CN103536965A - 具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法、及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法、及其产品和应用。本发明的一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架不仅复制了天然骨组织的化学成分(Ca/P=1.67)，更重要是重现了天然骨矿化胶原的等级结构即纳米板状晶体在纤维内形成的周期性横纹结构（D=67nm）。这种新的具严格等级结构的矿化胶原支架在干湿状态下的机械性能及生物相容性（细胞增殖，分化，成骨能力）均优于传统矿化胶原。而且，这种新的具严格等级结构的矿化胶原支架的机械性能（13.7±2.6GPa）与骨组织类似。因此本发明所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料领域将具有广泛的应用前景。

Description

具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法、及其产品和应用

技术领域

本发明涉及一种矿化胶原支架的制备方法，特别涉及一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法、及其产品和在制备骨组织修复材料中的应用。属于骨组织修复与治疗领域。

背景技术

骨组织是自然界中一种具严格等级结构，多功能矿化组织。在生命过程中，它不断地改建来适应外界机械应力，维持离子平衡并修复缺损。骨缺损的再生与修复一直是医学研究的重要课题。自体骨移植一直被认为骨缺损治疗的金标准。但由于来源有限及取材部位需二次手续而受到质疑。近年来，组织工程通过模拟天然骨组织的化学成分，物理性能及显微结构特点来解决这一难题。矿化胶原作为骨组织最基本的等级结构，被认为是最理想的骨再生修复材料。而传统方式合成的矿化胶原仅仅只实现了和骨组织一致的化学成分，并未复制其等级结构。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的缺点和不足提供一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法、及由该方法获得的产品和在制备骨组织修复材料中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明的一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）胶原磷酸化：将盛有3－4mg/ml鼠尾I型原胶原溶液的透析袋，浸泡于质量百分含量为1.25－2.5％的三聚磷酸钠溶液中5－10min，使胶原磷酸化；

（2）无定型磷酸钙（ACP）的制备：将0.5g－1g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于30－40ml含0.5－1mg/ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应1－2d，得到含有大小为45-50nm的纳米无定型磷酸钙的溶液；

（3）胶原的纤维化及再矿化：将步骤（1）得到的磷酸化的胶原置于步骤（2）得到的含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例为0.5-1mg：1ml，5－7d后，磷酸化的胶原将诱导纳米无定型磷酸钙在胶原纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原；

（4）三维矿化胶原支架的合成：将步骤（3）得到的矿化胶原于0.1M磷酸缓冲液中透析30min，之后置于4℃，3000－5000g离心5－10min，去掉上清液，向沉淀中加入适量的0.1M磷酸缓冲液，充分混匀后制备成悬浊液，倒入24孔板，于-25～-40℃冷冻24－48h，并冻干形成三维的疏松的多孔矿化胶原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联4－24h，采用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

在本发明中，优选的，步骤（2）中所述的人工模拟体液，其溶质组成如下：136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，3.0mM KCl，1.0mM K₂HPO₄·3H₂O，1.5mMMgCl₂·6H₂O，2.5mM CaCl₂，0.5mM Na₂SO₄以及3.08mM Na₃N，溶剂为水，用HCl和NaOH溶液调节pH=7.0。

在本发明中，优选的，步骤（4）中向沉淀中加入的0.1M磷酸缓冲液的体积为沉淀体积的1/20－1/10。

在本发明中，优选的，步骤（4）中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。

在本发明中，优选的，步骤（4）中所述的甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。

本发明中，将0.5g－1g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于30－40ml含0.5－1mg/ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应1－2d，I型白色硅酸盐水门汀在人工模拟体液中将逐渐释放Ca²⁺和OH-，使溶液的pH升高至9.5－10，Ca²⁺与PO₄ ^3-结合形成ACP，带负电的聚丙烯酸将吸附在ACP表面，从而控制ACP的大小约45－50nm（纳米ACP）；

在本发明中，本发明将磷酸化的胶原置于含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例约为0.5-1mg：1ml，溶液中k＋及碱性pH值能够促进胶原的纤维化，形成白色絮状纤维，同时纳米ACP进入纤维内的间隙区域，约5－7d后，磷酸化的胶原将诱导纳米ACP在纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原。

进一步的，本发明还提出了由以上所述的方法制备得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。及

所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。

相较于传统矿化胶原，本发明具有以下优点：

1、本发明通过这种新的仿生法合成的矿化胶原（IMC）不仅复制了天然骨组织的化学成分（Ca/P=1.67），更重要是重现了天然骨矿化胶原的等级结构即纳米板状晶体在纤维内形成的横纹结构（D=67nm）（图1）。

2、这种新的具严格等级结构的矿化胶在干湿状态下的机械性能（图2）及生物相容性（细胞增殖，分化，成骨能力（图3、4））均优于传统矿化胶原（EMC）。而且，这种新的具严格等级结构的矿化胶原的机械性能（13.7±2.6GPa）与骨组织类似。

附图说明

图1为扫描（SEM）和透射电镜（TEM）分别观察不同胶原支架的显微结构；

未矿化胶原（Col）负染可见D周期性横纹；IMC中纳米晶体沿胶原内D周期排列（箭头所示）；EMC晶体无规则排列在胶原表面（箭头所示），负染可见胶原呈D周期性横纹；

图2为干、湿状态下矿化胶原的纳米机械性能；

对干燥组，柱条上不同的大写字母表示组间存在显著性差异（P<0.05）；对湿润组，柱条上相同的小写字母表示组间无显著性差异（P>0.05）；对不同矿化组，相邻柱条上方的黑色线条表示组间存在显著性差异（P<0.05）；

图3为MTS检测MG63细胞的增殖（A）以及ALP活性（B）；

数据均采用均值±标准差表示，采用单因素方差分析数据间的差异；*：与第1天比p<0.05；#：与第3天比p<0.05。

图4为茜素红染色检测MG63在不同支架上的成骨能力；

图5为动物骨损伤模型的建立：

图6为6w后micro-CT新生骨量的比较:

对照组=1.3±0.4mm³，未矿化胶原（Col）=10.2±1.8mm³，EMC=17.7±4.3mm³，IMC=23.9±5.6mm³组间存在明显的差异；6w后，IMC组缺损区域已大部分修复，明显优于EMC组。拟12w后继续扫CT；

图7为未矿化胶原（Col）组缺损区组织切片染色结果；

A：HE染色，B-D：Masson染色；

图8为EMC组缺损区组织切片染色结果；

A：HE染色，B-D：Masson染色；

图9为IMC组缺损区组织切片Masson染色结果。

A：可见部分未降解支架材料，支架间隙被细胞及新生血管充满，B，C：局部可见新生骨岛，表面排列着立方状的成骨细胞以及多核破骨细胞，其内部的纤维与骨细胞的排列趋势呈同心圆状，类似环形骨单位；D：组织中还出现类似骨髓腔的结构，其中含有成骨细胞、间充质细胞、淋巴细胞和大量毛细血管与红细胞（箭头所示）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

材料及其购买来源：

鼠尾I型原胶原溶液（BD Bio-sciences）

透析膜（3500Da，Invitrogen，Paisly，UK）

甘氨酸（Sigma-Aldrich，USA）

I型白色硅酸盐水门汀(Lehigh Cement Co.，Allentown，PA，USA)

磷酸缓冲液（Gibco，Invitrogen，Paisly，UK）

聚丙烯酸（Sigma-Aldrich，USA）

三聚磷酸钠（Sigma-Aldrich，USA）

人工模拟体液按照以下配方制备：溶质组成如下：136.8mM NaCl，4.2mMNaHCO₃，3.0mM KCl，1.0mM K₂HPO₄·3H₂O，1.5mM MgCl₂·6H₂O，2.5mM CaCl₂，0.5mM Na₂SO₄以及3.08mM Na₃N，溶剂为水，用HCl和NaOH溶液调节pH=7.0。

实施例1具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备

（1）胶原磷酸化：将盛有3mg／ml鼠尾I型原胶原溶液的透析袋，浸泡于质量百分含量为1.25％的三聚磷酸钠溶液中5min，使胶原磷酸化；

（2）无定型磷酸钙（ACP）的制备：将0.5g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于30ml含0.5mg／ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应1d，得到含有大小为45-50nm的纳米无定型磷酸钙的溶液；

（3）胶原的纤维化及再矿化：将步骤（1）得到的磷酸化的胶原置于步骤（2）得到的含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例为1mg：1ml，5d后，磷酸化的胶原将诱导纳米无定型磷酸钙在胶原纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原；

（4）三维矿化胶原支架的合成：将步骤（3）得到的矿化胶原于0.1M磷酸缓冲液中透析30min，之后置于4℃，3000g离心10min，去掉上清液，向沉淀中加入1/20沉淀体积的0.1M磷酸缓冲液，充分混匀后制备成悬浊液，倒入24孔板，于-25℃冷冻48h，并冻干形成三维的疏松的多孔矿化胶原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联24h，采用质量百分浓度为1％的甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

其中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。

实施例2具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备

（1）胶原磷酸化：将盛有4mg／ml鼠尾I型原胶原溶液的透析袋，浸泡于质量百分含量为2.5％的三聚磷酸钠溶液中10min，使胶原磷酸化；

（2）无定型磷酸钙（ACP）的制备：将1g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于40ml含1mg／ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应2d，得到含有大小为45-50nm的纳米无定型磷酸钙的溶液；

（3）胶原的纤维化及再矿化：将步骤（1）得到的磷酸化的胶原置于步骤（2）得到的含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例为0.5mg：1ml，7d后，磷酸化的胶原将诱导纳米无定型磷酸钙在胶原纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原；

（4）三维矿化胶原支架的合成：将步骤（3）得到的矿化胶原于0.1M磷酸缓冲液中透析30min，之后置于4℃，5000g离心5min，去掉上清液，向沉淀中加入1/15倍沉淀体积的0.1M磷酸缓冲液，充分混匀后制备成悬浊液，倒入24孔板，于-40℃冷冻24h，并冻干形成三维的疏松的多孔矿化胶原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联20h，采用质量百分浓度为1％的甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

其中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。

实施例3具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备

（1）胶原磷酸化：将盛有3.5mg／ml鼠尾I型原胶原溶液的透析袋，浸泡于质量百分含量为2％的三聚磷酸钠溶液中10min，使胶原磷酸化；

（2）无定型磷酸钙（ACP）的制备：将1g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于30-40ml含1mg／ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应36h，得到含有大小为45-50nm的纳米无定型磷酸钙的溶液；

（3）胶原的纤维化及再矿化：将步骤（1）得到的磷酸化的胶原置于步骤（2）得到的含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例为1mg：1ml，6d后，磷酸化的胶原将诱导纳米无定型磷酸钙在纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原；

（4）三维矿化胶原支架的合成：将步骤（3）得到的矿化胶原于0.1M磷酸缓冲液中透析30min，之后置于4℃，4000g离心8min，去掉上清液，向沉淀中加入1/10倍沉淀体积的0.1M磷酸缓冲液，充分混匀后制备成悬浊液，倒入24孔板，于-30℃冷冻36h，并冻干形成三维的疏松的多孔矿化胶原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联16h，采用质量百分浓度为1％的甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

其中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。

试验例1本发明的具严格等级结构的三维矿化胶原支架的性能测试

供试材料：具严格等级结构的三维矿化胶原支架（实施例3制备）

方法：

1.采用扫描电镜（SEM）观察不同胶原支架的微观形貌（图1）。将实施例3制备得到的的支架材料经梯度酒精脱水（50％－100％），并冻干。喷金后，在15kV电压下观察。

2.采用透射电镜（TEM）观察不同胶原支架的纳米显微结构（图1）。将组装完成的胶原支架用3.7％福尔马林固定4h，梯度酒精脱水（30％－100％），树脂包埋后切成90－110nm厚度切片，附在铜网上进行观察。未矿化的胶原（Col）用1％磷钨酸负染后观察。

从图1结果可以看出，本发明采用新的仿生法合成的矿化胶原（IMC）不仅复制了天然骨组织的化学成分(Ca/P=1.67)，更重要是重现了天然骨矿化胶原的等级结构即纳米板状晶体在纤维内形成的横纹结构D=67nm。

3.原子力显微镜测量不同矿化胶原支架的力学性能（图2）。采用BrukerMultiMode8SPM在peak-force tapping模式下，以1.0Hz的扫描速率和200mV的振幅设定点定量测定支架材料的纳米机械性能。在室内常规环境和Tris-HCl缓冲液（10mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4）中分别进行测量。在室内常规环境下的测量中，采用硬度高的RTESP悬臂（弹性常数为25.89N/m），因为硬度较高低的悬臂粘附力较大。在缓冲液进行测量时，我们采用中等硬度的悬臂，其弹性常数为0.975N/m。采用Derjaguin–Muller–Toporov(DMT)模型拟合力对分离图的收缩曲线，来计算杨氏模量。每组选用2个样本，每个样本选择5个图，每个图中选10个点，这样每组共100个数据，并采用Kruskal-Wallis方差分析。

4.细胞增殖：用CellTiter96Aqueous One Solution估计活细胞的数量（图3A）。先建立MG63细胞的校准曲线，以便从吸光指数估计活细胞的数量。在固定的时点，去除孔板内培养基，用PBS清洗三次，将MTS检测试剂与无血清的a-MEM培养基1：5混合后加入到不同组，在37℃孵育3h。孵育后将样本移至96孔板。用酶标仪在490nm处读出吸光度值，每组重复三次，取平均值。

5.碱性磷酸酶活性测定（ALP）（图3B）：在细胞培养24h后，向完整培养基中添加10^-7M地塞米松、10mMβ-磷酸甘油和0.05mM2-磷酸抗坏血酸。在固定时点采用ELISA需要的碱性磷酸酶底物，在37℃孵育30分钟后，通过在每孔加入100μL的3N NaOH终止反应。用酶标仪在490nm处读出吸光度值，每组重复三次，取平均值。

6.通过茜素红染色分析MG63细胞在不同矿化胶原的成骨能力（图4）。用PBS洗涤三次，并用4%甲醛固定细胞10min。固定后的样本再用去离子水洗涤三次，并用2%的茜素红在室温下染色。在用去离子水洗涤数次后，在光镜下观察。

以上结果表明，本发明的这种具严格等级结构的骨样矿化胶原，具有合成简单，成本低，塑形方便，免疫原性低，机械性能及生物相容性良好等特点，在干湿状态下的机械性能（图2）及生物相容性（细胞增殖，分化，成骨能力（图3、4））均优于传统矿化胶原（EMC）。而且，这种新的具严格等级结构的矿化胶原的机械性能（13.7±2.6GPa）与骨组织类似。

试验例2颌骨缺损修复的实施方案

供试材料：具严格等级结构的三维矿化胶原支架（实施例3制备）

方法：

1.按照缺损区域大小修剪材料，使材料面积略大于缺损区。

2.消毒：环氧乙烷

3.取SD大鼠颌骨骨髓干细胞接种在材料上，或者取SD大鼠新鲜血液直接与材料混合。

4.动物模型建立：200-300g SD大鼠，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剪毛，固定，消毒铺巾；于颈部至颌下L形切口，分离肌层，暴露下颌骨骨面；使用种植机（W&H）1200转/min配合环形骨钻（外径4.8mm）于下颌升支磨除全层骨组织（图5），无菌生理盐水冷却，压迫止血；取已接种细胞的支架材料，修剪边缘使之适合缺损大小，植入缺损部位，分层缝合肌肉，皮肤（图5）。

5、Micro-CT扫描：6周（w）后，将一半样本处死，固定，并用Inveon MMCT(SIEMENS，USA)扫描缺损区域（电压80V，电流500uA，分辨率为18.4um），使用Acquisition Workplace与Inveon Research Workplace软件进行重建与数据分析，计算缺损区骨体积，每个样品重复测三次。使用SPSS对数据进行方差分析，图6为6w后micro-CT新生骨量的比较，对照组=1.3±0.4mm³，未矿化胶原组（Col）=10.2±1.8mm³，EMC=17.7±4.3mm³，IMC=23.9±5.6mm³组间存在明显的差异。表明6w后，IMC组缺损区域已大部分修复，明显优于EMC组。拟12w后继续扫Micro-CT。

6、缺损区的组织学检查：分别取修复6w后的未矿化胶原组（Col）、EMC组以及IMC组的缺损区组织，于含蔗糖的EDTA脱钙液中脱钙3-4w；梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，因组织切片机切片，厚度5um。二甲苯-酒精脱蜡至水，苏木精-伊红（HE）染色或Masson染色，封片，显微镜下观察，结果如图7-9所示。

图7为未矿化胶原（Col）组缺损区组织切片染色结果，可见材料基本降解完全，新生骨主要位于缺损边缘，中心区仅有少量成骨。

图8为EMC组缺损区组织切片染色结果，可见材料基本降解完全，新生骨主要位于缺损边缘，中心区仅有少量成骨。

图9为IMC组缺损区组织切片Masson染色结果，可见部分未降解支架材料，支架间隙被细胞及新生血管充满（图9A）；局部可见新生骨岛，表面排列着立方状的成骨细胞以及多核破骨细胞，其内部的纤维与骨细胞的排列趋势呈同心圆状，类似环形骨单位（图9B、9C）；组织中还出现类似骨髓腔的结构，其中含有成骨细胞、间充质细胞、淋巴细胞和大量毛细血管与红细胞（图9D，箭头所示）。

以上结果表明，本发明的三维矿化胶原支架可用于硬组织如颅骨，颌骨，长骨等缺损的修复。由于其微观结构与天然骨组织类似，此材料不仅可以作为良好的支架材料，而且可以直接作为骨替代材料用于骨组织修复。

Claims (7)

1.一种具严格等级结构的三维矿化胶原支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）胶原磷酸化：将盛有3－4mg/ml鼠尾I型原胶原溶液的透析袋，浸泡于质量百分含量为1.25－2.5％的三聚磷酸钠溶液中5－10min，使胶原磷酸化；

（2）无定型磷酸钙（ACP）的制备：将0.5g－1g I型白色硅酸盐水门汀浸泡于30－40ml含0.5－1mg/ml聚丙烯酸的人工模拟体液中，于37℃反应1－2d，得到含有大小为45-50nm的纳米无定型磷酸钙的溶液；

（3）胶原的纤维化及再矿化：将步骤（1）得到的磷酸化的胶原置于步骤（2）得到的含ACP的溶液中，胶原质量与溶液体积比例为0.5-1mg：1ml，5－7d后，磷酸化的胶原将诱导纳米无定型磷酸钙在胶原纤维内的有序排列与成核，形成具严格等级结构的矿化胶原；

（4）三维矿化胶原支架的合成：将步骤（3）得到的矿化胶原于0.1M磷酸缓冲液中透析30min，之后置于4℃，3000－5000g离心5－10min，去掉上清液，向沉淀中加入适量的0.1M磷酸缓冲液，充分混匀后制备成悬浊液，倒入24孔板，于-25～-40℃冷冻24－48h，并冻干形成三维的疏松的多孔矿化胶原支架；再使用含有1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺及N-羟基丁二酰亚胺的混合液交联4－24h，采用甘氨酸溶液与双蒸水交替冲洗，冻干，即得到孔径为80－300μm的，具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中所述的人工模拟体液，其溶质组成如下：136.8mM NaCl，4.2mM NaHCO₃，3.0mM KCl，1.0mMK₂HPO₄·3H₂O，1.5mM MgCl₂·6H₂O，2.5mM CaCl₂，0.5mM Na₂SO₄以及3.08mMNa₃N，溶剂为水，用HCl和NaOH溶液调节pH=7.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中向沉淀中加入的0.1M磷酸缓冲液的体积为沉淀体积的1/20－1/10。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中，所述的混合液按照以下方法制备得到：使用摩尔浓度为0.3mol/L的1-（3-二甲基氨基丙基）-3-乙基碳化二亚胺溶液及摩尔浓度为0.06mol/L的N-羟基丁二酰亚胺溶液按照体积比＝1：1配制。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述的甘氨酸溶液的质量百分浓度为1％。

6.由权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的具严格等级结构的三维矿化胶原支架。

7.权利要求6所述的具严格等级结构的三维矿化胶原支架在制备骨组织修复材料中的应用。

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