JP7104425B2 - 細胞外マトリックス材料 - Google Patents
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Description
10Ca(OH)2+6H3PO4→Ca10(PO4)6(OH)2+18H2O
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
(項目1)
フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場、ならびに
前記足場上に堆積しているセラミック
を含む、細胞外マトリックス材料。
(項目2)
前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相であるか、またはリン酸カルシウム鉱物相を含む、項目1に記載の細胞外マトリックス。
(項目3)
前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムである、項目1または項目2に記載の細胞外マトリックス材料。
(項目4)
前記増量剤が、グリコサミノグリカン(GAG;例えばコンドロイチン6-硫酸、コンドロイチン4-硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン)である、項目1または項目2に記載の細胞外マトリックス材料。
(項目5)
前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択される、項目1または項目2に記載の細胞外マトリックス材料。
(項目6)
細胞外マトリックス材料を調製するための方法であって、セラミックを、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場上に堆積させるステップを含む、方法。
(項目7)
前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相である、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、生物模倣堆積によって前記足場上に堆積させられる、項目6または項目7に記載の方法。
(項目9)
リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、Ca 2+ およびHPO 4 2 を含み、任意選択でi)Na + 、K + 、Mg 2+ 、Ca 2+ 、Cl - 、HCO 3 - ,HPO 4 2- およびSO 4 2- 、ii)Na + 、K + 、Mg 2+ 、Ca 2+ 、Cl - 、HCO 3 - およびHPO 4 2- 、またはiii)Na + 、K + 、Ca 2+ をさらに含む流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目6から8のいずれかに記載の方法。
(項目10)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~30mMのCa 2+ 、好ましくは1~20mMのCa 2 を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から9のいずれかに記載の方法。
(項目11)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、0.5~10mMのHPO 4 2- を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から10のいずれかに記載の方法。
(項目12)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、100~800mMのNa + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~50mMのK + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から12のいずれかに記載の方法。
(項目14)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、0.5~20mMのMg 2+ を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から13のいずれかに記載の方法。
(項目15)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、100~800mMのCl - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から14のいずれかに記載の方法。
(項目16)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~100mMのHCO 3 - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から15のいずれかに記載の方法。
(項目17)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~10mMのSO 4 2- を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から16のいずれかに記載の方法。
(項目18)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~5mMのCa 2+ 、好ましくは2~3mMのCa 2+ 、最も好ましくは約2.5mMのCa 2+ を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17のいずれかに記載の方法。
(項目19)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、0.5~3mMのHPO 4 2- 、好ましくは0.5~2mMのHPO 4 2- 、最も好ましくは約1mMのHPO 4 2- を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から18のいずれかに記載の方法。
(項目20)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、100~200mMのNa + 、好ましくは120~160mMのNa + 、さらにより好ましくは140~150mMのNa + 、最も好ましくは約142mMのNa + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から19のいずれかに記載の方法。
(項目21)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~10mMのK + 、好ましくは3~7mMのK + 、最も好ましくは約5mMのK + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から20のいずれかに記載の方法。
(項目22)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、0.5~3mMのMg 2+ 、好ましくは1~2mMのMg 2+ 、最も好ましくは約1.5mMのMg 2+ を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から21のいずれかに記載の方法。
(項目23)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、100~200mMのCl - 、好ましくは120~160mMのCl - 、より好ましくは140~150mMのCl - 、最も好ましくは約148.8mMのCl - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から22のいずれかに記載の方法。
(項目24)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~10mMのHCO 3 - 、好ましくは2~8mMのHCO 3 - 、より好ましくは4~5mMのHCO 3 - 、最も好ましくは約4.2mMのHCO 3 - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~5mMのCa 2+ 、0.5~3mMのHPO 4 2 、100~200mMのNa + 、1~10mMのK + 、0.5~3mMのMg 2+ 、100~200mMのCl - および1~10mMのHCO 3 - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目11から24のいずれかに記載の方法。
(項目26)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、2~3mMのCa 2+ 、0.5~2mMのHPO 4 2- 、120~160mMのNa + 、3~7mMのK + 、1~2mMのMg 2+ 、120~160mMのCl - および2~8mMのHCO 3 - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目11から25のいずれかに記載の方法。
(項目27)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、10~30mMのCa 2+ を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17のいずれかに記載の方法。
(項目28)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、5~10mMのHPO 4 2- を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27のいずれかに記載の方法。
(項目29)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、500~800mMのNa + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から28のいずれかに記載の方法。
(項目30)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、10~40mMのK + を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から29のいずれかに記載の方法。
(項目31)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、5~15mMのMg 2+ を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から30のいずれかに記載の方法。
(項目32)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、500~800mMのCl - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から31のいずれかに記載の方法。
(項目33)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、10~100mMのHCO 3 - を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から32のいずれかに記載の方法。
(項目34)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~10mMのSO 4 2- を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、項目7から17または27から33のいずれかに記載の方法。
(項目35)
前記足場が、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、または少なくとも9日間、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、項目9から34のいずれかに記載の方法。
(項目36)
前記足場が、20日間まで、好ましくは10日間まで、最も好ましくは9日間まで、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、項目9から35のいずれかに記載の方法。
(項目37)
前記足場が、
(a)フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
(c)前記架橋剤を除去するために、ステップ(b)で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって得られた、形成された、または入手可能である、項目7から36のいずれかに記載の方法。
(項目38)
(a)フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
(c)前記架橋剤を除去するために、ステップ(b)で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって、前記足場を形成することを含む、項目7から36のいずれかに記載の方法。
(項目39)
フィブリノゲンが、75%、80%、85%、90%、95%、97%または99%の1つを超える純度レベルで存在する、項目37または項目38に記載の方法。
(項目40)
フィブリノゲンが、切断型のフィブリノゲン、例えばフィブリンA、フィブリンB、フィブリンC、フィブリンD、フィブリンXおよびフィブリンYとして存在する、項目37から39のいずれかに記載の方法。
(項目41)
前記切断型のフィブリノゲンが、フィブリンEである、項目40に記載の方法。
(項目42)
フィブリノゲンが、リン酸緩衝食塩水(PBS)またはHEPES緩衝食塩水でpH4~10の間に緩衝化された水溶液として存在する、項目37から41のいずれかに記載の方法。
(項目43)
前記凝固剤が、酵素または非酵素凝固剤を含む、項目37から42のいずれかに記載の方法。
(項目44)
前記凝固剤が、トロンビン、例えばヒトトロンビンである、項目43に記載の方法。
(項目45)
ステップ(a)が、発泡剤と混合することを含む、項目37から44のいずれかに記載の方法。
(項目46)
前記発泡剤が、非イオン性洗浄剤、温度感受性ゲル化界面活性剤(例えばプルロニック127)、ジホスファチジルグリセロールタイプのリン脂質または不混和性相とフィブリノゲン水溶液相の混合物を含み、好ましくは前記発泡剤が、プルロニック界面活性剤、例えばプルロニックF68および/またはプルロニックF127、より好ましくはプルロニックF68を含む、項目45に記載の方法。
(項目47)
前記発泡剤が、糖界面活性剤のクラスの1種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、項目45または項目46に記載の方法。
(項目48)
前記発泡剤が、糖アシル界面活性剤のクラスの1種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
前記発泡剤が、C 8 ~C 12 のアシル鎖長を有する糖アシル界面活性剤のクラスの発泡剤である、項目48に記載の方法。
(項目50)
前記発泡剤が、少なくとも2種、好ましくは3種の糖界面活性剤を含むか、またはそれからなる、項目47から49のいずれかに記載の方法。
(項目51)
前記発泡剤の糖アシル界面活性剤が、ピラノシド(特に、グルコピラノシド)、マルトシド、およびアシルスクロース界面活性剤のクラスから選択される、項目48から50のいずれかに記載の方法。
(項目52)
前記糖アシル界面活性剤が、OGP、ODM、DGPおよびDdGP、TGP、HGP、DMP、デシルスクロース(nDS)、ドデシルスクロース(nDdS)、好ましくはOGM、DMPおよびDdGPからなる群から選択される、項目48から51のいずれかに記載の方法。
(項目53)
ステップ(b)で使用される前記架橋剤が、カルボジイミドカップリング剤、例えばN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイニド(ethylcarbodiiniide)(EDC);N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、アジドカップリング剤;ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレンジイソシアネート;エポキシド架橋剤、例えばエピクロロヒドリン、グリシジルエーテルおよびグリシジルアミン;ならびにアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールから選択される、項目37から52のいずれかに記載の方法。
(項目54)
前記架橋剤が、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールを含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
前記アルデヒド架橋剤が、グルタルアルデヒドである、項目54に記載の方法。
(項目56)
還元剤または毒性低減剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたはリシンを添加するステップをさらに含む、項目37から55のいずれかに記載の方法。
(項目57)
前記混合ステップ(a)が、例えば曝気により混合して発泡させることによって達成される、項目37から56のいずれかに記載の方法。
(項目58)
ステップ(a)で得られた前記混合物が、前記インキュベーションステップ(b)の前にキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥される、項目37から57のいずれかに記載の方法。
(項目59)
二価または多価金属イオン、例えばカルシウム、例えば塩化カルシウムを添加するステップをさらに含む、項目37から58のいずれかに記載の方法。
(項目60)
混合ステップ(a)のための前記混合物が、タンパク質安定剤として糖をさらに含み、
前記糖が、小さいポリオールまたは炭水化物、例えばグリセロール、ソルビトール、スクロースまたはトレハロースである、項目37から59のいずれかに記載の方法。
(項目61)
前記糖が、ステップ(a)の前記混合物中、フィブリノゲンに対して好ましくは10~11wt%の量、好ましくは4~7.5wt%の量のトレハロースである、項目60に記載の方法。
(項目62)
(i)ステップ(a)の前記混合物が、前記インキュベーションステップ(c)の前に、所定の形状の型でキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥されるか、または(ii)ステップ(d)の生成物が、所定の形状の型で生成され、次に前記生成物が凍結され、任意選択で凍結乾燥されるかのいずれかである、所定の形状を有する細胞外マトリックス組成物を調製するための、項目37から61のいずれかに記載の方法。
(項目63)
前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムである、項目37から62のいずれかに記載の方法。
(項目64)
前記増量剤が、グリコサミノグリカン(GAG;例えばコンドロイチン6-硫酸、コンドロイチン4-硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン)である、項目37から63のいずれかに記載の方法。
(項目65)
前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択される、項目37から64のいずれかに記載の方法。
(項目66)
項目6から65のいずれかに記載の方法によって得られた、または入手可能である、細胞外マトリックス材料。
(項目67)
リン酸カルシウム鉱物相が、前記細胞外マトリックス材料の重量の少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%である、項目1から5または66のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
(項目68)
in vitro、ex vivoもしくはin vivoでの骨再生のため、または骨欠損の処置のための医薬品の製造において使用するための、項目1から5または66に記載の細胞外マトリックス組成物の使用。
(項目69)
項目1から5または66に記載の細胞外マトリックス材料を、骨欠損、例えば創傷または骨折に適用するステップを含む、骨再生の方法。
(項目70)
in vitro、ex vivoもしくはin vivoでの骨再生において使用するため、または骨欠損を処置するための、項目1から5または66のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
(項目71)
リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、項目1から5または66のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
(項目72)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、項目7から65のいずれかに記載の方法。
(項目73)
リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、項目1から5または66のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
(項目74)
リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および/または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、項目1から5、66または73のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
(項目75)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、項目7から65のいずれかに記載の方法。
(項目76)
前記リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および/または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、項目7から65のいずれかに記載の方法。
材料および方法
・Smart Matrix(登録商標)の調製
Smart Matrixの製造方法は、3つの別個の段階で行われる。
1)予め加温した(37℃)試薬を激しく混合して(4000rpm)、白色の発泡物を形成し、それを、型にキャスティングし、37℃で1時間インキュベートして凝固させる。
2)80%無水エタノール/20%MES緩衝液中、0.2%vol/volのグルタルアルデヒド(Sigma-Aldrich、UK)を用いて室温で4時間、化学的に架橋した後、diH2Oで1回洗浄し(10分)、diH2O中0.1%wt/volのNaBH4(Sigma-Aldrich、UK)で1回洗浄し(一晩)、diH2O中0.1%wt/volのNaBH4で5回洗浄し(10分)、diH2Oで5回洗浄して(10分)、残留している可能性がある任意のグルタルアルデヒドおよびその還元剤NaBH4を排除する。
3)-40℃で36時間、足場を凍結乾燥させる(Virtis Genesis Freeze Dryer、Biopharma、UK)。
・MES緩衝液、pH=7.4中、2%wt/volのアルギン酸塩(Novamatrix、Norway)3ml
・diH2O中1M CaCl2(Sigma-Aldrich、UK)25μl
・MES/NaCl緩衝液、pH=7.4中、2%wt/volの透析ヒトフィブリノゲン(RiaSTAP(登録商標)、CSL Behring Ltd.、UK)(Sharmaら、2015年)またはウシフィブリノゲン(Sigma-Aldrich、UK)6ml
・界面活性剤ミックス[diH2O中20%wt/volのPluronic F-68(Sigma-Aldrich、UK)、diH2O中20%wt/volのデシル-β-d-マルトピラノシド(Sigma-Aldrich、UK)、diH2O中20%wt/volのドデシル-β-d-グルコピラノシド(Sigma-Aldrich、UK)、およびdiH2O中20%wt/volのオクチル-β-d-マルトピラノシド(Sigma-Aldrich、UK)](WO2013164635A1)750μl
・HEPES/NaCl緩衝液、pH7.4中、10I.U./mlのヒトトロンビン(TISSEEL(登録商標)、Baxter International Inc.、US)または透析ウシトロンビン(Sigma-Aldrich、UK)1.2ml
・diH2O中66%wt/volのトレハロース(Fisher Scientific、UK)1.5ml
SBF溶液を、Kokuboら、1990年によって記載されているプロトコールに従って調製した。SBF溶液は、定義された濃度の関連するイオンを含有していた(表1)。
SEMおよびEDX分析を、ロンドン大学クイーンメアリーのNanovision Centreで実施した。
・横断面のVon Kossa染色
1cm×1cmのCaP-SM足場(SBFへの浸漬時間当たりn=3)を、12ウェルプレートに入れた。足場ディスクを入れた各ウェルに、ベルセン溶液中0.25%トリプシン2.5mlを添加し、プレートを、5%CO2を用いて37℃でインキュベートした。0、2、4、6、24、48、および168時間(7日)目に、各ウェルから得られた一定分量100μlを、エッペンドルフチューブに移し、-80℃で保存した。各ウェルに、ベルセン溶液中、新しい0.25%トリプシン100μlで補充した。
3人の異なるドナーから得られた正常なヒトの初代皮膚線維芽細胞を使用した。細胞を単離し、既に記載されている通り培養した(Sharmaら、2015年)。
播種したCaP-SM足場を、10日間培養した後、4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン組織学的検査のために処理した。横断面を、ミクロトームを使用して厚さ4μmにカットした。
結果
・SEMおよびEDX分析
図1のSEM画像は、Smart Matrix(登録商標)が、線維から構成された均一で均質な材料であることを示している。この材料は、ミクロ多孔性(30~350μm)ならびにナノ多孔性(0.06~0.6μm)を有している。細孔は、相互接続しているように見える。
図5は、使用したSmart Matrix(登録商標)足場のエオシン染色(左)およびエオシンを用いた対比染色によるVon Kossaで染色された足場(右)を示す。図から分かる通り、Smart Matrix(登録商標)は、Von Kossa染色の後、より暗色に見える。SEM写真で既に観測された通り、足場の均質な開口細孔構造を見ることもできる。
図7は、SBFへの浸漬時間が延長すると、足場のin vitro分解速度が低下することを示している。分解速度は、特に、Smart Matrix(登録商標)と比較して、最初の6時間で低下する。これらの結果は、CaP-SMが、ブタモデルの全層皮膚創傷への埋め込み後5~6週間まで、組織学的切片に観測されたSmart Matrix(登録商標)よりも、in vivoで分解するのにより長時間かかり得ることを示唆している。in vivoでの新しい骨形成は、4カ月間までかかり(HadjidakisおよびAndroulakis 2006年)、したがって、骨の修復にとって、CaP-SMの分解がより緩慢であることが有益であると予測されることを示唆している。
図8に示されている結果は、細胞がCaP-SM足場上で成長し、増殖できることを示しており、このことは、生物模倣法によって堆積したCaPが、細胞にとって毒性ではないことを示唆している。
図9の写真は、正常なヒトの初代皮膚線維芽細胞が、CaP-SM足場を介して遊走することができ、10日間培養した後、足場全体に定植したことを示している。
代替足場を形成するための材料および方法
代替足場を、前述した通り、Smart Matrix(登録商標)をSBF溶液に浸漬させることによって配合した。
SM1:dH2Oに24時間浸漬させたSmart Matrix(登録商標)足場(CaP-SM1の対照)。
SM2:dH2Oに48時間浸漬させた、凍結乾燥させたSM1足場(CaP-SM2の対照)。
CaP-SM1:SBF-1に24時間浸漬させたSmart Matrix(登録商標)足場。CaP鉱物堆積物は、球状形態を示す。
CaP-SM2:SBF-3にさらに48時間浸漬させた、凍結乾燥させたSmartCaP1足場。CaP鉱物堆積物は、プレート様の形態を示す。
代替足場を試験するための方法および結果
a)走査電子顕微鏡(SEM)およびエネルギー分散X線分光法(EDX)
CaP堆積物における官能基の分析を、FTIRによって行った。足場を、減衰全反射アクセサリー(Golden Gate ATR、Specac、UK)と接触させて置くことによって、スペクトルを得た。スペクトルソフトウェアv5.0.1(Perkin-Elmer、UK)によって、各化学基のピーク強度を同定した(波数は、500~4000cm-1の間で固定し、分解は4cm-1とした)。
図13は、エオシンを用いた対比染色によるVon Kossaで染色された足場を示している。図13では容易には目に見えないが、CaP鉱物堆積物は、黒色/暗褐色に染色されており、フィブリン線維は、ピンク色/赤色に染色されている。図13から観測される通り、CaP鉱物堆積物は、足場構造全体に見出され、このことは、足場全体にCaPが均質に堆積したことを示唆している。SM1およびSM2対照試料にはCaP鉱物堆積物は観測されなかった。
レオロジーは、材料ならびに生体組織の粘弾特性(固体および流体の両方)を研究する工学部門である(Holtら、2008年;Saitohら、2010年)。Kinexusレオメータ(Malvern Instruments、UK)を振動モードで使用した。各足場から、2cm×2cmの試料を調製し、2つの直径20mmの並行プレートの間に置いた(プレート間の間隔=0.3mm)。試料を水和させ、統合温度調節器を使用して、試料ステージの温度を20℃に維持した。「振幅掃引」および「周波数掃引」を含めた測定の組合せを、各試料に対して行った。「振幅掃引」は、0.05から5%に線形増加する調節応力を適用することによって実施した。応力に対応する歪みを記録した。発振周波数は、1Hzに維持した。線形粘弾性領域(LVER)内の最大の歪みは、「振幅掃引」から選択された。せん断または貯蔵弾性率G’を、異なる試料について算出した。G’は、弾性に関するものであり、材料が、どのようにして弾性変形の形態で再使用することができるエネルギーを貯蔵するかの指標となる。したがって、G’は、材料の固体の特徴に関する。
足場(Smart Matrix(登録商標)、脱塩骨マトリックスまたはDBM、CaP-SM1およびCaP-SM2)を、5mm×5mmの正方形の小片にカットした後、pH7.2の1%トリプシンで37℃において48時間まで処理した。足場を、対照としてのPBS単独に浸漬させた。試料を、0時間、18時間、24時間および48時間目に、キャノンのカメラを使用して巨視的に画像化し、立体顕微鏡を使用して微視的に画像化した。
足場(対照として使用したSmart Matrix(登録商標)、CaP-SM1およびCaP-SM2)を、5mm×5mmの正方形の小片にカットし、70%IMSで滅菌し、PBSで3回洗浄し、平底24ウェル超低接着プレートに入れた。足場に、培地20μl中、1×105個のMC3T3-E1サブクローンマウス前骨芽細胞(骨前駆細胞)を播種した。播種した後、プレートを、37℃において5%CO2を用いて3時間インキュベートして、細胞を足場に接着させた。接着のためのインキュベーション時間が経過した後、骨形成補充物(50μg/mlのアスコルビン酸、10mMのβ-グリセロリン酸塩および100nMのデキサメタゾン)を含む(+OM)または含まない(-OM)、αMEM(1%抗生物質および10%ウシ胎仔血清を含むイーグル最小必須培地アルファ改変型)1mlを、ウェルごとに添加し、37℃において5%CO2を用いて28日間にわたって培養した。
播種したCaP-SM足場を、28日間培養した後、実施例1と同様に4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン組織学的検査のために処理し、標準ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色した。
標準条件または骨形成条件下のいずれかで28日間培養した後、播種した足場を、2.5%グルタルアルデヒドで固定した。1時間の1%四酸化オスミウム(Sigma-Aldrich)による固定の前後に、試料を0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。この後、等級シリーズのIMS(20%~60%)およびエタノール(70%~100%)によって試料を脱水させた。試料を、100%エタノール中に残し、エタノールを一晩で蒸発させた。乾燥させた細胞化試料および無細胞試料をスタブにマウントし、炭素コーティングし(Agar Auto Sputter Coater、Agar Scientific)、SEM顕微鏡(FEI Inspect F、Oxford Instruments、Oxford、UK)で観察した。
足場(対照として使用したSmart Matrix(登録商標)、CaP-SM1およびCaP-SM2)を、既に説明した通り、5mm×5mmの正方形の小片にカットし、滅菌し、1×105個のMC3T3-E1を播種し、標準培地および骨形成培地の両方で培養した。
足場の潜在的な血管新生促進可能性を、ex ovo絨毛性尿膜(CAM)アッセイを使用して評価した。足場(対照として使用したSmart Matrix(登録商標)、CaP-SM1およびCaP-SM2)を、5mm×5mmの正方形の小片にカットし、70%IMSで滅菌し、PBSで3回洗浄した。陰性および陽性対照を、足場と平行に実施した。濾紙に、PBS(陰性)または10ng/mlの血管内皮成長因子(VEGF)溶液(陽性)のいずれかを浸み込ませた。ニワトリの有精卵を、37.5℃、3%CO2でインキュベートし、湿度を35%~45%の間に維持した。インキュベーション後3日目に、胚を、湿度75~80%およびインキュベーション温度37.5℃で、卵殻を含まない培養系に移した。卵殻なしの培養時間が経過して6日目に、足場を、成長しているCAM上に適用した。すべての足場の血管新生を、立体顕微鏡を使用して写真を撮影することによって巨視的に調査した。ImageJソフトウェアを使用して、巨視的写真を分析し、足場ごとの血管面積の百分率を算出した。
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Claims (37)
- フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場であって、前記フィブリンまたはフィブリノゲンおよび前記増量剤が架橋されており、前記増量剤が前記フィブリンまたはフィブリノゲンに架橋されている、足場、ならびに
前記足場上に堆積しているセラミック
を含む、細胞外マトリックス材料。 - 前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相であるか、またはリン酸カルシウム鉱物相を含む、請求項1に記載の細胞外マトリックス材料。
- (ai)前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムである、
(aii)前記増量剤が、グリコサミノグリカン(GAG;例えばコンドロイチン6-硫酸、コンドロイチン4-硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン)である、あるいは
(aiii)前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択される、請求項1または請求項2に記載の細胞外マトリックス材料。 - 細胞外マトリックス材料を調製するための方法であって、セラミックを、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場上に堆積させるステップを含み、ここで、前記フィブリンまたはフィブリノゲンおよび前記増量剤が架橋されており、前記増量剤が前記フィブリンまたはフィブリノゲンに架橋されている、方法。
- 前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相である、請求項4に記載の方法。
- 前記リン酸カルシウム鉱物相が、生物模倣堆積によって前記足場上に堆積させられる、請求項5に記載の方法。
- リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、Ca2+およびHPO4 2を含み、任意選択でi)Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、HCO3 -,HPO4 2-およびSO4 2-、ii)Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、HCO3 -およびHPO4 2-、またはiii)Na+、K+、Ca2+をさらに含む流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項5または請求項6に記載の方法。
- 前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項5から7のいずれかに記載の方法であって、前記流体が、
(bi)1~30mMのCa2+、好ましくは1~20mMのCa2、あるいは1~5mMのCa2+、好ましくは2~3mMのCa2+、最も好ましくは約2.5mMのCa2+、あるいは10~30mMのCa2+、
(bii)0.5~10mMのHPO4 2-、あるいは0.5~3mMのHPO4 2-、好ましくは0.5~2mMのHPO4 2-、最も好ましくは約1mMのHPO4 2-、あるいは5~10mMのHPO4 2-、
(biii)100~800mMのNa+、あるいは100~200mMのNa+、好ましくは120~160mMのNa+、さらにより好ましくは140~150mMのNa+、最も好ましくは約142mMのNa+、あるいは500~800mMのNa+、
(biv)1~50mMのK+、あるいは1~10mMのK+、好ましくは3~7mMのK+、最も好ましくは約5mMのK+、あるいは10~40mMのK+、
(bv)0.5~20mMのMg2+、あるいは0.5~3mMのMg2+、好ましくは1~2mMのMg2+、最も好ましくは約1.5mMのMg2+、あるいは5~15mMのMg2+、
(bvi)100~800mMのCl-、あるいは100~200mMのCl-、好ましくは120~160mMのCl-、より好ましくは140~150mMのCl-、最も好ましくは約148.8mMのCl-、あるいは500~800mMのCl-、
(bvii)1~100mMのHCO3 -、あるいは1~10mMのHCO3 -、好ましくは2~8mMのHCO3 -、より好ましくは4~5mMのHCO3 -、最も好ましくは約4.2mMのHCO3 -、あるいは10~100mMのHCO3 -、ならびに
(bviii)1~10mMのSO4 2-
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数を含む、方法。 - 前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、1~5mMのCa2+、0.5~3mMのHPO4 2、100~200mMのNa+、1~10mMのK+、0.5~3mMのMg2+、100~200mMのCl-および1~10mMのHCO3 -を含む流体もしくは2~3mMのCa2+、0.5~2mMのHPO4 2-、120~160mMのNa+、3~7mMのK+、1~2mMのMg2+、120~160mMのCl-および2~8mMのHCO3 -を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項8に記載の方法。
- 前記足場が、少なくとも12時間、少なくとも24時間、少なくとも2日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間、または少なくとも9日間、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、ならびに/あるいは
前記足場が、20日間まで、好ましくは10日間まで、最も好ましくは9日間まで、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、請求項7から9のいずれかに記載の方法。 - 前記足場が、
(a)フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
(c)前記架橋剤を除去するために、ステップ(b)で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって得られた、形成された、または入手可能である、請求項5から10のいずれかに記載の方法。 - (a)フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
(b)ステップ(a)で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
(c)前記架橋剤を除去するために、ステップ(b)で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって、前記足場を形成することを含む、請求項5から10のいずれかに記載の方法。 - フィブリノゲンが、75%、80%、85%、90%、95%、97%または99%の1つを超える純度レベルで存在する、請求項11または請求項12に記載の方法。
- フィブリノゲンが、切断型のフィブリノゲン、例えばフィブリンA、フィブリンB、フィブリンC、フィブリンD、フィブリンXおよびフィブリンYとして存在する、請求項11から13のいずれかに記載の方法。
- 前記切断型のフィブリノゲンが、フィブリンEである、請求項14に記載の方法。
- フィブリノゲンが、リン酸緩衝食塩水(PBS)またはHEPES緩衝食塩水でpH4~10の間に緩衝化された水溶液として存在する、請求項11から15のいずれかに記載の方法。
- 前記凝固剤が、酵素または非酵素凝固剤を含む、請求項11から16のいずれかに記載の方法。
- 前記凝固剤が、トロンビン、例えばヒトトロンビンである、請求項17に記載の方法。
- ステップ(a)が、発泡剤と混合することを含む、請求項11から18のいずれかに記載の方法。
- 前記発泡剤が、非イオン性洗浄剤、温度感受性ゲル化界面活性剤、ポロキサマー、ポロキサミン、ジホスファチジルグリセロールタイプのリン脂質または不混和性相とフィブリノゲン水溶液相の混合物を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記発泡剤が、糖界面活性剤のクラスの1種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、請求項19または請求項20に記載の方法。
- 前記発泡剤が、糖アシル界面活性剤のクラスの1種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記発泡剤が、C8~C12のアシル鎖長を有する糖アシル界面活性剤のクラスの発泡剤である、請求項22に記載の方法。
- 前記発泡剤が、少なくとも2種、好ましくは3種の糖界面活性剤を含むか、またはそれからなる、請求項21から23のいずれかに記載の方法。
- 前記発泡剤の糖アシル界面活性剤が、ピラノシド(特に、グルコピラノシド)、マルトシド、およびアシルスクロース界面活性剤のクラスから選択される、ならびに/あるいは
前記糖アシル界面活性剤が、OGP、ODM、DGPおよびDdGP、TGP、HGP、DMP、デシルスクロース(nDS)、ドデシルスクロース(nDdS)、好ましくはOGM、DMPおよびDdGPからなる群から選択される、請求項22から24のいずれかに記載の方法。 - ステップ(b)で使用される前記架橋剤が、カルボジイミドカップリング剤、例えばN-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイニド(ethylcarbodiiniide)(EDC);N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、アジドカップリング剤;ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレンジイソシアネート;エポキシド架橋剤、例えばエピクロロヒドリン、グリシジルエーテルおよびグリシジルアミン;ならびにアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールから選択される、請求項11から25のいずれかに記載の方法。
- 前記架橋剤が、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールを含む、請求項26に記載の方法。
- 前記アルデヒド架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項27に記載の方法。
- 前記方法が、
(ci)前記方法が、還元剤または毒性低減剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたはリシンを添加するステップをさらに含むこと、
(cii)前記混合ステップ(a)が、例えば曝気により混合して発泡させることによって達成されること、
(ciii)ステップ(a)で得られた前記混合物が、前記インキュベーションステップ(b)の前にキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥されること、
(civ)前記方法が、二価または多価金属イオン、例えばカルシウム、例えば塩化カルシウムを添加するステップをさらに含むこと、ならびに
(cv)混合ステップ(a)のための前記混合物が、タンパク質安定剤として糖をさらに含み、前記糖が、小さいポリオールまたは炭水化物、例えばグリセロール、ソルビトール、スクロースまたはトレハロースであること
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数の特徴を含む、請求項11から28のいずれかに記載の方法。 - 前記糖が、ステップ(a)の前記混合物中、フィブリノゲンに対して好ましくは10~11wt%の量、好ましくは4~7.5wt%の量のトレハロースである、請求項29の(cv)に記載の方法。
- 所定の形状を有する細胞外マトリックス材料を調製するための、請求項11から30のいずれかに記載の方法であって、前記方法が、
(di)ステップ(a)の前記混合物が、前記インキュベーションステップ(b)の前に、所定の形状の型でキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥されること、
(dii)前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムであること、
(diii)前記増量剤が、グリコサミノグリカン(GAG;例えばコンドロイチン6-硫酸、コンドロイチン4-硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン)であること、ならびに
(div)前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択されること
からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数の特徴を含む、方法。 - 請求項4から31のいずれかに記載の方法によって得られた、または入手可能である、細胞外マトリックス材料。
- 前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相であるか、またはリン酸カルシウム鉱物相を含み、かつ
前記 リン酸カルシウム鉱物相が、前記細胞外マトリックス材料の重量の少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも50%である、あるいは
前記 リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、
請求項1、3または32のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。 - 医薬品の製造において使用するための、請求項1から3または32に記載の細胞外マトリックス材料の使用であって、前記医薬品がin vitro、ex vivoもしくはin vivoでの骨再生のため、または骨欠損の処置のためのものである、使用。
- 請求項1から3または32のいずれか一項に記載の細胞外マトリックス材料を含む組成物であって、
前記組成物は、骨再生のための組成物であり、骨欠損、例えば創傷または骨折に適用されることを特徴とする、組成物であるか、あるいは
前記組成物は、in vitro、ex vivoもしくはin vivoでの骨再生において使用するため、または骨欠損を処置するための組成物である、組成物。 - 前記リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、
前記リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、あるいは
前記リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および/または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、
請求項5から31のいずれかに記載の方法。 - 前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相であるか、またはリン酸カルシウム鉱物相を含み、かつ
前記 リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、ならびに/あるいは
前記 リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および/または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、請求項1、3または32のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
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