KR20110117382A - 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재 - Google Patents

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Abstract

이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계, 콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계, WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계, 용해된 콜라겐과 WSC용액을 혼합 반응시켜 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계 및 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재가 개시된다. 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재는 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절하고, 골세포의 증식을 용이하게 하여 초기 골고정력과 생체 친화성을 향상시키는 효과를 갖는다.

Description

표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재{Method for fabricating biphasic calcium phosphate bone substitute material bonded collagen on surface and bone substitute material fabricated by using the same}
본 발명은 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate) 이 적절한 비율로 화학결합된 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)과 콜라겐을 화학적으로 결합시킨 다공성 골대체재에 관한 것이다.
노화, 질병, 사고. 선천적인 요인 등 각종 원인에 의한 기능치의 상실에 대한 대안으로 임플란트 시술이 보편화되고 있다. 이와 같은 임플란트의 시술을 위해서는 먼저 치조골을 재생하는 치료가 우선되어야 하는데, 여기에 필요한 골대체재로서 골전도성, 생체활성, 초기 골재생 등에 효과가 좋은 재료가 요구되고 있다.
골대체재로서 수산화인회석(Hydroxyapatite)은 생체 내 용해율이 낮아 숙주 결합조직 내에서 면역반응이 없는 이물질로 작용하여 신생골 형성을 위한 지지체로서의 기능을 충분히 하지 못하고, 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate)은 조직에 쉽게 흡수되어 골성장을 위한 골격을 예견성있게 제공할 수 없다. 이와 같이, 순수한 수산화인회석이나 삼인산칼슘은 골대체재로서 한계가 있다. 따라서 수산화인회석과 삼인산칼슘을 적절한 비율로 조절한 이상인산칼슘이 현재 치과나 정형외과 등에서 임상적으로 이용되고 있다.
그러나 이상인산칼슘은 무기질만의 재료로서 탄력이 부족하여, 외부에서 가해지는 힘에 의해 깨질 염려가 있으며, 초기 골고정력이 다소 부족하여 치조골 재생을 위한 치료기간이 길어질 수 있다. 이에 따라 골조직의 중요한 성분의 단백질로서 세포의 초기부착이나 증식에 필요한 콜라겐을 단순히 골대체재의 표면에 물리적으로 코팅하거나 골대체재에 섞는 등의 시도가 이루어지고 있다.
본 발명의 목적은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 수산화인회석과 산인산칼슘이 적절한 비율로 결합된 이상인산칼슘에 생체활성물질인 콜라겐을 적용함으로써 초기 골고정력, 세포증식력, 생체친화성 등을 향상시킬 수 있는 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재를 제공하려는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법은 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosph)을 포함하는 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계, 콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계, WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계, 상기 제2 단계에서의 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 제조된 WSC용액을 혼합 반응시켜 상기 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계 및 상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 제1 단계는, 상기 이상인산칼슘 및 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 혼합한 용액을 교반시켜 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성할 수 있다.
상기 이상인산칼슘의 표면에 아미노기의 생성은, 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합 용액과 교반시킨 후, 헥산(Hexane)으로 세척하고, 건조하는 과정을 더 포함할 수 있다.
한편, 상기 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)를 혼합한 용액과 교반은, 상온에서 수행할 수 있다.
상기 제2 단계는, 상기 콜라겐과 아세트산(acetic acid) 수용액을 교반하여 상기 콜라겐의 용해가 이루어지도록 할 수 있다.
또한, 상기 아세트산 수용액은, 0.01wt% 내지 0.1wt%의 아세트산을 포함하고, 상기 콜라겐은, 상기 아세트산 용액의 중량 중에 0.01wt% 내지 1.0wt%를 차지하도록 하여, 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 교반하여 콜라겐을 용해할 수 있다.
상기 제3 단계는, EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxy succinimied)를 증류수에 용해시켜 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조할 수 있다.
한편, 상기 EDC 및 NHS는, 상기 증류수의 중량에 대하여 각기 0.01wt% 내지 1.0wt%의 비율로 용해시킬 수 있다.
상기 제4 단계는, 상기 혼합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 할 수 있다.
상기 제5 단계는, 상기 아미드 결합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 할 수 있다.
또한, 상기 제5 단계는, 상기 아미드 결합 반응을 한 다음, 증류수로 1회 내지 복수 회 세척하여 반응하지 않은 콜라겐을 씻어내고, 초저온에서 동결시킨 후, 동결 건조하는 과정을 더 포함할 수 있다.
상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재는 상기 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 골대체재는 골전도성은 유지하면서 재료의 흡수성을 조절하고, 골세포의 증식을 용이하게 하여 초기 골고정력과 생체 친화성을 향상시키는 효과를 갖는다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법을 순서대로 나타낸 흐름도이다.
도 2a는 실험예 1의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 2b는 실험예 1의 대조군인 순수한 이상인산칼슘의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 3a는 실험예 2의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재 표면의 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 3b는 실험예 2의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재 표면의 주사전자현미경상 이미지이다.
도 4a는 실험예 3의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 실험예 3의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼(Photoelectron Spectrum)을 나타낸 그래프이다.
도 5a는 실험예 4의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 5b는 실험예 4의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다.
도 6은 실험예 5에 의한 실험군, 비교군, 대조군의 세포증식력을 비교한 MTT분석(MTT assay) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 6에 의한 대조군(a), 비교군(b) 및 실험군(c)의 ALP 염색정도를 나타낸 사진이다.
도 8a는 실험예 7에 의한 비교군(a) 및 실험군(b)의 광학현미경 상 이미지를 나타낸 사진이다.
도 8b는 실험예 7에 의한 비교군 및 실험군의 조직계측학적 평가를 나타낸 그래프이다.
이하에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명할 것이다. 다음에서 설명되는 실시예들은 여러 가지 다양한 형태로 변형할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 완전한 설명을 하기 위하여 제공되는 것이다.
먼저, 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법에 관하여 설명하고, 다음으로 그 방법에 의해 제조된 골대체재의 품질 및 제조상태에 관하여 알아본 후, 마지막으로 몇 가지 실험예들을 들어 골대체재로서 적용시 효과를 살펴보도록 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법을 순차적으로 나타낸 흐름도이다.
도 1에 의하면, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법의 제1 단계는 이상인산칼슘을 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane) 용액과 반응시켜 이상인산칼슘 표면에 아미노기(-NH2)를 생성시키는 단계(S1)이다.
이에 대한 화학 반응식은 아래 화학식 1과 같다.
Figure pat00001
이상인산칼슘의 표면에 아미노기를 생성함으로써 아래에서 설명할 콜라겐(Collagen)의 카복실기(Carboxyl group, -COOH)와 결합할 수 있게 된다.
상세하게는, 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP) 1.0g을 준비하여, 헥산(Hexane) 50㎖와 3-APTES 2.5㎖를 혼합한 용액과 함께 상온에서 1시간 이상 교반 시킨다. 이후, 헥산으로 3회에 걸쳐 세척하고, 약 60℃의 온도에서 완전히 건조시킨다.
제2 단계는 콜라겐(Collagen)을 아세트산(acetic acid) 수용액에 용해시키는 단계(S2)이다.
콜라겐은 경단백질로 섬유 상 고체로 존재하는데, 콜라겐을 포함하는 골 단백질들은 뼈에서 세포 외 기질(extracellular matrix)의 구성물질이며, 골세포가 부착하여 뼈를 생산하는 장소를 제공할 수 있다. 또한, 뼈에 높은 인성을 부여하고 골세포의 선택적 부착을 유도하는 성질이 있다.
상세하게는, 증류수(Distilled water) 20㎖에 0.01wt% 내지 0.1wt%에 해당하는 아세트산(Acetic acid)을 넣은 아세트산 수용액을 만든 후, 그 아세트산 수용액의 0.01wt% 내지 1.0wt%에 해당하는 콜라겐을 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도를 유지하는 아이스 배스(ice-bath)에서 10시간 이내에서 교반 시킨다.
제3 단계는 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조하는 단계(S3)이다.
이때, WSC 용액은 상기 제2 단계에서 용해된 콜라겐의 카복실기를 활성화하는 역할을 한다. 상세하게는, 증류수 20㎖에 0.01wt% 내지 1.0wt%의 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 0.01wt% 내지 1.0wt%의 NHS(N-hydroxy succinimied)를 용해시켜 WSC 용액을 만든다.
제4 단계는 상기 제2 단계에서 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 준비된 WSC 용액을 혼합 반응시켜 콜라겐의 카복실기를 활성화하는 단계(S4)이다.
이때, 상기 혼합 반응은 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도에서 약 24시간 동안 반응시킨다.
제5 단계는 상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기가 결합된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기가 활성화된 콜라겐을 반응시켜 아미드(amide) 결합시키는 단계(S5)이다.
이에 대한 화학 반응식은 아래 화학식 2와 같다.
Figure pat00002
상세하게는, 카복실기가 활성화된 콜라겐 용액과 3-APTES 처리한 이상인산칼슘(BCP)을 8℃ 이하, 바람직하게는 0℃ 내지 8℃의 온도를 유지하는 아이스 배스ce-bath)에서 약 2시간 동안 반응시킨 후, 반응하지 않은 콜라겐은 3회에 걸쳐 증류수로 씻어낸다. 다음으로, 초저온 냉동고에서 동결시키고, 동결건조기(Freeze drier)를 이용하여 동결건조 시킨다.
상기 다섯 단계의 제조공정을 거침으로써, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재가 제조가 완료된다.
다음으로, 본 발명의 골대체재의 제조방법의 효과를 확인하기 위하여 상기 방법에 의해 제조된 골대체재의 구조와 성분을 분석하는 실험예 1 내지 실험예 3을 제시하고자 한다.
(실험예 1)
실험예 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘을 X선 회절 분석하여 결정상 변화와 이차상 생성의 유무를 확인하는 것이다. 여기서, 비교군은 순수한 이상인산칼슘으로 하였다.
상세하게는, X선 회절분석기(DMAX-2500, Rigaku Co. Ltd., Japan)로, 파장이 1.5418Å인 CuKα선을 이용하여, 5°/min의 속도로, 10° 내지 60°의 범위를 측정하였다.
도 2a는 실험예 1의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 회절 분석 그래프이고, 도 2b는 실험예 1의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 X선 회절 분석 그래프이다.
도 2a 및 도 2b를 참조하면, 상기 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재와 순수한 이상인산칼슘 골대체재 모두 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-TCP)의 비율이 6:4 내지 7:3으로 적절하게 이루어진 것으로 확인되었다. 이에 따라 콜라겐을 이상인산칼슘에 결합하는 과정에서 결정상의 변화는 없는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실험군 및 비교군 모두에서 이상인산칼슘의 피크(Peak) 외에 다른 피크는 발견할 수 없으므로 본 발명의 골대체재의 제조과정에서 이차상이 생성되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
다시 말해, 본 발명의 실시예에 의한 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법은 콜라겐을 이상인산칼슘의 표면에 부착하는 과정에서 이상인산칼슘 자체에는 어떠한 변성도 일으키지 않으므로 기존의 이상인산칼슘이 가지는 골대체재로서의 이점을 그대로 가질 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
(실험예 2)
실험예 2는 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 표면의 미세구조를 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM)으로 관찰하는 것이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
다공성의 생체재료의 경우, 기공의 크기가 최소 100㎛ 이상은 되어야 섬유조직, 혈관조직, 골조직이 그 기공 내에서 성장할 수 있다는 보고가 있다. 따라서 본 발명의 골대체재는 그 구조의 내부로 각종 영양소들이 원활하게 공급될 수 있어야 하므로 다공질의 구조를 가져야할 필요가 있다
도 3a는 실험예 2의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재 표면의 주사전자현미경 상 이미지이다. 이때, (a)는 ×10,000 배율로, (b)는 ×20,000 배율로 관찰한 것이다. 또한, 도 3b는 실험예 2의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재 표면의 주사전자현미경상 이미지이다. 이때, (a)는 ×10,000 배율로, (b)는 ×20,000 배율로 관찰한 것이다.
도 3a 및 도 3b를 참조하면, 실험군의 골대체재는 400 내지 500㎛ 직경을 갖는 매크로포어(Macro-pore)와 10 내지 50㎛의 마이크로포어(Micro-pore) 들이 연결된 다공질로 이루어져 있는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 실험군에서 관찰할 수 있는 다공질 구조는 비교군에서의 다공질 구조와 차이점이 거의 발견되지 않았다. 또한, 다공질의 표면에 콜라겐이 부착되어 있는 모습을 확인할 수 있었다.
다시 말해, 본 발명의 제조방법에 의해 이상인산칼슘의 표면에 콜라겐이 성공적으로 결합 되었으며, 전체적인 다공질 구조 또한 잘 유지되어 골대체재로서 최적의 상태를 가지는 제품을 제조할 수 있다는 것을 보여준다.
(실험예 3)
실험예 3은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 원소분석을 하는 것이다. 그 방법은 X선 광전자 분광법(X-Ray Photoelectron Spectroscopy, XPS)을 이용하였다. 비교군으로는 상기 실험예 1 및 2와 마찬가지로 순수한 이상인산칼슘으로 하였다.
도 4a는 실험예 3의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼을 나타낸 그래프이고, 도 4b는 실험예 3의 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 X선 분광법에 의한 광전자 스펙트럼(Photoelectron Spectrum)을 나타낸 그래프이다.
아래의 표 1 및 표 2는 도 4a 및 도 4b의 광전자 스펙트럼에서 피크(peak)를 나타내는 주요원소의 원소비율을 나타낸 것이다.
원소 표면원소비율(%)
C 26.54
Ca 14.4
N 4.02
O 40.02
P 12.11
Si 2.9
원소 표면원소비율(%)
C 22.23
Ca 18.12
O 46.99
P 12.66
도 4a, 도 4b 및 상기 표를 참조하면, 실험군의 광전자 스펙트럼은 비교군인 순수한 이상인산칼슘 골대체재의 광전자 스펙트럼과 비교할 때, 질소(N)에 해당하는 부분에서 피크(peak)가 뚜렷하게 나타남을 확인할 수 있다.
다시 말해, 본 발명의 골대체재 제조방법에 의한 골대체재의 표면은 순수한 이상인산칼슘 골대체재와 비교하여 볼 때. 질소(N) 성분이 상당히 증가하였고, 반면에 규소(Si) 성분은 감소함을 확인할 수 있다. 질소는 아미노산을 구성하는 주요 원소이고, 생체 단백질인 콜라겐에 대량 함유된 원소이다. 또한, 규소는 무기질인 이상인산칼슘에 다량 포함되어 있는 원소이다.
따라서, 상기 골대체재 표면의 성분분석결과는 본 발명의 실시예에 의한 제조방법에 의해 이상인산칼슘 표면에 콜라겐의 결합이 성공적으로 이루어졌음을 의미하는 것이다.
다음으로, 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 생체 적용시의 효과를 입증하기 위한 실험예들을 제시하고자 한다.
(실험예 4)
실험예 4는 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재의 세포초기부착능력에 관한 실험이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재(실험군)와 순수한 이상인산칼슘 골대체재(비교군)를 각각 조골세포인 MC3T3-E1 세포와 섞고, 로테이터(Rotator)에서 약 3시간 동안 회전시키면서 상기 골대체재를 세포에 부착하는 실험을 수행하였다. 이후, 탈수 과정을 거치고, 주사전자현미경(SEM)으로 그 표면을 관찰하였다.
도 5a는 실험예 4의 실험군인 본 발명의 실시예에 의한 제조방법으로 제조된 골대체재의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이고, 도 5b는 실험예 4의 비교군인 순수한 이상인산칼슘의 세포부착 모습을 나타낸 주사전자현미경 상 이미지이다. 이때, 배율은 각각 ×1000, ×3000으로 하여 관찰하였다.
도 5a 및 도 5b를 참조하면, 상기 실험군에서는 세포가 골대체재 내부까지 침투되어 이상인산칼슘의 전면에 부착된 것을 볼 수 있는 반면, 상기 비교군에서는 세포가 골대체재 내부로 침투되지 못하고 표면에만 부착되어 있는 것을 볼 수 있었다.
따라서 본 발명의 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 골대체재는 순수한 이상인산칼슘 골대체재에 비하여 세포의 초기 부착능력이 더 우수함을 확인할 수 있다.
(실험예 5)
실험예 5는 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 세포증식에 관한 실험이다.
실험방법은 24 웰 배양 플레이트(24 well culture plate)에 웰 마다 MC3T3-E1 세포 2×104개와 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘을 20㎎을 넣고, 10%의 우혈청을 포함하는 α-MEM 배지에서 1일 및 3일 동안, 37℃, 5%의 이산화탄소(CO2) 농도의 조건 하에서 배양하였다.
이때, 배양용기에 MC3T3-E1 세포만을 접종한 것을 대조군(Control)로 하고, 순수한 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 MC3T3-E1 세포와 함께 접종한 것은 비교군으로 하였다.
위와 같은 방법으로 배양된 세포는 MTT 분석(MTT assay)하여 570nm 파장에서의 흡광도(Optical Density, OD)를 측정하였다.
도 6은 실험예 2에 의한 실험군, 비교군, 대조군의 세포증식력을 비교한 MTT분석(MTT assay) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재(실험군)에서의 흡광도가 순수한 이상인산칼슘 골대체재(비교군)에서의 흡광도에 비하여 높게 나타났다.
따라서 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재에서의 세포증식력이 순수한 이상인산칼슘 골대체재에서의 세포증식력에 비하여 우수한 것을 확인할 수 있다.
(실험예 6)
실험예 6은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 세포분화에 관한 실험이다.
실험방법은 24 웰 배양 플레이트(24 well culture plate)의 웰 마다 MC3T3-E1 세포 2×104개와 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 넣고, 10%의 우혈청을 포함하는 α-MEM 배지에서 1일 동안, 37℃의 온도, 5%의 이산화탄소 농도 조건 하에서 배양하였다. 다음으로, 조골세포분화배지(10% FBS, 50㎍/㎕ α-ascorbic acid, 10mM β-glycerophosphate와 antibiotics가 첨가된 α-MEM)를 넣어 7일 동안 더 배양하였다.
이때, 배양용기에 MC3T3-E1 세포만을 접종한 것을 대조군(Control)로 하고, 순수한 이상인산칼슘 골대체재 20㎎을 MC3T3-E1 세포와 함께 접종한 것은 비교군으로 하였다.
도 7은 실험예 6에 의한 대조군(a), 비교군(b), 실험군(c)의 ALP 염색정도를 나타낸 사진이다.
세포분화능력을 검증하기 위한 방법으로는 ALP(Alkaline Phosphate) 염색법을 사용하였다. 상기 ALP 염색법은 효소인 ALP가 뼈세포 분화시 발현량이 증가하는 원리를 이용한 것으로서, BCIP, NPT와 침전 반응을 일으킨 후 보라색 침전이 나타나는 것을 관찰함으로써 뼈세포 분화 정도를 알 수 있다.
도 7을 참조하면, 실험군에서의 염색 정도가 비교군에 비해 다소 진한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 순수한 이상인산칼슘 골대체재에 비하여 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재에 있어서의 세포분화능력이 더 우수함을 확인할 수 있다.
(실험예 7)
실험예 7은 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 동물실험으로서, 토끼 두개골 결손부에 본 발명의 골대체재를 이식하는 실험에 관한 것이다. 이때, 비교군은 순수한 이상인산칼슘 골대체재로 하였다.
실험방법은, 먼저 실험용 토끼에 케타민(Ketara, 유한양행)과 질라진(Rompun, 유한양행)을 근육주사하여 전신마취를 시행 후, 수술부위를 면도하고 소독하였다. 이때, 케타민은 44㎎/㎏, 질라진은 7㎎/㎏의 양만큼 투여하였다.
다음으로, 2% 농도의 리도카인(유한양행)을 이용하여 부가적인 국소마취를 시행하고, 두개골의 정중부를 절개한다. 이후, 전층판막(mucoperiosteal flap)을 거상하고, 외경 8㎜, 내경 7㎜인 골편채취기(Trephine bur)를 이용하여 두개골 시상봉합(Sagittal suture)의 양측으로 골결손부를 형성하였다.
상기 형성된 양측의 골결손부에는 각각 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재 및 순수한 이상인산칼슘 골대체재를 이식하고, 봉합사로 봉합하였다. 수술 후에는 0.2㎖/㎏ 농도의 항생제(baytril, Bayer Korea)와 0.44㎖/㎏ 농도의 안정제(Nobin, Bayer Korea)를 근육주사 하였다.
상기 수술 4주 후, 실험 동물을 희생하고, 원래의 결손부를 포함한 블록시편을 채취하고, 통상적인 방법에 의한 탈회시편을 제작한다. 여기에 마슨스 트리크롬 염색(Masson`s trichrome staining)을 시행하여 조직시편을 제작하고, 조직계측학적 평가를 시행하였다.
도 8a는 실험예 4에 의한 순수한 이상인산칼슘 골대체재를 이식한 조직시편(비교군, a) 및 본 발명의 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재를 이식한 조직시편(실험군, b)의 현미경 상 이미지를 나타낸 사진이다. 또한, 도 8b는 상기 비교군 및 실험군의 조직계측학적 평가를 나타낸 그래프이다.
8a 및 도 8b를 참조하면, 비교군에 비하여 실험군에서의 새로운 골 형성이 더욱 활발히 이루어졌음을 확인할 수 있다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (13)

  1. 수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosph)을 포함하는 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)의 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 제1 단계;
    콜라겐을 용해하여 준비하는 제2 단계;
    WSC(Water-Soluble Carbodiimide)용액을 제조하는 제3 단계;
    상기 제2 단계에서의 용해된 콜라겐과 상기 제3 단계에서 제조된 WSC용액을 혼합 반응시켜 상기 콜라겐의 카복실기(-COOH)를 활성화하는 제4 단계; 및
    상기 제1 단계에서 준비된 표면에 아미노기(-NH2)가 생성된 이상인산칼슘과 상기 제4 단계에서 준비된 카복실기(-COOH)가 활성화된 콜라겐을 아미드(amide) 결합시키는 제5 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계의 이상인산칼슘(Biphasic calcium phosphate, BCP)은,
    수산화인회석(Hydroxyapatite)과 삼인산칼슘(β-tricalcium phosphate)이 6:4 내지 7:3의 비율로 이루어진 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 단계는,
    상기 이상인산칼슘 및 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액을 교반시켜 표면에 아미노기(amino group, -NH2)를 생성하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이상인산칼슘 표면에 아미노기의 생성은,
    상기 이상인산칼슘을 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액과 교반시킨 후, 헥산(Hexane)으로 세척하고, 건조하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 이상인산칼슘 및 상기 헥산(Hexane)과 3-APTES(3-aminopropyltriethoxysilane)의 혼합용액과의 교반은,
    상온에서 수행하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 제2 단계는,
    상기 콜라겐과 아세트산(acetic acid) 수용액을 교반하여 상기 콜라겐이 용해되도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아세트산 수용액은,
    0.01wt% 내지 0.1wt%의 아세트산을 포함하고,
    상기 콜라겐은,
    상기 아세트산 용액의 중량에 대하여 0.01wt% 내지 1.0wt%를 차지하도록 하여,
    0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 교반하여 콜라겐을 용해하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제3 단계는,
    EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N`-ethylcarbodiamide hydrochloride)와 NHS(N-hydroxy succinimied)를 증류수에 용해시켜 WSC(Water-Soluble Carbodiimide) 용액을 제조하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 EDC 및 NHS는,
    상기 증류수의 중량에 대하여 각기 0.01wt% 내지 1.0wt%의 비율로 용해시키는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제4 단계는,
    상기 혼합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제5 단계는,
    상기 아미드(amide) 결합반응이 0℃ 내지 8℃의 온도범위에서 이루어지도록 하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 제5 단계는,
    상기 아미드(amide) 결합반응을 한 다음, 증류수로 1회 내지 복수 회 세척하여 반응하지 않은 콜라겐을 씻어내고, 초저온에서 동결시킨 후, 동결 건조하는 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중에 선택된 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 표면에 콜라겐이 결합된 이상인산칼슘 골대체재.
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