JP6802838B2 - 多孔質ゼラチンシートの製造方法、多孔質ゼラチンシートおよびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、多孔質ゼラチンシートの製造方法に関する。さらに、本発明は、多孔質ゼラチンシート、その使用、多孔質ゼラチンシート・細胞複合材料に関する。

ヒトや動物の体が傷害を受けた場合、小規模な組織損傷であれば、通常は自身の（本来備わっている）修復機構により修復することができる。しかしながら、心筋梗塞や外傷等の重度の組織損傷を伴う傷害は、しばしば身体の再生能力を超える。重度の組織損傷の場合には、組織修復を支援する処置が必要である。

特許文献１には、マイクロキャリアが記載されているが、シートの記載はない。
特許文献２には、１５０μｍ以上のパラフィン球状物を使用して、球状チャンバーと繊維状の孔壁を有するゼラチンフォームを製造することが記載されているが、チャンバーのサイズ分布に関する記載はない。
特許文献３には、２種の乳化剤を用いて二重乳化法により球状物を製造することが記載されているが、単一の乳化剤を使用するものではない。

特許文献４には、１００μｍ〜９００μｍの孔サイズを有する孔構造が記載されている。
特許文献５には、乳化工程において３種の異なる生体適合性ポロゲンと細胞を使用することによって多孔質構造を製造することが記載されている。平均孔径は１０、２０、４０、８０、１００または２００μｍより大きく、および／または５００、３００、２００、１００、８０、４０または２０μｍより小さいことが記載されている。特許文献５においては多孔質構造を製造する際に細胞が使用されている。

ＷＯ２０１６／０６３９３５ ＵＳ２００８／２１３５６４ ＷＯ０３／１０４３１３ ＷＯ２０１４／１９５８６４ ＵＳ２０１４／１６１８４３

広範囲の組織傷害から生じる問題の１つは、生じた空間または穴をどのように閉じるかまたは埋めるかということである。この問題を考慮して、組織が欠損している空間または穴に詰める（半）永久的な充填材として、足場を使用することができる。また、足場は、増殖因子や薬品等を放出するため、または細胞を送達するための、徐放用の貯蔵場所として使用することもできる。身体に注入または移植する前に、所望の細胞を足場に事前に播種することにより、細胞送達を行うことができる。

本発明は、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートの製造方法、細胞増殖性を有する多孔質ゼラチンシートおよびその利用を提供することを解決すべき課題とする。

本発明者らの研究において、例えば空間を詰めるための足場または充填材として、傷の修復に使用し得る良好な細胞増殖性を有する多孔質シートの製造を試みた。本発明者らは、驚くべきことに、本発明の第１の側面において定義されるシートが、後述する通り、特に良好な細胞増殖性を有することを見出した。

本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞ 以下の工程：
（ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、および乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
（ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
（ｃ）支持体上に存在するエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
（ｄ）ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
（ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程
を含む、チャンバーを含む多孔質ゼラチンシートの製造方法であって、
上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有し、チャンバーの平均直径が１００μｍ未満である、上記の製造方法。

＜２＞ 工程（ａ）〜（ｅ）が細胞を含まない工程である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞ 乳化剤のＨＬＢが９以上である、＜１＞または＜２＞に記載の方法。
＜４＞ 上記シートが、チャンバーを相互接続し、細胞がチャンバーに入る通路を提供する孔のネットワークをさらに含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の方法。
＜５＞ 上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％である、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の方法。
＜６＞ 上記シートの孔の平均直径が少なくとも５μｍである、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の方法。
＜７＞ 上記シートの密度が０．０４〜０．５ｇ／ｃｍ³である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の方法。
＜８＞ 上記シートの体積が２〜２５ｃｍ³／ｇである、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の方法。
＜９＞ 上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、上記シートが平均直径が少なくとも５μｍである孔を含み、
（ｉ）上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり；および
（ｉｉ）チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、
＜１＞から＜８＞の何れか一に記載の方法。

＜１０＞ 上記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、上記シートが平均直径が少なくとも５μｍである表面孔を含み、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載の方法。
＜１１＞ チャンバーの少なくとも５０％が球状である、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の方法。
＜１２＞ ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載の方法。
＜１３＞ ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の方法。
＜１４＞ ゼラチンが、少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の方法。
＜１５＞ ゼラチンが、少なくとも２個のリシン残基を含む遺伝子組み換えゼラチンであり、上記リシン残基が端のリシン残基であって、第１の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチンのアミノ酸残基の総数の少なくとも２５％離れている、＜１＞から＜１４＞の何れか一に記載の方法。

＜１６＞ ＜１＞から＜１５＞の何れか一に記載の方法により製造される多孔質ゼラチンシート。
＜１７＞ ＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートの、細胞キャリアとしての使用。
＜１８＞ ＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートの、組織損傷修復のための足場としての使用。
＜１９＞ ＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートおよび生細胞を含む、複合材料。
＜１７Ａ＞ 細胞キャリアとしての使用するための、＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシート。
＜１７Ｂ＞ ＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートを細胞キャリアとして対象に投与することを含む、対象の処置方法。
＜１８Ａ＞ 組織損傷修復のための足場として使用するための、＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシート。
＜１８Ｂ＞ ＜１６＞に記載の多孔質ゼラチンシートを組織損傷修復のための足場として対象に投与することを含む、組織損傷の修復方法。

本発明による多孔質ゼラチンシートの製造方法によれば、一段階の乳化工程のみで多孔質ゼラチンシートを製造することができる。

図１ａ〜１ｄは、本発明のシートの断面の走査型電子顕微鏡（「ＳＥＭ」）写真である。 図２は、市販のＺｉｍｍｅｒ ＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標）の断面のＳＥＭ写真である（比較例）。

図１ａは、本発明のシートの断面を、３５０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ａのシートの厚さは１４０μｍである。
図１ｂは、本発明のシートの断面を、７０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｂのシートの厚さは９００μｍである。
図１ｃは、本発明のシートの断面を、２５倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｃのシートの厚さは２５００μｍである。
図１ｄは、本発明のシートの断面を、６５０倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図１ｄのシートの厚さは１４０μｍである。
図２は、Ｚｉｍｍｅｒ Ｄｅｎｔａｌより市販されているＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標）基材の断面を、８５倍の倍率で撮影したＳＥＭ写真である。図２のシートの厚さは７００μｍである。

図１ａ、ｂおよびｃに示すシートは精密に平坦であり、均一なチャンバーサイズ分布を有する球状のチャンバーを含み、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。
図１ｄに示すシートは球状のチャンバーを含み、その少なくとも半分は球状であり、かつ、その少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。
図１ｄのシートにおけるチャンバー（１）は、図２に示す比較例に示すシートに見られるチャンバーよりも、均一なサイズおよび形状を有することに注目すべきである。
図２に示すシート（比較例）は、不定形の非常に不規則なチャンバーを含み、チャンバーは一般にシートの上面（２ａ）では大きく、シートの底面（２ｂ）では小さい。

本発明のシートは、細胞培養のための支持体を提供し、細胞成長速度および成長した細胞数の点で特に良好な細胞増殖を提供する。
好ましくは、シートは可塑性であり、折り畳むことができ、ハサミで切ることが可能である。
このように、図２に示す市販のシートに存在するチャンバー（２ａおよび２ｂ）は、図１ａ〜１ｄの本発明のシートに示すチャンバーと比較して、不規則で、不定形であり、直径の範囲が広範である。

本明細書に使用される用語「ゼラチン」は、コラーゲンを含む。ゼラチンは、好ましくは平均分子量が１５０ｋＤａ未満であり、好ましくは１００ｋＤａ未満である。好ましくは、ゼラチンは、平均分子量が少なくとも５ｋＤａであり、好ましくは少なくとも１０ｋＤａであり、より好ましくは少なくとも３０ｋＤａである。遺伝子組み換えゼラチンの平均分子量の好ましい範囲は、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、２０ｋＤａ〜７５ｋＤａ、および５ｋＤａ〜４０ｋＤａである。ゼラチンの粘度が低いため、高い質量濃度のゼラチンが求められる場合は、より低い分子量が好ましい。ゼラチンの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーによって測定してもよい。

ゼラチンは、好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンである。遺伝子組み換えゼラチンは、例えば富士フイルム（株）より、商業的に入手してもよい。遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、欧州特許出願ＥＰ０９２６５４３号およびＥＰ１０１４１７６号に記載されたような、公知の方法で調製してもよく、これらの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。遺伝子組み換えゼラチンを調製する手法は「High yield secretion of recombinant gelatins by Pichia pastoris」, M. W. T. Werten et al., Yeast 15, 1087-1096 (1999)にも記載されている。好適な遺伝子組み換えゼラチンは、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号にも記載されている。

１つの態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも２個のリシン残基を含み、上記リシン残基は端のリシン残基(extreme lysine residues)であって、第１の端のリシン残基は、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基は、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基は、ゼラチンのアミノ酸の総数の少なくとも２５％離れている。このような遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、米国特許ＵＳ２００９／０２４６２８２号に記載の方法で得てもよい。

本発明のさらなる態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含み、上記２個のアミノ残基は、端のアミノ酸残基(extreme amino acid residues)であって、それらは、それぞれ独立に、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基から選択され、第１のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、第２の端のアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基は、ポリペプチドのＣ末端に最も近いアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基であり、上記端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基は、遺伝子組み換えゼラチンポリペプチドのアミノ酸の総数の少なくとも２５％離れている。

さらに、他の態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、少なくとも１個のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基を、上記端のアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基の間に含む。
好ましい態様では、ゼラチンは、優れた細胞接着性を有し、好ましくは、いかなる健康関連のリスクをも示さない。このことは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチン、例えば、アミノ酸の総数に対して、ＲＧＤモチーフのパーセンテージが少なくとも０．４である遺伝子組み換えゼラチンを使用することにより、有利に達成される。ＲＧＤエンリッチゼラチンが３５０個以上のアミノ酸を含む場合、３５０個のアミノ酸の各ストレッチは、好ましくは少なくとも１個のＲＧＤモチーフを含有する。好ましくは、アミノ酸の総数に対するＲＧＤモチーフのパーセンテージは、少なくとも０．６であり、より好ましくは少なくとも０．８であり、より好ましくは少なくとも１．０であり、より好ましくは少なくとも１．２であり、最も好ましくは少なくとも１．５である。

ＲＧＤモチーフのパーセンテージの０．４は、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも１個のＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であり、従って、０．４％という特徴に適合するためには、２５１個のアミノ酸よりなるゼラチンは、少なくとも２個のＲＧＤ配列を含むべきである。好ましくは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも２個のＲＧＤ配列を含み、より好ましくは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも３個のＲＧＤ配列を含み、最も好ましくは、２５０個のアミノ酸当たり少なくとも４個のＲＧＤ配列を含む。

さらなる態様では、ゼラチンは少なくとも４個のＲＧＤモチーフを含むＲＧＤエンリッチゼラチンであり、好ましくは少なくとも６個、より好ましくは少なくとも８個、さらにより好ましくは少なくとも１２個から１６個までのＲＧＤモチーフを含む。
本発明に使用される遺伝子組み換えゼラチンは、好ましくはコラーゲン配列に由来する。コラーゲン配列をコードする核酸配列は、当技術分野において一般的に記載されている。（例えば、Fuller and Boedtker (1981) Biochemistry 20: 996-1006; Sandell et al. (1984) J Biol Chem 259: 7826-34; Kohno et al. (1984) J Biol Chem 259: 13668-13673; French et al. (1985) Gene 39: 311-312; Metsaranta et al. (1991) J Biol Chem 266: 16862-16869; Metsaranta et al. (1991) Biochim Biophys Acta 1089: 241-243; Wood et al. (1987) Gene 61 : 225-230; Glumoff et al. (1994) Biochim Biophys Acta 1217: 41-48 ; Shirai et al. (1998) Matrix Biology 17: 85-88; Tromp et al. (1988) Biochem J 253: 919-912; Kuivaniemi et al. (1988) Biochem J 252: 633640; およびAla-Kokko et al. (1989) Biochem J 260: 509-516参照）。

ＲＧＤモチーフを多く含む遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、米国特許ＵＳ２００６／０２４１０３２号に記載されている一般的な方法により調製してもよい。
医薬および医療用途には、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸配列と近縁または同一のアミノ酸配列を含む、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。より好ましくは、ゼラチンは、天然ヒトコラーゲンに見られる１以上の（例えば、反復）アミノ酸配列を含み、特に、（ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを作るために）ＲＧＤモチーフを含むような配列を含む。このような選択された配列中のＲＧＤモチーフのパーセンテージは、選択された配列の選択された長さによって決まり、より短い配列を選択することにより、必然的に、最終的な遺伝子組み換えゼラチン中のＲＧＤのパーセンテージがより高くなる。天然ゼラチンより分子量の大きい遺伝子組み換えゼラチンを提供するため、選択されたアミノ酸配列を反復使用することができる。さらに、（天然ゼラチンと比較して）非抗原性のＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを得てもよい。

このように、好ましい態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然のヒトゼラチン配列またはその一部を含む。好ましくは、遺伝子組み換えゼラチンは、１以上の天然のヒトゼラチンアミノ酸配列の１以上の部分を少なくとも８０％含む（または少なくとも８０％よりなる）ＲＧＤエンリッチゼラチンである。好ましくは、ヒトゼラチン配列のこのような部分は、それぞれ、少なくとも３０個のアミノ酸、より好ましくは、少なくとも４５個のアミノ酸、最も好ましくは、少なくとも６０個のアミノ酸の長さを有し、例えば２４０個以下、好ましくは１５０個以下、最も好ましくは１２０個以下の長さであって、それぞれの部分は、好ましくは１以上のＲＧＤ配列を含有する。好ましくは、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、１以上の天然のヒトコラーゲン配列の１以上の部位を含む（またはそれらよりなる）。

本発明のシートを調製するために使用し得る遺伝子組み換えゼラチンの好適な起源の例は、ヒトCOL1A1-1である。ＲＧＤ配列を含む２５０個のアミノ酸の一部は国際公開ＷＯ０４／８５４７３号に記載されている。遺伝子組み換えゼラチン中のＲＧＤ配列は、インテグリンと呼ばれる細胞表面上の特異的なレセプターに接着することができる。

ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、例えば、欧州特許ＥＰ−Ａ−０９２６５４３号、ＥＰ−Ａ−１０１４１７６号または国際公開ＷＯ ０１／３４６４６号、特に最初の２つの特許公報の実施例に記載された遺伝子組み換え方法により製造してもよい。ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンの好ましい製造方法は、ＲＧＤアミノ酸配列を含むコラーゲンタンパク質の一部をコードする天然核酸配列を用いて開始することを含む。この配列を繰り返すことにより、ＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンを得てもよい。

このように、遺伝子組み換えゼラチンは、好適な微生物によってそのようなゼラチンをコードする核酸を発現させることにより、得ることができる。この方法は、真菌細胞または酵母細胞を用いて好適に実施することができる。好適には、宿主細胞は、ハンゼヌラ（Hansenula）、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、サッカロミセス（Saccharomyces）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、アカパンカビ（Neurospora）またはピチア（Pichia）のような、高発現宿主細胞である。真菌および酵母細胞は、反復配列の不適切な発現の影響を受け難いため、細菌より好ましい。最も好ましくは、宿主は、発現されたゼラチン構造を攻撃するプロテアーゼを高レベルで有さない。この点において、ピチア（Pichia）またはハンゼヌラ（Hansenula）は非常に好適な発現系の例である。発現系として、ピチアパトリス（Pichia pastoris）の使用が、欧州特許ＥＰ０９２６５４３号およびＥＰ１０１４１７６号に開示されている。この微生物は、プロリンの特定の水酸化およびリシンの水酸化等の、能動的な翻訳後プロセシング機構がなくともよい。代わりに、宿主系は、ゼラチンを高い効率で水酸化する、内因性のプロリン水酸化活性を有してもよい。

別の態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンよりガラス転移温度（Ｔｇ）が高く、例えばＴｇは１７０℃より高く、特に１８０℃より高く、さらには１９０℃より高い。天然ゼラチンよりＴｇが高い遺伝子組み換えゼラチンは、国際公開ＷＯ ０５／１１７４０号に記載されている。

さらなる態様では、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンよりグリコシル化が少なく、例えば、グリコシル化は２質量％未満、好ましくは１質量％未満、より好ましくは０．５質量％未満、特に０．２質量％未満、とりわけ０．１質量％未満である。好ましい態様では、遺伝子組み換えゼラチンはグリコシル化されない。

グリコシル化の程度または質量％は、ゼラチンの単位質量当たりの総炭水化物質量を言い、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry）により、またはデュボア（Dubois）による滴定法により測定される。「グリコシル化」という用語は、単糖だけでなく、多糖、例えば、二糖、三糖および四糖にも言及する。

ゼラチンにグリコシル化が少ないか、存在しないことを確認する、種々の方法がある。グリコシル化は翻訳後修飾であり、それにより、炭水化物がゼラチンの特定のアミノ酸に共有結合する。従って、アミノ酸配列およびアミノ酸配列が産生される宿主細胞（および酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼ）の両者がグリコシル化の程度を決定する。２種類のグリコシル化があり、Ｎ−グリコシル化は、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）のアミド基に、ＧｌｃＮＡｃ （Ｎ−アセチルグルコサミン）を結合することより始まり、Ｏ−グリコシル化は、通常、アミノ酸のセリン（ＳまたはＳｅｒ）またはスレオニン（ＴまたはＴｈｒ）にＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）を結合する。

従って、適切な発現宿主を選択することにより、および／または、宿主のグリコシルトランスフェラーゼにより認識されるコンセンサス部位を欠如する配列を修飾または選択することにより、ゼラチンのグリコシル化の程度を制御することができ、特に、低下させるか、または防止することができる。

ゼラチンの化学合成もまた、グリコシル化のないゼラチンを調製するために用いることができる。グリコシル化を含む遺伝子組み換えゼラチンを生成後に処理して、炭水化物の全部または大部分を除去してもよいし、またはグリコシル化されていないゼラチンを既知の方法を用いてグリコシル化されたゼラチンから分離してもよい。

さらに好ましい態様では、ゼラチンのアミノ酸残基の１０％未満、より好ましくは５％未満がヒロドキシプロリン残基である。好ましくは、ゼラチンはヒロドキシプロリン残基を含まない。また、ゼラチンがヒドロキシル化されたアミノ酸残基を含まないことも好ましい。

別の態様では、ゼラチンは、等電点が少なくとも５（例えば、５〜１１）であり、好ましくは６より高く、最も好ましくは７より高い。上記の等電点の目的は、生理学的条件下で正味の正電荷を有するゼラチンを提供することである。あらゆる理論に拘泥することなく、本発明のシートを創傷修復に使用する場合、正味の正電荷は、細胞のシートへの誘引、相互作用および結合を助け、それによって細胞増殖を増進させると考えられる。

本発明のシートは、チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する。本発明のシートにおけるチャンバーの平均直径は１００μｍ未満である。
好ましくは、シートは、チャンバーを相互接続し、生細胞がチャンバーに入る通路を提供する孔のネットワークをさらに含む。好ましくは、孔のネットワークは、チャンバーの少なくとも半分（少なくとも５０％）、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも９０％が、シート中に存在する少なくとも１つの他のチャンバーと連結している。

好ましくは、チャンバーは、例えば上記の孔のネットワークを通って、細胞が入ってもよく、栄養素の拡散が可能な、多孔性の壁（例えば、穴を含む壁）を含む。好ましくは、チャンバー壁の孔および穴の平均直径は、少なくとも１μｍであり、より好ましくは少なくとも５μｍである。

好ましくはチャンバーの少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％は、直径が、チャンバーの平均直径の±３０％以内（すなわち、チャンバーの平均直径の７０〜１３０％）である。
好ましくはチャンバーの少なくとも７５％、特に少なくとも８０％が球状である。
好ましくはチャンバーの少なくとも半分、より好ましくは少なくとも７５％、特に少なくとも８０％は、凹面の壁を有する。
チャンバーの平均直径は、１００μｍ未満であり、好ましくは９５μｍ以下であり、より好ましくは９０μｍ以下である。

このように、本発明のシートに存在するゼラチンは、好ましくは、上記チャンバーの壁および孔の壁を定める、足場を提供する。細胞または薬学的物質は孔を通ってチャンバーに入ってもよい。
完全な球はアスペクト比が１：１であり、半径が単一であることで定義される。本発明の球状のチャンバーは、概して球状であり、大部分が凹面の壁を有する限り、不規則な形状を有していてもよい。チャンバーのアスペクト比は、好ましくは１：１〜４：１であり、好ましくは１：１〜３：１であり、特に１：１〜２：１である。このように、球状のチャンバーは、好ましくは球形の(spherical)横断面（例えばサッカーボール様）を有し、楕円の横断面（例えばラグビーボール様）、さらにはジャガイモ形状のチャンバーも可能である。

ゼラチンシートは、ゼラチンに加えて、他のポリマー、生分解性ポリマー、バイオポリマー、軟化剤等の他の成分を含んでもよい。
本発明のゼラチンシートは、基質または型の形態に依存するあらゆる形状のものであってもよい。本発明のプロセスは、ガラスまたはテフロン（登録商標）プレートを使用する平坦なシートの製造に、特に好適である。従って、本発明のシートは、好ましくは平坦なフィルムまたはシートである。
本発明のシートは、好ましくは厚さが２０μｍ〜２ｃｍであり、より好ましくは５０μｍ〜１ｃｍであり、特に７５μｍ〜３００μｍである。
本発明のシートの最大面の断面積は、好ましくは少なくとも０．１ｃｍ²であり、より好ましくは少なくとも１ｃｍ²であり、特に少なくとも１００ｃｍ²である。

本発明のシートは、あらゆる好適な方法で製造してもよく、例えば、以下の工程を含む、本発明の第２の側面を提供する方法によって製造してもよい：
（ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、および乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
（ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度（すなわち、ゼラチンのゲル化点より高い温度）のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
（ｃ）支持体上に存在するエマルジョンをゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
（ｄ）例えば、限定されないがアセトン等の好適な溶媒を用いて、例えばゼラチンを洗浄することにより、ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
（ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程。

上記の工程（ａ）〜（ｅ）は、好ましくは、細胞を含まない工程である。即ち、本発明の好ましい形態の方法においては、細胞を含まない（cell-free）ことを特徴とする。

工程（ａ）で使用される組成物のｐＨは、好ましくは３〜１１の範囲内であり、より好ましくは４〜８である。工程（ａ）で使用される組成物は、親水性親油性バランス（「ＨＬＢ」）が９以上、特に１０以上、とりわけ１３〜１９である乳化剤を含む。このような乳化剤を２種以上使用してもよい。好適な乳化剤の例としては、以下が挙げられる：

ＰＥＧ４００モノオレエート ポリオキシエチレンモノオレエート（ＨＬＢ １１．４）、
ＰＥＧ４００モノステアレート ポリオキシエチレンモノステアレート（ＨＬＢ １１．６）、
ＰＥＧ ４００モノラウレート ポリオキシエチレンモノラウレート（ＨＬＢ １３．１）、
オレイン酸カリウム（ＨＬＢ ２０．０）、
ラウリル硫酸ナトリウム（ＨＬＢ ４０）、
オレイン酸ナトリウム（ＨＬＢ １８）、
Ｍｙｒｊ（登録商標）５２（ポリオキシエチレンステアリン酸、ＨＬＢ １７）、
Ｂｒｉｊ（登録商標）５８（ポリオキシエチレンセチルアルコール、ＨＬＢ １６）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ １６．７）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２１（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＨＬＢ １３．３）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ＨＬＢ １５．６）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ＨＬＢ １４．９）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６１（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ＨＬＢ ９．６）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６５（ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ＨＬＢ １０．５）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ １５．０）、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８１（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ＨＬＢ １０．０）、および
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５（ポリオキシエチレンソルビタントリオレート、ＨＬＢ １１．０）。

上記の乳化剤の中でも、特に好ましくは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｍｙｒｊ（登録商標）５２およびＢｒｉｊ（登録商標）５８、ならびにそれらの２以上を含む組合せである。
本発明においては、好ましくは単一の乳化剤を使用することができ、乳化工程を一段階で行うことができる。

工程（ａ）で使用し得る、好適な水非混和性液体としては、酢酸アルキル（例えば、酢酸エチル）、炭化水素（例えば、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、トルエン、キシレン等）、ハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン等）、およびオイル（例えば、植物油（例えば、コーン油）、灯油または工業潤滑油）、および上記の２種以上を含む組合せが挙げられる。特に好ましい水非混和性液体はコーン油である。
代表的には、エマルジョンは２相：水非混和性相および水相を含む。

好ましくは、工程（ａ）は、水非混和性相の体積量が、水相の体積量と同量であるか、水相の体積量より大きい、例えば２倍以上で、実施される。
所望により、本発明の方法は、工程（ｂ）の間、および／または、工程（ｂ）の後に、ゼラチンを架橋する工程をさらに含む。このような架橋は、例えば架橋剤を使用する、化学的架橋であってもよく、または、より好ましくは、例えば熱脱水架橋である、熱架橋であってもよい。

ゼラチンは、例えば、ゼラチン中に存在する官能基が互いに反応してイオン結合または共有結合を形成することによって、架橋することができ、例えば、リシンのアミノ基がゼラチンのグルタミン酸および／またはアスパラギン酸のカルボキシル基と架橋することができ、または、ゼラチンがアクリル化ゼラチン等、化学的に修飾されてもよい。

化学的架橋に好適な架橋剤は、好ましくは、生分解の間、放出された時に毒性または抗原性作用を引き起こさないものである。好適な架橋剤としては、例えば、グルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミド、ビスエポキシ化合物、ホルマリン、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ビス−ヒドロキシ−スクシンイミド、グリシジルエーテル（アルキレングリコールジグリシジルエーテルまたはポリグリセロールポリグリシジルエーテル等）、ジイソシアネート（ヘキサメチレンジイソシアネート等）、ジフェニルホスホリルアジド、Ｄ−リボース、ゲニピン、およびそれらの２種以上を含む組合せのうちの１またはそれ以上が挙げられる。架橋技術は、Weadockらによる、Evaluation of collagen cross-linking techniques (Biomater. Med. Devices Artif. Organs, 1983-1984, 11 (4): 293-318)にも記載されている。好ましい態様では、水溶性の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が使用される。別の好ましい態様では、ヘキサメチレンジイソシアネートが架橋剤として使用される。他の好適な架橋剤としては、例えば塩化シアヌルおよびジクロロヒドロキシトリアジン等の反応性トリアジンが挙げられる。その他の架橋化合物としては、ジビニルスルホン、２無水物、２官能性のイミデート、ジエポキシドまたはジマレイイミジン(dimaleiimidine)が挙げられる。１分子中にエポキシドおよび無水物基を含む２官能性の架橋化合物等の、異なる反応基を有する、２官能性の架橋剤を使用することもできる。

酵素的架橋剤、例えば、トランスグルタミナーゼも有用である。
架橋剤は、２個より多い官能基を有してもよく、例えば、塩化シアヌル（三官能基）、および、２個のエポキシドと１個の無水物基を含む化合物が挙げられる。このような架橋剤は、典型的には、ゼラチンのアミノ酸中に存在するアミン基および／またはスルフヒドリル基と反応する。

要すれば、１種より多い架橋剤を使用してもよい。架橋剤がゼラチンと接触したとき、または、例えばｐＨを調整した後、または光開始により、または他の活性化メカニズムを用いた後、架橋は自発的に開始し得る。
特に有用な架橋剤はグルタルアルデヒドであり、これは２つのリシン残基を架橋する。別の好適な生体適合性架橋剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）であり、これはアミン基とカルボキシル基とを結合させる。また、ヘキサメチレンジイソシアネートも架橋剤として使用し得る。

脱水熱架橋は、ゼラチン中に存在するアミン基とカルボキシル基との縮合により架橋を引き起こし、アミド基を形成する。脱水熱架橋は、好ましくは、１２０℃より高い温度で、真空中で実施される。

シートの形成に寄与するため、ゼラチンは、好ましくは少なくとも２つのリシン残基を含む。好ましくは、ゼラチンは、少なくとも３個、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または少なくとも１２個のリシン残基を含む、遺伝子組み換えゼラチンである。さらなる態様では、ゼラチンは、少なくとも２個のリシン残基に加えて、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選択される少なくとも２個のアミノ酸残基を含む。より好ましくは、ゼラチンは、好ましくは少なくとも２個のリシン残基に加えて、少なくとも３個、または、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１個、または少なくとも１２個のアスパラギン酸およびグルタミン酸残基を含む。

多孔質ゼラチンシートであって、上記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、および／または、上記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、シートの形成を助けるため、ゼラチンは、好ましくは、ゼラチン分子の長さに沿って分布した、リシン、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸を含む。このように、１つの態様では、ゼラチン中に存在する５０個のアミノ酸の各ストレッチは、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のリシン残基を含むか、少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含むか、または、少なくとも１個のリシン残基と少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基とを含む。好ましくは、ゼラチン中に存在する４０個のアミノ酸の各ストレッチ（より好ましくは、２５個のアミノ酸の各ストレッチ）は、少なくとも１個のリシン残基および／または少なくとも１個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基を含む。

好ましくは、ゼラチンは、互いに隣接していない架橋可能なアミノ酸残基を含み、例えば、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個の、架橋可能でないアミノ酸により離れている、架橋可能なアミノ酸残基を含む。架橋可能なアミノ酸残基は、第１級アミン基（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するために典型的に使用される第１級アミン基の他に）、−ＳＨおよび／またはカルボン酸基（タンパク質骨格中のアミド結合を形成するすために典型的に使用されるカルボン酸基の他に）を含む。

ゼラチンは、特にその後の架橋を助けるため、好ましくは、天然ゼラチンよりもリシン残基のパーセンテージ（％）または数が大きい、遺伝子組み換えゼラチンである。
多くの架橋剤は、リシン残基および／またはＮ末端アミンに結合する。天然ゼラチンは、典型的には、アミノ酸残基１，０００個当たり、２５〜２７個のリシン残基および１１２〜１３３個のグルタミン酸およびアスパラギン酸残基を含有する。本発明に使用される遺伝子組み換えゼラチンでは、リシン残基の数を、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、約２０、１５、１０または５個以下に減らすことができ、または、要すれば、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、約３０、４０または５０個以上に増やすことができる。

本発明に使用されるゼラチン中に存在する、グルタミン酸またはアスパラギン酸残基の数は、例えば、アミノ酸残基１，０００個当たり、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５個以下に減らすことができ、または、要すれば、アミノ酸残基１，０００個当たり、例えば、１５０個以上に増やすことができる。
要すれば、ゼラチン中に存在する、いくつかまたは全てのグルタミンおよびアスパラギン残基を脱アミノ化し、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基に変換することができる。

１つの態様では、ゼラチンは、ゼラチン１ｇ当たり０．０２〜１．０ｍｍｏｌの架橋剤とゼラチンを接触させることを含む方法により、架橋される。例えば、ゼラチン１ｇ当たり、約０．０２、０．０５、０．１、０．２５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、２．０、３．０、４．０および５．０ｍｍｏｌの架橋剤を使用してもよい。

このように、シートの物理的性質をカスタマイズするため、使用される架橋化合物の量と共に、架橋可能なアミノ酸残基の数を利用することができる。架橋可能な残基の数が多いこと、および／または、架橋化合物の濃度が高いことにより、機械的ストレスに晒される用途に特に有用な、頑丈なシートを得ることができる。架橋可能なアミノ酸残基の数が少ないこと、および／または、架橋化合物の濃度が低いことにより、より容易に変形可能で、かつ、低侵襲送達技術および医薬用途に特に好適なシートを得ることができる。

シートが医学的用途に使用される場合に特に望ましいことであるが、熱脱水架橋は、ゼラチンの化学的コンタミネーションの可能性を回避することから、好ましい。
架橋の程度もまた、ゼラチンシートの体内での溶解または分解に要する時間に影響する。従って、所望の用途のために、シートの溶解または分解速度を制御することが可能である。

工程（ａ）において、水：水非混和性液体の体積：体積の比は、好ましくは、５：１〜１：１０の範囲内であり、より好ましくは１：１〜１：５、特に２：３〜１：３である。
工程（ａ）で使用される組成物（および得られるエマルション）は、好ましくは、
１〜１５質量％、より好ましくは１．５〜１０質量％、特に３〜５質量％のゼラチン；
１０〜７０質量％、より好ましくは２０〜５０質量％、特に３０〜４０質量％の水；
２０〜９０質量％、より好ましくは４０〜８０質量％、特に５０〜７０質量％の水非混和性液体；および
０．５〜２０質量％、より好ましくは１〜１０質量％、特に２〜６質量％の乳化剤を含む。

工程（ａ）は、好ましくは１０〜１００℃の範囲内の温度で実施し、より好ましくは２０〜８０℃、特に３０〜６０℃の範囲内の温度で実施する。
工程（ａ）で行われる混合は、例えば、振とうまたは攪拌等の、いずれの好適な方法で行ってもよい。好ましくは、混合は攪拌によって行われ、特に溶解槽タイプの攪拌機を用いる場合、１分当たり特に２０〜５，０００回転（「ｒｐｍ」）の速度の撹拌、より好ましくは２００〜１，０００ｒｐｍ、特に２５０〜６００ｒｐｍの速度の攪拌によって行われる。

工程（ｂ）において、得られたエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンがゲルの形態でない温度で、支持体上に流し込まれ、例えば、工程（ｂ）において用いられるエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より、少なくとも３℃、より好ましくは少なくとも５または１０℃高い温度を有する。支持体は、例えば、無孔の型（例えば、テフロン（登録商標）製またはプラスチック材製）または平坦な無孔のシート（例えばガラス板）であってもよい。

工程（ｃ）で行われる冷却は、受動的であっても能動的であってもよい。例えば、受動的冷却は、単にエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンが固化／ゲルを形成する温度まで自然に冷却させることによって提供されてもよい。冷却は、制御された冷却速度で、または制御せずに、温度を低下させる冷却手段（例えば、氷、冷水、または工程（ｂ）の生成物を冷蔵庫内に置くことによる）を用いて提供されてもよい。能動的冷却は、最終的なシートの性質の調整に有用である。

しかしながら、好ましくは、工程（ｃ）は、エマルジョンが０．１〜２０℃／分の速度で、より好ましくは１〜１０℃／分の速度で冷却するように行われる。このような冷却速度により、特に有用な性質を有するシートを提供することができる。例えば、工程（ｂ）が６０℃位の温度のエマルジョンを使用して実施される場合、好ましい冷却速度は１．８℃／分となる。３０分後、得られたシートは最終温度が６℃ということになる。冷却速度は線形であっても、非線形であってもよい。

工程（ｄ）において、水非混和性液体は、例えば、ゼラチンを、水非混和性液体よりも沸点の低い溶媒で洗浄することにより、ゼラチンから除去してもよく、例えば、コーン油（高沸点）は、アセトン（低沸点）を用いて洗い流してもよい。水非混和性液体を洗い流すために使用される液体は、その後、相対的に低沸点であるために揮発する。用いられる乾燥方法は重要ではなく、例えば、オーブン中での乾燥、温風の吹き付け、真空乾燥、および単なる得られたシートの自然乾燥が挙げられる。

好ましくは、本発明の方法は、無菌条件下で実施される。
上記を考慮すると、本発明の第２の側面による方法は、好ましくは以下の特徴を有する：
（ｉ）工程（ａ）で使用される組成物は：
３〜５質量％のゼラチン；
３０〜４０質量％の水；
５０〜７０質量％の水非混和性液体；および
２〜６質量％の乳化剤
を含み；
（ｉｉ）工程（ａ）における混合は、１分当たり２５０〜６００回転の速度で撹拌することによって行われ；
（ｉｉｉ）工程（ａ）において、水対水非混和性液体の体積：体積の比は、２：３〜１：３の範囲内であり；
（ｉｖ）工程（ｂ）において支持体上に流し込まれるエマルジョンは、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点よりも温度が高く；
（ｖ）好ましくは、工程（ｃ）は、支持体上に存在するエマルジョンが１〜１０℃／分の速度で冷却するように実施され；
（ｖｉ）所望により、この方法は、得られた多孔性ゼラチンシートを、好ましくは熱脱水架橋により、架橋する工程をさらに含む。

本発明の好ましい側面によれば、本発明の第１の側面のゼラチンシートは、以下の特徴の１以上を有する：
（ａ）表面孔は、最小平均直径が、少なくとも１μｍ、例えば少なくとも３μｍ、さらにより好ましくは少なくとも５μｍである；
（ｂ）空隙率が、少なくとも５０体積％、例えば、５１〜９５体積％、特に６０〜９０体積％である；
（ｃ）密度が、０．０４〜０．５０ｇ／ｃｍ³、例えば０．０６〜０．２５ｇ／ｃｍ³、特に０．１〜０．２ｇ／ｃｍ³である；
（ｄ）体積が、２〜２５ｃｍ³／ｇ、例えば４〜１７ｃｍ³／ｇ、特に５〜１０ｃｍ³／ｇである；
（ｅ）チャンバーの平均直径が、１００μｍ未満であり、好ましくは、チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する；および
（ｆ）孔のネットワークはチャンバーを相互接続し、好ましくは、このような孔の平均直径は、少なくとも１μｍ、例えば少なくとも３μｍ、好ましくは少なくとも５μｍである。

チャンバーおよび孔の平均直径は、走査型電子顕微鏡像（例えば、Ｊｏｅｌ ＪＳＭ６３３０Ｆを用いて）の分析により、および、マイクロコンピューテッドトモグラフィー（ＣＴ）（ＶＧＳｔｕｄｉｏ ＭＡＸ２．２ソフトウェアを有するＳｋｙｓｃａｎ１１７２ ＭｉｃｒｏＣＴ装置（Ｂｒｕｋｅｒ社製））によって測定してもよい。

シートの平均空隙率は、以下の通り、式（１）で示される以下の計算を実施することによって測定してもよい：
Ｐ＝（ｐｖｌ／Ｖ）ｘ１００％
式（１）
式中：
Ｐは、シートの平均空隙率であり、
ｐｖｌは、シート内部の平均総空間体積であり；および
Ｖは、シートの平均総体積である。
ｐｖｌはマイクロＣＴ測定（例えば、Ｓｋｙｓｃａｎ１１７２ ＭｉｃｒｏＣＴ装置 （Ｂｒｕｋｅｒ社製）を使用）により、または、水銀圧入（孔が相互接続されている場合に適用可能）により測定してもよい。

シートの平均空隙率（Ｐ）を計算する別の方法は、シートの既知の体積の質量を測定し、ゼラチンの密度（１．３４ｇ／ｃｍ³）から求める。例えば、１ｃｍ³のシートの質量を測定し、式（２）によって平均空隙率を計算する：
Ｐ＝（１−Ｗ／ｄ）ｘ１００％
式（２）
式中：
Ｐは、シートの平均空隙率であり、
Ｗは、シート１ｃｍ³の質量であり；および
ｄは、ゼラチンの密度（１．３４ｇ／ｃｍ³）である。

本発明のゼラチンシートは、好ましくは、上述の特徴（ａ）〜（ｆ）の１以上を有し、および／または、下記の特徴の１以上を有する。多孔性ゼラチンシートは、上述の方法によって得てもよい。
上記の特徴（ａ）〜（ｆ）は、本発明の架橋および非架橋シートの両者に適用する。
上述の方法は、現在、市販で入手可能なフィルムフィートと大きく異なる３次元構造を有するゼラチンシートを提供するために使用してもよい。より具体的には、上述の方法は、本発明の第１の側面において記載される多孔性ゼラチンシートを提供するために使用することができる。

本発明の第３の側面によれば、本発明の第１の側面による多孔性ゼラチンシートおよび生細胞を含む複合材料が提供される。
代表的には、生細胞は、本発明のシートのチャンバー内および／またな孔内、特にチャンバー内に存在する。所望により、複合材料は、生細胞のための１以上の栄養素をさらに含む。

本発明の複合材料中に存在する生細胞の種類としては、制限はなく、ヒトまたは動物細胞が挙げられる。例えば、皮膚の細胞を使用することができ、得られる複合材料は、様々な種類の皮膚損傷の治療に使用することができる。別の例は、例えば心筋梗塞の治療に使用できる、筋芽細胞（筋細胞）である。もう１つの例は、肝臓病変中の毒性物質の無毒化に使用できる、肝細胞である。好ましい態様では、生細胞は幹細胞であり、例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、および間葉幹細胞である。使用し得る他の細胞としては、多分化能（multipotent）細胞、内皮細胞、前駆細胞、および骨髄由来細胞が挙げられる。

生細胞は、由来元であるか使用される予定のヒトまたは動物の体内に通常存在する条件下で栄養素を与えられた場合に、増殖する能力がある細胞である。
本発明の複合材料は、本発明のシートを所望の細胞と共に培養することにより調製してもよい。

細胞の増殖に使用される特定の栄養素は、代表的には、成長させる細胞に適合するように選択される。多数の栄養製剤が市販されており、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハムＦ−１０およびＦ−１２培地、培地１９９、ＭＥＭ、Ａｍｅｓ培地、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ改変）、Ｃｌｉｃｋ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、グラスゴー最少必須培地（ＧＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地 （リーボビッツ）、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、Ｓｗｉｍ Ｓ−７７培地、ウェイマウス培地、ウィリアム培地ＥおよびＲＰＭＩ １６４０培地が挙げられる。

本発明の第１および第３の側面のシートおよび複合材料は、多数の用途に使用することができ、例えば再生医学療法のための細胞キャリアまたは組織損傷修復のための足場として使用することができる。このように、第１の側面のシートは、生細胞と融合して、本発明の第３の側面による複合材料を供し、人工皮膚、人工器官、脂肪組織、筋肉、血管等の供給または培養に使用することができる。シートおよび複合材料は、細胞培養における細胞のキャリアとして、および、ヒトまたは動物の体への移植前または後に所望の物質を生産させるために存在する細胞のキャリアとして、使用することができる。細胞は、宿主自身（自家移植）の細胞または他の起源の細胞（特性種または外来種）であってもよい。いくつかのケースでは、細胞自体が所望の生成物であることができ、例えば、後に脂肪細胞に変換するために、移植後に増殖し得る、キャリア上に付着した初期段階の脂肪細胞（前脂肪細胞）であることができる。

本発明のシートおよび複合材料は、形成外科の分野において、並びに、毒性および薬物スクリーニングアッセイにおいても、特に有用である。後者の場合、本発明の第１の側面によるシートは、毒性または薬物スクリーニングのための使用に好適な生細胞によりコロニーを形成してもよい。本発明のシートにより、有利に、より自然な空間構造中で細胞が組織化し、これは、生体中に見られる細胞組織化の典型である。本発明によるシートを、先に生細胞と融合させずに、ヒトまたは動物の体に移植することも可能である。シートをヒトまたは動物の体に移植した後、体内の隣接する細胞は、例えばチャンバーおよび／または孔内に定着し、その後、増殖することにより、シート中に移動しコロニーを形成する。移植されたシートが溶解した後、コロニーを形成した細胞は、移植に対応した構造を形成しているであろう。

本発明を、以下の限定されない実施例により説明する。以下の略称を使用する。
「ＲＧ１」は、１０質量％固体の水性組成物であって、ｐＨ５．４を有し、以下に配列番号１として示される配列を有するＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチン（ＭＷＴ：５１．２ｋＤａ）含む組成物を意味する。このＲＧＤエンリッチ遺伝子組み換えゼラチンは、ヒトＣＯＬｌＡｌ−Ｉのゼラチンアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列を基に、この核酸配列を修飾することによって製造した。使用した方法は、欧州特許ＥＰ−Ａ−０９２６５４３号、同ＥＰ−Ａ−１０１４１７６号および国際特許ＷＯ０１／３４６４６号に開示されている。このように、ＲＧ１はヒドロキシプロリンを含まず、以下の配列番号１のアミノ酸配列を含む。
配列番号１のアミノ酸配列：
GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG;

配列番号１は、５７１個のアミノ酸長であり、１２個のＲＧＤモチーフを含む。
「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０」は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
「ＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地である。

実施例１
工程（ａ）− 第１のエマルションの調製
ＲＧ１（１５ｇ、１０質量％が固体）およびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０（１．０ｇ）の混合物を６０℃に加熱し、その温度で１５分間維持した。混合物は、ＲＧ１（９０質量％が水）由来の水を含んでいた。ＦＳ１については混合物を５５０ｒｐｍで攪拌しながら、水非混和性液体（コーンオイル、３０ｍｌ）を７分かけて添加した。６０℃（ＲＧ１のゲル化点より高い）の温度を維持しながら、さらに３分間、５５０ｒｐｍで攪拌を継続して、第１のエマルションを得た。チャンバーの平均直径が異なるＦＳ１ａおよびＦＳ１ｂを調製するために、攪拌速度を調節し、チャンバーの平均直径が所定のものを得た。
工程（ｂ）− コーティングの調製
第１のエマルジョンをさらに６０℃で、ガラスプレート上に、種々の厚さに流し込んだ。
工程（ｃ）− コーティングの冷却
第１のエマルジョンを種々の厚さでコーティングしたガラスプレートを、冷蔵庫中、４℃で３０分間冷却し、ＲＧ１をガラスプレート上で多孔性ゼラチンシートとして固化させた。

工程（ｄ）− 水非混和性液体の除去
多孔性ゼラチンシートを有するガラスプレートを、冷却したアセトン浴に移した。シートを、水およびコーン油がシートから除去されるまで、新しいアセトンで数回洗浄した。その後、シートをオーブン中、６０℃で乾燥した。
任意工程（ｅ）− 架橋
工程（ｄ）で得られたシートは、以下の通り、熱脱水処理により架橋して、架橋した多孔性ゼラチンシートを得た：工程（ｄ）で得られた乾燥シートを、真空下１４５℃の温度のＢｉｎｄｅｒＶＤ５３真空ストーブ中に９６時間置いた。

上記で概説したように、ガラスプレート上に第１のエマルジョンの層を流し込んで生成した、架橋した多孔性ゼラチンシート（「シートＦＳ１」、「シートＦＳ１ａ」および「シートＦＳ１ｂ」）は、以下の表１に記載の性質を有していた。

注：
１： シートＦＳ１、ＦＳ１ａおよびＦＳ１ｂ中のチャンバーの形状および平均直径は、ＳＥＭ画像およびマイクロＣＴデータ（ＧＳｔｕｄｉｏ ＭＡＸ２．２ソフトウェアを備えたＢｒｕｋｅｒ社のＳｋｙｓｃａｎ １１７２ ＭｉｃｒｏＣＴ装置を使用）を用いて測定した。
２： シートＦＳ１の平均空隙率は、上述の式（１）により測定した。
３： シートＦＳ１の平均密度は、１ｃｍ³のシートの総質量を測定することにより測定し、算出した。
４： シートＦＳ１の平均体積は、１ｇのシートＦＳ１の体積を測定することにより測定した。

実施例２〜４および比較例１
以下の表２に示した変更以外は実施例１を繰り返した。得られたシートの性質を表３に示す：

（チャンバーの平均直径、平均空隙率、平均直径、平均密度および平均体積は、上記実施例１で記載した通り測定した。）
＊＝チャンバーのほとんどが球状ではなかったため、測定できなかった。
シートＦＳ１〜ＦＳ４、および比較例１のシートは、ＳＥＭによって分析した。シートＦＳ１、ＦＳ２およびＦＳ３のＳＥＭ写真を、それぞれ図１ａ、図１ｂおよび図１ｃに示し、比較例１のＳＥＭ写真を図２に示す。

複合材料の調製および試験
本発明の第３の側面による複合材料および比較例の複合材料を以下の通り調製した：
殺菌工程
シートＦＳ１〜ＦＳ４をそれぞれリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムおよびマグネシウムを含まない；「ＰＢＳ」と略す）中に置いた。ＰＢＳ緩衝液中、室温で１時間後、シートをオートクレーブにより殺菌した（ＰＢＳを除去せず）。殺菌後、ＰＢＳを除去し、新しいＰＢＳを加えた。殺菌、ＰＢＳ除去およびＰＢＳ置換のサイクルを３回繰り返した。最終的に得られた、殺菌したシートは、使用時まで、１０％ウシ胎仔血清（「ＦＢＳ」）を含むＤＭＥＭ中、４℃で保存した。比較例１の市販のシート（Ｚｉｍｍｅｒ Ｄｅｎｔａｌ社のＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標））は、追加の殺菌をせず、滅菌パーケージから直接使用した。

Ｃ２Ｃ１２細胞（筋線維芽細胞マウス、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７７２）の調製
Ｃ２Ｃ１２細胞をＴ７５培養フラスコ中、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で前培養し、細胞が５０〜６０％コンフルエントになり、活発に増殖したときに継代させた。その後、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ²）でリンスし、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを除去した。続いて、ＰＢＳを吸引した。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を細胞に加え（３〜４ｍｌ／７５ｃｍ²）、得られた混合物を３７℃で６分間インキュベートした。その後、再度、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを、トリプシン量に対して１：２の割合で加えて、トリプシンを中和させた。その後、得られた単一細胞溶液を室温で５分間、１２５ｒｐｍで遠心分離した。上澄を吸引し、得られた細胞ペレット内の生細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで穏やかに再懸濁し、Ｃ２Ｃ１２細胞を得た。細胞密度は顕微鏡を用いて測定した。

細胞培養
上記で得られたＣ２Ｃ１２細胞を、直径５ｍｍの円形のシートＦＳ１、および比較例で使用したシート（Ｚｉｍｍｅｒ Ｄｅｎｔａｌ社のＣｏｌｌａＴａｐｅ（登録商標））上に、円形シート当たり細胞５ｘ１０⁵個の密度で、動的振とう法により播種した。動的振とう法は、評価対象のシートをＣ２Ｃ１２細胞の懸濁液中に置き、混合物を２００ｒｐｍで４時間回転させ、その後、評価対象のシートを、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の細胞培養プレートに移動させた。その後、細胞を、評価対象のシートの存在下、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、７日間培養した。その後、評価対象のシート内に存在する生細胞の量を、ＤＮＡ定量化（ＣｙＱｕａｎｔピコグリーンアッセイ）によって測定した。結果を表４に示す：

表４中、以下のスコアシステムを使用した。
+++ は非常に良好な細胞増殖を意味し；
++ は良好な細胞増殖を意味し；および
+ は中等度の細胞増殖を意味する。
表４から分かるように、本発明によるシートＦＳ１、ＦＳ１ａおよびＦＳ２〜ＦＳ４の細胞増殖は、比較例の細胞増殖より優れていた。また、チャンバーの平均直径が１００μｍを超えるシートＦＳ１ｂは、低い細胞増殖を示した。

Claims (12)

1. 以下の工程：
   （ａ）水、ゼラチン、水非混和性液体、およびＨＬＢが１５．０以上の乳化剤を含む組成物を混合して、エマルションを得る工程；
   （ｂ）組成物中に存在するゼラチンがゲルを形成する温度より高い温度のエマルジョンを支持体上に流し込む工程；
   （ｃ）支持体上に存在するエマルジョンを、組成物中に存在するゼラチンのゲル化点より低い温度に冷却する工程；
   （ｄ）ゼラチンから水非混和性液体を除去する工程；および
   （ｅ）ゼラチンを乾燥して、多孔質ゼラチンシートを提供する工程
   を含む、チャンバーを含む多孔質ゼラチンシートの製造方法であって、
   前記チャンバーの少なくとも半分は球状であり、前記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有し、チャンバーの平均直径が１００μｍ未満であり、前記シートが、チャンバーを相互接続し、細胞がチャンバーに入る通路を提供する平均直径が少なくとも５μｍの孔のネットワークをさらに含む、前記の製造方法。
2. 工程（ａ）において、水非混和性相の体積量が、水相の体積量と同量であるか、水相の体積量より大きい、請求項１に記載の方法。
3. 工程（ａ）〜（ｅ）が細胞を含まない工程である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％である、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
5. 前記シートの密度が０．０４〜０．５ｇ／ｃｍ^３である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
6. 前記シートの体積が２〜２５ｃｍ^３／ｇである、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
7. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、
   （ｉ）前記チャンバーの少なくとも半分は球状であり；および
   （ｉｉ）チャンバーの少なくとも８０％はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、
   請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
8. 前記シートの空隙率が少なくとも５０体積％であり、前記シートが平均直径が少なくとも５μｍである表面孔を含み、前記チャンバーの少なくとも半分はチャンバーの平均直径の±３０％の直径を有する、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
10. ゼラチンが、等電点が少なくとも５である遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
11. ゼラチンが、少なくとも３個のＲＧＤモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
12. ゼラチンが、少なくとも２個のリシン残基を含む遺伝子組み換えゼラチンであり、前記リシン残基が端のリシン残基であって、第１の端のリシン残基が、ゼラチンのＮ末端に最も近いリシン残基であり、第２の端のリシン残基が、ゼラチンのＣ末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチンのアミノ酸残基の総数の少なくとも２５％離れている、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。