.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤3)中，所述的I型胶原的浓度为0.1～10mg/mL，透析环境中羟基磷灰石的质量为0.1～100mg。
7.根据权利要求1所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法，其特征在于，在步骤4)中，所述的EDC溶液的配置方法为：将1g的EDC加入到99mL80％乙醇中，使其质量百分数为1％，甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。
8.如权利要求1-7任一项所述的三维矿化胶原支架材料的制备方法得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。
9.如权利要求8所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。
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