ES2966058T3 - Andamio - Google Patents

Abstract

Se describe un método para preparar un armazón proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico. El método comprende: proporcionar una emulsión de aceite en agua que comprende gotitas de aceite dispersadas en una fase continua que comprende una solución proteica acuosa tamponada con pH, en donde la emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico en una cantidad de 0,01 a 10 volúmenes % del volumen total de la fase oleosa en la emulsión de aceite en agua; gelificar la proteína alrededor de las gotitas de aceite, tal como mediante actividad enzimática o mediante reacción química sin actividad enzimática o mediante gelificación térmicamente controlada; y retirar las gotitas de aceite de la fase continua. También se describen un andamio proteico poroso y sus usos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Andamio

Campo de la invención

Esta invención se refiere aun método para preparar un andamio poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico. La presente invención también se refiere a un andamio proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico. También se divulga el uso de andamios proteicos porosos obtenidos para implantación quirúrgica en un sitio de herida o defecto tisular u otro sitio para apoyar la reparación o el nuevo crecimiento del tejido. La divulgación se refiere además a los usos del andamio proteico poroso y a una construcción de ingeniería tisular obtenida a partir del mismo.

Antecedentes

La arquitectura porosa interconectada jerárquica y la estructura a nanoescala son requisitos fundamentales de los andamios biointeligentes tridimensionales basados en proteínas, esenciales para las funciones de conductividad celular, perfusión de nutrientes, angiogénesis, diferenciación vasculogénica y crecimiento neuronal. Estos requisitos estructurales también son fundamentales para el desarrollo de biomateriales, que pueden utilizarse en aplicaciones como la curación de heridas y la regeneración de tejidos en un paciente. Sin embargo, existe la necesidad de métodos eficaces, controlables y escalables para producir tales andamios nanoestructurados.

Un método que puede usarse para lograr una porosidad controlada en hidrogeles de proteínas es la congelación y liofilización controladas. En este método, los poros se forman mediante exclusión de material del porógeno de cristales de hielo. Esto puede dar como resultado un material estructurado laminar denso, en gran medida desprovisto de estructura a nanoescala. Esto lo demuestran muchos de los andamios actuales, en particular los andamios de colágeno acelular. La celularización y vascularización de dichos materiales puede ser relativamente lenta.

La formación de espuma puede ser otro método para lograr una porosidad controlada en hidrogeles de proteínas. Sin embargo, esto también puede tener algunas limitaciones, debido a una gran interfaz de aire expuesta para la desnaturalización de proteínas, la inestabilidad intrínseca de las burbujas y el drenaje de la espuma durante la gelificación y la reticulación. Estos pueden causar dificultades para lograr un grado de homogeneidad biológicamente aceptable y pueden dar como resultado defectos de poros grandes debido al colapso de las burbujas de espuma durante la fabricación.

Recientemente, la atención se ha centrado en las poderosas y altamente controlables metodologías de fabricación ascendente. El electrohilado es un método establecido para formar mallas de fibras a micro y nanoescala, pero puede no ser adecuado para fabricar estructuras con el grosor y la consistencia necesarios para la ampliación comercial necesaria para comercializar andamios tridimensionales. Si bien la impresión 3D y la creación rápida de prototipos también son tecnologías emergentes que pueden crear estructuras de andamios blandos, el concepto de construir una estructura a macroescala a partir de un filamento nanométrico a la escala requerida para la fabricación comercial sigue siendo un desafío. Por lo tanto, nuevos métodos de fabricación controlable, rápida y versátil de biomateriales regenerativos nanoestructurados representarían un avance significativo en la tecnología sanitaria.

El documento US 2009/017092 describe un método para preparar una matriz extra celular artificial, que implica preparar una emulsión de aceite en agua a partir de una solución acuosa de moléculas de matriz extra celular, un fluorocarbono y un emulsionante biocompatible.

El documento WO 2017/182676 describe un método para formar un andamio, que incluye preparar una emulsión de fase interna alta (HIPE) que comprende una solución acuosa de: proteínas seleccionadas del grupo que consiste en colágeno y mezclas de colágeno y quitosano.

A. Barbetta et al. (Biomacromoléculas 2006, 7(11), 3059-3068) describe andamios biodegradables porosos basados en gelatina A3.

M. De Colli et al. (Biomed. Madre. 2012, 7(5), 055005) describe un andamio de gelatina mezclada y glicosaminoglicano, que se obtuvo utilizando una técnica de creación de plantillas de emulsión concentrada conocida como emulsión de fase interna alta (HIPE).

El documento WO 2013/164635 describe un proceso de preparación de una composición de matriz extracelular que comprende: (a) mezclar una solución acuosa de fibrinógeno con un agente coagulante y un agente de volumen y un agente espumante; y (b) hacer que la mezcla forme espuma y se coagule.

El documento WO 2017/183710 describe un método para producir una lámina de gelatina porosa que tiene propiedades de proliferación celular.

Uno de los objetivos de las realizaciones de la presente invención es desarrollar un método mejorado para producir un andamio proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico.

Resumen de la invención

La invención proporciona un método para preparar un andamio proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico. El método comprende: proporcionar una emulsión de aceite en agua que comprende gotitas de aceite dispersadas en una fase continua que comprende una solución proteica acuosa tamponada con pH, en el que la emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico o una mezcla de tensioactivos no iónicos, en el que el tensioactivo no iónico está en una cantidad de 0.01 a 10 % en volumen del volumen total de la fase oleosa en la emulsión de aceite en agua, en el que un HLB del tensioactivo no iónico o la mezcla de tensioactivos es de 10 a dieciséis; gelificar la proteína alrededor de las gotitas de aceite; retirar las gotitas de aceite de la fase continua después de la formación de un andamio; e incubar el andamio con una solución excipiente. El andamio de proteína porosa es típicamente un andamio de proteína nativa porosa.

La invención también proporciona un andamio proteico poroso. El andamio proteico poroso se puede obtener a partir del método de la invención usando una proteína gelificable seleccionada de al menos uno de colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina y elastina, en el que el andamio proteico poroso comprende una estructura fibrosa interconectada de proteínas y tiene un tamaño de poro promedio en el rango de 80 a 200 micrómetros.

La invención también se refiere a usos y métodos que implican el andamio proteico poroso.

El andamio proteico poroso puede usarse en la reparación de tejidos o en la regeneración de tejidos en un ser humano o un animal. Por ejemplo, el andamio proteico poroso se puede utilizar en la cicatrización de heridas.

Se describe un método de reparación de tejido o regeneración de tejido en un ser humano o un animal. El método comprende aplicar o implantar el andamio proteico poroso en un sitio, tal como una herida, en un cuerpo humano o animal. Normalmente, el sitio es un área del cuerpo humano o animal que necesita regeneración o reparación de tejido.

La invención también se refiere a un método in vitro o ex vivo de (i) fabricar o diseñar un tejido o (ii) fabricar una construcción diseñada por tejido. Cada método comprende aplicar células al andamio proteico poroso de la invención.

La invención proporciona además una construcción diseñada mediante ingeniería tisular. La construcción obtenida mediante ingeniería tisular se puede obtener mediante un método de la invención. Adicional o alternativamente, la construcción diseñada mediante ingeniería tisular comprende células o un tejido soportado sobre el andamio proteico poroso.

La invención también se refiere a usos y métodos que implican la construcción de ingeniería tisular.

La construcción de ingeniería tisular puede usarse en el tratamiento del cuerpo humano o animal.

Se describe un método para tratar a un ser humano o un animal. El método comprende aplicar o implantar la construcción diseñada mediante ingeniería tisular en un sitio, tal como una herida, en el cuerpo humano o animal.

Breve descripción de los dibujos

A continuación se describen con mayor detalle realizaciones de la invención, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos.

La Figura 1 proporciona imágenes de microscopía electrónica de barrido de varios andamios EmDerm (dérmicos con plantilla de emulsión) con plantilla de emulsión de acuerdo con una realización de la invención.

La Figura 2 proporciona gráficos que muestran el tiempo de degradación de andamios EmDerm fabricados usando emulsiones preparadas con concentraciones variables de tensioactivo de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 3 proporciona gráficos que muestran la proliferación de tipos de células en andamios de EmDerm después de la liofilización con diferentes excipientes de acuerdo con realizaciones de la presente invención. Para los histogramas mostrados en A, las primeras tres barras (de izquierda a derecha en el eje x) se relacionan con el excipiente “P68”, las tres segundas barras se relacionan con el excipiente “M” y las tres últimas barras se relacionan con Excipiente “NIL”. Para los histogramas mostrados en B., las tres primeras barras (de izquierda a derecha en los ejes x) se relacionan con el excipiente “PVA”, las tres segundas barras se relacionan con el excipiente “M”, las tres barras siguientes se relacionan con el excipiente “P68” y las tres barras finales se relacionan con el excipiente “PEG”. Para los histogramas mostrados en C, las primeras tres barras (de izquierda a derecha en los ejes x) se relacionan con el excipiente “PVA”, las segundas tres barras se relacionan con el excipiente “M”, las siguientes tres barras se relacionan con el excipiente “PEG” y las tres barras finales se refieren al excipiente “NIL”.

La Figura 4 proporciona gráficos que muestran la proliferación de tipos de células en andamios de EmDerm de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En los histogramas mostrados de A. a C. el % de tensioactivo en cada eje x de izquierda a derecha es 0.1, 0.3, 0.5 y 0.7 respectivamente.

La Figura 5 proporciona gráficos que muestran la proliferación de tipos de células en andamios EmDerm de acuerdo con realizaciones de la presente invención en comparación con andamios comparadores comerciales. En los histogramas mostrados, las primeras tres barras (de izquierda a derecha en los ejes x) se relacionan con el tipo de andamio “0.1C-P68”, las segundas tres barras se relacionan con el tipo de andamio “0.1CF-P68”, la siguiente tres barras se refieren al tipo de andamio “0.1F-P68”, el cuarto conjunto de tres barras se refieren al tipo de andamio “MATRIDERM” y las tres últimas barras se refieren al tipo de andamio “INTEGRA”.

La Figura 6 proporciona imágenes de microscopio de campo amplio de andamios de EmDerm de acuerdo con realizaciones de la presente invención cultivadas con diferentes tipos de células durante 7 días.

La Figura 7 proporciona imágenes de microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O elaboradas con diferentes valores de HLB de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

Las Figuras 8Ay 8B proporcionan imágenes de microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O con diferentes velocidades de mezcla y concentraciones de tensioactivo, y mediciones resumidas del diámetro de las gotas de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La Figura 8A muestra el efecto de la velocidad de cizallamiento sobre el tamaño de las gotas de mezclas de emulsión HLB 13 con una mezcla de tensioactivo al 0.75 % y una concentración de Kollidon al 0.8 %. El aumento de la velocidad de corte provoca una reducción significativa en el tamaño de las gotas (media ± DE, *p<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001). La Figura 8B muestra el efecto combinado de la velocidad de corte y la concentración de tensioactivo sobre el diámetro de la gota. En el histograma superior, la primera barra de cada grupo de barras representa 0.25 SA, la segunda barra representa 0.5 SA, la tercera barra representa 0.75 SA, la cuarta barra representa 1.0 SAy la quinta barra representa 1.5 SA. En el histograma inferior, la primera barra de cada grupo de barras representa “1500”, la segunda barra representa “2000”, la tercera barra representa “2500” y la cuarta barra representa “3000”.

La Figura 9 proporciona imágenes de microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O con diferentes concentraciones de tensioactivo de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 10 proporciona imágenes de microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O con concentraciones variables de PVP de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 11 proporciona imágenes de microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O a temperaturas variables de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

Las Figuras 12A a 12F proporcionan perfiles de estabilidad de emulsión para emulsiones con valores variables de HLB, concentraciones de PVP y concentraciones de tensioactivo de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 13 proporciona la caracterización de la viscoelasticidad de emulsiones de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 14 proporciona imágenes de microscopía confocal de emulsiones BSA-FITC de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 15 proporciona intensidades de fluorescencia relativas en las fases acuosa y oleosa de emulsiones de acuerdo con realizaciones de la presente invención. En cada uno de los histogramas, la fase acuosa está representada por la primera barra (de izquierda a derecha a lo largo del eje x) y la fase oleosa está representada por la segunda barra.

La Figura 16 proporciona espectros FTIR de emulsiones de acuerdo con realizaciones de la presente invención. La Figura 17 proporciona espectros de dicroísmo circular de albúmina sérica bovina mezclada con una emulsión de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 18 proporciona ensayos de fluorescencia de triptófano para fibrinógeno mezclado con emulsiones con concentraciones variables de tensioactivo y PVP de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 19 proporciona ensayos enzimáticos para LDH mezclada con emulsiones con concentraciones variables de tensioactivo y<p>V<p>de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

La Figura 20 es una ilustración esquemática de un aparato de emulsificación descrito en el Ejemplo 4;

La Figura 21 es un gráfico que ilustra cómo el diámetro de las gotas de emulsión puede controlarse mediante la velocidad del impulsor como se describe en el Ejemplo 4 (por ejemplo, controlado directamente mediante la velocidad de cizallamiento teórica del impulsor a la velocidad correspondiente).

La Figura 22 es una serie de histogramas que muestran el resultado de la proliferación celular de cocultivos que comparan EmDerm y controles.

La Figura 23 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en andamios EmDerm-C donde (A) es para HDF/HDE y (B) es para MSC/HDE.

La Figura 24 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células, donde (C) es para HEK/HDF en el andamio EmDerm-C y (A) es para HDF/HDE en el andamio EmDerm-CF.

La Figura 25 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en el andamio EmDerm-CF donde (B) es para MSC/HDE y (C) es para HEK/HDF.

La Figura 26 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en el andamio EmDerm-F donde (A) es para HDF/HDE y (B) es para MSC/HDE.

La Figura 27 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en el andamio Integra donde (A) es para HDF/HDE y (B) es para MSC/HDE.

La Figura 28 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en los andamios Integra o Matriderm donde (C) es para HEK/HDF en el andamio Integra y (A) es para HDF/HDE en el andamio Matriderm.

La Figura 29 muestra una serie de imágenes del cocultivo de células en el andamio Matriderm donde (B) es para MSC/HDE y (C) es para HEK/HDF.

La Figura 30 muestra imágenes SEM de queratinocitos sembrados en EmDerm-C (A), EmDerm-CF (B), Integra (C) y Matriderm (D).

La Figura 31 es una representación esquemática de una en vivo plan experimental (no de acuerdo con la invención reivindicada).

La Figura 32 muestra una biopsia del día 7 de EmDerm-C con abrasión en el lado izquierdo y sin abrasión en el derecho.

La Figura 33 muestra una biopsia del día 7 de EmDerm-CF con abrasión en el lado izquierdo y sin abrasión en el derecho.

La Figura 34 muestra una biopsia del día 7 de EmDerm-F con abrasión en el lado izquierdo y sin abrasión en el derecho.

La Figura 35 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-C (abrasión).

La Figura 36 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-CF (abrasión).

La Figura 37 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-F (abrasión).

La Figura 38 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-C (sin abrasión).

La Figura 39 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-CF (sin abrasión).

La Figura 40 muestra una biopsia del día 14 de EmDerm-F (sin abrasión).

La Figura 41 son histogramas que muestran el número medio de vasos sanguíneos en biopsias.

La Figura 42 son histogramas que muestran el grado medio de inflamación en biopsias.

Descripción

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para preparar un andamio proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico. El método comprende proporcionar una emulsión de aceite en agua que comprende gotitas de aceite dispersadas en una fase continua que comprende una solución proteica acuosa tamponada con pH. La emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico en una cantidad del 0.01 al 10 % en volumen del volumen total del aceite (es decir, fase hidrófoba) en la emulsión de aceite en agua. El método comprende además gelificar la proteína alrededor de las gotitas de aceite, retirar las gotitas de aceite de la fase continua después de la formación de una estructura; e incubar el andamio con una solución excipiente.

El método de la presente divulgación proporciona un método eficaz para la fabricación de andamios para apoyar el crecimiento de células biológicas. En particular, el método de la presente divulgación emplea una emulsión de aceite en agua que puede actuar como plantilla para fabricar un andamio proteico poroso. Gelificando la proteína alrededor de las gotitas de aceite, se puede producir un andamio que tenga la estructura de poros deseada. Como las gotas de aceite no participan directamente en la gelificación de proteínas, el aceite se puede eliminar posteriormente (por ejemplo, eluir) para proporcionar una estructura proteica porosa para apoyar el crecimiento celular.

Se conocen métodos de creación de plantillas en emulsión. Sin embargo, hasta la fecha, tales métodos no se han empleado para la fabricación de andamios de proteínas porosos, en particular cuando la proteína está en una configuración secundaria y terciaria nativa. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se cree que esto se debe a las dificultades asociadas con la estabilidad y compatibilidad entre un sistema de emulsión oleosa y la proteína de soporte, la desnaturalización de la proteína así como la posterior eliminación de la fase oleosa. Por ejemplo, se ha descubierto que si se usan tensioactivos iónicos, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS) o cloruro de dodeciltrimetilamina (DTMA), como únicos tensioactivos en la emulsión, se puede inhibir o prevenir la gelificación de la proteína. Además, los tensioactivos iónicos, como el ácido decanoico, pueden no formar emulsiones estables, lo que aumenta el riesgo de separación durante el proceso de formación de plantillas de emulsión.

Ahora se ha descubierto que los problemas de desnaturalización y/o descomposición y/o inestabilidad de la emulsión pueden reducirse usando tensioactivos no iónicos en ciertas cantidades. La cantidad de tensioactivo no iónico con respecto a la cantidad de aceite en una emulsión de aceite en agua también puede controlarse para controlar el tamaño de las gotas de aceite y, por tanto, el tamaño de los poros del andamio final.

A diferencia de los métodos de la técnica anterior, el método de la invención puede producir un andamio proteico poroso donde la proteína no está desnaturalizada. Esto permite la producción de un andamio proteico poroso donde se conserva la microestructura de las proteínas, de modo que formen una estructura fibrosa interconectada. La producción del andamio se puede lograr mediante actividad enzimática en la fase acuosa, mediante reacción química no enzimática o mediante gelificación térmicamente controlada de moléculas de proteína. La estructura fibrosa interconectada puede facilitar la formación de estructuras funcionales dentro del tejido que crece en el andamio, como la vasculatura al crear una capa dérmica de piel. Por el contrario, los andamios proteicos de la técnica anterior son generalmente lisos y sin rasgos distintivos.

La etapa de gelificar la proteína alrededor de las gotitas de aceite se puede realizar usando un agente gelificante. El agente gelificante se puede añadir a la emulsión de aceite en agua para provocar la gelificación de la proteína alrededor de las gotitas de aceite. Alternativamente, el agente gelificante puede incluirse en la emulsión de aceite en agua desde el principio. Por tanto, la emulsión de aceite en agua puede comprender el agente gelificante.

El agente gelificante puede ser un agente gelificante enzimático, tal como trombina.

El agente gelificante puede ser un agente gelificante no enzimático. El agente de gelificación no enzimático puede ser un agente químico o un agente reticulante, tal como genipina. El agente de gelificación no enzimático puede ser un agente de reticulación iónico, tal como cloruro de calcio.

Proteínas

Como se describió anteriormente, el método de la presente divulgación implica proporcionar una emulsión de aceite en agua que comprende gotitas de aceite dispersadas en una fase continua que comprende una solución proteica acuosa tamponada con pH.

La solución proteica acuosa puede comprender una solución proteica acuosa nativa. Una proteína nativa es una proteína que está en su conformación o forma adecuadamente plegada y/o ensamblada que está asociada con su actividad biológica específica, es decir, es operativa y funcional. En otras palabras, una proteína nativa no ha sido alterada, por ejemplo, por un agente desnaturalizante como el calor, productos químicos o acción enzimática, lo que podría resultar en un despliegue parcial o completo. La estructura terciaria plegada de una proteína nativa hace que la proteína sea capaz de realizar su función biológica. En otras palabras, una proteína nativa es una proteína caracterizada que posee la capacidad de realizar una o más funciones biológicas que dicha proteína sería capaz de realizar dentro de su entorno nativo.

Ejemplos de proteínas que pueden usarse como, por ejemplo, el componente estructural primario de un andamio de la invención incluyen colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina y elastina.

Normalmente, la proteína es una proteína gelificable, tal como una proteína gelificable seleccionada de al menos uno de colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina y elastina.

Se prefiere que la proteína incluya colágeno o fibrinógeno. Más preferentemente, la proteína incluye colágeno.

El colágeno puede ser cualquier tipo o forma de solución de colágeno extraída disuelta o suspendida. El colágeno puede ser cualquier forma de solución de colágeno que sea gelificable. El colágeno puede ser fibrilar (Tipo I, II, III, V, XI) o no fibrilar (IX, XII, XIV, XIX, XXI, VIII, X, IV, XV, XVIII, XIII, XVII, VI, VII). El colágeno puede ser colágeno disuelto en ácido, siendo el ácido preferiblemente ácido acético. En una realización, la proteína es colágeno tipo I, por ejemplo colágeno tipo I extraído con ácido.

El colágeno puede ser, por ejemplo, colágeno humano, colágeno porcino, colágeno bovino o colágeno de cola de rata. Preferiblemente, el colágeno es colágeno humano, colágeno porcino o colágeno bovino. Más preferentemente, el colágeno es colágeno humano o colágeno porcino.

La solución proteica acuosa puede comprender una única proteína, o una mezcla de una o más proteínas, o una mezcla de una proteína o proteínas con péptidos. En una realización, se puede usar un péptido o proteína desnaturalizada tal como gelatina o fibroína de seda en una mezcla con una proteína nativa.

Además, se pueden usar otros materiales biológicos o macromoléculas, tales como glucosaminoglucanos (por ejemplo, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de heparina y ácido hialurónico) y polisacáridos, por ejemplo, quitosano y alginato, en combinación con la proteína en la fase continua. Estas otras macromoléculas biológicas pueden actuar para mejorar la especificidad del andamio. Por ejemplo, los glucosaminoglicanos de la matriz extracelular pueden ser útiles como constituyentes coacervados de formulaciones de compuestos con el constituyente proteico primario.

Se pueden agregar otros materiales biológicos al andamio. Estos otros materiales biológicos pueden actuar para mejorar la especificidad del andamio. Otros materiales biológicos pueden incluir hidroxiapatita, fosfatos tricálcicos y otros minerales, como el fosfato cálcico amorfo.

El material biológico puede seleccionarse entre al menos uno de glicosaminoglicanos, alginatos, polisacáridos y partículas de fosfato cálcico, tales como hidroxiapatita.

La cantidad de proteína de soporte estructural en la fase acuosa final de la mezcla de emulsión de aceite en agua puede estar en el intervalo de 0.01 a 5 % p/v, preferiblemente de 0.05 a 4 % p/v, por ejemplo de 0.1 a 3 % p/v. Por ejemplo, un intervalo preferido puede ser de 1 mg/ml (0.1 % p/v) a 5 mg/ml (0.5 % p/v) para colágeno tipo I, y de 10 mg/ml (1 % p/v) a 50 mg/ml (5 % p/v) para fibrinógeno.

En una realización preferida, la solución proteica acuosa puede comprender una mezcla de dos o más proteínas. Cuando la solución proteica acuosa comprende una mezcla de dos o más proteínas, se prefiere que al menos una de las proteínas sea colágeno.

Por ejemplo, se puede usar una mezcla de soluciones de colágeno y fibrinógeno para crear un andamio interpenetrante de colágeno y fibrina. Preferiblemente, el colágeno es colágeno tipo I. La mezcla de reactivos de colágeno y fibrinógeno puede estar presente en una proporción en masa de 1:50 a 10:1, preferiblemente de 1:25 a 5:1, por ejemplo, de 1:20 a 2: 1. En un ejemplo preferido, se mezcla una combinación de 0.2 % p/v de colágeno y 2 % p/v de fibrinógeno a partir de soluciones separadas en una proporción en volumen de 1:1 para dar una proporción en masa de 1:10.

La proporción final de fase continua en la emulsión de aceite en agua puede ser del 25 al 75 % en volumen del volumen total de la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, la proporción final de fase continua en la emulsión de aceite en agua puede ser del 25 % al 50 % del % en volumen del volumen total de la emulsión de aceite en agua. Más preferiblemente, la proporción final de fase continua en la emulsión de aceite en agua puede ser del 25 % al 35 % del % en volumen del volumen total de la emulsión de aceite en agua. La proporción final de fase continua en la emulsión de aceite en agua puede ser el % en volumen del volumen total de la emulsión de aceite en agua utilizada para la fundición. Preferiblemente, la cantidad de proteína en la emulsión de aceite en agua puede ser del 0.1 % al 5 % en masa del componente acuoso total de la emulsión de aceite en agua.

La fase acuosa de la emulsión de aceite en agua se puede fabricar en etapas, a partir de soluciones de componentes. Por ejemplo, la solución de tensioactivo se puede preparar a partir de formas fabricadas o concentrados mediante adición a agua para formar una solución de tensioactivo. Cada proteína o proteínas se puede disolver, diluir o preparar de otro modo en un tampón acuoso separado, por ejemplo, como una solución proteica concentrada. Se puede utilizar una solución tampón separada como diluyente. Se puede utilizar una solución de agente estabilizante separada. Posteriormente, estas soluciones de componentes se pueden agregar a la mezcla de formación de andamio en proporciones apropiadas para lograr la composición de fase acuosa final.

Fase oleosa (hidrófoba)

En el método de la presente invención se puede utilizar cualquier aceite adecuado. Ejemplos de aceites adecuados incluyen aceites minerales ligeros, decano o aceites de hidrocarburos de cadena corta (con longitudes de cadena de hidrocarburos en el intervalo C8-C18, preferiblemente C8-C12). Los ejemplos de aceites minerales ligeros incluyen aceite mineral ligero de calidad farmacéutica, con baja viscosidad y no tóxicos, triglicéridos preferiblemente con longitudes de cadena de hidrocarburos de grupos acilo grasos en el rango C8-C18, preferiblemente C8-C12 (por ejemplo, trioctanoato de glicerilo), ciclohexano, tolueno, También son compatibles los hidrocarburos de cadena corta y el aceite de perfluorocarbono, o mezclas de los mismos. En una realización particularmente preferida, el aceite es decano.

También se pueden usar perfluorocarbonos opcionalmente en combinación con fosfolípidos como fase oleosa/hidrófoba.

La fase oleosa puede estar presente en la emulsión de aceite en agua en una cantidad de al menos el 25 % del volumen total de la emulsión, preferiblemente al menos el 50 %, por ejemplo al menos el 75 %. Preferiblemente, la fase oleosa puede estar presente en la emulsión de aceite en agua en una cantidad de al menos 100 % en volumen del volumen de la fase continua, más preferiblemente en una cantidad de 100 % en volumen a 300 % en volumen del volumen de la fase continua. En una realización preferida, la fase oleosa puede estar presente en la emulsión de aceite en agua en aproximadamente un 300 % en volumen de la fase continua. Al constituir la mezcla final, la fase oleosa puede estar presente en al menos el 66 % del volumen de la fase continua en el caso en que la fase continua se mezcla con la fase oleosa en dos o más pasos, como la adición de tensioactivo concentrado y solución tampón acuosa antes de la adición de la solución de proteínas.

Tensioactivo

Se utiliza un tensioactivo no iónico para formar la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, el tensioactivo no iónico se puede usar para reducir el riesgo de que la proteína en la fase continua se adsorba en la interfaz de la gotita de aceite y/o que el tensioactivo desnaturalice los componentes proteicos. El tensioactivo no iónico puede aumentar la probabilidad de que la proteína permanezca en la fase acuosa en masa. El tensioactivo no iónico también puede reducir el riesgo de que la proteína se desnaturalice durante el proceso de fabricación del andamio.

El tensioactivo puede ser cualquier tensioactivo no iónico adecuado. Un tensioactivo no iónico consta de una cabeza hidrófila, una cola hidrófoba y no tiene carga. Ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen ésteres o éteres de un poliol. Los polioles adecuados incluyen alcoholes de azúcar y sus derivados. En un ejemplo, el poliol es sorbitán. El tensioactivo no iónico puede comprender un éster o éter de sorbitán y un ácido graso. El tensioactivo no iónico puede comprender un éster de sorbitán y un ácido graso. Los ácidos grasos adecuados incluyen Csto C<20>ácidos grasos, por ejemplo, C<10>a C<18>o C<12>a C<16>ácidos grasos. El tensioactivo no iónico puede comprender un éster o éter de sorbitán y un ácido graso seleccionado de al menos uno de C10 a C18 ácido graso, preferiblemente un C12 (ácido láurico), C14 (ácido mirístico) C16 (ácido palmítico) o C18 (ácido esteárico). El tensioactivo no iónico puede comprender un mono, di o triéster o éter de un ácido graso seleccionado de al menos uno de C10 a C18 ácido graso, preferiblemente un C12 (ácido láurico), C14 (ácido mirístico) C16 (ácido palmítico) o C18 (ácido esteárico).

En un ejemplo, el tensioactivo no iónico puede comprender un mono, di o triéster de un ácido graso seleccionado de al menos uno de un grupo C10 a C18 ácido graso, preferiblemente un C12 (ácido láurico), C14 (ácido mirístico) C16 (ácido palmítico) o C<18>(ácido esteárico). Preferiblemente, el tensioactivo no iónico comprende un monoéster de sorbitán y ácido láurico. Los ésteres adecuados de sorbitán y ácidos grasos se venden bajo la marca comercial Span™. Por ejemplo, el tensioactivo no iónico puede comprender monolaurato de sorbitán, Span 20™.

Estructura Span 20™

El tensioactivo no iónico puede comprender un éster etoxilado de un poliol. El tensioactivo no iónico puede comprender un éster etoxilado de sorbitán o un polisorbato. Los polisorbatos adecuados se venden bajo la marca comercial Tween™.

El tensioactivo no iónico puede comprender un éster de sorbitán de ácido graso etoxilado. El ácido graso se puede seleccionar de al menos uno de C8 a C<20>ácido graso, por ejemplo, un C<10>a C<18>o C<12>a C<16>ácido graso. En un ejemplo, el tensioactivo no iónico puede comprender monolaurato de sorbitán etoxilado, Tween 20™.

Se puede emplear una mezcla de tensioactivos no iónicos. La mezcla puede comprender éster(es) de sorbitán y éster(es) de sorbitán etoxilado. En un ejemplo, una mezcla de Span™ y Tween™ se pueden emplear tensioactivos. Preferiblemente una mezcla de monolaurato de sorbitán, Span 20™ y monolaurato de sorbitán etoxilado, Tween 20™ puede ser empleado.

La proporción de éster(es) de sorbitán a éster(es) de sorbitán etoxilado se puede controlar para proporcionar un equilibrio hidrófilo-lipófilo (Hl B) adecuado. El Hl B es una medida del grado en que el tensioactivo es hidrófilo o lipófilo. Por ejemplo, el valor HLB de Span 20 es 8.6 y de Tween 20 es 16.7.

El tensioactivo no iónico o la mezcla de tensioactivos que comprende el (los) tensioactivo(s) no iónico(s) tiene un valor HLB de al menos 10. El tensioactivo no iónico o la mezcla de tensioactivos que comprende el o los tensioactivos no iónicos tiene un valor HLB de hasta 16. El HLB es de 10 a 16. En ejemplos preferidos, el HLB puede estar entre 11 y 14, preferiblemente entre 12 y 13.5, más preferiblemente entre 12.5 y 13.

Otros tensioactivos no iónicos adecuados incluyen tensioactivos no iónicos etoxilados con un grupo de cola hidrocarbonado de 6 a 20 átomos de carbono, preferiblemente de 8 a 15 átomos de carbono, por ejemplo de 10 a 12 átomos de carbono. Preferiblemente, los tensioactivos tienen al menos 12 moles, particularmente preferido al menos 16 moles y aún más preferiblemente al menos 20 moles, tal como al menos 25 moles de óxido de etileno por mol de alcohol.

Los tensioactivos etoxilados adecuados incluyen los ésteres de sorbitán (familia Span™), ésteres de sorbitán polietoxilados (familia Tween™), copolímero de bloque de polioxipropileno-polioxietileno (familia Poloxámero), grupo hidrocarburo aromático de óxido de polietileno, etoxilatos de ácidos grasos/alcohol y ésteres de glicerol de ácidos grasos.

El tensioactivo no iónico se puede utilizar en combinación con un cotensioactivo. El cotensioactivo puede ser un tensioactivo iónico, tal como un tensioactivo aniónico o un tensioactivo catiónico. El cotensioactivo puede comprender hasta un 10 % en peso del tensioactivo total, preferiblemente hasta un 7.5 % en peso, por ejemplo hasta un 5 % en peso.

Ejemplos de tensioactivos iónicos que pueden usarse como cotensioactivos son dodecilsulfato de sodio (SDS) o cloruro de dodeciltrimetilamina (DTMA) o ácido decanoico.

El cotensioactivo puede tener una longitud de cadena de hidrocarburo similar o idéntica a la del tensioactivo no iónico. En un ejemplo, el cotensioactivo puede tener una longitud de cadena de hidrocarburo en el intervalo C<10>-C<14>, cuando el tensioactivo no iónico principal tiene una longitud de cadena de hidrocarburo de C<12>.

Mezclando tensioactivos no iónicos con tensioactivos aniónicos o catiónicos, puede ser posible alterar el potencial zeta (y ) de las gotitas de la emulsión. Esto puede proporcionar un aumento en la estabilidad de la emulsión, ya que la magnitud del potencial zeta indica el grado de repulsión electrostática entre partículas adyacentes con carga similar dentro de una dispersión.

Se puede usar un tensioactivo catiónico como cotensioactivo, por ejemplo, cuando la proteína es fibrinógeno. En otro ejemplo, se puede usar un tensioactivo aniónico como cotensioactivo, por ejemplo, cuando la proteína es colágeno.

La emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico en una cantidad del 0.01 al 10 % en volumen del volumen total de la fase oleosa en la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, la emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico en una cantidad del 0.05 % al 1 % del % en volumen, más preferiblemente del 0.1 % al 0.5 % del % en volumen del volumen total de aceite en la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, la emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico en una cantidad del 0.1 % al 0.7 % del % en volumen del volumen total del aceite en la emulsión de aceite en agua. Por ejemplo, una concentración molar de 1 % de Tween 20™ equivale a 8.2 ^m en la fase oleosa. Una concentración molar del 1 % Span 20™ equivale a 29 ^m en la fase oleosa.

Cuando se emplea una mezcla de tensioactivos, la cantidad total de tensioactivos puede estar en el intervalo de 0.05 -2 % en masa de la fase oleosa. Por ejemplo, la concentración molar de una mezcla de tensioactivos preferida de la invención con un HLB de 12.5, donde el tensioactivo total es 0.1 %, equivale a 0.393 |jm deTween 20™ más 1.50 |jm Span 20™, en la fase oleosa.

Cuando se emplea una mezcla de tensioactivos, el HLB de la mezcla de tensioactivos puede estar entre 11 y 14, preferentemente entre 12 y 13.5, más preferentemente entre 12.5 y 13.

El tensioactivo se puede emplear en combinación con un agente estabilizante. Un agente estabilizante adecuado puede ser polivinilpirrolidona. El agente estabilizante se puede emplear en una cantidad del 0.1 al 10 % p/v de la fase acuosa, por ejemplo, del 0.5 al 5 % p/v de la emulsión de aceite en agua.

Método de preparación a andamio de proteína porosa

El método de la presente invención emplea una fase oleosa emulsionada en una fase acuosa tamponada con pH, que contiene el componente o componentes proteicos que formarán la estructura de andamio. Las emulsiones de este tipo se denominan genéricamente emulsiones de tipo aceite en agua (O/W). Para que sean útiles para la creación de plantillas, las emulsiones de la invención son deseablemente estables durante al menos el tiempo necesario para la gelificación de proteínas, y preferiblemente para que se produzca la reticulación posterior, y deseablemente deberían tener un tamaño de gotita controlable. En al menos algunas realizaciones, la estabilidad de las emulsiones de la invención se puede lograr mediante la formulación descrita anteriormente, empleando tensioactivos no iónicos, preferiblemente con grupos de cabeza de poliol, y más preferiblemente mediante el HLB del tensioactivo o mezcla de tensioactivos empleada.

El tamaño de las gotas puede controlarse mediante la velocidad de cizallamiento del sistema de emulsificación.

De acuerdo con el método de la presente invención, se usa gelificación de proteínas para formar una red de proteínas alrededor de las gotitas de aceite y separarlas de ellas. En un ejemplo, la etapa de gelificación de proteínas puede incluir procesos de reticulación no iónicos, iónicos o covalentes, o una mezcla de los mismos. En otro ejemplo, la etapa de gelificación de proteínas puede incluir reacciones químicas enzimáticas o no enzimáticas, procesos de reticulación iónicos o no iónicos, incluido el autoensamblaje molecular controlado térmicamente, o una mezcla de los mismos.

La gelificación de proteínas se puede realizar durante un período de tiempo en condiciones controladas de temperatura y humedad. Normalmente, el inicio de la gelificación física se diseñará para que se produzca entre 5 y 10 minutos después del moldeo, y la finalización del proceso de gelificación puede ocurrir hasta 60 minutos después del moldeo, por ejemplo 30 minutos después del moldeo. La gelificación de proteínas se puede realizar, por ejemplo a 37 °C, en una cámara humidificada o en una bandeja cubierta para minimizar la pérdida por evaporación de la superficie del andamio.

En un ejemplo, se puede realizar una etapa de reticulación química adicional. Preferiblemente, la etapa de reticulación se produce después de la formación de la estructura primaria, es decir, después de la gelificación de proteínas. La etapa de reticulación adicional puede unir (por ejemplo, de forma covalente) moléculas de proteína para crear una matriz insoluble. En la técnica se entiende que el entrecruzamiento entre proteínas puede permitir el control de la tasa de degradación proteolítica en masa de una estructura proteica. La reticulación puede aumentar la resistencia física y la estabilidad química y bioquímica del andamio proteico. Se cree que esto puede permitir controlar la tasa de degradación y el perfil del andamio. La reticulación también puede aumentar las propiedades mecánicas del andamio.

Puede usarse cualquier agente reticulante de proteínas adecuado para el componente proteico del andamio. Por ejemplo, dialdehídos (por ejemplo, glioxal, glutaraldehído), diisocianatos (por ejemplo, diisocianato de hexametileno), succinimidas (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)), carbodiimidas (por ejemplo, 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil) clorhidrato de carbodiimida (EDC), N,N diciclohexilcarbodiimida), imidoésteres (por ejemplo, adipimidato de dimetilo (DMA), suberimidato de dimetilo (DMS), epiclorhidrina, éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, genipina o enzimas con función de reticulación de proteínas (transglutaminasa, factor XIII).

Los reactivos de reticulación compatibles incluyen clorhidrato de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (NHS). En una realización, se pueden usar EDC y NHS en combinación. Puede emplearse cualquier relación molar adecuada de EDC y NHS. Por ejemplo, la relación molar de EDC a NHS puede ser de 1 a 10: 1, por ejemplo, 1 - 5: 1, o 2 - 3: 1. En un ejemplo, la relación molar de EDC a NHS puede ser 5: 2. En un ejemplo, EDC:NH<s>(relación molar5:2) en el intervalo de 1 a 100 mm para EDC, preferiblemente se puede utilizaren el intervalo de 10 a 35 mm.

Otros reactivos de reticulación adecuados incluyen glutaraldehído. Por ejemplo, se puede utilizar glutaraldehído en el intervalo de 10 a 500 mm, más particularmente en el intervalo de 15 a 50 mm.

Se puede usar una solución alcohólica en la etapa de reticulación adicional. Ejemplos de alcoholes adecuados incluyen alcoholes C<1>-C<6>, preferiblemente alcoholes C<1>-C<4>, por ejemplo alcoholes C<1>-C<3>. En una realización preferida, el alcohol es etanol. El alcohol se puede utilizar en combinación con un tampón de pH acuoso, en el intervalo del 50 % al 95 %.

En una realización, se puede usar una solución de reticulación de etanol al 75-85%con un tampón de pH acuoso en la región de pH 6-8, preferiblemente en el intervalo de pH 7-7.5, por ejemplo pH 7.4.

También se pueden utilizar reactivos de reticulación enzimáticos. Un ejemplo es la transglutaminasa. También se puede utilizar reticulación enzimática usando transglutaminasa disuelta en un tampón acuoso a una concentración entre 0.001 y 1000 unidades/ml.

De acuerdo con el método de la presente invención, las gotitas de aceite en emulsión se eliminan del andamio después de su formación. Las gotas de aceite pueden eliminarse mediante elución del andamio. Para este paso se puede utilizar cualquier disolvente adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar un disolvente alcohólico. El alcohol puede ser un alcohol alifático. En una realización, el alcohol es un alcohol C<1>-C<12>, preferiblemente un alcohol C<1>-C<6>, por ejemplo un alcohol C<1>-C<4>. Ejemplos de alcoholes adecuados incluyen metanol, etanol, propano-1-ol, propano-2-ol, butano-1-ol, butano-2ol, terc-butanol y mezclas de los mismos. La elución se realiza lavando el andamio con un exceso de volumen de alcohol o solución alcohólica. La etapa de lavado puede verse favorecida por una agitación suave, tal como la que se logra mediante un movimiento orbital giratorio.

Después de la eliminación de las gotitas de aceite, el andamio se incuba con una solución de excipiente. El excipiente puede ser un excipiente hidrófilo orgánico soluble en agua. Ejemplos de excipientes adecuados incluyen polioles tales como azúcares (por ejemplo, manitol, sorbitol, dextrosa, sacarosa), polímeros como alcohol polivinílico (PVA), polietilenglicol (p Eg ) o copolímero en bloque de polioxietileno-polioxipropilenglicol (por ejemplo, pluronic P68), polivinilpirrolidona (PvP) (por ejemplo, Kollidon™), o copolímeros de polietilenglicol y alcohol polivinílico (por ejemplo, Kollicoat™). Se puede utilizar una mezcla de excipientes. La concentración del excipiente en solución, luego puede ser de hasta 10 % en volumen, por ejemplo de 1 a 5 % en volumen.

El andamio se puede incubar durante cualquier período de tiempo adecuado, por ejemplo de 5 a 10 minutos. El excipiente puede reducir la contracción masiva del andamio durante el secado y también puede preservar la nanoestructura del andamio durante un proceso de liofilización. La concentración de excipiente utilizada está en el intervalo de 0.5 - 2 M acuoso para azúcares, o en el intervalo de 0.5 - 5 % p/v acuoso para excipientes poliméricos.

Después de la incubación, el exceso de solución de excipiente se elimina del soporte, por ejemplo mediante drenaje, mientras se mantiene la saturación del soporte con la solución de excipiente. El propio excipiente recubre la estructura del andamio y puede eliminarse después de la liofilización, por ejemplo puede eliminarse mediante lavado. Es deseable retirar el excipiente antes de usar el andamio, por ejemplo, en el tratamiento de heridas.

De acuerdo con un método preferido de la presente invención, se realiza la liofilización del andamio. La liofilización (o liofilización) es un proceso de deshidratación que funciona congelando el andamio que está saturado en agua o solución excipiente y luego reduciendo la presión circundante. Esto permite la eliminación del disolvente (agua) y del aceite volátil restante del andamio. Por lo tanto, la liofilización mejora ventajosamente el almacenamiento y la vida útil del andamio. El control de los parámetros de liofilización permite la preservación de la nanoestructura de andamio que se ha formado mediante la creación de plantillas de emulsión. Preferiblemente, la liofilización se realiza entre -20 y -40 °C, y a una presión inferior a la presión de vapor correspondiente a la temperatura de secado seleccionada. En un ejemplo, la liofilización se realiza a -40 °C. En un ejemplo, la liofilización se realiza a <200 mTorr.

En algunos ejemplos, el andamio se prepara en una sala limpia en condiciones estériles.

Andamio

El andamio poroso formado mediante el método de plantilla de emulsión descrito comprende una estructura tridimensional basada en proteínas, en la que la proteína del andamio es una proteína que proporciona sitios de adhesión celular, y que está diseñada para tener una dimensión de poro para permitir el ingreso de las células a la estructura tridimensional. La estructura de andamio proporciona así una estructura tridimensional capaz de acomodar células en su interior.

El andamio poroso puede comprender una estructura con una proporción sustancial de poros de dimensión suficiente para permitir que las células pasen a través de ella y así penetren en la estructura. La estructura porosa del andamio es preferiblemente una estructura de poros interconectados, que se extiende a través de al menos parte de la estructura en una dimensión. El tamaño de los poros normalmente se mide por el diámetro de los poros o la distancia más corta entre las laminillas del andamio que forman la pared de los poros.

El intervalo de dimensiones de poros (diámetro de poro más corto) adecuado es superior a 20 pm e inferior a 350 pm. El andamio tiene un tamaño de poro promedio en el intervalo de 80 a 200 micrómetros, preferiblemente en el intervalo de entre 90 a 120 micrómetros, por ejemplo entre 100 a 110 micrómetros.

Los poros pueden tener una forma regular o irregular. Por ejemplo, los poros pueden definir cámaras o túneles que se extienden a través de al menos una parte del andamio. El andamio puede tomar la forma de una matriz. En una realización, el andamio toma la forma de una matriz que comprende una pluralidad de poros.

Los andamios de la presente divulgación tienen un tamaño de poro promedio en el intervalo de 80 a 200 micrómetros, preferiblemente en el intervalo de 90 a 120 micrómetros o de 80 a 100 micrómetros. La Figura 1 muestra imágenes de microscopía electrónica de barrido de varios andamios EmDerm con plantilla de emulsión (andamios dérmicos con plantilla de emulsión). En los histogramas mostrados de D. a F. el % de tensioactivo en cada eje x de izquierda a derecha es 0.1, 0.3, 0.5 y 0.7 respectivamente. El tamaño de los poros se puede medir utilizando una sección transversal de la imagen SEM, como se muestra en la Figura 1.

El andamio comprende una estructura fibrosa interconectada de las proteínas.

En general, la(s) proteína(s) no están desnaturalizadas. La(s) proteína(s) pueden presentarse en su configuración de naturaleza secundaria y/o terciaria.

El andamio puede ser un andamio de colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina o elastina. Alternativamente, se puede formar un andamio compuesto usando dos o más proteínas. El andamio o andamio compuesto también puede incluir un agente coligativo tal como gelatina o fibroína.

Ejemplos de andamios compuestos incluyen andamios de colágeno-fibrinógeno, andamios de colágeno-sulfato de condroitina, andamios de colágeno-ácido hialurónico. Ejemplos de estructuras compuestas de fibrina incluyen sulfato de fibrina-condroitina, ácido hialurónico de fibrina y gelatina de fibrina.

Se prefiere que el andamio comprenda colágeno.

El andamio puede tener una resistencia a la tracción adecuada para soportar la adhesión celular y para ser manejado y manipulado físicamente. Por ejemplo, el andamio puede tener una resistencia máxima a la tracción (UTS) de entre 0.01 y 100 MPa. Preferiblemente, la UTS del andamio está entre 1 y 20 MPa. Por ejemplo, la UTS de un andamio de la invención está en el intervalo de 10 a 16 MPa.

El andamio puede tener un módulo de Young de entre 0.01 y 100 MPa, preferiblemente de 0.5 a 3 MPa, por ejemplo de 1 a 2 MPa.

La estabilidad del andamio de la invención es suficiente para soportar el ingreso y la proliferación celular dentro de la estructura durante el tiempo suficiente para cumplir el propósito previsto del andamio.

La estabilidad del andamio en un entorno proteolítico se puede medir mediante la tasa de pérdida de peso durante el tiempo de incubación en una solución proteolítica de prueba. Por ejemplo, es adecuada una solución de tripsina de calidad para cultivo de tejidos, al 0.25 % p/v en solución salina tamponada con fosfato o tampón verseno. En un ensayo en el que se incuba una muestra de andamio en dicha solución de tripsina a 37 °C y la tripsina se reemplaza cada 24 horas. La estabilidad preferida, medida por una pérdida de peso del 50 %, puede ser de 4 a 10 días, por ejemplo, de 5 a 7 días.

Usos de los andamios

Los andamios de la invención pueden tener una variedad de aplicaciones. Estos incluyen, por ejemplo, el uso como implantes acelulares, también denominados andamios de reparación de tejidos, para promover la reconstrucción de tejidos organizada histológicamente y la curación de heridas. Otro uso ejemplar es el de un andamio de reparación de tejidos asistida por células, en el que un andamio de la invención se siembra con células terapéuticas antes de la implantación quirúrgica para la reconstrucción de tejidos y la cicatrización de heridas. Otro ejemplo de uso de los andamios de la invención es la creación de tejidos obtenidos mediante ingeniería tisular in vitro, en los que se siembran células dentro o sobre el andamio, en condiciones asépticas, en un medio de cultivo celular fisiológico y soportados en un entorno que permita células para organizarse sobre o dentro del andamio, para formar una estructura de tejido u organoide o estructura similar a un órgano. Estos se denominan comúnmente construcciones de ingeniería tisular, equivalentes de tejido o equivalentes de piel. Estas construcciones de ingeniería tisular pueden usarse para implantación como productos medicinales de terapia avanzada (ATMP) o usarse con fines de investigación no clínicos, como detección de fármacos o evaluación de terapias.

El andamio proteico poroso puede usarse en la reparación de tejidos o en la regeneración de tejidos en un ser humano o un animal. Por ejemplo, el andamio proteico poroso se puede utilizar en la cicatrización de heridas. La herida puede estar asociada con pérdida de tejido, tal como, por ejemplo, una quemadura, una herida por explosión, una lesión por quitarse los guantes. La herida puede ser una herida de resección quirúrgica, tal como la de la extirpación de un cáncer de piel. La herida puede ser una herida crónica, como una úlcera o una llaga por presión.

El andamio proteico poroso se puede utilizar en un método de reparación de tejido, o para la regeneración de tejido, en un ser humano o un animal. El método comprende aplicar o implantar el andamio proteico poroso en un sitio, tal como una herida, en el cuerpo humano o animal. Normalmente, el sitio es un área del cuerpo humano o animal que necesita regeneración o reparación de tejido.

La introducción del andamio puede ayudar a que el tejido vuelva a crecer en el sitio en el que se aplica o implanta. Después de aplicar o implantar el andamio de proteína porosa, se puede aplicar un material de vendaje sobre el sitio con el andamio de proteína porosa.

El andamio proteico poroso se puede asegurar en el sitio con suturas o grapas.

Antes de aplicar o implantar el andamio de proteína porosa, el método puede implicar remojar o lavar el andamio de proteína porosa en una solución salina (es decir, una solución salina estéril) antes de la aplicación o implantación. El andamio poroso se puede utilizar en combinación con otros sustitutos de la piel. Por ejemplo, el andamio poroso se puede usar en combinación con una membrana, por ejemplo una membrana electrohilada o una lámina de silicona. La membrana se puede utilizar para proporcionar una barrera semipermeable o microporosa encima del andamio. La membrana puede ser porosa, lo que puede permitir que los nutrientes se difundan a través de la porción de membrana hacia el interior del andamio poroso para facilitar la propagación y el crecimiento celular. En un ejemplo, los poros entre fibras de una membrana electrohilada tienen un diámetro medio inferior a 10 pm.

El andamio de proteína porosa se puede utilizar como andamio de reparación de tejidos o material compuesto. El andamio poroso está diseñado para acomodar células. Por ejemplo, el andamio proteico poroso puede comprender aberturas o poros para acomodar células. En consecuencia, se pueden sembrar células en el andamio, y el andamio puede facilitar el crecimiento de tejido nuevo.

El andamio se puede utilizar para crear andamios con fines de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, el andamio puede usarse para diseñar órganos sólidos, por ejemplo, hígado, corazón o riñón artificiales. El andamio también se puede utilizar para la reconstrucción de tejidos de dermis, fascia, tendones, ligamentos, pericardio, periostio y tejidos blandos como injertos de grasa y músculos.

La invención proporciona una in vitro o ex vivo método de (i) fabricar o diseñar un tejido o (ii) fabricar una construcción diseñada por tejido. Cada método comprende aplicar células al andamio proteico poroso, preferiblemente en un recipiente de cultivo. Esta etapa produce un andamio proteico poroso sembrado de células.

Las células pueden derivar de piel, tejido blando o hueso.

Las células pueden ser fibroblastos, queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans, células de Merkel o células madre.

Las células pueden ser células humanas o células porcinas, preferiblemente células humanas.

El método puede comprender aplicar células y un medio de cultivo al andamio proteico poroso.

Después de aplicar las células, el método implica hacer crecer células y/o tejido en el andamio proteico poroso sembrado. Esta etapa se puede realizar usando técnicas conocidas en la técnica.

El andamio elaborado de acuerdo con el método de la presente invención también se puede utilizar como sistema de administración de portadores de células madre para la curación y regeneración de heridas. Por ejemplo, el andamio puede usarse para el tratamiento de quemaduras, tales como quemaduras de espesor parcial a total. El andamio también se puede utilizar para el tratamiento de heridas, como heridas crónicas que no cicatrizan.

Construcción de ingeniería tisular

La invención proporciona además una construcción diseñada mediante ingeniería tisular. La construcción diseñada mediante ingeniería tisular comprende células o un tejido soportado sobre el andamio proteico poroso.

Las células o el tejido pueden estratificarse sobre el andamio proteico poroso.

La construcción diseñada mediante ingeniería tisular puede comprender una primera capa y una segunda capa. La primera capa puede comprender fibroblastos y queratinocitos soportados sobre una primera estructura proteica porosa. Esta primera capa puede proporcionar parte de un andamio cutáneo que tiene un epitelio estratificado. La segunda capa puede comprender fibroblastos y células madre, preferiblemente células madre mesenquimales, soportadas sobre una segunda estructura proteica porosa. Esta segunda capa puede proporcionar parte de un andamio cutáneo que tiene una construcción dérmica vascularizada.

El primer andamio proteico poroso puede tener la misma o diferente composición que el segundo andamio proteico poroso. Tanto el primer como el segundo andamio proteico poroso están de acuerdo con la invención.

La construcción de ingeniería tisular puede usarse en el tratamiento del cuerpo humano o animal. Por ejemplo, la construcción de ingeniería tisular puede usarse en la curación de heridas. La herida puede estar asociada con pérdida de tejido, tal como, por ejemplo, una quemadura, una herida por explosión, una lesión por quitarse los guantes. La herida puede ser una herida de resección quirúrgica, tal como la de la extirpación de un cáncer de piel. La herida puede ser una herida crónica, como una úlcera o una llaga por presión.

Se divulga un método para tratar a un ser humano o un animal. El método comprende aplicar o implantar la construcción diseñada mediante ingeniería tisular en un sitio, tal como una herida, en el cuerpo humano o animal. El método comprende aplicar o implantar la construcción diseñada mediante ingeniería tisular en un sitio, tal como una herida, en el cuerpo humano o animal. Normalmente, el sitio es un área del cuerpo humano o animal que necesita regeneración o reparación de tejido.

Después de aplicar o implantar la construcción de ingeniería tisular, se puede aplicar un material de vendaje sobre el sitio con la construcción de ingeniería tisular.

El andamio de construcción de ingeniería tisular se puede asegurar en el sitio con suturas o grapas.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales

Se adquirieron colágeno de cola de rata tipo I 5 mg/ml en ácido acético (First Link, Reino Unido), fibrina bovina (Sigma Aldrich), y trombina bovina (Sigma Aldrich). Decane, Tween 20 y Span 20 también se obtuvieron de Sigma Aldrich para preparar emulsiones de aceite en agua. También se obtuvieron de Sigma-Aldrich clorhidrato de 1-etil-3-(-3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y sulfo-N-hidroxisuccinimida (NHS), etanol puro, e isopropanol puro para reticulación y elución de aceite. El ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) y el cloruro de sodio se compraron de Sigma Aldrich, así como el ensayo Cell Counting Kit (CCK-8). El alcohol polivinílico (PVA) (99 % hidrolizado, MW 89.000 a 98.000), polietilenglicol (PEG) (MW 6000), Pluronic F-68 (P68) y manitol se obtuvieron de Sigma Aldrich. También se adquirió de Sigma-Aldrich una solución de tripsina-EDTA al 0.25 % para cultivo celular.

Fabricación de Andamios

Se mezclaron mezclas de emulsión que comprendían decano, Span 20/Tween 20 con un HLB calculado de 13 y un tampón acuoso (MES 25 mm, NaCl 150 mm, pH 7.4) en una jeringa de 60 ml sin la punta, durante 15 segundos a 1000 rpm. utilizando una batidora Caframo de alta velocidad. Se prepararon emulsiones con una concentración de tensioactivo de 0.1 %, 0.3%, 0.5% y 0.7%. Para fabricar andamios a partir de varios tipos de proteínas, cada una de las emulsiones se añadió a soluciones de proteínas designadas de la siguiente manera: colágeno (Col), fibrinógeno más trombina (Fbn) o una mezcla de solución de colágeno y fibrina en una proporción de 1:1 (ColFbn). La solución gelificante de colágeno se usó a 4.5 mg/ml, se preparó fibrinógeno a 20 mg/ml y trombina a 10 unidades/ml en tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). Cada andamio de emulsión se dejó gelificar a 37 °C durante 30 minutos y luego se entrecruzó con EDC:NHS (relación molar 5:2) en etanol al 80 %. Luego se lavaron los andamios con isopropanol al 80 % y luego con agua desionizada tres veces durante 15 minutos. En este punto, los andamios se incubaron adicionalmente con una solución de excipiente al 1 % p/v (por ejemplo, P68, PVA, PEG o manitol (M)). Todos los andamios se liofilizaron a -40 °C (para andamios de fibrina) y -30 °C (para andamios de colágeno)

Los posibles efectos de los diferentes excipientes utilizados, sobre los parámetros funcionales y la morfología del andamio, se compararon utilizando andamios fabricados con un tamaño de poro grande con una concentración de tensioactivo del 0.1 %. Se comparó el efecto de la concentración de surfactante entre andamios fabricados con Pluronic F68 como excipiente.

Tamaño de poro de los andamios

Cada uno de los andamios se cortó con un bisturí de modo que la sección transversal de cada andamio quedara horizontal sobre la cinta de carbono montada en los trozos de aluminio para obtener imágenes por microscopía electrónica de barrido. Se tomaron tres imágenes por andamio y se promediaron los diámetros de 20 poros aleatorios para calcular el tamaño medio estimado de los poros de cada andamio. También se observó la morfología del andamio (por ejemplo, fibroso o liso).

Biocompatibilidad de andamios

Se sembraron andamios con tres tipos de células para determinar la biocompatibilidad de cada andamio con los distintos tipos de células: fibroblastos dérmicos humanos (HDF), células endoteliales dérmicas humanas (HDE) y células madre mesenquimales humanas (MSC) marcadas con GFP Cada andamio se cortó en discos de 6 mm mediante una biopsia por punción y se lavó con PBS (solución salina tamponada con fosfato) tres veces antes de incubar durante la noche en medio DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) con FBS (suero bovino fetal) al 10 % y antibióticos de penicilina/estreptomicina. Al día siguiente, cada uno de los andamios se sembró con 5000 células/pocillo y se dejó durante la noche para que las células se adhirieran al material del andamio. Al día siguiente, los andamios sembrados se transfirieron a una placa de pocillos nueva y se dejaron incubar hasta 14 días. Los medios se cambiaron en días alternos. Los días 3, 7 y 14, se realizó un ensayo de proliferación celular utilizando CCK-8 (Sigma, Reino Unido) para determinar el crecimiento celular en cada andamio. El día 14, los andamios se fijaron en formalina tamponada normal para obtener más imágenes.

Imágenes de campo amplio de andamios sembrados

Cada uno de los andamios sembrados se tiñó usando anticuerpos fluorescentes para obtener imágenes posteriores. Los andamios sembrados con fibroblastos dérmicos humanos se tiñeron con faloidina 1:6 (Alexa Fluor 488, Thermo Fisher) y los andamios sembrados con células endoteliales dérmicas humanas se tiñeron con CD31 antihumano de ratón 1:250 (Dako) y 1: 1000 vWF antihumano de conejo (Dako). La tinción secundaria se realizó con anti-ratón de cabra (Alexa Fluor 488, Thermo Fisher) y anti-conejo de cabra (Alexa Fluor 568, Thermo Fischer). Los andamios sembrados con células madre mesenquimales no se tiñeron porque eran células que expresaban GFP Se tomaron pilas en Z para visualizar la migración celular a través del andamio mediante imágenes de campo amplio con un aumento de 20X. Las imágenes se desconvolucionaron utilizando AutoQuant X3 (Media Cybernetics) y se visualizaron utilizando Bitplane (software Imaris, versión 9.1).

Análisis estadístico

Los datos entre diferentes estructuras y puntos temporales se analizaron mediante un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) para evaluar la significación estadística entre las comparaciones. Un valor de p inferior a 0.05 se considera estadísticamente significativo. Cuando corresponda, * indica un valor p de <0.05, ** indica un valor p de <0.01 y *** indica un valor p de <0.001. Todo el análisis estadístico se realizó utilizando GraphPad Prism versión 4.0 para Windows.

Resultados

Estructura y porosidad del andamio

La aplicación de las emulsiones de aceite en agua de decano tuvo éxito en la formación de estructuras a partir de cada tipo de proteína de estructura, extracto de ácido acético de colágeno tipo I neutralizado, que gelifica espontáneamente al calentarse desde una solución de 4 °C a 37 °C; y fibrinógeno, coagulado enzimáticamente con trombina a 37 °C. La interconectividad de los poros de los andamios se obtuvo al controlar la relación de fase aceite:acuosa a >0.5. Es importante destacar que los andamios formados demuestran una arquitectura fibrosa a nanoescala derivada del estado hidrogelatinoso. Fue necesario el uso de un excipiente para preservar esta estructura en la liofilización y reducir la contracción.

El tamaño de los poros de los andamios EmDerm se correlacionó inversamente con la concentración de surfactante utilizada para crear la emulsión. Hubo una relación inversa entre la concentración de surfactante, la velocidad de mezcla (velocidad de corte aplicada) y el diámetro de las gotas de la emulsión, es decir, aumentar la concentración de surfactante y/o la velocidad de corte puede disminuir el diámetro de las gotas. Para los andamios elaborados a partir de emulsiones con un 0.1 % de tensioactivo, se obtuvo un tamaño medio de poro de alrededor de 100 pm. Esto disminuyó a aproximadamente 40 pm con 0.7 % de tensioactivo.

Propiedades mecánicas de los andamios

La medición de las propiedades de tracción de cada tipo de andamio EmDerm (Tabla 1) mostró que los andamios de colágeno-fibrina tenían el módulo de Young y la resistencia máxima a la tracción (UTS) más altos, aproximadamente de 1 a 2 MPa y de 12 a 16 MPa respectivamente. A esto le siguen los andamios de colágeno, que tenían un módulo de Young de aproximadamente 1 a 2 MPa y un UTS de aproximadamente 7 a 9 MPa. Los andamios de fibrina tenían un módulo de Young de aproximadamente 1 a 2 MPa y un UTS de aproximadamente 4 a 5 MPa. El cambio en la porosidad de los andamios y los excipientes utilizados no pareció tener un impacto significativo en las propiedades mecánicas de los andamios, en comparación con el tipo de material del que están hechos los andamios.

Tabla 1. Caracterización de resistencia mecánica de andamios.

Degradación hidrolítica del andamio

La degradación de los andamios por hidrólisis se determinó midiendo el peso seco residual de los andamios empapados en PBS (solución salina tamponada con fosfato) durante períodos prolongados (Figura 2 A-C). Los andamios de colágeno mostraron una gran caída en la masa seca del 40-50 % durante la primera semana. Esto se debe en gran medida a la disolución de los excipientes durante la hidratación inicial del andamio. Al final de las 5 semanas, todos los andamios retuvieron aproximadamente entre el 40 y el 60 % de su masa seca. Aunque la estabilidad del andamio de colágeno se logró en el tiempo de reticulación más corto (Fig. 2A), los andamios de colágeno-fibrina y fibrina que se entrecruzaron durante un período más prolongado se degradaron más lentamente en comparación con los andamios que se entrecruzaron durante 30 minutos (Fig. 2B, C) aunque esto no fue estadísticamente significativo en este experimento. En particular, los andamios de fibrina que se entrecruzaron durante sólo 30 minutos se degradaron por completo al cabo de 5 semanas.

Degradación enzimática del andamio

Los andamios de colágeno y colágeno-fibrina permanecieron degradados de manera incompleta el día 7 cuando se incubaron en solución de tripsina (Fig. 2A, B). Todos los andamios de fibrina que se entrecruzaron durante menos de 2 horas se degradaron completamente en 7 días. Los que se entrecruzaron durante 0.5 horas se degradaron completamente al cabo de 3 días, seguidos por los que se entrecruzaron durante 1 hora el día 5 y los que se reticularon durante 1.5 horas el día 7 (Fig. 2C). Al igual que con la degradación hidrolítica, la masa de cada andamio disminuyó significativamente durante el primer día. Es probable que la disolución de los excipientes contribuya a la caída inicial de la masa seca del andamio.

Biocompatibilidad de andamios

La evaluación de la biocompatibilidad de las estructuras EmDerm se investigó midiendo la proliferación de tres tipos de células fundamentales para la reconstrucción de la piel: HDF, HDE y MSC. La proliferación neta de cada tipo de célula se produjo durante los 14 días del ensayo en cada material de soporte (Figuras 3-5). Es importante destacar que no hubo ningún efecto significativo al variar el excipiente utilizado, en comparación con el excipiente plurónico (Fig. 3). La proliferación de HDE y MSC en andamios de colágeno fabricados sin excipiente (C-GEL) fue menor que en andamios de colágeno EmDerm con excipiente (C-P68 y C-M) (Fig. 3A). Además, HDF mostró una menor proliferación en los andamios CF-PEG (Fig. 3B) y F-M (Fig. 3C).

Si bien la proliferación fue marcada en andamios con alta porosidad, hubo una tendencia general a que la proliferación fuera progresivamente menor a medida que la porosidad disminuía (Fig. 4). Este efecto fue más pronunciado para HDF en andamios C con la porosidad más baja, correspondiente a una mezcla de surfactante del 0.5 y 0.7 % en la plantilla de emulsión (Fig. 4A), y en andamios CF con la porosidad más baja (Fig. 4B).

Comparación con andamios comerciales

Se produjo una proliferación significativamente mayor de cada tipo de célula en cada uno de los andamios EmDerm de alta porosidad con tensioactivo al 0.1 % que los andamios de comparación comerciales, Matriderm e Integra (Fig. 5). Es de destacar que 0.1F-P68 apoyó la mayor proliferación de HDE, mientras que 0.1C-P68 promovió una mejor proliferación de células mesenquimales, siendo ambos efectos estadísticamente significativos (Fig. 5).

Imágenes de microscopio de campo amplio de andamios sembrados

Según las pilas Z obtenidas, se encontró que cada tipo de célula se infiltraba en el andamio de manera uniforme sobre el plano XY y el plano Z (Fig. 6). Debido a las limitaciones en la penetración de la luz, solo se tomaron imágenes de las células hasta una profundidad de aproximadamente 100 micrómetros. En particular, se observó infiltración celular en estructuras de colágeno en un grado similar a la de las estructuras que contienen fibrina, lo que sugiere el efecto de la nanoestructura de fibra preservada en estas estructuras. Curiosamente, las células endoteliales parecían formar estructuras en forma de anillo cuando se sembraban en estructuras de EmDerm, sobre todo con CF y F (flechas en la Fig. 6, paneles HDE). También es notable que el HDE ingresa a las estructuras de EmDerm C y, aunque muestra una menor diseminación citoesquelética, demuestra cierta asociación en las estructuras anulares. Por el contrario, los tipos de células estromales adoptan una morfología alargada en forma de huso cuando se siembran en estructuras EmDerm, más pronunciada en los fibroblastos que en las células madre mesenquimales (Fig. 6).

Ejemplo 2 - Eficiencia de emulsificación (no según la invención reivindicada) Gelificación

Se prepararon mezclas de emulsiones para sistemas de gelificación de fibrina.

Fibrina

Se disolvió fibrinógeno para dar una solución al 2 % de proteína coagulable en tampón MES/NaCl. El pH se ajustó a 7.4 después de la disolución completa de la proteína.

Se preparó una mezcla de emulsión que comprendía 2 pl de cloruro de calcio, MES/NaCl, hasta 250 pl, 500 pl de decano y un tensioactivo de prueba (en el intervalo de 0.1 a 1 % del volumen de decano).

Cada una de las mezclas de emulsión se mezcló mediante vórtice y agitación manual para establecer una emulsión. Se añadieron 250 pl de fibrinógeno y la mezcla se volvió a mezclar brevemente. Luego se añadieron 25 pl de trombina y la mezcla se agitó vigorosamente durante 30 segundos y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Se realizaron pruebas de control de los componentes acuosos, cloruro de calcio, fibrinógeno, tampón MES/NaCl y trombina para verificar la coagulación.

Tabla 2: Resultados de gelificación para sistemas de gelificación de fibrina

Los resultados demuestran que el tensioactivo iónico no se puede sustituir por la mezcla no iónica Span 20/Tween 20 con un HLB optimizado para el decano. Los efectos adversos de los tensioactivos iónicos pueden deberse a la desnaturalización de las proteínas o a la inhibición de la gelificación y a la inestabilidad de la emulsión. Sin embargo, la incorporación de hasta un 0.1 % de tensioactivo iónico en combinación con un 0.9 % de Span 20/Tween 20 no iónico en estos sistemas de gelificación puede ser compatible con la gelificación y la creación de plantillas.

Ejemplo 3 (no de acuerdo con la invención reivindicada)

Materiales

Se compraron aceite mineral, Tween 20 y Span 20, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), cloruro de sodio (NaCl), Oil Red O, albúmina sérica bovina (pureza >95 %), FITC-BSA y butanol de Sigma. El excipiente de polivinilpirrolidona (PVP) (Kollidon KDF90) se obtuvo de BASF Pharmaceutical Co.

Preparación de emulsión

Efecto de la relación HLB sobre la emulsificación

Se mezclaron Tween 20 y Span 20 para obtener un rango de relaciones de HLB de 9.5 a 14, ya que el HLB relativo (rHLB) del aceite mineral para formar una emulsión de aceite en agua se describe como aproximadamente 10.5. Se añadió 0.75 % de tensioactivo a 5 ml de aceite mineral. Se añadió 2 % de PVP a 2.5 ml de tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). La solución se agitó durante 15 segundos.

Efecto de la concentración de PVP sobre la emulsificación

Se añadió 0.5 % de una mezcla de tensioactivos Tween 20/Span 20 con una relación HLB de 13 a 5 ml de aceite mineral. Se añadió 0 %, 0.5 %, 2 % y 4 % de PVP a 2.5 ml de tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). La solución se agitó durante 15 segundos.

Efecto de la concentración de tensioactivo sobre la emulsificación.

Se añadió 0.25 %, 0.5 %, 0.75 %, 1 % y 1.5 % de una mezcla de tensioactivos Tween 20/Span 20 con una relación HLB de 13 a 5 ml de aceite mineral. Se añadió PVP al 2 % a 2.5 ml de tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). La solución se agitó durante 15 segundos.

Efecto de la temperatura sobre la emulsificación

Se añadió una concentración de tensioactivo del 0.75 % de una mezcla de tensioactivos Tween20/Span 20 con una relación HLB de 13 a 5 ml de aceite mineral y 2.5 ml de tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). La mezcla se almacenó a 4, 22 y 37 grados Celsius durante una hora y se agitó durante 15 segundos.

Efecto de variar la concentración de surfactante a diferentes velocidades de corte.

Se añadió 0 %, 0.25 %, 0.5 %, 0.75 %, 1 % y 1.5 % de una mezcla de tensioactivos Tween20/Span 20 con una relación HLB de 13 a 5 ml de aceite mineral y 2.5 ml de tampón MES 25 mm/NaCl 150 mm (pH 7.4). La mezcla se mezcló con una mezcladora de alta velocidad (Caframo, Canadá) a 500, 1000, 1500, 2000, 2500 y 3000 rpm.

Análisis del tamaño de las gotas de emulsión

Se tiñeron 100 pl de todas las mezclas de emulsión con Oil Red O y se colocaron en un portaobjetos de vidrio con un cubreobjetos. El diámetro de las gotas se caracterizó mediante microscopía óptica simple e Imagen J. Todas las mediciones se expresan como media ± desviación estándar. Se realizó la prueba de Shapiro-Wilk para comprobar la normalidad de los datos. Los datos no paramétricos se evaluaron mediante ANOVA unidireccional (Kruskal-Wallis) con corrección de comparación múltiple de Dunn. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p<0.05.

Análisis de estabilidad de la emulsión

El análisis de estabilidad se realizó midiendo la turbidez (analizador de estabilidad de emulsión Turbiscan, Formularon, Francia). Se utilizó el cambio en la transmisión de luz y la retrodispersión en toda la muestra para caracterizar el efecto de la relación HLB, la concentración de surfactante y la concentración de PVP sobre la estabilidad de cada mezcla de emulsión. Se pipetearon 2 ml de cada mezcla de emulsión en cubetas de vidrio y se realizaron 21 exploraciones durante un período de 10 minutos (1 exploración cada 30 segundos). Se representó gráficamente el cambio en la transmisión de luz y la retrodispersión a lo largo de la celda de vidrio a lo largo del tiempo para obtener mediciones puntuales de desestabilización de la emulsión.

Análisis de viscoelasticidad de emulsión

Se utilizó un sistema de espectroscopía de onda de difusión (DWS Rheolab, LS Instruments, Suiza) para medir la viscoelasticidad de varias emulsiones para evaluar el efecto de la concentración de PVP en el sistema de emulsión. Brevemente, el sistema DWS Rheolab es un instrumento de microrreología óptica que utiliza espectroscopia de ondas de difusión para monitorear el movimiento térmico de sistemas de fluidos coloidales y, por lo tanto, permite calcular el almacenamiento, la pérdida y los módulos complejos. Se agitaron 200 pl de cada muestra de emulsión y se pipetearon inmediatamente en cubetas ópticas personalizadas DWS de 2 mm de longitud de trayectoria para medir G' (módulo de pérdida), G” (módulo de almacenamiento), así como G* (módulo complejo).

Caracterización de la interacción proteína-emulsión

Localización de proteínas en mezcla de emulsión

Se añadieron 10 pl de FITC-BSA1 mg/ml a cada mezcla de emulsión y se agitaron durante 15 segundos. Las mezclas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos antes de obtener imágenes bajo microscopía confocal. Se registró la distribución de FITC-BSA para cada mezcla de emulsión y se tomaron imágenes confocales de fluorescencia verde con un aumento de 10x.

Cuantificación de proteínas en fase oleosa y acuosa.

Se añadieron 10 pl de FITC-BSA 1 mg/ml a cada mezcla de emulsión y se agitaron durante 15 segundos. Las mezclas se incubaron a 37 °C durante 30 minutos antes de centrifugar a 10000 g durante 10 minutos para inducir la formación de crema. Se retiraron cuidadosamente 200 pl del subnadante acuoso y se transfirieron a una placa de 96 pocillos por triplicado (50 pl por pocillo). Se retiraron 100 pl del sobrenadante cremoso y se mezclaron con 100 pl de butanol para romper la emulsión antes de transferirla a una placa de 96 pocillos por triplicado (50 pl por pocillo). La fluorescencia relativa se midió frente a una solución de control que contenía 10 pg/ml de FITC-BSA en tampón MES/NaCl. Las placas se leyeron utilizando la plataforma de detección multimodo Spectramax i3x a una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. Se utilizó una curva estándar que utiliza un rango de concentración de FITC-BSA para cuantificar la cantidad de proteínas en las fases acuosa y cremosa. Todo el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA en GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.).

Evaluación de la conformación de BSA adsorbida.

Reflexión total atenuada: se utilizó espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (ATR-FTIR) para evaluar la desnaturalización de la BSA adsorbida en la fase de crema. Cada mezcla de emulsión se preparó como se describió anteriormente, sin embargo, se añadió BSA al 3 % en tampón MES/NaCl a la fase acuosa antes de agitar y centrifugar a 10000 g. Esta concentración garantizaría que incluso si se adsorbiera el 0.1 % de BSA total, estaría por encima del umbral del límite de detección (3 mg/ml). También se midieron los espectros de BSA nativa pura y BSA desnaturalizada (calentada a 80 °C durante 2 horas).

Se cargaron alrededor de 20 pl de fase crema en el cristal de un espectrómetro TENSOR 37 (Bruker) con una unidad ATR de reflexión única Specac Golden Gate (Specac Ltd., Orpington, Reino Unido). El detector de muestras se purgó con nitrógeno y se registró un espectro de absorción en el rango de 1000-4000 cirr1, Las mediciones de fondo se basaron en 64 escaneos y las mediciones de muestra se basaron en 64 escaneos. Los datos obtenidos por FT-IR fueron procesados utilizando las opciones de OPUS versión 6.5. Cada espectro de emulsión se restó de los espectros de emulsión de proteína para obtener señales de solo proteína, si estaban presentes. Los espectros fueron entonces desconvolucionados utilizando una derivada secundaria y corrección del valor inicial lineal de la banda de amida I para determinar si había alguna señal de proteína proveniente de BSA presente.

Evaluación de la conformación de BSA en fase acuosa de emulsión

Se utilizó dicroísmo circular de UV cercano (espectropolarímetro Jasco J-815) para evaluar los cambios en la conformación de BSA en la fase acuosa de la emulsión. Se preparó una mezcla en emulsión HLB 13 con una concentración de tensioactivo del 0.25 %. Se preparó una solución de BSA a una concentración de 4 mg/ml en un tampón fosfato 10 mm (pH 7.4). Como controles, también se prepararon muestras de BSA nativa y desnaturalizada, así como muestras de emulsión pura (sin proteínas). La mezcla de emulsión se incubó con BSA (en una proporción de volumen de 1:1) durante 30 minutos y luego se centrifugó a 10.000 g y se filtró tres veces, usando un filtro de 0.2 |jm para eliminar todas las partículas de emulsión. El filtrado se analizó utilizando dicroísmo circular casi UV. Los espectros de UV cercano se recogieron entre 260 nm y 310 nm utilizando una celda de cuarzo de 1 cm de longitud de trayectoria en pasos de 0.1 nm con 4 exploraciones por muestra. Todas las mediciones se realizaron a 25 °C y la línea base se corrigió utilizando el tampón fosfato 10 mm. Para garantizar que se obtuvieron resultados confiables, solo se incluyeron espectros por debajo de 1 kV de voltaje de dínodo de alta tensión (HT). Los espectros de UV lejano no se incluyeron en este estudio ya que el voltaje HT superó 1 kV.

Evaluación de la fluorescencia intrínseca del triptófano del fibrinógeno en la fase acuosa de una emulsión

La fluorescencia intrínseca de las proteínas debida a aminoácidos aromáticos como el triptófano proporciona otra forma de evaluar la estructura terciaria de las proteínas en la fase acuosa de las emulsiones, que puede verse alterada por la presencia de tensioactivos y gotitas de emulsión hidrófobas. El triptófano se excita alrededor de 275 nm y tiene una emisión de 350 nm en un ambiente acuoso. La desnaturalización de las proteínas da como resultado la exposición de residuos de triptófano, lo que provoca cambios en el pico de emisión.

Se prepararon una serie de mezclas de emulsión con diferentes concentraciones de surfactante (0.25 % SA, 0.5 % SA, 0.75 % SA) y PVP (1 % PVP, 2 % PVP, 4 % PVP) con una concentración final de 1 % de fibrinógeno. Como controles, también se prepararon muestras de fibrinógeno nativo y desnaturalizado (en SDS al 1 %) sin emulsiones. Cada mezcla de emulsión se incubó con fibrinógeno durante 30 minutos y luego se centrifugó a 10.000 g para separar la fase acuosa de la emulsión. Se pipetearon 50 ul de cada muestra en una placa de 96 pocillos por triplicado y las placas se leyeron utilizando el detector multimodo Spectramax i3x con una excitación de 275 nm y se recogieron espectros de emisión de 300 nm a 400 nm.

Evaluación de la función de la lactato deshidrogenasa en la fase acuosa de una emulsión

Además de examinar los cambios estructurales de las proteínas expuestas a emulsiones, también se investigaron los cambios funcionales de las proteínas expuestas a emulsiones. Se utilizó un ensayo colorimétrico con lactato deshidrogenasa (Sigma) para investigar el efecto de la exposición de la enzima a tensioactivos y gotitas de emulsión hidrofóbica. Se preparó una serie de mezclas de emulsión con diferentes concentraciones de tensioactivo (0.25 % SA, 0.5 % SA, 0.75 % SA) y PVP (1 % PVP, 2 % PVP, 4 % PVP). Como control negativo se utilizó LDH en SDS al 1 %.

Se agregaron 2 j l de control positivo de LDH a 1 ml de cada mezcla de emulsión y se incubaron durante 30 minutos. Luego las emulsiones se centrifugaron a 10.000 g para separar la fase acuosa de la emulsión. Se pipetearon 50 ul de cada muestra en una placa de 96 pocillos por triplicado junto con 50 ul de mezcla de reacción por muestra, según el protocolo de ensayo. Las placas se leyeron utilizando el detector multimodo Spectramax i3x a OD 450 nm en modo cinético, cada 3 minutos durante 30 minutos a 37 °C.

Resultados

Caracterización del tamaño de las gotas de emulsión

Efecto de la relación HLB sobre el tamaño de las gotas

Con un HLB de 9.5 no se obtuvieron emulsiones y sólo se formaron agregados coloidales. Con valores de HLB de 10 y 10.5, se obtuvieron pequeñas gotas inestables de aceite en agua y agua en aceite que formaban emulsiones bifásicas. Con un HLB de 11, se formaron emulsiones complejas de agua en aceite en agua (W-O-W). A partir de HLB de 11.5 a 15 se obtuvieron emulsiones metaestables de aceite en agua. Por lo tanto, aumentar la relación HLB estabiliza la fase de emulsión de aceite en agua con una tendencia hacia tamaños medios de gota más pequeños. La Figura 7 muestra microscopía óptica de las emulsiones teñidas con Oil Red O que muestra la transición de fase de las emulsiones a medida que aumenta el valor HLB (aumento 10x). El diámetro medio de las gotas disminuyó significativamente a medida que aumentaron los valores de HLB (p<0.05).

Efecto de variar la concentración de surfactante a diferentes velocidades de corte

El aumento de las velocidades de cizallamiento para cada una de las concentraciones de surfactante dio como resultado una disminución gradual del tamaño medio de las gotas (Figura 8). No se obtuvieron emulsiones para velocidades de cizallamiento de 500 rpm en este sistema para todos los rangos de concentración de tensioactivo. Esto sugiere que hay un umbral de velocidad de corte que debe alcanzarse para la formación de la emulsión, por encima del cual la formación de la emulsión depende de la velocidad de corte. El aumento de la concentración de tensioactivo a 1500 rpm no cambió significativamente los tamaños medios de las gotas ya que las emulsiones formadas eran inestables y floculantes/coalescentes. Esto dio como resultado desviaciones estándar muy grandes del diámetro medio de las gotas. Sin embargo, a partir de 2000 rpm, el aumento de la concentración de tensioactivo da como resultado una tendencia hacia tamaños medios de gota más pequeños. El aumento de la velocidad de cizallamiento en todas las concentraciones de surfactante parece reducir el tamaño de las gotas. Sin embargo, aumentar la velocidad de cizallamiento a una concentración de tensioactivo del 0.25 % parece disminuir el tamaño medio de las gotas de la emulsión de aceite en agua hasta 2500 rpm (lo que da un tamaño medio de las gotas de 85 ± 37 micrómetros).

Cuando no se añadió tensioactivo al aceite mineral, tampón MES 25 mm/NaCI 150 mm (pH 7.4) con PVP al 2 %, las emulsiones eran extremadamente inestables. En concentraciones del 0.25 % al 1.5 % de la mezcla de tensioactivos HLB 13, el aumento en la concentración de tensioactivos también dio como resultado una tendencia hacia gotas más pequeñas. La Figura 9 muestra microscopía óptica de las emulsiones teñidas con Oil Red O que muestran una disminución en el diámetro medio de las gotas a medida que aumenta la concentración de surfactante (p<0.05).

Efecto de la concentración de PVP sobre el tamaño de las gotas.

En la mezcla de emulsión HLB 13 con una concentración de mezcla de tensioactivo del 0.5 % sin PVP, se obtuvieron grandes diámetros de gotita de aproximadamente 200 micrómetros. El aumento de la concentración de PVP hace que las gotas sean más pequeñas y uniformes. Esto sugiere que la PVP puede tener propiedades de bloqueo estérico o propiedades tensioactivas o interactuar con moléculas tensioactivas en las regiones interfaciales que estabilizan aún más la emulsión. También puede ejercer un efecto influyendo en las propiedades viscoelásticas de la emulsión. La Figura 10 muestra microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O que muestran una disminución en el diámetro medio de las gotas a medida que aumentaba la concentración de PVP (p<0.05).

Efecto de la temperatura sobre el tamaño de las gotas.

Entre 4 y 37 °C, el cambio de temperatura tuvo un efecto insignificante sobre el tamaño de las gotas. Hubo un ligero aumento en el tamaño medio de las gotas cuando la temperatura se cambió de 22 °C a 37 °C a aproximadamente 105 micrómetros. Sin embargo, este no fue un efecto significativo. No se probaron temperaturas superiores a 37 °C, ya que las proteínas se desnaturalizan más allá de las temperaturas fisiológicas. Además, no se observó inversión de fase a temperaturas entre 4 y 37 °C. La Figura 11 muestra microscopía óptica de emulsiones teñidas con Oil Red O que no muestran cambios significativos en el diámetro medio de las gotas a medida que aumenta la temperatura (p>0.05).

Efecto de variar la concentración de surfactante a diferentes velocidades de corte

El aumento de las velocidades de cizallamiento para cada una de las concentraciones de surfactante dio como resultado una disminución gradual del tamaño medio de las gotas (Figura 8). No se obtuvieron emulsiones para velocidades de cizallamiento de 500 rpm en este sistema para todos los rangos de concentración de tensioactivo. Esto sugiere que hay un umbral de velocidad de corte que debe alcanzarse para la formación de la emulsión, por encima del cual la formación de la emulsión depende de la velocidad de corte. El aumento de la concentración de tensioactivo a 1500 rpm no cambió significativamente los tamaños medios de las gotas ya que las emulsiones formadas eran inestables y floculantes/coalescentes. Esto dio como resultado desviaciones estándar muy grandes del diámetro medio de las gotas. Sin embargo, a partir de 2000 rpm, el aumento de la concentración de tensioactivo da como resultado una tendencia hacia tamaños medios de gota más pequeños. El aumento de la velocidad de cizallamiento en todas las concentraciones de surfactante parece reducir el tamaño de las gotas. Sin embargo, aumentar la velocidad de cizallamiento a una concentración de tensioactivo del 0.25 % parece disminuir el tamaño medio de las gotas de la emulsión de aceite en agua hasta 2500 rpm (lo que da un tamaño medio de las gotas de 85 ± 37 micrómetros).

Caracterización de la estabilidad de la emulsión

Efecto del valor HLB sobre la estabilidad de la emulsión

En HLB 9.5 y 10, la estabilidad de la emulsión medida por el turbiscan fue muy baja, con grandes aumentos en la retrodispersión en el fondo de las células, lo que indica sedimentación. En HLB 10.5, la sedimentación fue menos pronunciada. Sin embargo, en HLB 11, los cambios en la transmisión de luz y la retrodispersión indicaron la formación de 3 capas distintas que indican una transición de fase de emulsiones de agua en aceite a emulsiones de aceite en agua. Desde HLB 11.5 hasta HLB 13, los cambios en la transmisión de luz y la retrodispersión debido al cremado disminuyeron a medida que aumentaron los valores de HLB, lo que indica una mayor estabilidad del sistema de emulsión. La Figura 12 muestra los perfiles de estabilidad de la emulsión Turbiscan a lo largo del tiempo para emulsiones con diferentes valores de HLB (HLB 11.5 y 13.0).

Efecto de la concentración de tensioactivo sobre la estabilidad de la emulsión.

Emulsiones sin tensioactivos, fases separadas en menos de un minuto en fases continuas separadas de aceite y agua. A medida que aumentó la concentración de surfactante, los cambios en la transmisión de luz y la retrodispersión, medidos por el turbiscan, debido a la formación de crema disminuyeron, lo que indica un aumento en la estabilidad de las emulsiones. La Figura 12 muestra los perfiles de estabilidad de la emulsión Turbiscan a lo largo del tiempo para emulsiones a diferentes concentraciones de tensioactivo.

Efecto de PVP concentración sobre la estabilidad de la emulsión

Las emulsiones sin PVP crecieron rápidamente pero no se separaron completamente las fases. A medida que aumentó la concentración de PVP, las emulsiones se volvieron mucho más estables con pequeños cambios en la transmisión de luz y la retrodispersión. La Figura 12 muestra los perfiles de estabilidad de la emulsión Turbiscan a lo largo del tiempo para emulsiones sin PVP o con 4 % de PVP

Caracterización de la viscoelasticidad de una emulsión

Efecto de PVP concentración sobre la viscoelasticidad de la emulsión

Aunque la PVP parece tener un efecto sobre el tamaño y la estabilidad de las gotas, las emulsiones con PVP únicamente (sin tensioactivos) fueron muy inestables y se separaron las fases sin formar emulsiones. Esto sugiere que es poco probable que el efecto de la PVP se deba a su propiedad tensioactiva. Una posible explicación es que la PVP aumenta la estabilidad de la emulsión mediante cambios en la viscoelasticidad de la emulsión. Por lo tanto, estudiamos el efecto de la PVP sobre las propiedades viscoelásticas de la emulsión en varias frecuencias. Los resultados de microrreología muestran que el aumento de la concentración de PVP resultó en un aumento de los cambios dinámicos en el módulo de pérdida (G”) de la mezcla de emulsión (Figura 13). El módulo de almacenamiento G' fue mayor para la emulsión con la mayor concentración de PVP (4 % de PVP), seguida de 2 % de PVP y 0.5 % de PVP, independientemente del rango de frecuencias. A frecuencias muy bajas (<50 Hz), las emulsiones con concentraciones más altas de PVP (4 % de PVP) tuvieron la mayor G” seguidas de las emulsiones con 2 % de PVP y 0.5 % de PVP En frecuencias de rango medio (50-3500 Hz), las emulsiones con 2 % de PVP tuvieron la mayor G”, seguidas de las emulsiones con 0.5 % de PVP y luego con 4 % de PVP En frecuencias de rango alto (>3500 Hz), las emulsiones con 0.5 % de PVP tuvieron la G” más alta, seguidas de las emulsiones con 2 % de PVP y 4 % de PVP Esto indica que el efecto de adelgazamiento por cizallamiento aumentó al aumentar la concentración de PVP

Caracterización de la interacción proteína-emulsión

Localización de proteínas en mezcla de emulsión

FITC-BSAformó una capa alrededor de cada gota de emulsión en lugar de dispersarse uniformemente en la emulsión de aceite en agua, lo que sugiere que las proteínas se habían adsorbido en el límite de la interfaz con los tensioactivos Tween20/Span 20 o formaron una cubierta externa que rodeaba las gotas de emulsión recubiertas de tensioactivo. La Figura 14 muestra imágenes de microscopía confocal que muestran el “efecto de recubrimiento” cuando FITC-BSA y el tensioactivo interactúan cerca de las regiones interfaciales aceite-acuosas (aumento de 10x). Para distinguir entre los dos, la mezcla de emulsión se centrifugó para inducir la formación de crema de las emulsiones. Si se adsorbió FITC-BSA en la interfaz, es probable que permanezcan en la capa de crema. Sin embargo, si FITC-BSA hubiera formado una capa exterior suelta que rodeara cada gota, la centrifugación interrumpiría la interacción proteínasurfactante, permitiendo que FITC-BSA regresara a la fase acuosa.

Luego se cuantificaron las concentraciones de proteína en cada fase para observar la proporción de FITC-BSA en la fase oleosa y acuosa. La fluorescencia relativa en las fases acuosa y oleosa muestra que la mayor parte del FITC-BSA se concentra en la fase acuosa en lugar de en la fase oleosa, independientemente del valor de HLB, la concentración de tensioactivo, la concentración de PVP o la temperatura. La Figura 15 muestra la cuantificación de la intensidad relativa de fluorescencia de FITC-BSA en fase acuosa versus fase oleosa, lo que demuestra que la mayor parte de la proteína permanece concentrada en la fase acuosa mientras que la cantidad de proteína en la fase oleosa es demasiado baja para ser cuantificada de manera confiable. De hecho, casi nada de FITC-BSA es detectable en la fase oleosa, lo que sugiere que las capas de FITC-BSA estaban ligeramente unidas a las gotitas de la emulsión en lugar de ser adsorbidas principalmente en la interfaz. Esto sugiere que los restos tensioactivos de óxido de polietileno y sorbitán previenen la adsorción de proteínas en la interfaz o/wy protegen a las proteínas de la desnaturalización en la interfaz.

Evaluación de la conformación de BSA adsorbida

Para confirmar aún más nuestros hallazgos, se obtuvieron espectros FTIR de la fase crema de emulsiones con y sin BSA. Los espectros de ambas emulsiones con y sin BSA fueron similares sin cambios demostrables en la región Amida I (1600-1700 cm-1). Como no hubo señales de proteínas detectables, esto sugiere que casi toda la BSA se desorbe de la superficie de las gotas de emulsión durante la centrifugación. Esto es consistente con los resultados de la cuantificación de la fluorescencia. Validamos aún más nuestros resultados realizando una desconvolución de los espectros FTIR obtenidos utilizando la segunda derivada para revelar los picos ocultos. Se observaron cuatro picos separados en la solución que contenía BSA pura; sin embargo, solo se observó un pico en todos los espectros de emulsión con y sin BSA. Esto se muestra en los espectros FTIR de BSA, y emulsiones con y sin BSA, mostrados en la Figura 16, que no muestran diferencias significativas en la región amida (1600-1700 cirr1). La Figura 16 también muestra la segunda derivada de los espectros FTIR restados de la fase crema de las emulsiones con BSA a diferentes concentraciones de HLB, tensioactivo y PVP, mostrando solo picos de agua sin señales de proteínas, en comparación con los cuatro picos en BSA. Es probable que esto se deba a los picos de agua observados en la región 1650 cm-1, debido a ligeras diferencias en la cantidad de agua en la fase dispersa de la crema en emulsión.

Evaluación de la conformación de BSAen fase acuosa de emulsión

Los espectros de UV cercano de BSA nativa en tampón fosfato y BSA incubada con emulsiones HLB 13 demostraron un cambio en 0 de 260 nm a 290 nm, lo que indica que BSAen la fase acuosa de las emulsiones todavía estaba en estado plegado. Mientras tanto, el espectro de BSA desnaturalizado era una línea plana que indicaba la pérdida de polarización de los residuos aromáticos (triptófano, tirosina, fenilalanina) debido al despliegue de la molécula de proteína. De manera similar, las muestras con solo emulsiones filtradas eran una línea plana y no mostraron ningún cambio en 0 de 260 nm a 290 nm, lo que indica que cualquier partícula de emulsión residual que no se eliminó mediante el proceso de filtración no interfirió con las lecturas de los espectros de CD (Figura 17).

Evaluación de la fluorescencia intrínseca del triptófano del fibrinógeno en la fase acuosa de una emulsión

Los espectros de emisión máxima de triptófano fueron de aproximadamente 350 nm, independientemente de la concentración de tensioactivo o PVP Esto indica que el fibrinógeno en la fase acuosa de las emulsiones todavía se encuentra en su estado nativo. Tras la desnaturalización con SDS al 1 %, se produce un desplazamiento al rojo de la intensidad máxima del pico a 340 nm. Esto sugiere que el fibrinógeno ya no está en su estado nativo y se ha desplegado, exponiendo así los residuos de triptófano nativos en el fibrinógeno a los tensioactivos disponibles (figura 18).

Evaluación de la función de la lactato deshidrogenasa en la fase acuosa de una emulsión

También se evaluaron los cambios funcionales de las proteínas expuestas a las emulsiones utilizando una enzima, la lactato deshidrogenasa (LDH). Es bien sabido que la LDH reduce el NAD+ al NADH. La formación de NADH se puede cuantificar mediante colorimetría. En la Figura 19, la adición de 0.25 % de tensioactivo no afectó significativamente la actividad de la enzima LDH. Sin embargo, a una concentración de tensioactivo del 0.5 % y superior, hay una ligera disminución en la actividad enzimática en comparación con el control positivo. De manera similar, la adición de PVP dio como resultado una disminución de la actividad enzimática de una manera dependiente de la concentración. No se observó reacción enzimática para los controles negativos con SDS al 1 %.

Ejemplo 4: Control del tamaño de la plantilla de emulsión (no según la invención reivindicada) Relación entre velocidad de corte, tensión superficial y tamaño de gota de emulsión.

El control del tamaño de las gotitas de la emulsión es un aspecto crítico de la invención en un sistema de emulsión de plantilla, el tamaño de la gota de aceite en agua como porógeno o plantilla de poro determina directa y estrechamente el tamaño de poro de los andamios resultantes.

Las dispersiones en emulsión pueden considerarse intrínsecamente inestables. Esto se argumenta a partir de la consideración de la estabilidad de una fase oleosa pura con agua pura. Al agitarlo se formará una emulsión, aunque será inestable y se separará rápidamente. La introducción de un tensioactivo cambia la estabilidad termodinámica, porque el tensioactivo reducirá la energía superficial de la interfaz y proporcionará una capa límite estable que se opone a la fuerza de separación de una mezcla.

Relación teórica

La presión de las gotas de emulsión viene dada por la ley de Laplace

donde el subíndice d se refiere a la gota de emulsión.

La tasa de variación de rd con APd viene dado por el diferencial dPd/dr = -Y/rd2

En un ejemplo de un sistema de emulsificación, como se ilustra en la Figura 20, el impulsor giratorio imparte energía cinética al sistema, en relación con la velocidad angular. La velocidad angular máxima en la punta del impulsor es2TTiorp= 14 v2

donde w es la frecuencia de revolución.

Presión dinámica = Energía cinética / volumen unitario Pdyn = p.v2 donde p es la densidad de fase dispersa.

El esfuerzo cortante puede estar relacionado con el gradiente de presión dinámica 8Pd/8r

Como aproximación, dPdyn/dr = p.(2n.w.rp)2/ro donde re es la zona de corte radial (radio del cilindro mezclador - radio del impulsor). El esfuerzo cortante determina el límite del tamaño de las gotas de emulsión. Por tanto, una relación teórica entre la velocidad angular del impulsor, el esfuerzo cortante rotacional y el tamaño de la gota se puede relacionar con el tamaño de la gota:

p .(2n.cjo.rp)2/rc=-Y/rd2

Y _________

rd2 =-vrc/p .(2n.ü).rp)2así querd = —

yjI

P \2ny

.ürc

>.rv)2

Un modelo modificado considera el flujo de rebote desde la pared del vaso. El rebote tiene dos efectos: aumentar el término de velocidad efectiva y disminuir el espacio para el gradiente de corte, aumentando así la velocidad de corte. Para rebote elástico, vp= -vr entonces la velocidad entre el flujo propulsado y el de rebote es el doble (v = 2vp) y la velocidad de corte se duplica debido al rebote (es decir, 5Pd/5r = p.v2 / % rC).

Por tanto, el gradiente de presión dinámica se convierte en:

<d P d y n / d r>= 2p .(4TT.(jo.rp)2/rc.

Método

Medición de la tensión interfacial

La tensión superficial (<y>) del tampón de fase acuosa, MES 0.025 M en NaCl 0.15 M, pH 7.4, aceite mineral de calidad farmacéutica, con 1%volumen a volumen de mezcla Span 20 Tween 20 HLB 12.5, se midió mediante un proceso de caída dinámica. La densidad del aceite mineral es 855 kg/m3 y la viscosidad es 14.2-17 cP.

Las emulsiones se prepararon mezclando la mezcla anterior en una proporción de 30:70 de fase acuosa a fase oleosa, en una cámara de mezcla cilindrica con un impulsor giratorio impulsado por un mezclador de velocidad variable (Ceframo), como se describe en el párrafo [00110].

La estabilidad de las gotitas durante 24 h se confirmó por la falla de una emulsión de gotitas de aceite teñidas de aceite de color rojo petróleo enriquecidas con la posterior formación de la emulsión no teñida, para fusionarse o intercambiarse con gotitas no teñidas.

El tamaño de las gotas producidas en cada velocidad de mezcla se registró dentro de los 5 minutos posteriores a la mezcla, mediante microscopía óptica. El diámetro de las gotas de emulsión se obtuvo mediante medición directa utilizando la Imagen J a partir de imágenes de micrografía óptica (datos de la figura 8).

Resultados

La relación entre las rpm del impulsor y el tamaño de la gota obtenida experimentalmente y mediante cálculos teóricos se muestra en la Figura 21 y la siguiente tabla. D(exp) es el diámetro de la gota experimental, D*(t0) y D*(teq) son los diámetros teóricos basados en los valores iniciales y de equilibrio de y, y D#(teq) es la curva para duplicar la velocidad de corte debido a rebote. Los cálculos utilizaron valores de y obtenidos inicialmente, en la formación de gotas y después del equilibrio durante 30 minutos. Los valores representados para los datos experimentales son valores medios de experimentos repetidos. Las curvas del modelo para el gradiente de presión dinámica rotacional basadas en geometría simple son D*(t0) y D*(teq). La curva R#(teq) resulta de considerar el rebote del flujo.

Valores experimentales y teóricos del diámetro de las gotas de emulsión y número de Reynolds calculado para cada condición.

Conclusiones

Los resultados obtenidos ilustran el control del diámetro de las gotas obtenido mediante una concentración de mezcla de tensioactivos que sigue un modelo geométrico para la velocidad de cizallamiento dentro del rango práctico útil. Los resultados demuestran que existe una relación entre la velocidad del impulsor (rpm) y el tamaño de la gota. La relación experimental obtenida sigue una tendencia similar a la relación teórica entre corte y tensión interfacial. Sin embargo, los resultados experimentales muestran un tamaño de gota más pequeño para un esfuerzo cortante dado, basándose en la conversión de la velocidad angular a lineal y del impulsor al espacio de la pared. Esto sugiere que el flujo turbulento en este sistema da como resultado un corte real mayor que el calculado por la geometría general del sistema. Los valores del número de Reynolds (Re) de la fase dispersa en el sistema están en el rango 60-170 y, por tanto, por debajo del valor esperado de alrededor de 2000 para flujo turbulento. Sin embargo, la consideración del flujo de rebote puede explicar en gran medida los resultados observados. Aquí, si la velocidad de rebote es elástica, vp=-vr entonces la velocidad entre el flujo propulsado y el de rebote es el doble (v = 2vp) y el gradiente de presión se duplica debido al rebote (es decir, 8Pd/8r = p.v2/ A r.c. Por tanto, el gradiente de presión dinámica se convierte en:

dPdyn/dr = 2p .(4n.u>.rp)2/rc.

Esto se muestra por el R#(teq) curva en la Fig. 20.

El modelo también ilustra el efecto de la variación en la tensión interfacial en el sistema. Aunque los valores ilustrados son para el efecto de los valores iniciales versus los valores de equilibrio de y a la misma concentración aparente de tensioactivo, se obtendrían efectos claramente similares variando la concentración aparente de tensioactivo. Tales efectos permitirían tener en cuenta el comportamiento experimental obtenido para la variación en la concentración de tensioactivo y la velocidad de cizallamiento.

Ejemplo 5: cocultivo de estructuras proteicas porosas

Materiales y métodos

Materiales

El colágeno se obtuvo de FirstLink (Wolverhampton, Reino Unido). La fibrina y la trombina bovinas se obtuvieron de Sigma. Amenos que se indique lo contrario, todos los reactivos se compraron a Sigma. Los queratinocitos epidérmicos humanos neonatales (HEK), los medios Epilife y el suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS) se adquirieron de ThermoFisher. Los fibroblastos dérmicos humanos neonatales (HDF), el medio modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa y el suero bovino fetal (FBS) se obtuvieron de ThermoFisher. hTERT: las células endoteliales dérmicas microvasculares humanas (HDE), el medio basal de células vasculares y el kit de crecimiento de células endoteliales microvasculares (VEGF) se adquirieron de ATCC. Las células madre mesenquimales (MSC) de médula ósea inmortalizadas transfectadas con GFP se recibieron como regalo de colaboradores de la Universidad de Hong Kong y el medio modificado de Dulbecco con bajo contenido de glucosa se obtuvo de Sigma.

Preparación del andamio

(A) Preparación de andamios de colágeno con plantilla de emulsión (“EmDerm-C”)

Se transfirieron 10 ml de la emulsión HLB 13 (preparada como se describe anteriormente) y 10 ml de solución de colágeno neutralizado a una jeringa de 50 ml con un extremo abierto y se mezclaron a 1000 rpm. Luego se vertieron 4 ml de la mezcla en cinco bandejas de moldeo cuadradas y se dejaron gelificar a 37 °C durante 30 minutos. Luego, los andamios de emulsión-hidrogel se reticularon usando EDC: NHS (relación molar 5:2) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reticulación, cada andamio se lavó con agua desionizada dos veces para eliminar el exceso de reticulado.

Luego se lavó cada andamio con isopropanol al 80 % durante 15 minutos en un agitador para eluir las gotitas de aceite atrapadas dentro del gel de colágeno. Después de eso, cada andamio se lavó con agua desionizada tres veces para eliminar el exceso de disolvente y aceite. Se añadió 5 % de P68 a los andamios y se dejó incubar durante 10 minutos. Finalmente, los andamios se enjuagaron rápidamente con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de solución de excipiente antes de liofilizar a -30 °C.

(B) Preparación de andamios de fibrina con plantilla de emulsión (“EmDerm-F”)

Se transfirieron 10 ml de la emulsión HLB 13, 8 ml de solución de fibrinógeno al 2 % y 2 ml de trombina (10 unidades/ml) a una jeringa de 50 ml con un extremo abierto y se mezclaron a 1000 rpm. Luego se vertieron 4 ml de la mezcla en bandejas de moldeo cuadradas y se dejaron gelificar a 37 °C durante 30 minutos. Luego, los andamios de emulsiónhidrogel se reticularon usando EDC: NHS (relación molar 5:2) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reticulación, cada andamio se lavó con agua desionizada dos veces para eliminar el exceso de reticulado. Luego se lavó cada andamio con isopropanol al 80 % durante 15 minutos en un agitador para eluir las gotitas de aceite atrapadas dentro del gel de colágeno. Después de eso, cada andamio se lavó con agua desionizada tres veces para eliminar el exceso de disolvente y aceite. Se añadió 5 % de P68 a los andamios y se dejó incubar durante 10 minutos. Finalmente, los andamios se enjuagaron rápidamente con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de solución de excipiente antes de liofilizar a -30 °C.

(C) Preparación de andamios de colágeno-fibrina con plantilla de emulsión (“EmDerm-CF”)

También se desarrollaron andamios de colágeno-fibrina con plantilla de emulsión compuesta utilizando el sistema de emulsión de decano. Se añadieron 10 ml de la emulsión HLB 13 a 5 ml de solución de colágeno neutralizado y 5 ml de fibrinógeno-trombina al 2 % p/v en una relación de volumen 2:1:1 y se mezclaron a 1000 rpm. Luego se vertió cada andamio de emulsión-hidrogel en bandejas de fundición cuadradas y se dejó gelificar a 37 °C durante 30 minutos. Luego, los andamios de emulsión-hidrogel se reticularon usando EDC: NHS (relación molar 5:2) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la reticulación, cada andamio se lavó con agua desionizada dos veces para eliminar el exceso de reticulado. Luego se lavó cada andamio con una solución de isopropanol al 80 % durante 15 minutos en un agitador para eluir las gotitas de aceite atrapadas dentro de las andamios. Después de eso, cada andamio se lavó con agua desionizada tres veces para eliminar el exceso de disolvente y aceite. Se añadió 5 % de P68 a los andamios y se dejó incubar durante 10 minutos. Finalmente, los andamios se enjuagaron rápidamente con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de solución de excipiente antes de liofilizar a -30 °C.

Cada uno de los andamios EmDerm-C, EmDerm-CF y EmDerm-F se cortó en discos de 6 mm mediante biopsias por punción. Cada andamio se lavó en solución tamponada con fosfato (PBS) tres veces y se irradió con luz ultravioleta durante 15 minutos. Cada andamio se incubó en los medios respectivos durante la noche durante 24 horas antes de usarlo para experimentos de siembra celular. El colágeno se obtuvo de FirstLink (Wolverhampton, Reino Unido). La fibrina y la trombina bovinas se obtuvieron de Sigma. A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos se compraron a Sigma. Queratinocitos epidérmicos humanos neonatales (h Ek ), medios Epilife y suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS).

Cultivo de células

Las células HEK se subcultivaron utilizando medio Epilife con HKGS añadido. En los experimentos sólo se utilizaron células entre los Pasajes 2 y 7. Las células HDF se subcultivaron utilizando DMEM con alto contenido de glucosa (4.5 g/l) con 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina. En los experimentos sólo se utilizaron células entre los Pasajes 2 y 9. Se subcultivaron células HDE inmortalizadas usando medio basal de células vasculares con kit de crecimiento de células endoteliales-VEGF que contenía los siguientes suplementos: rh VEGF (5 ng/ml), rh EGF (5 ng/ml), rh FGF básico (5 ng/ml), rh IGF-1 (15 ng/ml), L-glutamina (10 mm), Sulfato de heparina (0.75 Unidades/ml), Hidrocortisona (1 pg/ml), Ácido ascórbico (50 pg/ml), Suero fetal bovino (2 %). Las células MSC se subcultivaron utilizando DMEM bajo en glucosa (1 g/l) con 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina. Todas las células se pasaron a aproximadamente un 80 % de confluencia utilizando tripsina-EDTA estándar.

Cocultivo de andamios

Cada tipo de célula se pasó utilizando 1xtripsina-EDTAy se suspendió en su medio respectivo. Se añadieron 10 ul de la suspensión celular a 10 ul de azul tripfano y se contaron usando el Countess Cell Counter. Luego, las suspensiones celulares se diluyeron en serie para lograr una concentración de 5 x 104 células/ml. Luego se agregaron gota a gota 200 ul de cada mezcla de suspensión celular (HEK/HDF, HDF/HDE, MSC/HDE) en cada andamio respectivo (EmDerm-C, EmDerm-CF, EmDerm-F) para lograr un andamio sembrado uniformemente y Se dejó incubar a 37 °C con 5 % de CO2 durante 4 horas en una placa de 96 pocillos. Las células se alimentaron cada 2-3 días durante un máximo de 14 días. Se realizaron dos conjuntos de experimentos de cocultivo: uno para lisis celular y otro para fijación e imágenes.

Ensayo de proliferación celular

Los días 3, 7 y 14, se realizó un ensayo de proliferación celular utilizando CCK-8 (Sigma, Reino Unido) para determinar el crecimiento celular en cada andamio.<c>CK-8 es un ensayo colorimétrico de recuento de células altamente sensible basado en una sal de tetrazolio altamente soluble en agua (WST-8), que se reduce mediante la deshidrogenasa en las células para dar un tinte de formazán de color amarillo. La cantidad de colorante formazán generado por el metabolismo celular es directamente proporcional al número de células vivas. Se pipetearon 10 pl de solución de CCK-8 (pura) en cada pocillo de 100 pl de medio celular. Cada placa se incubó durante 4 horas en la incubadora a 37 °C y 5 % de CO<2>. Posteriormente, se pipetearon 50 pl del contenido de cada pocillo en una placa nueva y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando el lector de placas multimodo Spectramax i3 (Molecular Devices, CA, EE. UU.). También se añadieron 10 pl de CCK-8 a una serie de diluciones de concentraciones conocidas de células para obtener una curva de calibración en una placa de 96 pocillos. Se utilizaron medios libres de células con solución CCK-8 como controles negativos. Se probaron tres réplicas para cada muestra. Por último, los andamios se fijaron en formalina tamponada neutra (NBF) el día 14 para obtener más imágenes.

Cocultivo de interfaz aire-líquido (ALI) de queratinocitos humanos y fibroblastos dérmicos

Se sembraron 5000 células/pocillo de HDF en cada andamio (EmDerm-C, EmDerm-CF, EmDerm-F, Matriderm e Integra) y se cultivaron durante una semana en DMEM (4.5 g/l de glucosa), 10 % de FBS 1 % de penicilina/estreptomicina. Después de una semana, se sembraron 5000 células/pocillo de HEK en el otro lado de cada andamio y se cultivaron durante una semana en una placa Transwell, completamente sumergida en medio. Los medios utilizados fueron Epilife HKGS y DMEM (4.5 g/l de glucosa) 10 % de FBS 1 % de penicilina/estreptomicina (en una proporción de volumen de 2:1). Después de 7 días, los andamios se elevaron a la interfaz aire-líquido para permitir la diferenciación y estratificación de los queratinocitos. Los medios se cambiaron cada dos días. El día 21 de cultivo, los soportes se fijaron en formalina tamponada neutra para obtener imágenes mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y evaluación histológica.

Tinción de inmunofluorescencia de andamios cocultivados.

Cada andamio sembrado se fijó en formalina tamponada neutra durante al menos 24 horas. Los andamios se lavaron 3 veces con PBS. Luego, los andamios celularizados fijados se permeabilizaron usando Triton X-100 al 0.1 % en PBS durante 30 minutos y se lavaron 3 veces con PBS. Luego, los andamios se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 1 % en PBSt (PBS 0.1 % Tween 20) durante una hora y se lavaron. Luego se agregaron los anticuerpos primarios y se dejaron durante la noche en un agitador orbital. Al día siguiente, se aspiró la solución de anticuerpo primario y los soportes se lavaron con PBS 3 veces. Luego se agregaron anticuerpos secundarios y se dejaron durante la noche en un agitador orbital. Luego, las células se tiñeron con 0.1 ug/ml de Hoescht durante 5 minutos y luego se enjuagaron con PBS tres veces.

Para los soportes cocultivados con HEK/HDF, se utilizaron pancitoqueratina antihumana de ratón (Abcam) 1:100 y faloidina 4881x (ThermoFisher) para teñir HEKy HDF respectivamente. Se utilizó anticuerpo anti-ratón de cabra 1:500 (AlexaFluor 568, ThermoFisher) como anticuerpo secundario. Para los andamios cocultivados con HDF/HDE, se utilizaron CD31 antihumano de ratón 1:4 (Dako) y vWF antihumano de conejo 1:1000 (Dako) como anticuerpos primarios. Como anticuerpos secundarios se utilizaron anti-ratón de cabra (AlexaFluor 488, ThermoFisher) y anti conejo de cabra (AlexaFluor 568, ThermoFisher). Phalloidin 647 también se utilizó para teñir los filamentos de actina. Para los andamios cocultivos de MSC/HDE, se utilizaron CD31 antihumano de ratón 1:4 (Dako) y vWF antihumano de conejo 1:1000 (Dako) como anticuerpos primarios. Como anticuerpos secundarios se utilizaron anti-ratón de cabra (AlexaFluor 647, ThermoFisher) y anti-conejo de cabra (AlexaFluor 568, ThermoFisher).

Preparación del andamio de imágenes SEM

Se tomaron imágenes de los andamios HEK/HDF que se cultivaron en la interfaz aire-líquido bajo microscopía electrónica de barrido para observar la estratificación de los queratinocitos cuando se elevaron a la interfaz aire-líquido. Los andamios fijos se deshidrataron en un gradiente de etanol de la siguiente manera: 25 % etanol, 50 % etanol, 75 % etanol, 80 % etanol, 90 % etanol y 100 % etanol. Finalmente, los andamios se transfirieron a pocillos que contenían hexametildisilazano (HMDS) y se dejaron secar en la campana extractora durante la noche. Esto es para garantizar que las muestras estén completamente secas antes de tomar las imágenes. Luego, cada andamio se cubrió con oro durante 120 segundos y se tomaron imágenes utilizando el microscopio electrónico de barrido Zeiss.

Resultados y discusión

Ensayo de proliferación celular

La proliferación celular de cocultivos (HEK/HDF, HDF/HDE y MSC/HDE) se midió utilizando el ensayo CCK-8. Los resultados se muestran en la Figura 22. En el cocultivo<h>E<k>/HDF, EmDerm-C tuvo tasas de proliferación celular similares a las de los andamios Integra y Matriderm disponibles comercialmente (no de acuerdo con la invención). Esto no es sorprendente ya que los tres están formados por estructuras de colágeno. HEK/HDF en EmDerm-CF y EmDerm-F tuvieron una tasa de proliferación celular más baja en comparación con otros andamios. EmDerm-F se degradó parcialmente el día 3 y se degradó completamente el día 7. EmDerm-CF tuvo una menor proliferación celular en comparación con los controles: Matriderm e Integra el día 3. En el cocultivo HDF/HDE y MSC/HDE, todos los andamios EmDerm tuvieron tasas comparables de proliferación celular en comparación con los controles Integra y Matriderm. Esto fue constante desde el día 3 al día 14 del experimento de cocultivo.

Imágenes de fluorescencia

(1) EmDerm-C

En el cocultivo de HDF y HDE se produjo un buen crecimiento celular de ambos tipos de células. Había más fibroblastos presentes en comparación con células endoteliales debido a la mayor tasa de crecimiento de los fibroblastos. Los fibroblastos y las células endoteliales también parecen crecer en grupos, formando las células endoteliales estructuras pseudotubulares y redes vasculares nacientes, mientras que los fibroblastos parecen crecer alrededor de las células endoteliales. Vea las imágenes que se muestran en (A) de la Figura 23, que muestran que los HDE parecen formar redes vasculares con HDF creciendo alrededor de estas estructuras similares a vasos.

Para el cocultivo de MSC y HDE, ambos tipos de células proliferaron bien en los andamios. Sin embargo, había más MSC en comparación con las células endoteliales, ya que tienden a crecer más rápido y son menos exigentes. Las células endoteliales no parecían expresar ni secretar vWF de manera significativa y proliferaban de manera desorganizada. No se observó una formación clara de estructuras vasculares tempranas, como se observa en el cocultivo HDF/HDE. Vea las imágenes que se muestran en (B) de la Figura 23, que muestran que las MSC conservaron su morfología alargada mientras que las HDE se intercalan entre las MSC.

Para el cocultivo de HEK y HDF, hubo una buena proliferación de HDF y HEK. Las células HEK tenían una morfología aplanada y estirada y crecían principalmente en la superficie del andamio, mientras que las células HDF migraban al andamio y tenían una morfología más alargada. Vea las imágenes en (C) de la Figura 24, que muestran que HEK creció en forma de hoja con HDF esparcidos en el medio.

(2) EmDerm-CF

Para el cocultivo de HDF y HDE, los fibroblastos y las células endoteliales crecieron en grupos y ambos fibroblastos crecieron alrededor de las redes formadas por las células endoteliales. También parecían crecer alrededor de las estructuras porosas del andamio. Vea las imágenes en (A) de la Figura 24, que muestran que los HDE y HDF parecían crecer de manera interdispersa uno alrededor del otro.

Para el cocultivo de MSC y HDS, las MSC y las células endoteliales crecieron unas alrededor de otras y se adhirieron a las paredes de los poros de los andamios. Las MSC conservaron su morfología de huso. Hubo una producción mínima de vWF intra y extracelularmente. Vea las imágenes que se muestran en (B) de la Figura 25, que muestran que las MSC conservan su morfología alargada y las HDE estaban esparcidas por el andamio.

Para el cocultivo de HEK y HDF, hubo una buena proliferación de ambos tipos de células. Las células HEK crecieron en capas en forma de lámina, mientras que las células HDF crecieron en grupos. Vea las imágenes que se muestran en (C) de la Figura 25, que muestran que las HEK crecieron en hojas mientras que las HDF crecieron en grupos. (3) EmDerm-F

Para el cocultivo de HDF y HDE, se formaron redes vasculares de células endoteliales con fibroblastos agrupados alrededor de las células endoteliales. Las células también parecieron crecer alrededor de los poros del andamio. Hubo una expresión mínima de vWF. Vea las imágenes en (A) de la Figura 26, que muestran que los HDE crecieron en forma de red con los HDF creciendo en el medio.

Para el cocultivo de MSC y HDE, hubo un buen crecimiento celular de ambas células. Sin embargo, las MSC eran mucho más abundantes y crecían alrededor de las superficies de los andamios, mientras que las endoteliales estaban interdispersadas entre las MSC. Hubo una expresión mínima de vWF. Vea las imágenes en (B) de la Figura 26, que muestran que las MSC conservaron su morfología alargada con HDE dispersas entre las MSC.

Para el cocultivo de HEK y HDF, los andamios EmDerm-F sembrados con HEK y HDF se degradaron completamente después del día 3. Por lo tanto, no se obtuvieron imágenes.

(4) Integra

Para el cocultivo de HDF y HDE, los fibroblastos crecieron en láminas y las células endoteliales formaron estructuras en forma de red en el medio. Hubo una proliferación celular mucho mayor de fiboblastos en comparación con las células endoteliales. También hubo una producción significativa de vWF intracelular como se observa en el canal rojo dentro de las células endoteliales. Vea las imágenes en (A) de la Figura 27, que muestra que los HDF crecieron en láminas con los HDE formando estructuras similares a redes.

Para la cocultura de MSC y HDE, hubo una proliferación muy alta de MSC con una organización mínima. Las MSC parecían crecer en grupos, con pérdida de su morfología fusiforme. Las células endoteliales también parecieron crecer intercaladas entre las MSC sin formación de redes vasculares. Hubo una expresión mínima de vWF intracelular o extracelular. Vea las imágenes en (B) de la Figura 27, que muestran que las MSC crecieron en grupos con HDE intercaladas en el medio.

Para el cocultivo de HEK y HDF, hubo un crecimiento extenso tanto de HEK como de HDF en forma de lámina. Debido a la alta tasa de proliferación de células, hubo hacinamiento de células y es difícil distinguir HEK de HDF ya que las células HEK no adoptan la morfología poligonal extendida como en los andamios EmDerm-C y EmDerm-CF. Vea las imágenes en (C) de la Figura 28, que muestran que HEK y HDF crecieron en forma de hoja.

(5) Matriderm

Para el cocultivo de HDF y HDE, hubo un crecimiento significativo de fibroblastos en todo el andamio, con células endoteliales formando estructuras en forma de red dentro del propio andamio. También hubo una expresión mínima de vWF, intra y extracelularmente. Vea las imágenes en (A) de la Figura 28, que muestran que los<h>D<f>crecieron en forma de lámina mientras que los HDE formaron estructuras en forma de vasos.

Para el cocultivo de MSC y HDE, hubo un buen crecimiento celular tanto de MSC como de células endoteliales. Sin embargo, tienden a crecer en grupos uno alrededor del otro. También hubo una producción mínima de vWF No hubo un patrón claro de red vascular de crecimiento de células endoteliales. Vea las imágenes en (B) de la Figura 29, que muestran que las MSC crecieron de manera desordenada con HDE dispersas en el medio.

Para el cocultivo de HEK y HDF, hubo un crecimiento extenso tanto de HEK como de HDF en forma de lámina. Sin embargo, fue difícil distinguir las HEK de las HDF ya que las células HEK no adoptan la morfología aplanada característica típica de los queratinocitos diferenciados. Vea las imágenes en (C) de la Figura 29, que muestran que los HEK y HDF crecieron en forma de hoja.

Imágenes de microscopía electrónica de barrido

Las células HEK adoptaron una morfología muy aplanada y extendida cuando se sembraron en estructuras, lo cual es una característica clave de los queratinocitos, lo que indica una buena unión celular. También se encontró que las células crecían unas sobre otras de manera estratificada. Vea las imágenes en la Figura 30 de EmDerm-C (A), EmDerm-CF (B), Integra (C) y Matriderm (D), que muestran una morfología aplanada, estirada y una estratificación parcial. Para el andamio EmDerm-F, los queratinocitos parecieron degradarse en el día 7, lo que sugiere que los andamios EmDerm a base de fibrina eran menos adecuados para crear una construcción de piel bicapa en comparación con los andamios a base de colágeno.

Los resultados muestran que la proliferación celular de HEK y HDF cocultivados en EmDerm-C es comparable a los andamios Integra y Matriderm disponibles comercialmente. Esto puede deberse a que todos estos andamios están formados por material de colágeno, que favorece el crecimiento de queratinocitos y fibroblastos. El crecimiento de HEK/HDF fue más lento en las estructuras EmDerm-CF en comparación con Integra y Matriderm el día 3, pero mejoró entre el día 7 y el día 14. Se observó que los andamios EmDerm-F estaban parcialmente degradados en el día 3 del cocultivo HEK/HDF Es probable que esto se deba a la liberación de enzimas degradativas fibrinolíticas por parte de los queratinocitos.

Los andamios EmDerm-C sembrados con HDE y HDF parecieron formar redes nacientes de estructuras vasculares con HDF creciendo alrededor de estas redes tubulares. Esto también se observó en EmDerm-CF y EmDerm-F, pero de forma menos organizada.

La penetración de las células pareció ser mejor en los andamios EmDerm en comparación con Integra y Matriderm. Tanto en Integra como en Matriderm, las células sembradas parecieron proliferary extenderse sobre la superficie de los andamios. Por el contrario, las células de los andamios de EmDerm parecieron migrar mejor hacia los andamios, en lugar de crecer a lo largo de la superficie del andamio. La mejora en la profundidad de la penetración celular puede deberse a la micro y nanoestructura de los andamios EmDerm, que permiten una mejor difusión de oxígeno y nutrientes en el andamio.

También se observó la estratificación de los queratinocitos cuando se cultivaron en la interfaz aire-líquido en los andamios EmDerm-C y EmDerm-CF. Hubo buena unión celular y proliferación de queratinocitos.

En resumen, se ha demostrado que los andamios EmDerm son sustitutos dérmicos eficaces de la piel, ya que favorecen el crecimiento de fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales. También promovieron el proceso de vascularización estimulando la organización de las células endoteliales en redes vasculares nacientes. Los andamios también se pueden utilizar como sustituto de la piel con bicapa epidérmica y dérmica, ya que favorecen el crecimiento de queratinocitos y fibroblastos, así como la estratificación de los queratinocitos cuando se cultivan en la interfaz airelíquido. Esto puede ser útil para la reconstrucción en una sola etapa de quemaduras y heridas crónicas, ya que las capas dérmica y epidérmica se pueden aplicar simultáneamente.

Ejemplo 6: cocultivo de estructuras proteicas porosas

Materiales y métodos

Materiales

El colágeno tipo I de cola de rata se obtuvo comercialmente de FirstLink (Wolverhampton, Reino Unido). La fibrina y la trombina bovinas se obtuvieron de Sigma UK. Amenos que se indique lo contrario, todos los reactivos se obtuvieron de Sigma UK. Para medir la cantidad de endotoxina lipopolisacárido, se utilizó el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (Hycult Biotech, PA, EE. UU.). Las ratas se obtuvieron de un proveedor de animales autorizado en el Reino Unido.

Preparación del andamio

Se fabricaron andamios EmDerm-C, EmDerm-CF y EmDerm-F como se describe en el Ejemplo 5. Todos los andamios se fabricaron utilizando una mezcla de tensioactivos al 0.1 % y se reticularon durante una hora utilizando EDC-NHS con P68 al 5%como excipiente antes de la liofilización. Los andamios se cortaron en discos de 8 mm mediante biopsias por punción. Cada andamio se lavó en solución tamponada con fosfato (PBS) tres veces y se irradió con luz UV durante 15 minutos. Luego, los andamios se dejaron durante la noche en una solución de penicilina/estreptomicina al 5 %. Luego se dio a los andamios un enjuague final con solución salina normal antes de usarlos para la implantación.

Endotoxina ensayo

Los reactivos se llevaron a temperatura ambiente y se prepararon según el protocolo del fabricante. Cada andamio se pesó y se cortó en porciones de 1 g y se incubó en 200 pl de agua libre de endotoxinas para disolver cualquier endotoxina presente en el andamio (solución de muestra pura). Los estándares se prepararon según las instrucciones del fabricante. Se prepararon diluciones en serie de cada solución de muestra por duplicado. Se añadieron 50 pl de cada solución de muestra a la placa de 96 pocillos libre de endotoxinas. Se utilizó agua libre de endotoxinas como control negativo. Luego se añadieron 50 pl de reactivo LAL a cada solución de muestra. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Los valores de absorbancia se determinaron utilizando un lector de placas UV-Vis (Spectramax i300, Molecular Devices, CA, EE. UU.) a 405 nm.

Animales

Se alojaron individualmente tres ratas Sprague-Dawley sanas (machos de 2 meses de edad, peso corporal entre 500 y 600 gramos). Todos los animales tuvieron libre acceso a alimentos nutricionalmente equilibrados y agua potable y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Se proporcionó enriquecimiento ambiental para mantener a las ratas activas y saludables. El estudio se llevó a cabo en el Instituto de Investigación Médica de Northwick Park (NPIMR). Este estudio se realizó con la aprobación ética de los Organismos de Revisión Ética y Bienestar Animal (AWERB) en NPIMR bajo una licencia de proyecto otorgada por el Ministerio del Interior. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron bajo anestesia inhalatoria de isofluorano y se proporcionó analgesia antes y después del procedimiento para minimizar el sufrimiento de los animales. Todos los animales fueron aclimatados durante dos semanas antes del estudio y monitoreados de cerca para detectar signos de complicaciones posoperatorias.

Implantación de andamios

Se implantaron cuatro andamios en el dorso de cada rata. Los andamios probados fueron EmDerm-C, EmDerm-CF y EmDerm-F. En este estudio se utilizó un total de tres ratas (un andamio por rata). En la Figura 31 se muestra una representación esquemática de la implantación del andamio en cada rata. A cada rata se le implantaron 4 discos de andamio. En un lado, dos heridas eran bolsas subcutáneas con un andamio implantado subdérmicamente, mientras que en el otro lado dos heridas fueron raspadas para eliminar parte de la dermis y paniculli carnosus, dejando solo la epidermis y parte de la dermis superpuestas al andamio para simular una división. Modelo de herida de injerto de piel de espesor. Las biopsias se tomaron los días 7 y 14. La muestra de sangre se realizó el día 0, el día 7 y el día 14.

Procedimiento quirúrgico

Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron asépticamente utilizando equipo estéril en los quirófanos del animalario. El dorso de cada animal se afeitó y limpió con clorhexidina. Se realizaron dos incisiones verticales de 15 mm y se realizó una disección roma para crear bolsas subcutáneas a cada lado de la incisión. Para las heridas abrasivas se utilizó un bisturí para retirar parte de la dermis y panículos del borde de la incisión (aproximadamente 225 mm2). Se insertaron cuidadosamente andamios en cada bolsillo subcutáneo. Se utilizó una puntada de túnel para cerrar las bolsas subcutáneas y evitar la migración del andamio. Las heridas se cerraron con suturas de Vicryl y se aplicaron clips para proteger la herida y evitar que los animales mordieran los extremos de la sutura.

Biopsias de heridas

El día 7, se realizaron dos biopsias de herida por rata: una para la herida no erosionada y otra para la herida erosionada. Se utilizaron biopsias por sacabocados de 5 mm. En la medida de lo posible, las biopsias se realizaron de manera que incluyeran la parte del andamio y parte de los tejidos circundantes alrededor del andamio para determinar si había alguna reacción inflamatoria dentro del andamio y en el tejido alrededor del andamio. Las muestras de biopsia se fijaron inmediatamente en formalina tamponada neutra durante 24 horas antes de incluirlas en bloques de parafina. También se tomaron fotografías de las biopsias y de las heridas de las biopsias. Luego se suturaron las heridas con Vicryl y se aplicaron clips. El día 14, se sacrificó a todos los animales y se biopsiaron/extirparon las cuatro heridas.

Muestra de sangre

En el día -7 (valor inicial), el día 7 y el día 14, se tomó una muestra de sangre de la vena de la cola para evaluar si había alguna respuesta inflamatoria sistémica. Brevemente, cada rata se inmovilizó mediante un túnel y se utilizó una aguja de 24 g para aspirar 1.5 ml de volumen de sangre de la vena caudal superficial en cada momento para una evaluación hematológica y bioquímica posterior. Se recogieron 500 pl de sangre en un tubo con EDTA y la sangre restante se mantuvo en un tubo heparinizado para el análisis ELISA de proteína C reactiva (PCR).

Evaluación hematológica y bioquímica.

Para la evaluación hematológica, las muestras de sangre se transfirieron de los tubos de EDTA a un analizador de hematología veterinario automatizado (Procyte Dx Analyser) que dio las siguientes lecturas: recuento de eritrocitos (RBC), recuento total de leucocitos (WBC), recuento diferencial de glóbulos blancos (Diff), hemoglobina (Hb), hematocrito (Hct), volumen celular medio (MCV), hemoglobina celular media (MCH), concentración media de hemoglobina celular (MCHC), plaquetas (PLT), volumen plaquetario medio (MPV). En particular, se compararon los valores de WBC y PLT en cada momento para determinar si hubo algún cambio en estos marcadores inflamatorios en cada rata.

El análisis de PCR ELISA se realizó utilizando el kitAbcam Rat CRP ELISA, según el protocolo del fabricante. Las muestras de suero se centrifugaron a 3.000 g durante 10 minutos y luego se diluyeron a 1:60.000. Brevemente, los reactivos se llevaron a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones en serie de estándares y muestras por duplicado. Se añadieron 50 pl de cada estándar/muestra a la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 2 horas. Luego se aspiró el contenido de cada pocillo y se lavó cinco veces con el tampón de lavado 1x. Posteriormente, se añadieron 50 pl de anticuerpo CRP biotinilado y se incubaron durante una hora. Luego, los pocillos se lavaron nuevamente y se añadió 1x conjugado SP a cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos. Luego, los pocillos se lavaron nuevamente y se agregaron 50 pl de sustrato cromógeno a cada pocillo y se incubaron en la oscuridad durante 10 minutos. Finalmente, se añadieron 50 pl de solución de parada a cada pocillo y se leyó la absorbancia a 450 nm inmediatamente (la corrección de longitud de onda se realizó a 570 nm). Las lecturas de DO de cada muestra se compararon en diferentes momentos para determinar si hubo algún cambio en los niveles de PCR en cada rata.

Evaluación histológica de la respuesta inflamatoria

Cada muestra de tejido se fijó durante 24 horas en formalina tamponada neutra (NBF), se procesó y se embebió en bloques de parafina. Se utilizó un micrótomo para seccionar las muestras en 10 pm de espesor, se montaron en portaobjetos de vidrio, se desparafinaron y luego se tiñeron utilizando el protocolo convencional de hematoxilina-eosina (H&E). Brevemente, cada portaobjetos se desparafinizó en Citroclear durante 3 minutos (x2), luego se transfirió a etanol al 100 % durante 3 minutos (x2), etanol al 70 % durante 3 minutos, etanol al 50 % durante 3 minutos y agua del grifo durante 3 minutos. A continuación, los portaobjetos se transfirieron a hematoxilina de Harris filtrada durante 4 minutos y luego de nuevo al agua corriente durante 3 minutos. Luego, los portaobjetos se sumergieron diez veces en alcohol ácido al 1 %, agua del grifo de Scott y carbonato de litio al 0.5 % (con lavados con agua del grifo entre cada solución). Luego, los portaobjetos se sumergieron en etanol al 50 % y al 70 % diez veces antes de incubarlos en eosina Y durante 1 minuto. Luego, los portaobjetos se lavaron en etanol al 90 % durante 1 minuto (x4), etanol al 100 % durante 1 minuto (x2) y xileno durante 1 minuto (x2) antes de montarlos con un cubreobjetos. Se tomaron imágenes de cada portaobjetos utilizando un Leica Scanscope con un aumento de 40x para el análisis posterior.

Cuantificación de la vascularización del andamio

El grado de vascularización de cada andamio se cuantificó el día 14. Se tomaron diez fotogramas por portaobjetos para cada muestra de tejido con un aumento de 40x utilizando un microscopio óptico. Cada cuadro fue tomado al azar. El número de estructuras vasculares encontradas dentro de los andamios se contó manualmente para su cuantificación. Se calculó y analizó la media ± DE para cada andamio para determinar su significación estadística.

Cuantificación de la inflamación local

El grado de inflamación que rodea cada andamio se cuantificó el día 7. Se tomaron diez fotogramas por portaobjetos para cada muestra de tejido con un aumento de 40x utilizando un microscopio óptico. Cada cuadro fue tomado al azar. El grado de respuesta inflamatoria encontrado dentro de los andamios se clasificó manualmente como: 1 - mínimo, 2 - leve, 3 - moderado y 4 - grave. Esto se hizo utilizando marcos de referencia para la densidad de neutrófilos. Se calculó y analizó la media ± DE del grado inflamatorio total para cada andamio para determinar su significación estadística.

Análisis estadístico

Todos los valores se expresan como media ± DE para cada experimento. Se utilizó ANOVA unidireccional para determinar la significancia con la prueba de Tukey post-hoc. Se utilizó ANOVA de medidas repetidas para los valores que se midieron repetidamente en diferentes momentos. Todo el análisis estadístico se realizó utilizando GrapPad Prism 4 (Graph Pad, La Jolla, CA) y un valor de p <0.05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados y discusión

Ensayo de endotoxina

El ensayo de endotoxinas (ensayo LAL) es uno de los ensayos reconocidos para cuantificar la cantidad de endotoxinas en materiales de acuerdo con las Regulaciones de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA). El límite de endotoxinas aceptado es 5 UE/kg. En todos los andamios probados, los niveles de endotoxinas estaban por debajo de este límite de detección. El nivel de endotoxinas para EmDerm-C fue de 0.08 UE/g, mientras que EmDerm-CF fue de 0.10 UE/g y EmDerm-F fue de 0.12 UE/g respectivamente.

Análisis hematológico de la respuesta inflamatoria sistémica.

No hubo cambios significativos en el recuento total de glóbulos blancos (WBC), el recuento de neutrófilos o el recuento de linfocitos en los tres animales durante todo el período del estudio (14 días). Tampoco hubo cambios significativos en el recuento de plaquetas, que es un marcador conocido de inflamación sistémica. Tampoco hubo evidencia evidente de inflamación localizada como eritema, hinchazón o aumento de calor en el área de implantación del andamio, lo cual es consistente con los resultados de sangre.

Análisis bioquímico del reactivo de fase aguda.

No hubo cambios significativos en la concentración de proteína C reactiva (PCR) medida mediante el ensayo ELISA. Esto es consistente con el análisis hematológico anterior, lo que indica que los andamios EmDerm no fueron proinflamatorios a nivel sistémico.

Evaluación histológica de la respuesta inflamatoria.

Semana 1

(1) EmDerm-C

No hubo evidencia de inflamación localizada significativa dentro y alrededor de la estructura de colágeno. Los andamios estaban parcialmente degradados y estaban ligeramente adheridos al tejido conectivo que rodeaba el andamio. No hubo evidencia de revascularización el día 7. Ver Figura 32. La imagen de la izquierda (desgastada) y la imagen de la derecha (no desgarrada) muestran cambios inflamatorios locales mínimos y estructuras parcialmente degradadas.

(2) EmDerm-CF

Había un grado moderado de inflamación dentro del andamio y alrededor de los andamios EmDerm-CF. Hubo un menor grado de degradación del andamio a pesar de la afluencia de linfocitos inflamatorios alrededor del andamio. Tampoco había estructuras vasculares nacientes presentes en esta etapa. Ver Figura 33. La herida raspada mostró una reacción inflamatoria mínima en comparación con la herida no raspada donde hay una reacción inflamatoria de leve a moderada alrededor del andamio. En ambos casos, los andamios estaban parcialmente degradados.

(3) EmDerm-F

Había un grado moderado de inflamación dentro o alrededor de los andamios EmDerm-F, que es similar a los andamios EmDerm-CF. Sin embargo, hubo una degradación mínima del andamio a pesar de la respuesta inflamatoria alrededor del andamio. Tampoco hubo vascularización del andamio presente en esta etapa. Ver Figura 34. En ambos andamios, hubo una reacción inflamatoria de leve a moderada dentro y alrededor de los andamios parcialmente degradados. Semana 2

Heridas abrasadas

(1) EmDerm-C

No hubo evidencia de inflamación dentro del andamio o alrededor del andamio. Había muchas estructuras vasculares presentes que contenían glóbulos rojos dentro de la luz, lo que sugiere un flujo sanguíneo activo dentro del andamio y la integración con el tejido circundante. También hubo una regeneración significativa de la capa dérmica con depósito de colágeno y regeneración parcial del paniculli carnosus. Ver Figura 35. Hubo una mayor vascularización del sitio de la herida, como lo muestran las flechas, y los andamios se remodelaron/integraron en las heridas.

(2) EmDerm-CF

Había evidencia de inflamación residual en el tejido alrededor del andamio. Hay evidencia de vascularización de la estructura, con cierto depósito y remodelación de matriz de colágeno. También hubo regeneración de la capa dérmica pero no hubo evidencia de regeneración de la capa del paniculli carnosus. Ver Figura 36. Hubo una mayor vascularización del sitio de la herida, como lo muestran las flechas, y los andamios se remodelaron/integraron en las heridas. Sin embargo, hubo cierta respuesta inflamatoria residual y un aumento de la deposición de ECM en la capa dérmica.

(3) EmDerm-F

Hubo una inflamación mínima en el tejido que rodeaba el andamio. Hubo evidencia de vascularización de la estructura con aumento de la deposición de matriz de colágeno y remodelación de la estructura. La capa dérmica ha sanado casi por completo, sin embargo no hubo regeneración del paniculli carnosus, que es similar al andamio EmDerm-CF. Ver Figura 37. Hubo una mayor vascularización de la herida (como lo muestran las flechas) y una deposición significativa de material de ECM dentro del sitio de la herida y la capa dérmica.

Heridas no abrasivas

(1) EmDerm-C

En la semana 2, las heridas no abrasivas con EmDerm-C implantado mostraron una respuesta inflamatoria mínima dentro y alrededor del andamio. También hubo una excelente vascularización del andamio y remodelación de la matriz. Ver Figura 38. Hubo una respuesta inflamatoria mínima y la mayor parte de la estructura se remodeló con crecimiento interno de la estructura vascular (ver flechas).

(2) EmDerm-CF

Los andamios de EmDerm-CF en las heridas no erosionadas también mostraron una respuesta inflamatoria mínima alrededor y dentro de los andamios. Se formó vasculatura dentro y alrededor de los andamios y gran parte del andamio original se había degradado y remodelado en tejido conectivo. Ver Figura 39. Hubo una respuesta inflamatoria mínima y la mayor parte del andamio había sido remodelado con crecimiento interno de la estructura vascular (ver flechas).

(3) EmDerm-F

Los andamios EmDerm-F demostraron el menor grado de vascularización y cierta respuesta inflamatoria residual. El andamio en sí estaba prácticamente degradado por completo. Sin embargo, también hubo una mayor deposición de matriz extracelular en comparación con los otros dos andamios, lo que indica cierto grado de fibrosis presente. La nueva matriz depositada parecía ser fibrillas desorganizadas sin forma o estructura obvia en su interior. Ver Figura 40. Hubo una respuesta inflamatoria mínima y la mayor parte de la estructura se remodeló con crecimiento interno de la estructura vascular (ver flechas). También hubo una importante deposición de ECM.

Cuantificación de la vascularización

El número medio de vasos en los andamios EmDerm-C (media 6.5 ± 2.3) fue significativamente mayor en comparación con los andamios EmDerm-F en el modelo de herida raspada y no raspada (media 3.7 ± 1.6 y 1.9 ± 1.6 respectivamente). Los andamios EmDerm-CF dieron como resultado un grado intermedio de vascularización en comparación con EmDerm-C y EmDerm-F tanto en las heridas raspadas como en las no raspadas (media 4.7 ± 2.0 y 3.2 ± 1.0 respectivamente). Sin embargo, este resultado no es estadísticamente significativo. Ver Figura 41. Tanto en las heridas raspadas como en las no raspadas, hubo un número medio mayor de estructuras vasculares en las heridas tratadas con EmDerm-C.

Cuantificación de la respuesta inflamatoria local

El grado de inflamación fue más bajo en los andamios EmDerm-C (media 1.5 ± 0.48) en comparación con los andamios EmDerm-CF (media 3.1 ± 0.81) y EmDerm-F (media 3.3 ± 0.67) en el modelo de herida erosionada. El grado inflamatorio medio también fue más bajo en EmDerm-C (media 1.5 ± 0.52) en comparación con EmDerm-CF (media 3.1 ± 0.74) y EmDerm-F (media 3.4 ± 0.7). No hubo diferencias significativas en la respuesta inflamatoria entre las estructuras EmDerm-CF y EmDerm-F. Ver Figura 42. Tanto en las heridas raspadas como en las no raspadas, hubo un mayor grado de inflamación en los andamios EmDerm-F, seguido de EmDerm-CF y luego EmDerm-C.

El modelo de herida no abrasiva se diseñó para probar la presencia de cualquier reacción localizada a la propia implantación del andamio. El modelo de herida erosionada simula un injerto de piel de espesor parcial donde se eliminó parte de la dermis inferior y se implantó el andamio para probar la cicatrización y la revascularización de la herida.

Se seleccionó un momento de dos semanas para examinar el efecto del andamio sobre la revascularización temprana. Esta duración de tiempo permitiría que la respuesta inflamatoria de la creación de la herida y la lesión inicial se calmara y se formara una neodermis. Idealmente, los lechos de las heridas deberían estar listos para el injerto epidérmico antes del día 14, lo cual fue otra razón para seleccionar este momento. El día 7, se observó que los tres soportes EmDerm tenían angiogénesis y vasculogénesis mínimas y respuestas inflamatorias variables. Por lo tanto, se necesitaba un período de tiempo más prolongado para evaluar el crecimiento vascular hacia el interior y la resolución de la inflamación.

También se observó un efecto diferencial en los tres soportes de EmDerm durante el período de dos semanas. Los andamios EmDerm-C tuvieron la mayor cantidad de estructuras vasculares el día 14 en comparación con otros andamios EmDerm. Esto es comparable a Integra.

En general, los andamios EmDerm-C parecen ser los más biocompatibles con la menor respuesta inflamatoria y la mayortasa de vascularización del andamio. Esto puede deberse al hecho de que el colágeno es una matriz extracelular abundante que permite una buena unión y migración celular. Esto también podría deberse a la superficie nanofibrilar agregada de los andamios EmDerm-C, lo que da como resultado una mayor superficie para la adhesión y proliferación celular.

Los andamios EmDerm-F parecen tener una menor biocompatibilidad, con la mayor respuesta inflamatoria dentro de los 7 días y la tasa más baja de vascularización a los 14 días.

Aunque no hubo una respuesta inflamatoria sistémica obvia en los animales a los andamios, hubo un efecto inflamatorio local notable en el día 7 después de la implantación tanto en los modelos de heridas raspadas como en las no raspadas. Esto no es sorprendente ya que la inflamación es parte de la respuesta de curación de la herida. Sin embargo, la respuesta inflamatoria parece resolverse el día 14. Esto contrasta con Matriderm e Integra, donde la respuesta inflamatoria persiste más allá del día 14 en un modelo de curación de heridas en ratas con defectos de espesor total. A la fase inflamatoria le sigue una vascularización y remodelación bastante rápida de la neodermis en el día 14. Además, la deposición de matriz extracelular fue más pronunciada en EmDerm-F en comparación con los otros dos andamios.

El grado de respuesta inflamatoria local y vascularización no se vio afectado significativamente por el tipo de herida (abrasión versus no abrasión), sino más bien por el tipo de material del que estaban hechos los andamios. La liberación de productos de degradación de fibrina en EmDerm-CF y EmDerm-F puede haber dado lugar a una mayor respuesta inflamatoria en comparación con las estructuras de EmDerm-C.

En general, el grado de inflamación observado en los andamios EmDerm fue mínimo y transitorio. La mayoría de las células inflamatorias (por ejemplo, células polimorfonucleares) se observaron en las biopsias del día 7, pero se resolvieron el día 14. El grado de respuesta inflamatoria se correlacionó en cierta medida con los niveles de endotoxinas y la estabilidad enzimática de los andamios de EmDerm, teniendo EmDerm-C los niveles de endotoxinas más bajos y la tasa de degradación más lenta, mientras que EmDerm-F tiene los niveles de endotoxinas más altos y la tasa de degradación más rápida.

Hubo diferencias notables en la remodelación de la matriz extracelular entre los distintos andamios de EmDerm cuando se implantaron en vivo, a pesar de utilizar los mismos métodos de fabricación de plantillas de emulsión. Esto sugiere que el tipo de material utilizado para crear los andamios influye en el comportamiento celular en el entorno de la herida aguda.

En conclusión, estos en vivo Los resultados indican que los andamios EmDerm son biocompatibles y promueven la cicatrización de heridas y la vascularización durante un período de dos semanas.

Se debe entender que los rasgos, números enteros, características, compuestos, restos químicos o grupos descritos junto con un aspecto, realización o ejemplo particular de la invención son aplicables a cualquier otro aspecto, realización o ejemplo descrito en el presente documento a menos que sea incompatible con el mismo. La invención no se limita a los detalles de ninguna de las realizaciones anteriores.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar un andamio proteico poroso para soportar el crecimiento de tejido biológico, dicho método comprende:

proporcionar una emulsión de aceite en agua que comprende gotitas de aceite dispersadas en una fase continua que comprende una solución proteica acuosa tamponada con pH, en el que la emulsión de aceite en agua comprende un tensioactivo no iónico o una mezcla de tensioactivos no iónicos, en el que el tensioactivo mo iónico está en una cantidad del 0.01 al 10 % en volumen del volumen total de la fase oleosa en la emulsión de aceite en agua, en la que un HLB del tensioactivo no iónico o de la mezcla de tensioactivos es de 10 a 16;

gelificar la proteína alrededor de las gotitas de aceite;

retirar las gotitas de aceite de la fase continua después de la formación de un andamio; e

incubar el andamio con una solución excipiente.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína es una proteína gelificable seleccionada de al menos uno de colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina y elastina.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la solución proteica acuosa comprende una proteína nativa.

4. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el tensioactivo no iónico o una mezcla de tensioactivos no iónicos tiene un HLB de entre 11 y 14.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el tensioactivo no iónico está presente en una cantidad de 0.05 a 1 % en volumen del volumen total de aceite en la emulsión de aceite en agua.

6. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la solución de excipiente comprende un excipiente hidrófilo orgánico soluble en agua, que es un poliol o un polímero seleccionado entre alcohol polivinílico (PVA), polietilenglicol (PEG), copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropilenglicol, polivinilpirrolidona (PVP) y copolímero de polietilenglicol-alcohol polivinílico.

7. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que el tensioactivo no iónico comprende un éster de un poliol.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la emulsión de aceite en agua comprende un aceite seleccionado entre un aceite mineral ligero, decano y un aceite de hidrocarburo de cadena corta que tiene una longitud de cadena de hidrocarburo en el intervalo de C8-C18.

9. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la emulsión comprende gotitas de aceite que tienen un diámetro en el intervalo de entre 10 y 500 micrómetros.

10. El método de cualquier reivindicación anterior, en el que la fase acuosa continua comprende adicionalmente un material biológico.

11. Un andamio proteico poroso obtenible mediante un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores usando una proteína gelificable seleccionada de al menos uno de colágeno, fibrinógeno, fibronectina, laminina y elastina, en el que el andamio proteico poroso comprende una estructura fibrosa interconectada de proteínas y tiene un tamaño de poro promedio en el rango de 80 a 200 micrómetros.

12. Un andamio proteico poroso para uso en la reparación de tejidos o para la regeneración de tejidos en un ser humano o un animal, en el que el andamio proteico poroso es como se define en la reivindicación 11.

13. Un método in vitro para fabricar o diseñar un tejido, en el que el método comprende aplicar células al andamio proteico poroso de acuerdo con la reivindicación 11.

14. Una construcción de ingeniería tisular que se puede obtener a partir del método de la reivindicación 13 y/o que comprende células o un tejido soportado sobre el andamio proteico poroso como se define en la reivindicación 11.

15. Una construcción diseñada mediante ingeniería tisular para uso en el tratamiento del cuerpo humano o animal, en la que la construcción diseñada mediante ingeniería tisular es como se define en la reivindicación 14.