JP2015515872A - 細胞外マトリックス−合成皮膚足場 - Google Patents
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Abstract
Description
安定化剤としてのトレハロースの有用な濃度範囲は、2.5〜20%である。より具体的には、下記のように、5〜11%(アルギン酸塩及び界面活性剤の添加の前後)が、足場製造において有効であると示された。これは、飽和ストック溶液を使用することにより達成され得る。
本発明は:
1.凝固前の溶液の安定化;
2.高い泡塊安定性を有する適切な界面活性剤;
3.適切な束一的な増量剤;
4.トロンビン又は他のフィブリノーゲン選択的プロテアーゼの添加による酵素的凝固;
を許容するフィブリノーゲン混合物の一種である。
Smart Matrix Synthetic Dermal Replacement
本発明の足場の種類の一つの態様は、皮膚置換足場である。Smart Matrix Synthetic Dermal Replacement (SDR)は、一次癒合で治癒し得ない大きい全層皮膚損傷の治療を想定した組織修復足場である。斯かる創傷には、以下の3つの一般的な分類が存在する。
1.急性外傷性組織損傷、例えば火傷、発破傷(blast wound)、脱手袋損傷(de−gloving injury)等。
2.外科的切除傷、例えば大型の扁平上皮細胞癌/メラノーマ等。
3.慢性傷、例えば静脈下腿潰瘍、糖尿病性脚部潰瘍、及び褥瘡等。
一つの態様において、SDRは、白色、凍結乾燥、泡塊状材料で、厚さ1〜5mmで、様々なサイズで利用でき、様々な部位の創傷に適用出来る。適切なサイズに切り取られてもよい。
SDRは微細孔質合成マトリックスである。微細孔質合成マトリックスの物理的構造は、細胞の増殖を支持する環境を提供することが知られている(例えばDagalakis et al, 1980、O’Brian, 2005)。SDRは、組織再生に関わる細胞の迅速な侵入を可能とし、その構造の迅速な細胞化(cellularisation)及び血管新生を引き起こす。細胞化が達成された時点で、SDRは実質的に分解している。
−全層皮膚欠損において創傷治癒を補助する。
−再生足場として機能する。
−迅速な血管新生及び細胞増殖を支持する。
−分層皮膚移植用の安定な新皮(neodermis)をもたらす。
急性外傷性創傷、外科的切除傷、又は慢性潰瘍による全層皮膚欠損における使用
前記生産物は、全層創傷に対する公知の臨床的治療の付属物として想定される。慢性潰瘍において、潰瘍の根本的な原因は、適切な臨床的管理を必要とし得る。
創傷は外科的に創傷清拭されるか、又は壊死及び細菌感染した組織片を除去した後に、滅菌条件下でSDRで治療されなければならない。
前記SDRは、滅菌されて、剥離パウチ内の金属箔密封トレイ中に個別に包装されて提示される。
Dagalakis, N., J. Flink, P. Stasikelis, J. F. Burke and I. V. Yannas (1980). “Design of an artificial skin. Part III. Control of pore structure.” J Biomed Mater Res 14(4): 511−28.
O’Brien, F. J., B. A. Harley, I. V. Yannas and L. J. Gibson (2005). “The effect of pore size on cell adhesion in collagen−GAG scaffolds.” Biomaterials 26(4): 433−41.
凝固
候補混合物を1ml光学キュベット中で調製し、425nmでモニターした。混合物は、最初にトロンビン無しで調製されて、水ブランクに対するベースライン吸光データを測定した。そしてトロンビンが添加され、転回により混合された混合物(パラフィルム)及び吸光度を、凝固が完遂するまで毎分測定した。時間差及び凝固速度のデータを、各プロフィールから求めた。凝固終了時、足場のゲル硬度が手動で評価され、界面活性剤を用いないフィブリンを100%ゲルとして、パーセンテージスケール上で主観的に評点された。
方法:
試験成分をフィブリノーゲンと混合し、425nmで光学密度(OD)を測定して、溶液の濁度(turbidity)、即ち混濁(cloudiness)を測定した(広範囲の他の任意の波長を測定しても類似の結果が得られる)。
カルシウム(言及無い場合CaCl2)、濃縮ストック溶液(例えば1M CaCl2)
フィブリノーゲン(ヒト又はウシ:hFbg/bFbg)、(FybexはhFbg、Bioproducts Laboratories, Dagger Lane, Elstree, Herts, UK)
希釈剤(典型的にはHEPES/ NaCl; HEPES 25mM, NaCl 150mM pH 7.4)
安定化剤(好ましくはトレハロース、飽和ストック溶液から添加)
界面活性剤
−これらを混合し、凝固前の測定を行う。
−そしてトロンビンを添加し、その時点を凝固t=0とする。
−凝固が完遂するまで、又はODが範囲外(>2.5)となるまで毎分測定する。
−イオン強度(25−400mM NaCl)
−アニオン及びカチオン効果(Na+に代えてK+/Cl−に代えてSO4又はHEPES)
−イオン環境(MES、HEPES、TRISの緩衝剤pKaの効果)
−pH(6.7〜7.4)
−増量剤、アルギン酸の効果
−低分子量炭水化物の効果(グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース、トレハロース)
−非イオン性界面活性剤の効果(PluronicシリーズF127及びF68)Tween20、Triton X100及びOGP。
これらの研究は、フィブリノーゲンの溶解性及び酵素的(トロンビン触媒)凝固に影響する要素(Smart Matrix製造混合物の潜在的成分)を評価するものである。
フィブリノーゲンの沈殿及び凝固に対する効果
イオン強度
イオン強度の増大は凝固速度の比例的阻害をもたらし、低イオン強度は沈殿をもたらす。60mM近辺のイオン強度の増大は、フィブリノーゲン溶解度に対して、塩溶(salting−in)効果を有する。NaClは、界面活性剤と共にFbg溶液を維持する(例えば150mMから100mMの減少は、1%F68により引き起こされるFbg沈殿をもたらす)。
ナトリウムをカリウムで置き換えると、Fbg沈殿が増大する。
塩化物をHEPES、TRIS又は硫化物に置き換えると、Fbg沈殿が増大する。
グリシン(最大0.2M)は、Fbg沈殿を増大させ、凝固を促進した。
凝固は6.7より7.4でより急速に起こるが、緩衝系により異なる:MES>HEPES>TRIS(即ちpKaの低い緩衝剤ほど、Fbg/AA混合物中により急速に凝固をもたらす)。
アルギン酸(AA)は、Fbg(1%)と同じ質量/体積辺りで、Fbg沈殿を引き起こし、凝固を促進する。37℃に加熱すると効果は減少した。
グリセロール(5〜10%)、ソルビトール(22〜32%)、スクロース(15〜50%)、ラフィノース、及びトレハロース(10〜66%)は、Fbg沈殿を減少させ、凝固を阻害する。これらは、アルギン酸塩及び/又は界面活性剤の添加によるFbg沈殿も減少させる。
Pluronic F127又はF68は、0.5%より上でFbg沈殿を引き起こし、凝固を促進する。
・イオン強度の増大、37℃への加熱、低分子炭水化物(グリセロール、ソルビトール、スクロース、トレハロース)により低下する。
・アルギン酸、4℃への冷却により増大する。
これらの実験からの一つの一般的な結論は、幾つかの要素が、タンパク質溶液の安定性を増大させ、また酵素的凝固を阻害する効果を有することである(例えば、NaCl、グリセロール、スクロース、トレハロース、OGP)。
標準化された手順に従い足場を製造した。要するに、当該製造は、以下の手順を含む。
1.全ての試薬を調製する。
2.混合チャンバー(逆さの開口したシリンジ)への試薬の連続的に添加する。塩化カルシウム、フィブリノーゲン、トレハロース、トロンビン、10秒間静かに旋回後、アルギン酸塩、そして強く混合(泡立て器(whisk)、6000rpm)を開始し、30秒間継続し、15秒時点で界面活性剤を加える。
3.加湿インキュベーター中37℃で成形及びインキュベートする。
4.0.1m MES pH7.4、80%エタノール中、0.2%グルタルアルデヒドで架橋する(4時間)。
5.水素化ホウ素ナトリウム0.1%水溶液で1時間還元し、その後10分間4回洗浄する。
6.水で10分間5回洗浄する。
7.凍結乾燥させる。
外科用メスを用いて調製された足場から試料が切り取られ、「組織学的」処理のために蝋で包埋された。標準的な組織学的方法により、切片を切り出し(5μm)、エオシンで染色され、検鏡用にDPXをマウントした。LeicaDC200デジタルカメラ及びLC50イメージソフトウエアインターフェースを用いて10倍で切片の連続画像を保存した。連続画像は、評価のためにデジタル的に「縫合」された(ICEソフトウエア)。
(i)画像解析(孔サイズ分布)
足場の顕微鏡切片の個々の孔サイズを、ImageJソフトウエアを用いて測定した。
画像は、孔サイズ、ラメラ密度、並びに孔サイズ及び上下分布の均一性を評価された。
これらの一連の実験の幾つかの足場製剤は、以下について評価された。
(i)インビトロでの繊維芽細胞の侵入
(ii)インビボでのブタ全層創傷治癒モデルにおける導入
幾つかの足場は、LM解析を確証するために、SEMにより画像化された。
OGPは内在性膜タンパク質の溶解に使用される洗剤であり、最終的なタンパク質抽出物から容易に除去出来る。OGPは20重量%の濃度でdH2O中に溶解し、比較的安定な泡塊を形成し、凝固試験においてフィブリノーゲン溶解度と比較的高い適合性を有するので、現在の製剤において界面活性剤として使用される。OGPは、4:1でPluronic(F−68)と共に使用される。斯かる比率は、泡塊を安定化させるのに最も有効であることが見出されている。この製剤は、視覚的、組織学的、及び凝固アッセイ解析により、かなりの量の安定な泡塊を製造することが判明している。トレハロースは、溶液安定効果を有するが、他と比較してトロンビン凝固を強力に阻害しない、「ポリオール」として選択された。この製剤は、「Smart Matrix(商標)最適化製剤#1」と名付けられた。具体的な組成は、以下の通りである。
1.CaCl2 1Mストック溶液。dH2Oで調製されたもの(16.2μl)。混合物中で約2mMとなる。
2.2重量%フィブリノーゲンタンパク質。Mes/NaCl中で調製されたもの(3ml)。
3.66重量%トレハロース飽和ストック溶液。dH2O中で調製されたもの(600μl)。
4.トロンビン(750μl)10IU/mlストック。
5.2重量%アルギン酸。MES/NaCl中で調製されたもの(1.5〜3ml)。
6.20重量%OGP。dH2O中で調製し、20重量%F68と4:1で混合する(750μl)。
「SMOF#1」を使用した足場成形は、良好な泡塊の形成を呈し、60mlの混合容器を完全に埋めた。凝固試験において、凝固開始の僅かな阻害が見られたが、タンパク質溶液の安定性は良好で、安定した固いゲルが得られた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。凝固開始から1時間後、上部から形成された泡と底部から形成された泡とのサイズの差は顕著となり、上部の泡がより大きくなった。この差は、架橋により維持された。組織的解析は、足場の上部に存在する泡のラメラは、下部よりも厚いことを示した。加えて、底部と比べて上部の孔サイズに、僅かだが明らかな差が見られた。これは、足場の均一性の低下をもたらすが、従来の実験よりも良好である。
Spansは、ソルビタンエステルとしても知られ、乳剤、クリーム及び軟膏の調製において乳化剤として使用される親油性非イオン性界面活性剤である。ソルビタンモノエステルのシリーズ(Span20、40、60及び80)の、Smart Matrix(商標)における孔の形成に及ぼす影響を観察した。Span20(S−20)及びSpan80(S−80)は粘液として入手され、一方Span40(S−40)及びSpan60(S−60)は、粉末として入手された。
足場の成形は、1%重量/体積の(OGP+F68)中のSpanを使用した。全てのSpansは良好に泡塊を形成したが、37℃1時間のインキュベーションで完全に崩壊した。SMOF#1+0.0106Span(20/40/60/80)による足場の製造は、良好な泡塊を呈し、60mlの混合容器を完全に埋めた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。S−80を使用した足場の成形は、上部から形成された泡と底部から形成された泡とのサイズの差は、他のSpansを使用した足場成形と比較して顕著でなかった。Spansを使用した足場成形の視覚的比較において、当該足場の上部の泡のサイズは、SMOF#1により製造された足場と比較して小さかった。
ODMは、OGPと密接に関連する水溶性非イオン性洗剤であり、膜タンパク質の可溶化及び単離にも使用される。ODMは追加の6炭素ピラノース環を有することにより、OGPよりもHLBが高い。ODMは、dH2O中に20重量%の濃度でOGPに代えて使用された。ODMにより製造された足場は、視覚的解析では良好に泡塊を形成した。
「SMOF#1+ODM」による足場の製造は、良好な泡塊の形成を呈し、60mlの混合容器を完全に埋めた。ODMの泡塊形成性能を観察するために、前記混合溶液を100ml混合容器中で調製して、全容積の60%まで泡立てた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後のレベルであっても叩いて落とすことが容易であった。「SMOF#1」により調製した足場と比較して、泡のサイズが顕著に小さかった。
DGPは、OGPよりも親油性の高いグルコピラノシドファミリーの洗剤である。水に急速に溶解しないため、溶解の際に電子レンジで5秒間加熱して、20重量%の溶液を作製する。
「SMOF#1+DGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の50%まで泡立てられ、当該泡塊はより硬く、成形後に叩いて落とすのが困難であった。「SMOF#1」により調製した足場と比較して、泡のサイズが顕著に小さかった。
DGPは、dH2O中20重量%の濃度で使用した。F−68と4:1(DGP:F−68)の比率で溶解され、電子レンジで15秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。DGP自体は、我々の研究室で既に構築されたように、良好に泡立たないため、OGPと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
「SMOF#1+DGP/OGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の80%まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DGPは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。F−68と4:1(DGP:F−68)の比率で溶解され、電子レンジで15秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。DGP自体は良好に泡立たないため、ODMと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
TGPは、OGPと密接に関連する水溶性非イオン性洗剤であり、膜タンパク質の可溶化及び単離にも使用される。TGPは、水溶液中で安定で、透析により容易に除去される。TGPは、dH2O中20重量%の濃度でOGPに代えて使用され、電子レンジで5秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。
「SMOF#1+TGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の60%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。形成された泡のサイズは上部と底部で顕著に差異が存在し、視覚的に観察した場合、足場の上部で、「SMOF#1」により調製した足場と比較してより大きい泡が見られた。
HGPは、OGPよりも親水性の強い穏和なイオン性洗剤である。HGPは、dH2O中20重量%の濃度でOGPに代えて使用され、電子レンジで5秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。
「SMOF#1+HGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の20%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。視覚的に観察した場合、形成された泡のサイズに顕著な低下が存在し、「SMOF#1」により調製した足場と比較して、足場の上部と下部との間での差異はそれほど顕著ではなかった。
DdGPは、天然状態(native state)で、内在性膜タンパク質を溶解するのに使用される洗剤として知られている。DdGPはOGPと類似しているが、より親油性が高い。
DdGPは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。F−68と4:1(DdGP:F−68)の比率で溶解され、電子レンジで15秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。DdGP自体は良好に泡立たないため、ODMと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。この界面活性剤が沈殿するのを防ぐため、実験の間中37℃ウォーターバス中でインキュベーションされた。
「SMOF#1+DdGP/OGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の80%まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DdGPは、dH2O中20重量%の濃度で使用され、F−68と4:1(DdGP:F−68)の比率で溶解され、電子レンジで15秒間加熱され、37℃ウォーターバス中に置いて、透明な溶液が得られた。上記のようにDdGPは、ODMと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。この界面活性剤が沈殿するのを防ぐため、実験の間中ウォーターバス中に置いた。
「SMOF#1+DdGP/ODM」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の80%まで泡立てられた。混合後、泡塊は固体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが困難であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DMPは、2つの炭素環に結合した12個の炭素原子鎖を有するイオン性洗剤である。
DMPは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。F−68と4:1(DMP:F−68)の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。DMP自体は良好に泡塊を形成しないため、OGPと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
「SMOF#1+DMP/OGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の75%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DMPは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。F−68と4:1(DMP:F−68)の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。DMP自体はOGPと同等に良好に泡塊を形成しないため、ODMと3:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。
「SMOF#1+DMP/ODM」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の75%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DMP、DdGP及びODMは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。各界面活性剤は、F−68と4:1(DMP:F−68)の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。DMP/F68自体は良好に泡塊を形成しないため、DdGP/F−68と2:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。ODM/F−68は、この溶液(DMP/F68+DdGP/F−68)に、1:3の比率で混合された。
「SMOF#1+DMP/DdGP/ODM」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の90%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。更に、37℃で1時間足場をインキュベーションした後、泡及び孔のサイズは、「SMOF#1」により調製した足場と比較して顕著に小さかった。
DMP、DdGP及びOGPは、dH2O中20重量%の濃度で使用された。各界面活性剤は、F−68と4:1(DMP:F−68)の比率で溶解されて、透明な溶液が得られた。DMP/F68自体は良好に泡塊を形成しないため、DdGP/F−68と2:1の比率で混合して、泡塊形成効果を増大させた。OGP/F−68は、この溶液(DMP/F68+DdGP/F−68)に、1:3の比率で混合された。
「SMOF#1+DMP/DdGP/OGP」により調製された足場は、100ml混合容器中で混合された。当該溶液混合物は、混合容器の全容積の90%まで泡立てられた。混合後、泡塊は流体の特性を呈し、成形後に叩いて落とすのが容易であった。成形後、当該泡は、足場の全深度で均一であった。
試験された主要な検討条件を以下に列挙する。
混合液中2〜50mM(1Mストック溶液から調製)
1.5〜12U/120mg Fbg[2%Fbg6ml=120mg]
2%溶液、最終混合物中で約1%に希釈される。
(pH7.4のNaOHを用いて溶解及び中和する)
シグマアルギン酸AA、
シグマアルギン酸ナトリウム、
ISP LKX、
ISP DMB、
ISP LB (Manucol LB)
ISP KC (Kelcolloidアルギン酸プロピルグリコール)、(K3B426)
ISP AA (アルギン酸H/LDB)
NovaMatrix High G-NM GVLMW (UP VLVG)
グリセロール 5%
トレハロース トロンビン添加前の混合物中10〜11%、トロンビン/アルギン酸塩/界面活性剤添加後4〜7.5%(約60〜66重量%の飽和ストック溶液から調製)。
Pluronic L101、L85、F68、F127
OGP(オクチル−βDグルコピラノシド)
OTP(オクチルチオグルコピラノシド)
DGP(デシル−βD−グルコピラノシド)
DdGP(ドデシル−βD−グルコピラノシド)
ODM(オクチル−βDマルトシド)
DMP (デシル−βD−マルトピラノシド)
足場製造
解析
a)LM:蝋で包埋し、組織切片を切り出し、エオシンで染色した。
b)SEM:diH2O中で試料を再水和し(ソルビトールの除去)、凍結乾燥し、炭素泡沫(carbon splutter)被覆し、SEMで検鏡した。
試験した足場の物理的構造を、以下の3つについて視覚的に評価した。
1.マクロスケールの均一性
2.孔構造
3.微小構造、特に孔ラメラ周辺
この試験は、2mMのカルシウムを含有するフィブリノーゲンアルギン酸塩凝固混合物に泡形成Pluronic界面活性剤(F127又はF68)を使用することにより開口孔を形成出来たが、微小凝集塊の無い開口繊維質ラメラ微小構造を有する均一な開口孔構造を形成する方策は同定できなかったことを示す。
幾つかのインビボ実験で、SM製造混合物中のCa2+濃度と炎症性応答(典型的には移植後2週間にピークとなる)との間に関連性が示された。Ca2+イオンが炎症性応答に直接影響することは明確に証明されていないが、リン酸カルシウム沈殿の形成により炎症性応答が起こることを強く示唆する証拠は見いだされていた。他の考えられる可能性は、カルシウムイオンがアルギン酸等の他の要素を取得される足場内に組み込むことにより、炎症を引き起こすことである。インビトロで好中球をアルギン酸塩に直接暴露しても活性化は見られないが、同様のアッセイにおいて、リン酸カルシウムは、好中球の細胞溶解作用の活性化を引き起こした。
増量剤及び凝固剤としてのアルギン酸塩は、幾つかの潜在的に適切な性質を有する。(i)一般的な多糖類と同様に、水溶液中で高度に水和した分子複合体を形成する。(ii)高い極性をもたらす水酸基の密度がタンパク質と相互作用する機能を有する。(iii)酸性基が、表面のタンパク質残基と相対的に強い(イオン性の)相互作用をもたらす。重要なことに、アルギン酸塩の組み込みは、嵩張った繊維質の網又は格子を形成することが実験的に見出された。
アルギン酸は、ガラクツロン酸及びマヌロン酸残基の比率によって異なり、ガラクツロン酸の比率が高いものを高G等級、マヌロン酸の比率が高いものを高M等級と呼ぶ。ポリマーの分子量も異なるため、固有粘度も異なる。高G型は繊維の押出し及び硬いゲルの形成に適した特徴を有し、一方高M型は柔らかいハイドロゲルの形成及び水性吸収又は生産物分散適用に適している。様々な等級において合理的な説明が事前に可能であったため、いずれの型がSmart Matrixにおいて最良に機能すると期待され得るか最初は不明であった。高G型の繊維形成能力は足場産物中のアルギン酸塩及びフィブリン繊維の組み合った(interlocking)網をもたらし、フィブリンの機械的支持に貢献し得るし、高Mの開口ハイドロゲルは、膨潤して創傷浸出液を吸収し、創傷治癒における生理的環境を改善し得る。また、高分子量のフォームはより長く維持されるため、より長く利益が得られ、低分子量のフォームはより迅速に分解されて、創傷治癒の障壁とならない。プロピルグリコール誘導体化アルギン酸塩は、非極性基の導入により、タンパク質や界面活性剤に対する相互作用が顕著に増大し得る。
Pluronic界面活性剤は、最初は、タンパク質の変性を引き起こしそうにない、潜在的に適した非洗剤非炎症性生体適合性物質として同定された。最初の実験は、1〜2%までのPluronicを含有する緩衝溶液において、凝固が進行し得ることを示した。最初に使用された一つのPluronicF127は、F68と類似するが、僅かに泡立ちが弱かった。他の2つ、P77及びP85は、殆ど泡立たなかった。L101及びL121は、強力に泡立ちを抑えた。
トロンビンとアルギン酸塩の本来の比率は、60分以上でフィブリノーゲンを完全に凝固させるのに必要な活性に基づき、プラスミン消化によるフィブリン消化産物を調製するのに最初に使用したものと同一である(Walker & Nesheim, 1999, J Biol Chem 274 p5201−12)。トロンビンのレベルは足場構造を形成するのに充分と見られ、SM製品において1xと定義された(1x=0.0125IU/mgフィブリノーゲン)インキュベーション工程でのフィブリノーゲン凝固の過程で泡構造が部分的に崩壊して二層構造(濃厚及び多孔質)が形成されることが認識され、この破壊を防ぐためのトロンビン濃度を増大させることが図られた。実験されたフィブリノーゲンレベルは倍数で設定され、最大で15x、一般的には1、4、及び8xが用いられた。最適な開口網微小構造に必要な量は、界面活性剤の存在及び濃度に依存するように見られる。下記の製剤において、10x濃度が、最適な界面活性剤混合物(SMOF1等)を使用した巨大な均一構造を取得するのに使用された。
この相の作業において取り組まれた最初の問題は、最適な物理的足場構造の同定及びこれを達成するための製造の妥当な方法の開発であった。生産物の不均一性は宿主反応にとって問題があることが認識されていた。高密度の網構造は、漸進的に多孔質化し、組織足場として良好に機能する。しかしながら、開口孔構造が細胞の侵入の速度を増大させ、足場の機能性(細胞の組織化、血管新生、炎症のコントロール)を尚も維持することは明らかであった。
考察
2つの主要な変更が、更なる実験において調査された。第一が、糖界面活性剤OGPの使用、第二が、タンパク質安定化剤としてのトレハロースである。
グリセロール評価に続いて、凝固実験は、試験された糖(グルコース、ソルビトール、スクロース及びトレハロース)が、アルギン酸及びPluronic界面活性剤の存在下フィブリノーゲン沈殿を減少させたが、また凝固も顕著に阻害したことを示した。しかしながら、トレハロースは、法外な程度にまで凝固を阻害せずにフィブリノーゲンの沈殿を免れる濃度範囲を有することが分かった。アルギン酸塩及び界面活性剤の存在下、凝固プロフィールは、単純なフィブリノーゲン溶液のものと類似していた。足場製剤中の安定化剤としてのトレハロースの評価は、生産物の間隙率に有益な効果をもたらし、微小構造を改善することを見出した。しかしながら、トレハロースは、Pluronic界面活性剤が使用された場合に足場構造内に微小凝集体が形成されるのを完全に防止しなかった。
界面活性剤の種類の違いの効果も試験された。Pluronic(ポロキサマー)界面活性剤は周知であり、その「穏和な」効果(非変性、低細胞毒性、低炎症性)のため生物系で有用であることが示され、これらの効果は、界面活性剤メカニズムに関連し得る。当該分子は、表面張力を変化させるいかだ(raft)を形成すると考えられており、単純な洗剤構造(アシル鎖及び親水性頭基)とは異なる。しかしながら、相対的に高レベルのPluronic界面活性剤(>約0.9%)は、高密度の微小凝集塊の形成と明確に関連していた。
A.「ヘアードライヤー」
凝固混合物に熱い空気を当てることは、37℃の試薬の温度が室温の大気で曝気することで低下するのを最小にするために使用される。
基本的な泡塊展開方法は作業表面上のトレイを数回タップすることである。しかしながら、10x10cmを超えるトレイに泡塊を展開するために、以下の代替法が評価された。
−落下=50cm程度の高さから泡塊を容器に空ける。
−押しつぶし=プラスチックシート(他のトレイ又はペトリ皿の蓋)を使用して泡塊を展開する。この場合、押しつぶしは均等に行い、最初に蓋の角と30〜45度の角度で接触させ、泡塊全体に空気の泡が入らないようにゆっくり倒しきり、トレイ全体に泡塊を展開させる。
−タップ=トレイを持ち上げて作業表面上に叩き付ける(knocking)。
−大タップ、トレイの2つの角を両手で持ち、肘を傾けて約45度にそれを持ち上げ、それを作業表面上に打ち付け/叩き付ける(flicking/slapping)。
インペラ混合器は1つの軸上の2つのインペラ(三枚ブレードプロペラ形状)からなる。我々は、それらの両方が心棒上に押し付けるようにマウントされる場合、混合容器中の液体の再循環が非常に効率的になることを見出した。これは、従来使用されていたワイヤー「ボウタイ」泡立て器と比較して泡塊の形成が増大することが見出された。
これらのアイデアは、(i)加湿37℃インキュベーターへの標準的な移動と比較して泡塊への熱の移動を促進し、そして(ii)滑らかな表面の泡塊を生じるためのものである。
このシリーズにおいて、SM−OF2(Smart Matrix最適化製剤2)と呼ばれる製剤が、SM−OF1から開発された。この製剤から形成された足場は、開口孔構造と繊維質の微小構造との間の良好なバランスを示した。この作業の焦点は、孔構造の均一性の改善、並びに潜在的な最適化工程及び製造パラメーターの調査であった。
OGPは、その有用性を限定し得る内在的な泡塊の不安定性を有するように見える。幾つかの類似の糖界面活性剤が調査された。Spanシリーズは、水溶性が低いため、使用が限定されることが見出された(好ましい状態はミセル乳液である)。
足場は、アルギン酸の代替として、増量剤のメチルセルロース、キサンタンガム及びアガロースを使用して作製された。
泡塊安定性試験及び凝固試験に基づき、糖界面活性剤型は、最も適切な潜在的候補として挙がってきた。このデータに拘らず、取得される足場構造の結果を完全に予測することは出来ない。故に、シクロヘキシルエチルβD−マルトシド(CHM)が、良好な泡塊安定性をもたらすように見え、その凝固アッセイのプロフィールは低いが、透明なゲル構造を生じた。CHMを使用した足場の成形において、取得された泡塊は急速に崩壊して、透明なゼラチン状足場構造をもたらした。これは強固だが、凍結乾燥された場合、ミリメートルスケールの間隙を有する非常に大きい開口をもたらした。しかしながら、安定した泡塊をもたらし凝固を支持する、デシル−マルトピラノシドやnドデシル−スクロース等の他の界面活性剤は優秀な足場をもたらした。
方法
20%水溶液を、(1)diH2O、(2)1%アルギン酸塩/Mes/NaCl pH7.4、(3)1%bFbg/Mes/NaCl pH7.4で希釈して、1%とした(50μlに対して希釈剤950μl)。溶液はコニカルボトムユニバーサルチューブ30ml中で泡立てられ均等な泡塊にされた。泡塊の達した高さ、及び100μlの液体がチューブのコーンの基部に形成された時間が測定された。それらの結果に基づき、泡塊安定性をランク付けした。
目的
フィブリノーゲン溶液の溶解性及び酵素凝固に対する様々な界面活性剤の効果を評価するため、各界面活性剤について、凝固アッセイを実施した。当該アッセイにおいて、20分以上425nmで濁度がモニタリングされた。
1M CaCl2溶液を新しく調製し、使用前に滅菌濾過した。オートクレーブしたMES/NaCl緩衝剤、25mM MES及び150mM NaClを、凝固アッセイを実施するための希釈剤として使用した。ウシフィブリノーゲン(BFbg)溶液を、MES/NaCl緩衝剤中で2%に希釈した。トロンビン溶液は10U/mlとした。最後に、20%界面活性剤溶液を、dH2O中で作製した。
初期値、ゲルの質、最大の速度及び時間差
下記表は、全ての界面活性剤における結果をまとめたものである(3ランの平均)。
この試験は、ウシフィブリノーゲンの酵素的凝固及び溶解性に対する様々なクラスの界面活性剤の効果を評価することが目的であった。凝固試験は、各界面活性剤において、0.125〜2%w/vの範囲で実施された。濁度により凝固を測定する方法の重要な限定は、幾つかの界面活性剤が凝固して透明なゲルを形成することである。従って、凝固の阻害を透明なゲルの形成と区別するために、対照に関してゲル強度の主観的な評価が行われた。
ここで試験された全てのアニオン性界面活性剤は、試験された濃度範囲内で強力なフィブリノーゲン凝固の阻害を引き起こし、CHAPSの効果が最も弱かった。SDSは、SDS−PAGE電気泳動等の生化学的技術でタンパク質の変性剤として使用される古典的な界面活性剤で、タンパク質はSDSにより変性されて、それらのサイズに従い分離される。斯かる界面活性剤において凝固が阻害されたように見えたのは、驚くべきことではない。n−ラウリルサルコシン、デオキシコレート及びCHAPSの類似した効果は、この種類の界面活性剤が、Smart Matrix製造に適合しないことを示唆する。
塩基性カイマン活性剤の範囲は、他の種類より狭い。しかしながら、比較的単純な構造のBMABは、泡塊を形成する濃度で阻害的であった。同様に、両性イオン界面活性剤は、他の種類より多くないが、ここで試験されたEMPIGENも、泡塊を形成する濃度で凝固を阻害した。
通常使用される非イオン性界面活性剤は多く存在し、代表的なものが試験され、それらの大半が、トロンビン触媒fbg凝固を支持することが見出された。幾つかの周知の型、例えばポリオキシエチレン型(GENAPOL、THESIT、IGEPAL、BRIJ−35)は、試験した範囲全体で、凝固を支持した。しかしながら、他の類似の界面活性剤(Triton X100、Tween 20)はそうではなかった。MEGA−10も、1%以上で阻害的であることが証明された。ポリエトキシ/ポリプロピロキシ−ブロックコポリマー型(Pluronic F127、Pluronic F68)は凝固を支持したが、それらは1%以上でタンパク質の沈殿を増大させ、それはGENAPOL又はIGEPALよりも顕著であった。これは、Pluronic界面活性剤を使用して形成された足場内に微小凝集塊が生じることを説明し得る。
スルホベタンは、凝固の制御に関する候補分子である。ここで研究された単純なスルホベタインは、透明な(濁りの無い)ゲルの形成をもたらす凝固の変化を示した。界面活性剤の泡立ち特性の欠如のため、製造における価値は限定される。
この研究は、単純なアッセイ方法を使用してフィブリンベースの足場を製造するための剤として使用する界面活性剤の潜在的な適切性の基礎的な基準を同定する。アニオン性、カチオン性及び両イオン性界面活性剤は酵素的フィブリノーゲン凝固を阻害するため、更なる考慮において不適切である。ここで幾つかの非イオン性界面活性剤も不適切である。それらは凝固プロセスの阻害を引き起こすからである(NP40、MEGA−10、TritonX100、Tween20、n−デシル−スクロース、モノ/ジ−ラウリル酸スクロース、又はモノ/ジオレイン酸スクロース)。他の非イオン性界面活性剤は、ここで試験されたとき、2%w/vまでは、凝固を阻害しない(Genapol、IGEPAL、THESIT、Pluronic F68、F127、BRIJ−35、シクロヘキシルエチルβDマルトシド、ドデシル−βD−マルトシド、n−ドデシルスクロース)。よって、フィブリン足場製造プロセスにおける使用の可能性を示す。
各界面活性剤の凝固の結果は、A=0.125%、B=0.5%、C=0.5%、D=1%、E=2%(質量/体積)のそれぞれの濃度において、3回の試行の平均である。
試験Aで凝固が見られた。
試験Cで凝固が見られた。
界面活性剤の濃度の増大に従い凝固速度が増大した。試験C、D及びEは、対照よりも高い凝固速度を示した。試験Aは凝固を示さなかった。
全ての界面活性剤濃度で凝固が観察された。
試験Bにおいてのみ完全な凝固が観察され、対照試料の速度と類似であった。
最低の界面活性剤の濃度でのみ凝固が観察された。
いずれの界面活性剤濃度も凝固は観察されなかった。
最高濃度(試験E)以外の全てのDMAB濃度で凝固が観察された。試験Dで、最初のBFbgの沈殿が見られた。
最低のDMG濃度(試験A及びB)で凝固が観察された。
全ての界面活性剤濃度で完全な凝固が測定され、対照よりも高い速度であった。
全ての濃度で完全な凝固が測定され、界面活性剤濃度に伴い凝固速度が増大した。
Triton X−100と同様に、全ての濃度で完全な凝固が測定され、界面活性剤濃度に伴い凝固速度が増大した。しかしながら、Tween20の濃度が最高の場合に、最低の凝固速度が観察された。
Bfbgの最初の沈殿がこの界面活性剤、特に最高の濃度(試験D及びE)を使用して観察された。
PLURONIC F−68と同一の結果が観察された。
SDSは、いずれの濃度も凝固を生じなかった。
全ての界面活性剤濃度で凝固が観察され、対照試料の場合と同様の速度であった。
全てのTHESIT濃度で凝固が観察された。界面活性剤濃度に従い凝固速度が増大した。
最低のnDS濃度(試験A及びB)で凝固が観察された。凝固の速度は、nDSの濃度増大に伴い低下した。
この界面活性剤において、最高(試験E)及び最低(試験A)濃度で、凝固が観察された。試験Bでも凝固が見られたが、対照、試験A及び試験Eよりも遅かった。
最低のdDMP濃度(試験A及びB)で凝固が観察された。
全ての濃度で凝固が観察された。界面活性剤濃度に従い凝固速度が増大した。
最低濃度の試験Aで凝固が観察されたが不完全であった。
全ての界面活性剤濃度で凝固が生じた。試験A〜Eの凝固速度は対照よりも速かった。
SUC−Lと同様に、全ての界面活性剤濃度で凝固が生じ、試験A〜Eの凝固速度は対照よりも速かった。BFbgの最初の沈殿は、試験B〜Eで見られた。
凝固(I):フィブリノーゲンに対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
生物学的及び治療的目的での多孔質足場を製造するためにフィブリノーゲン足場を利用するため、凝固したフィブリンの三次元的組織化を調整するのが望ましい。これを達成するため、増量剤及び界面活性剤とフィブリノーゲンを組み合わせるのが有用と見出された。しかしながら、そのような混合溶液からのフィブリノーゲンの幾らかの沈殿が迅速に生じることが見出され、これは望ましくない。この一連の実験は、潜在的な安定化剤としてのポリオール(特に糖及び糖アルコール)の、足場製造に使用されるフィブリノーゲン溶液の酵素的凝固及び溶解度に対する効果を評価することである。この第一のセットにおいて、単純な緩衝化フィブリノーゲン/トロンビン凝固混合物に対する効果が評価された。後の研究において、これは、アルギン酸塩、及びアルギン酸塩プラス界面活性剤を含有する混合物に拡張された。基底溶液の安定性及び凝固は、425nmで20秒間濁度を測定して評価された。試験されたポリオールは、グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース及びラフィノースである。
1MのCaCl2溶液を新しく調製し、使用前に0.2μmフィルターでろ過した。オートクレーブしたMES/NaCl緩衝剤(25mM MES、150mM NaCl、pH7.4)をフィブリノーゲンの溶解及び希釈剤として用いた。ウシフィブリノーゲン(bFbg)溶液を、MES/NaCl緩衝剤中で2%に希釈した。トロンビン溶液は25mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4中で10U/mlとし、分注し、−80℃で保存した。グリセロールを直接使用した。試験された糖類は、diH2O中、37℃でほぼ飽和で溶解させられ、6倍希釈まで試験された。結果では重量/体積%を示す。
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
これらの結果は図18に示され、フィブリノーゲンの凝固プロフィールに対するポリオール(糖アルコール)の顕著かつ強力な効果を実証する。一般に、ゲル構造の吸光度は、1%重量/体積のポリオールにより0.5Au以下まで低下するように見えるが、T50(最終的なODの50%に達する時間)により見積もられた凝固の動的プロフィールは殆ど影響を受けない。グリセロールが、T50の幾らかの遅れをもたらすのは僅かに例外的であった。特に、ポリオールを含有する得られたゲルの濁度の低さは、フィブリン繊維のより細かい、より分散した分布を暗示する。重要なことに、凝固期間の最後のゲル強度及び完全性の質的評価は、ポリオール濃度の増大、特に5%以上に従い、ゲルが弱くなる一般的傾向を示す。特異な例外はトレハロースで、試験された10%までのいずれの濃度でも、得られたゲルの完全性を損なわなかった。
凝固(II):フィブリノーゲン/アルギン酸塩混合物に対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
この第二のセットにおいて、潜在的な安定化剤としてのポリオールの、足場製造に使用される濃度での混合されたフィブリノーゲン及びアルギン酸塩溶液の安定性及び酵素的凝固に対する効果が評価される。上記と同様に、安定性及び凝固は、425nmでの濁度を測定して評価された。試験されたポリオールは、グリセロール、ソルビトール、グルコース、スクロース及びラフィノースである。
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
下記表は、フィブリノーゲン及びアルギン酸塩の存在下での全ての糖における結果をまとめたものである。
これらの結果は、アルギン酸塩が含まれないより単純なアッセイ混合物由来の類似する比較データセットに関連する。現在の結果は図19に示され、アッセイ混合物へのアルギン酸塩の導入が、ポリオールの効果の性質を変化させることを実証する。これらのポリオールの効果における主要な関心は、凝固の前の、可溶性フィブリノーゲンの潜在的な安定化剤としてである。これらの実験において、プレ−トロンビンOD値は0.1〜0.2であり、一方、アルギン酸塩の無い場合、それらは典型的には0.05〜0.1であることが見られる。アルギン酸塩無しでは、試験されたポリオールは、タンパク質凝集及び沈殿の指標である、凝固前の濁度に殆ど影響しない。しかしながら、アルギン酸塩の存在下、試験されたポリオールの殆どが実際にベースライン濁度を増大したため、所望の安定化効果を実証しない。しかしながら、トレハロース及びラフィノースは、ベースライン濁度の増大を殆ど又は全く引き起こさなかった。
凝固(III):フィブリノーゲン/アルギン酸塩/SMOF2混合物に対する安定化剤としてのポリヒドロキシ分子の効果
目的
上記2つの比較研究は、多孔質のフィブリン足場の製造に使用されるのと類似の条件下での、フィブリノーゲン及びフィブリノーゲンプラスアルギン酸塩溶液の凝固に対する、ポリオールの効果を特徴付けたものである。しかしながら、実際の足場製造混合物は、フィブリノーゲン及びアルギン酸塩に加えて、界面活性剤を含有する。SMOF2に使用される具体的な界面活性剤混合物は、多孔質フィブリン足場構造の製造に特に効果的であることが既に見出されている。この第三のセットにおいて、潜在的な安定化剤として以前の結果から最も有用なポリオールの効果が、このより複合的な凝固混合物において評価される。以前のアッセイと同様に、凝固前の溶解度、酵素的凝固の動態、及び最終的なゲル生産物に対する効果が、完全な評価を行うのに必要である。選択されたポリオールは、砂糖、スクロース、トレハロース及びラフィノースであった。
1MのCaCl2溶液を新しく調製し、使用前に0.2μmフィルターでろ過した。オートクレーブしたMES/NaCl緩衝剤(25mM MES、150mM NaCl、pH7.4)をフィブリノーゲン、アルギン酸の溶解及び希釈剤として用いた。ウシフィブリノーゲン(bFbg)溶液(2%)及びアルギン酸塩溶液(4%)を、MES/NaCl緩衝剤中で希釈し、pHを7.4に調整した。トロンビン溶液は25mM HEPES、150mM NaCl、pH 7.4中で10U/mlとし、分注し、−80℃で保存した。SMOF−2は、幾つかの界面活性剤の混合物である(DMP8%、ODM4%、DdGP4%、Pluronic F68 4%(合計の界面活性剤濃度20%)。試験された糖類は、diH2O中、37℃でほぼ飽和で溶解させられ(各%重量/体積は記録された)、当該アッセイにおいて、最終濃度2.5、5及び10重量/体積%で試験された。
安定性及び凝固アッセイのデータのまとめ
これらの結果は、フィブリノーゲン、又はフィブリノーゲンプラスアルギン酸塩に対するポリオールの効果が試験された、より単純なアッセイ混合物に由来する以前の随伴のデータセットに関連する。これらの結果は図20に示され、この試験で最も有用なポリオールとして、スクロース、トレハロース及びラフィノースが示されている。この結果は、界面活性剤混合SMOF2の添加はフィブリノーゲンアルギン酸塩混合物の最初の沈殿を増大させるが、凝固動態に殆ど影響しないことを実証している。候補糖類の効果は、溶液の安定性に影響すること、凝固の開始を遅延させること、及び得られたゲルの強度及び完全性に影響することである。
目的
架橋フィブリン足場の主要な構造的特徴に関連するパラメーターを測定できることは重要である。フィブリンベースの足場の間隙率特性は、製造された材料を定義し、また生物学的機能を判定するのに重要である。
この特徴付けの試験における足場は、物理的特性、並びにインビボ及びインビトロでの生体相互作用の評価の結果に基づいて、ほぼ最適と判定された組成及び方法を使用して調製された。特に、当該足場は、ミクロトーム切片の検鏡により材料の全層でほぼ均一な構造が観察されるものである。これらの足場は、SM−OF1、SM−OF2及びDdSuc(単一の界面活性剤、n−ドデシルスクロースが混合物の代りに使用される)と名付けられた組成を使用して製造された。製造プロセスの最後の工程で足場は脱イオン水で5回洗浄され、それらは、下記のいずれかの方法により凍結乾燥されて乾燥生産物が調製された。
収率パラメーターは、使用したフィブリノーゲン及びアルギン酸塩の質量と生産物との比率により計算された。
間隙率は、生産物の重量及び線寸法(linear dimension)を記録することにより測定された。間隙率=体積/質量。
外科用メスを用いて足場の試料が切り出され、Miles Scientific Tissue−Tek組織学的組織プロセッサー中で、10%ホルムアルデヒド中で固定され、パラフィンワックス中に包埋されることにより処理された。切片は、4μmに設定されたミクロトームを使用して切り出された。切片はスライドガラスに貼り付けられ、ワックスが除去され、0.5%w/vエオシンY水溶液で染色され、脱水され、DPXでマウントされた。
この研究に含まれる試料において、収率は相対的に一定であるが、間隙率の値は変動し、SMOF2セットではSD13%、DdSucセットでは39%であった。間隙率を求めるための少なくとも正確な測定パラメーターは試料の高さであり、この変動は、孔サイズの変動を反映するものである。
(i)25%四分位範囲=20〜75ミクロン;
(ii)中央範囲=30〜125ミクロン;
(iii)75%四分位範囲=50〜200ミクロン;
の範囲である細胞外マトリックス組成物も提供する。
要約
細胞足場は、皮膚の再構築を改善し、合併症の割合を減少し、回復を促進し、瘢痕の肥大を防止する、皮膚再構築において顕著な役割を果たす。
フィブリンベースの足場製造における現在の試みの一つは、均一な構築物の製造である。機械的な脆弱と構造的な複雑性に拘らず、それらの機械的性質の特徴付けは、それらの製造及びそれらの細胞挙動に対する効果の理解を促進する。
Smart Matrix足場を、間隙率の異なる10種類の一連の足場を作製するために、界面活性剤混合物を含む成分の比率の変化を用いて製造した。
a)3x2cmの標準的なダンベル型の試料を、各生検から調製した。試料を引張機(INSTROM 5565)の中に充填して、3mm/minの速度で失敗するように試験した。最大の伸展及び最大抗張力を、ANOVA (Prism software)で解析した。
参照材料と比較した変形に対するSmart Matrixの動的粘弾性を、振動数ランププログラム(Bohlin CVO rheometer)を用いて測定した。
この連続して様々な混合物のシリーズにおける足場は、専ら細かい繊維状の網構造からなるように見えた。ほとんどの製剤は、ミクロンスケールの開口孔をもたらした(<250:)。しかしながら、足場製剤と結果物の間隙率との間の関係は単純又は一貫しなかった。むしろ、多孔質構造は、様々な製剤の範囲に渡り支持され、その範囲外で、より高密度の構造が取得された。
この研究は、Smart Matrix型の足場の重要な機械的特性を樹立し、Matridermよりも柔らかいことを示す。これは、Smart Matrixにおいて樹立された有益な創傷治癒の成果に貢献し得る。
フィブリノーゲン溶解度
「塩含有」においてNaCl > 20 mM
0.5% pluronic (RT)と共にNaCl > 133 mM
1:1アルギン酸塩と共にNaCl > 150 mM
0.5% pluronic + 1:1アルギン酸塩と共にNaCl >200 mM
温度> 20oC
Na+をK+で置換−沈殿形成
Cl−をSO4 2−で置換-沈殿形成
Cl−をpH7.4のTrisで置換-沈殿形成
HEPES (pKa 7.55)をTris (pKa 8.06)で置換−沈殿なし
1:1アルギン酸塩+グリセロール、20% − <2% pluronic; 5% − <1% pluronic
1:1アルギン酸塩+スクロース、30% − <2% pluronic; 15% − <1% pluronic
1.フィブリノーゲン
・促進: Ca2+ (最大20 mM);トロンビン(速過ぎる> 10x); Pluronic (<0.5%); アルギン酸塩(1:1)
・NaClにより開始(最適NaCl約20−50 mM).
−NaClを150mMから75mMに減少させると、凝固時間が10分から3分に短縮する。
−Cl−を150mMのHEPESで部分的に置換すると速度が増大する。
・凝固前に沈殿が生じる場合(A425>0.1)、得られたゲルは最適以下である。
・フィブリノーゲン+アルギン酸塩1:1 + pluronic 0.5%は、200 mM NaClで十分な速度(<5分)をもたらす。
フィブリノーゲン安定化:
・NaCl > 50 mM
・グリセロール>5%
・スクロース、グルコース、ソルビトール2−20%, >10%
・トレハロース:トロンビン添加前10−11%;トロンビン/アルギン酸塩/界面活性剤添加後4−7.5% (約6.6%)
・オクチル -ベータD−グルコピラノシド>0.5%
・NaCl <50 mM
・アルギン酸塩>0.5%
・Pluronic F68 >0.2%
凝固促進
・NaCl <50 mM
・アルギン酸塩>0.5%
・Pluronic F68 >0.2%
・MES > HEPES
・ NaCl >75 mM
・グリセロール>5%
・スクロース、グルコース、ソルビトール >5%
・トレハロース 4−7.5%%
・オクチル -ベータD−グルコピラノシド>0.5%
・Tris > HEPES
泡塊安定化:
・ NaCl <50 mM
・グリセロール>5%
・トレハロース 4−7.5%
・オクチル -ベータD−グルコピラノシド
・ NaCl >50 mM
・アルギン酸塩>0.5%
・Pluronic F68 <2%
・アルギン酸塩>0.5%+界面活性剤>2%
・Pluronic F68 >0.2%
・MES > HEPES
・NaCl >75 mM
・グリセロール>5%
・スクロース、グルコース、ソルビトール
・トレハロース4−7.5%
・オクチル -ベータD−グルコピラノシド
・Tris > HEPES
・試薬混合物の安定性は重要である。
・安定性における幾つかの負のパラメーターが同定されている。H−結合剤(グリセロール、スクロース)による粘性増大は界面活性剤に対する安定性を増大させる(好ましい)が、凝固を阻害する(好ましくない)。
・安定性は、NaCl、緩衝塩、温度、(グリセロール、スクロース、トレハロース等のピロール)界面活性剤、及びアルギン酸塩成分により調整出来る。
・糖界面活性剤、又は他の界面活性剤、例えばオクチルグルコピラノシドを使用する。
・最適化された製剤は、安定化剤(トレハロース)等の他の要素を使用する。
安定化剤としてのトレハロースと、Pluronic界面活性剤に添加された糖ベースの界面活性剤とを組み合わせる方策を使用して、フィブリン−アルギン酸塩材料の一貫した製剤を作製することが可能であった。
Claims (43)
- 細胞外マトリックス組成物を調製するプロセスであって:
(a)フィブリノーゲンの水溶液を、凝固剤、増量剤及び泡形成促進剤と混合する工程;
(b)当該混合物を泡立て凝固させる工程;
(c)工程(b)で取得された混合物を架橋剤と共にインキュベーションする工程;
(d)工程(c)で取得された架橋組成物を洗浄して架橋剤を除去する工程;
を含み、当該泡形成促進剤が、糖界面活性剤(sugar−surfactant)のクラスから選択される1つ以上の界面活性剤からなる、当該プロセス。 - 前記フィブリノーゲンの純度が、75%、80%、85%、90%、95%、97%又は99%を超える、請求項1に記載のプロセス。
- 前記フィブリノーゲンの水溶液が、本質的に他のタンパク質を含有しない、請求項1に記載のプロセス。
- 前記フィブリノーゲンが、フィブリンA,フィブリンB、フィブリンC、フィブリンD、フィブリンX及びフィブリンY等の、フィブリノーゲンの切断型として存在する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記フィブリノーゲンの切断型が、フィブリンEである、請求項4に記載のプロセス。
- 前記フィブリノーゲンが、pH4〜10に緩衝された水溶液として存在し、好ましくは緩衝剤が、MES/NaCl又はHEPES緩衝生理食塩水である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記混合工程(a)における混合物が、更に、タンパク質安定化剤として糖を含有し、当該糖が、低分子ポリオール又は炭水化物、例えばグリセロール、ソルビトール、スクロース又はトレハロースである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記糖が、好ましくはフィブリノーゲンに対して10〜11重量%、そして好ましくは工程(b)の混合物中で4〜7.5重量%のトレハロースである、請求項7に記載のプロセス。
- 前記凝固剤が、酵素系又は非酵素系凝固剤を含有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記凝固剤が、トロンビン、例えばヒトトロンビンである、請求項9に記載のプロセス。
- 前記泡形成促進剤が、糖−アシル界面活性剤(sugar−acyl surfactant)のクラスから選択される1つ以上の泡形成促進剤からなる、又は含有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記泡形成促進剤が、C8〜C12の鎖長のアシルを有する糖−アシル界面活性剤のクラスから選択される、請求項11に記載のプロセス。
- 前記泡形成促進剤が、2つ、好ましくは3つの糖界面活性剤を含有する、又はからなる、請求項1又は11のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記糖界面活性剤が糖−アシル界面活性剤である、請求項13に記載のプロセス。
- 前記糖−アシル界面活性剤が、ピラノシド(特にグルコピラノシド)、マルトシド、及びアシル−スクロース界面活性剤のクラスから選択される、請求項11、12又は14のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記糖−アシル界面活性剤が、OGP、ODM、DGP及びDdGP、TGP、HGP、DMP、デシルスクロース(nDS)、ドデシルスクロース(nDdS)からなる群から選択される、請求項15に記載のプロセス。
- 前記糖−アシル界面活性剤が、DMP、DdGP及びODMを含有する、又はからなる、請求項16に記載のプロセス。
- 前記混合工程(a)の混合物が、更に、非イオン性洗剤、熱感受性ゲル化界面活性剤、ポロキサマー(例えばPluronic(登録商標)、特にF68又はF127)、又はポロキサミン(例えばTetronic(登録商標)1307)、ジホスファチジル−グリセロール型リン脂質、又は不混和相とフィブリノーゲン水溶液相との混合物を含有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記混合工程(a)の混合物が、更に、非イオン性界面活性剤、例えば好ましくはPluronic F68及びF127から選択されるPluronic界面活性剤等を含有する、請求項1又は18のいずれか1項に記載のプロセス。
- 前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウム又は誘導体化アルギン酸塩である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記増量剤が、ヒドロキシエチル澱粉、エチルセルロース、キサンタンガム及びアガロースから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記増量剤が、グリコサミノグリカン(CAG;例えばコンドロイチン6−硫酸、コンドロイチン4−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸、又はヒアルロナン)である、又は含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記架橋剤が:カルボジイミドカップリング剤、例えばN−(3−ジメチルアミノプロピル)−N‘−エチルカルボジイミド(EDC);N−ヒドロキシスクシニミド(NHS)、アザイドカップリング剤;ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレンジイソシアネート;エポキシド架橋剤、例えばエピ−クロルヒドリン、グリシジルエーテル及びグリシジルアミン;及びアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド及びグリオキサルから選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記架橋剤が、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド又はグリオキサル等を含有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記アルデヒド架橋剤がグルタルアルデヒドである、請求項24に記載のプロセス。
- 追加で還元剤又は毒性減少剤(toxicity reducing agent)、例えば水素化ホウ素ナトリウム又はリシン等の添加を含む、請求項24に記載のプロセス。
- 前記泡形成工程(b)が、瀑気を含む混合により、例えばホイッピング又はブレンディングにより達成される、請求項1に記載のプロセス。
- 所定の形状を有する細胞外マトリックス組成物を調製するための請求項1に記載のプロセスであって、
(i)工程(a)の混合物が所定の形状の型に流し込まれ、凍結、任意で凍結乾燥された後、インキュベーション工程(c)に続く;又は
(ii)工程(d)の産物が所定の型の中で生産され、その後、当該産物が、凍結、任意で凍結乾燥される、
当該プロセス。 - 追加で、二価又は多価金属イオン、例えばカルシウム(例えば塩化カルシウム)を、好ましくは1〜5mMの濃度範囲で、好ましくは約2mMの濃度でカルシウムイオンを提供するように添加する工程を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 請求項1に記載のプロセスにより取得される、架橋フィブリノーゲン又はその誘導体を含有する細胞外マトリックス組成物。
- 請求項1のプロセスにより取得される、架橋フィブリノーゲン又はその誘導体を含有する細胞外マトリックス組成物。
- インビトロ、エクスビトロ又はインビボで創傷治癒又は組織再生を行う方法であって、創傷に請求項30又は31のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物を適用することを含む、当該方法。
- インビトロ、エクスビトロ又はインビボで創傷治癒又は組織再生を行う方法であって、創傷に請求項1に記載のプロセスにより取得された細胞外マトリックス組成物を適用することを含む、当該方法。
- インビトロで組織構築(tissue engineering)を行う方法であって、培養容器中で、請求項30又は31のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物に、内皮細胞又は繊維芽細胞、及び培養培地を適用することを含む、当該方法。
- インビトロで組織構築を行う方法であって、培養容器中で、請求項1に記載のプロセスにより取得された細胞外マトリックス組成物に、内皮細胞又は繊維芽細胞、及び培養培地を適用することを含む、当該方法。
- 細胞外マトリックス組成物の製造に使用される製剤であって:
−0.5〜10重量%のフィブリノーゲン;
−安定化剤;
−凝固剤;
−増量剤;及び
−泡形成促進剤;
を含有し、当該泡形成促進剤が、糖界面活性剤のクラスから選択される1つ以上の界面活性剤を含む、又はからなる、当該製剤。 - 更に、タンパク質安定化剤として糖を含有する、請求項36に記載の製剤。
- 前記糖がトレハロースであって、好ましくは当該糖が当該製剤に対して10〜11重量%の量で存在する、請求項37に記載の製剤。
- 前記架橋フィブリノーゲンは、沈殿したタンパク質の、高密度の微小凝集塊(dense micro−aggregates)、又はプレート(plates)を本質的に含有しない、請求項30又は31のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物。
- 前記架橋フィブリノーゲンにおける孔サイズの分布が:
(i)25%四分位範囲=20〜75ミクロン;
(ii)中央範囲=30〜125ミクロン;
(iii)75%四分位範囲=50〜200ミクロン;
の範囲である、請求項30、31又は39のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物。 - 前記架橋フィブリノーゲンのバルク間隙率(bulk porosity)の範囲が、0.08〜0.4ml/凍結乾燥産物mgである、請求項30、31、39又は40のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物。
- 前記架橋フィブリノーゲンの孔サイズの分布が請求項40に記載されたものであって、バルク間隙率の範囲が請求項41に記載されたものである、請求項40又は41のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物。
- 水和した場合、前記架橋フィブリノーゲンの弾性係数が、ヤング係数で1〜6Mpaであり、応力速度1mm/sで最大抗張力が0.4〜3Mpaであり、振動数1Hzで複素弾性係数が約3000Paである、請求項30、31、39〜42のいずれか1項に記載の細胞外マトリックス組成物。
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