CN104288839A - 双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法及其应用。所涉及的制备方法是将纤维内钙与硅杂化仿生骨支架浸入合适浓度的趋化因子和成骨诱导蛋白混合溶液中，在适宜条件下处理后得双因子携载型杂化仿生骨支架。所涉及的应用为上述支架材料作为骨缺损修复材料的应用。本发明中杂化骨胶原内部还有二氧化硅和羟基磷灰石两种矿物质，其中二氧化硅表面存在的大量带有负电荷的硅醇基团及活性羟基对碱性蛋白如SDF-1或TGF-β的有效结合，及纳米羟基磷灰石对成骨诱导蛋白如BMP-2或BMP-7的特异强吸附性，使得无需添加额外的缓释系统而实现了杂化骨细胞募集性/成骨诱导性的双重功能化修饰。
Description
技术领域
本发明属于组织工程支架材料领域，涉及一种构建新型具有诱导骨原位再生能力的纤维内钙/硅杂化仿生骨支架的方法，构建了具有高度仿真性、良好机械性能及诱导骨原位再生作用的新型仿生杂化骨支架材料。
背景技术
自然骨组织主要由胶原有机质和纳米羟基磷灰石无机矿物以7级分级、有序排列的方式相互作用而形成，决定了骨组织优异的力学特性和生物学特征。目前的人工合成骨修复材料虽有上百种之多，但尚未见有能够同时准确模拟自然骨组织成分、纳米结构和分级结构的产品，导致其无法兼具自然骨优良机械性能及高生物活性的特性。
因此，如何采用仿生合成的手段，模拟自然骨组织的分级结构，恢复自然矿化胶原中有机质和无机矿物的有序排列状态，是构建具有与自然骨结构和功能相近似的新型骨修复材料的关键所在。
传统的合成方法往往是将胶原与钙磷矿物质晶体直接混和或者是二者在纤维化自组装过程中共沉积而形成，这种矿化材料虽然在基本的化学成分上与自然骨组织一致，但是在微观结构上则表现为矿物质在胶原纤维外的无序沉积，并不能模拟自然骨组织胶原纤维与矿物质有序排列的纤维内矿化形式，而这种纤维内矿化形式是构成自然骨组织7级分级结构的基础，不仅决定了骨组织在纳米尺度上的力学性能，更对其整体机械和生物学特性起着决定性作用。
近年来，在仿生矿化理念的指导下，使用非胶原蛋白类似物，稳定并引导液相无定形矿物质纳米前体在胶原纤维内定向渗透、沉积、晶化，成功实现了胶原纤维的纤维内钙化，所形成的纤维内仿生钙化胶原支架生物相容性好，机械强度高，极大地提高了胶原支架的稳定性。但是当该技术应用于具有分级结构的脱矿骨胶原基质时，由于自然胶原基质密度高、胶原交联度大、分级层次多，而使矿物质前体对胶原的渗透性较差，使得矿化周期长(14天-3月)、矿化不均匀、无法形成脱矿骨胶原基质均匀一致的纤维内钙化，成为仿生矿化技术进一步应用于骨缺损修复材料构建领域的掣肘。此外这种纤维内钙化材料具有脆性大、促成骨活性低的问题，那么如何使用仿生合成的方法，在自然骨胶原多级分级结构的基础上，实现其快速均匀的纤维内矿化，同时提高其韧性及促成骨活性成为该领域下一步研究的热点和难点。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足,本发明的目的在于提供一种双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法。
为此，本发明提供的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法包括：
将纤维内钙与硅杂化仿生骨支架浸入合适浓度的趋化因子和成骨诱导蛋白混合溶液中，在适宜条件下处理后得双因子携载型杂化仿生骨支架。
所述的趋化因子为SDF-1或TGF-β。
所述的成骨诱导蛋白为BMP-2或BMP-7。
所述的适宜条件为-20℃～-50℃。
所述趋化因子和成骨诱导蛋白混合溶液浓度为：SDF-1：800-1200μg/mL，BMP-7：200-500μg/mL，TGF-β：600-1000μg/mL，BMP-2：400-800μg/mL。所述的纤维内钙与硅杂化仿生骨支架的制备方法包括：
(1)对动物骨进行脱脂、脱蛋白、脱矿、脱抗原处理后得到具有分级结构的骨胶原支架；
(2)将步骤(1)所得的骨胶原支架置于硅酸前体溶液中进行矿化处理，实现二氧化硅矿物质在骨胶原支架胶原分子内的沉积；所述硅酸前体溶液为正硅酸溶液与聚丙烯氯化铵溶液的混合溶液；
(3)将步骤(2)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于磷酸钙前体溶液中孵育制得纤维内钙与硅杂化仿生骨支架；所述磷酸钙前体溶液为聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液，所述聚阴离子的供体为聚天冬氨酸或聚丙烯酸。
所述脱脂、脱蛋白、脱矿、脱抗原处理包括先用氢氧化钠溶液浸泡处理，之后用氯仿和甲醇混合溶液进行脱脂处理，接着用双氧水进行脱蛋白处理，然后用EDTA溶液进行脱矿处理，最后用盐酸胍、Tris-HCl和CaCl2的混合溶液进行托抗原处理。
将步骤(1)所得的骨胶原支架置于硅酸前体溶液中进行矿化处理2-6天。将步骤(2)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于磷酸钙前体溶液中孵育4-7天。
针对现有技术的缺陷或不足，本发明的另一目的在于提供上述方法制备的双因子携载型杂化仿生骨支架作为骨缺损修复材料的应用，诱导骨原位再生。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明中杂化骨胶原内部还有二氧化硅和羟基磷灰石两种矿物质，其中二氧化硅表面存在的大量带有负电荷的硅醇基团及活性羟基对碱性蛋白(如SDF-1、TGF-β)的有效结合，及纳米羟基磷灰石对成骨诱导蛋白(如BMP-2、BMP-7)的特异强吸附性，使得无需添加额外的缓释系统而实现了杂化骨细胞募集性/成骨诱导性的双重功能化修饰。细胞募集因子及成骨诱导因子将随材料在体内降解而缓慢有序释放，活性硅易水解的特点可实现SDF-1及活性硅酸的首先释放，从而发挥细胞募集及促血管新生的功能，有利于移植区血供的尽早建立，为骨缺损的修复提供细胞及营养基础；羟基磷灰石骨传导性强的特点有利于骨结合的早期形成，水解缓慢的特点可实现BMP-7的缓释，从而促进募集而来的骨髓间充质干细胞的成骨分化。该材料有望达到诱导自体骨组织原位再生的功能，从而克服了常规骨组织工程中种子细胞获取困难、来源有限、费用昂贵、成骨活性不足等严重缺陷。
(2)本发明通过将自然骨胶原基质的分级结构与纤维内仿生杂化理念相结合，所形成的多分级、纤维内钙/硅杂化仿生骨胶原支架相比于其他骨修复材料具有明显的优越性，体现在：
1)脱矿脱抗原的骨胶原基质在消除异种骨抗原性的同时，保留了自然骨组织多分级结构的增强增韧机制，并能够为细胞生长提供更好的内环境；
2)纤维内羟基磷灰石/二氧化硅矿物质的沉积及骨胶原基质7级分级结构的保存，显著增强了胶原纤维的机械强度；
3)材料中多组分有序结合的特点综合了胶原纤维的生物相容性、羟基磷灰石的骨传导性及活性硅促进成骨、成血管特性；
4)材料钙/硅比例的可控化为定向调节材料的理化性能、机械强度及生物学特性提供了可能，有利于形成适于不同类型骨缺损修复的系列材料；
5)二氧化硅表面的活性硅醇基团及纳米羟基磷灰石的强吸附性，使得材料的可修饰性强，且不同的修饰位点及修饰机理有利于对材料实现多重功能化改性。
附图说明
图1为实施例1的纤维内仿生杂化骨胶原支架材料的Micro-CT扫描重建图，其中a为三维重建图、b为冠状面图像、c为矢状面图像、d为横断面图像。
图2为实施例1制备的硅/钙杂化骨胶原支架的傅里叶红外光谱与硅化、钙化骨胶原支架的傅里叶红外光谱的对比图。
图3为实施例1制备的纤维内仿生杂化骨胶原支架在模拟体液中浸泡24小时后的投射电镜观察图；其中a为25000倍图像；b为40000倍图像。
图4为实施例1的脱矿骨胶原、对比例1仿生硅化骨胶原、实施例1的仿生杂化骨胶原的生物相容性对比图，相同大写字母表示不同支架组间不具有统计学显著(P>0.05)；相同小写字母表示不同支架浸提液组间不具有统计学显著(P>0.05)。
图5为实施例1的纤维内仿生杂化骨胶原支架表面形成大量骨髓间充质干细胞的粘附示意图，左上图为488nm激发波长下共聚焦扫描重建图，显示的是绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞在杂化骨胶原表面的粘附；右上图561nm激发波长下共聚焦扫描重建图，显示的是细胞骨架铺展情况；左下633nm激发波长下共聚焦扫描重建图，显示的是细胞核的分布；右下图为上述三者的叠加。
图6为实施例1制备的纤维内仿生杂化骨胶原支架双因子携载型杂化骨SDF-1、BMP-7的累积释放量。
具体实施方式
现有的纤维内仿生钙化胶原材料生物相容性好，机械强度高，极大地提高了胶原支架的稳定性，但是应用于具有分级结构的骨胶原支架的纤维内钙化时存在矿化周期长(14天-3月)、矿化不均匀等问题；现有的纤维内仿生硅化胶原材料合成速度快、胶原矿化均匀、支架材料韧性高、促成骨活性强，但是仍存在机械性能尚无法与自然骨组织相媲美，细胞生物相容性与骨整合速度不及纤维内钙化材料等问题亟待解决。因此如何将纤维内钙化生物相容性高、力学性能接近天然骨的特点与纤维内硅化快速、高效、促成骨活性强的优势相结合，构建出新型的纤维内羟基磷灰石/二氧化硅杂化沉积的仿生骨胶原支架成为仿生矿化技术进一步应用于骨缺损修复材料构建领域的关键。
本发明将自然骨胶原基质的分级结构与纤维内仿生杂化技术相结合，构建多分级纤维内钙/硅杂化仿生骨支架，利用杂化仿生骨中两种矿物质可修饰性强的特点，对其进行趋化因子(如SDF-1)及成骨诱导蛋白(如BMP-7)的双因子加载，以实现其诱导骨原位再生的应用。
本发明的骨胶原支架(自然骨胶原基质)可以为牛骨胶原支架、猪骨胶原支架、猴骨胶原支架等动物骨胶原支架。骨胶原支架为具有分级结构的脱矿脱抗原骨胶原支架多分级纤维内钙/硅杂化仿生骨支架的制备方法包括：
(1)采用脱脂、脱蛋白、脱矿、脱抗原的方法制备具有分级结构的骨胶原支架。
(2)通过水解正硅酸四乙酯获得正硅酸溶液，与聚丙烯氯化铵溶液混合后，制备稳定的硅酸前体溶液；
(3)将步骤(1)所得的脱矿脱抗原骨胶原支架置于步骤(2)所得的硅酸前体溶液中进行矿化处理，实现二氧化硅矿物质在胶原分子内的有序沉积。
(4)制备聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液。
(5)将步骤(3)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于步骤(4)所得的聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中孵育制得纤维内杂化骨胶原支架材料。
(6)将步骤(5)所得的纤维内杂化骨胶原支架材料置于不同浓度的趋化因子/成骨诱导蛋白溶液中－50℃冷冻干燥24小时，制得双因子携载型杂化骨，赋予材料诱导骨原位再生的作用，以应用于骨缺损的修复。
本发明的硅酸前体溶液的制备方法可参考：室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备一定浓度(3％-5％)的正硅酸；将所得正硅酸与适宜浓度(10-30mg/mL)聚丙烯氯化铵溶液按照适当的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5-6；离心取上清制得不同浓度的聚丙烯氯化铵稳定的正硅酸前体溶液。
本发明的磷酸钙前体溶液的制备方法可解释如下：以Tris缓冲液为溶剂分别制备CaCl2·2H2O溶液及K2HPO4溶液，之后将CaCl2·2H2O溶液及K2HPO4溶液等容混合，并加入聚阴离子稳定剂如聚天冬氨酸或聚丙烯酸，从而制得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液。
以下是发明人提供的实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1：
该实施例的双因子携载型杂化仿生骨支架构建方法，按照如下步骤：
(1)取牛干骺端松质骨制备1cm×1cm×1cm骨块；将1kg骨块置于1L0.1mol/L NaOH溶液中浸泡处理24h后，使用1L1:1氯仿/甲醇混合溶剂脱脂72h，每24h更换一次脱脂液，脱脂间隙4000转/min离心30min，清除骨块或骨粒内异物；800mL 0.3g/L双氧水脱蛋白48h，脱除主要非胶原蛋白；800mL17％EDTA溶液室温下脱钙直至完全去除矿物质；500mL 4mol/L盐酸胍、50mmol/LTris-HCl和0.5mol/L CaCl2(pH＝7.4)溶液4℃再次脱蛋白24h，彻底去除免疫原性较强的非胶原蛋白，而保留胶原结构不被破坏；500mL双蒸水冲洗，使用25kGy的γ-射线灭菌，4℃储存备用。
(2)室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备浓度为3％的正硅酸；将所得正硅酸与20mg/mL的聚丙烯氯化铵溶液按照1:1的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5.5；3000转/分钟离心3分钟，取上清制得10mg/mL的聚丙烯氯化铵稳定的1.5％的正硅酸前体溶液。
(3)将步骤(1)所得的脱矿脱抗原牛骨胶原支架置于步骤(2)所得的硅酸前体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，分别孵育2天后，使用蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得具有分级结构的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料；
(4)以0.1M Tris缓冲液为溶剂分别制备9mM CaCl2·2H2O溶液及4.2mMK2HPO4溶液，将上述溶液等容混合，并加入聚阴离子稳定剂如聚天冬氨酸(100μg/mL)，从而制得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液(终浓度：4.5mM CaCl2·2H2O/2.1mM K2HPO4)；
(5)将步骤(3)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于步骤(4)所得的聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中，37℃条件下孵育7天，每天更换钙化液。最终形成以纤维内羟基磷灰石与二氧化硅有序沉积为特点、具有分级结构的仿生杂化骨胶原支架材料，如图1所示；
(6)将100g步骤(5)所得的纤维内杂化骨胶原支架材料置于100mL含800μg/mL SDF-1及200μg/mL BMP-7的溶液中，-50℃冷冻干燥24小时，制得双因子携载型杂化骨，应用于骨缺损的修复。
实施例2：
该实施例与实施例1不同之处在于：
(3)将步骤(1)所得的脱矿脱抗原牛骨胶原支架置于步骤(2)所得的硅酸前体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，分别孵育4天后，使用蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得具有分级结构的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料。
(5)将步骤(3)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于步骤(4)所得的聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中，37℃条件下孵育4天，每天更换钙化液。最终形成以纤维内羟基磷灰石与二氧化硅有序沉积为特点、具有分级结构的仿生杂化骨胶原支架材料。
6)将100g步骤(5)所得的纤维内杂化骨胶原支架材料置于100mL含1000μg/mL TGF-β及400μg/mL BMP-2的溶液中，-20℃冷冻干燥制得双因子携载型杂化骨，应用于骨缺损的修复。
对比例1：
该对比例提供的是关于纤维内仿生硅化骨胶原支架材料的制备方法：
(1)取牛干骺端松质骨制备1cm×1cm×1cm骨块；将1kg骨块置于1L0.1mol/L NaOH溶液中浸泡处理24h后，使用1L1:1氯仿/甲醇混合溶剂脱脂72h，每24h更换一次脱脂液，脱脂间隙4000转/min离心30min，清除骨块或骨粒内异物；800mL 0.3g/L双氧水脱蛋白48h，脱除主要非胶原蛋白；800mL17％EDTA溶液室温下脱钙直至完全去除矿物质；500mL 4mol/L盐酸胍、50mmol/LTris-HCl和0.5mol/L CaCl2(pH＝7.4)溶液低温下再次脱蛋白24h，彻底去除免疫原性较强的非胶原蛋白，而保留胶原结构不被破坏；500mL双蒸水冲洗，使用25kGy的γ-射线灭菌，4℃储存备用。
(2)室温以正硅酸四乙酯为原料采用稀酸水解法制备浓度为3％的正硅酸；将所得正硅酸与20mg/mL的聚丙烯氯化铵溶液按照1:1的体积比均匀混合，并将终溶液pH值调至5.5；3000转/分钟离心3分钟，取上清制得10mg/mL的聚丙烯氯化铵稳定的1.5％的正硅酸前体溶液。
(3)将步骤(1)所得的脱矿脱抗原牛骨胶原支架置于步骤(2)所得的硅酸前体溶液中进行矿化处理，每天更换新鲜的硅酸前体溶液，分别孵育2天后，使用蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得具有分级结构的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料。
对比例2：
该对比例提供的是关于纤维内仿生钙化骨胶原支架材料的制备方法：
(1)取牛干骺端松质骨制备1cm×1cm×1cm骨块；将1kg骨块置于1L0.1mol/L NaOH溶液中浸泡处理24h后，使用1L1:1氯仿/甲醇混合溶剂脱脂72h，每24h更换一次脱脂液，脱脂间隙4000转/min离心30min，清除骨块或骨粒内异物；800mL 0.3g/L双氧水脱蛋白48h，脱除主要非胶原蛋白；800mL17％EDTA溶液室温下脱钙直至完全去除矿物质；500mL 4mol/L盐酸胍、50mmol/LTris-HCl和0.5mol/L CaCl2(pH＝7.4)溶液低温下再次脱蛋白24h，彻底去除免疫原性较强的非胶原蛋白，而保留胶原结构不被破坏；500mL双蒸水冲洗，使用25kGy的γ-射线灭菌，4℃储存备用。
(2)以0.1M Tris缓冲液为溶剂分别制备9mM CaCl2·2H2O溶液及4.2mMK2HPO4溶液，将上述溶液等容混合，并加入聚阴离子稳定剂如聚天冬氨酸(100μg/mL)，从而制得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液(终浓度：4.5mM CaCl2·2H2O/2.1mM K2HPO4)；
(3)将步骤(1)所得的脱矿脱抗原牛骨胶原支架置于步骤(2)所得聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液中，37℃条件下孵育14天后，使用蒸馏水反复冲洗后，冷冻干燥备用，制得具有分级结构的纤维内仿生钙化骨胶原支架材料。
发明人对实施例1和对比例1、2所得的产品进行了如下实验：
如图2所示，傅里叶红外光谱分析证实这种仿生杂化骨胶原支架同时具有二氧化硅和羟基磷灰石两种矿物；在硅化骨胶原组中在460，800和第1070cm-1处可见Si-O-Si键的振动峰(TO1，TO2和TO3),但未见有关羟基磷灰石的相关峰；在钙化骨胶原组中可检测到960和1020cm-1处的羟基磷灰石相关的ν1PO4和ν3PO4峰和560和602cm-1处的ν4PO4和ν2PO4峰，但未见有关二氧化硅的相关峰；而在杂化骨胶原中则可同时检测到羟基磷灰石和二氧化硅的相关峰，显示了其杂化特性。
如图3所示，实施例1制备的仿生杂化骨胶原支架在模拟体液中浸泡24小时后表面形成大量羟基磷灰石晶体沉积，显示了良好的生物活性。
如图4所示，相比于仿生硅化和脱矿骨胶原，实施例1制备的仿生杂化骨胶原支架具有更好的生物相容性。
如图5所示，实施例1制备的仿生杂化骨胶原支架可以促进骨髓间充质干细胞可在其表面形成良好的粘附。
将实施例1制备的双因子携载型杂化骨(50g)置于50mL模拟体液中37℃孵育12天，利用酶联免疫吸附实验检测双因子的释放量可见该双因子携载型杂化骨可以实现SDF-1、BMP-7的缓释，结果如图6所示。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。
Claims (10)
1.一种双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
将纤维内钙与硅杂化仿生骨支架浸入合适浓度的趋化因子和成骨诱导蛋白混合溶液中，在适宜条件下处理后得双因子携载型杂化仿生骨支架。
2.如权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述的趋化因子为SDF-1或TGF-β。
3.如权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述的成骨诱导蛋白为BMP-2或BMP-7。
4.如权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述的适宜条件为-20℃～-50℃。
5.如权利要求2所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述趋化因子浓度为：SDF-1：800-1200μg/mL，TGF-β：600-1000μg/mL。
6.如权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述成骨诱导蛋白溶液的浓度为：BMP-7：200-500μg/mL，BMP-2：400-800μg/mL。
7.如权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述的纤维内钙与硅杂化仿生骨支架的制备方法包括：
(1)对动物骨进行脱脂、脱蛋白、脱矿、脱抗原处理后得到具有分级结构的骨胶原支架；
(2)将步骤(1)所得的骨胶原支架置于硅酸前体溶液中进行矿化处理，实现二氧化硅矿物质在骨胶原支架胶原分子内的沉积；所述硅酸前体溶液为正硅酸溶液与聚丙烯氯化铵溶液的混合溶液；
(3)将步骤(2)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于磷酸钙前体溶液中孵育制得纤维内钙与硅杂化仿生骨支架；所述磷酸钙前体溶液为聚阴离子稳定的无定型液相磷酸钙前体溶液，所述聚阴离子的供体为聚天冬氨酸或聚丙烯酸。
8.如权利要求7所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，所述脱脂、脱蛋白、脱矿、脱抗原处理包括先用氢氧化钠溶液浸泡处理，之后用氯仿和甲醇混合溶液进行脱脂处理，接着用双氧水进行脱蛋白处理，然后用EDTA溶液进行脱矿处理，最后用盐酸胍、Tris-HCl和CaCl2的混合溶液进行托抗原处理。
9.如权利要求7所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的制备方法，其特征在于，将步骤(1)所得的骨胶原支架置于硅酸前体溶液中进行矿化处理2-6天；将步骤(2)所得的纤维内仿生硅化骨胶原支架材料置于磷酸钙前体溶液中孵育4-7天。
10.权利要求1所述的双因子携载型杂化仿生骨支架的方法制备的双因子携载型杂化仿生骨支架作为骨缺损修复材料的应用。
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