JP6346672B2 - マイクロキャリアの調整方法、マイクロキャリア及びその応用 - Google Patents
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Description
[2]上記工程(b)で使用する非水溶性液体が、HLB値が8未満の乳化剤を含まない、[1]に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[3]上記工程(b)で使用する非水溶性液体が、乳化剤を含まない、[1]に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[4]上記工程(a)で使用する乳化剤のHLB値が9より大きい、[1]〜[3]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[5]上記第一エマルションのpHが3〜11の範囲内である、[1]〜[4]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[6]上記遺伝子組み換えゼラチンの等電点が少なくとも5である、[1]〜[5]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[7]上記遺伝子組み換えゼラチンがヒドロキシプロリンを含まない、[1]〜[6]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[8]更に(d)第二エマルションから凝固したゼラチンを除去する工程を含む、[1]〜[7]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[9]上記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも3個のRGDモチーフを含む、[1]〜[8]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[10]上記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも二個のリシン残基を含み、二個のリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのN末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのC末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも25%離れている、[1]〜[9]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[11]上記工程(b)で上記非水溶性液体の体積が、上記第一エマルションの体積より大きい、[1]〜[10]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[12]上記工程(c)で、0.1〜20℃/分で冷却を行う、[1]〜[11]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[13]上記第一エマルションが少なくとも1〜15重量%の遺伝子組み換えゼラチンを含む、[1]〜[12]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[14]上記工程(a)で使用される組成物が、1〜15重量%の遺伝子組み換えゼラチン、10〜70重量%の水、20〜90重量%の非水溶性液体、および0.5〜20重量%の乳化剤、を含む、[1]〜[13]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[15]更に、上記工程(b)中、および/または、工程(b)の後に、ゼラチンを架橋する工程を含む、[1]〜[14]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[16]更に、上記工程(b)の後に、ゼラチンの脱水熱架橋を行う工程を含む、[1]〜[15]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
[17] [1]〜[16]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法により得られる、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[18]少なくとも5μmの平均径を有する表面孔を有し、少なくとも50体積%の平均空隙率を有する、[17]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[19]平均粒子径が20〜800μmである、[17]または[18]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[20]平均密度が、0.04〜0.5g/cm3である、[17]〜[19]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[21]平均体積が、2〜25cm3/gである、[17]〜[20]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[22] [1]〜[16]のうちいずれかに記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法により得られる、[18]〜[21]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[23]平均粒子径が20〜800μmであり、少なくとも80%のマイクロキャリアが平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有する、[17]に記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリア。
[24] [17]〜[23]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
[25] [17]〜[23]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの組織損傷修復のための足場としての使用。
[26] [17]〜[23]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアと細胞とを含み、上記細胞が上記マイクロキャリアの表面および/または内部に存在する複合材料。
[27] 薬理学上許容できるキャリアと、[17]〜[23]のうちいずれかに記載の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアまたは[26]に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
[28]80〜4000μmの内部口径を有するシリンジを通じて注入できる、[27]に記載の注入用組成物。
[30]少なくとも5μmの平均径を有する表面孔を有する[29]に記載のマイクロキャリア。
[31]少なくとも50体積%の平均空隙率を有する、[29]または[30]に記載のマイクロキャリア。
[32]上記空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲にある、[29]〜[31]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[33]平均粒子径が20〜800μmである、[29]〜[32]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[34]平均密度が、0.04〜0.5g/cm3である、[29]〜[33]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[35]平均体積が、2〜25cm3/gである、[29]〜[34]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[36]平均粒子径が20〜800μmであり、少なくとも80%のマイクロキャリアが、平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有する、[29]〜[35]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[37]少なくとも5μmの平均径を有する表面孔、少なくとも50体積%の平均空隙率、および、20〜800μmの平均粒子径を有し、少なく半分以上の空隙が球状であり、少なくとも80%のマイクロキャリアが平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有し、空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲である、[29]に記載のマイクロキャリア。
[38]少なくとも5μmの平均径を有する表面孔、少なくとも50体積%の平均空隙率、および、20〜800μmの平均粒子径を有し、少なく半分以上の空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有し、少なくとも80%のマイクロキャリアが平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有し、空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲である、[29]に記載のマイクロキャリア。
[39]少なくとも75%の空隙が球状である、[37]または[38]に記載のマイクロキャリア。
[40]上記ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、[29]〜[39]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[41]上記ゼラチンが、等電点が少なくとも5である遺伝子組み換えゼラチンである、[29]〜[40]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[42]上記ゼラチンが、ヒドロキシプロリンを含まない遺伝子組み換えゼラチンである、[29]〜[41]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[43]上記ゼラチンが、少なくとも3つのRGDモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、[29]〜[42]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[44]上記ゼラチンが、少なくとも二つのリシン残基を含み、二つのリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのN末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのC末端に最も近いリシン残基であり、上記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも25%離れている、遺伝子組み換えゼラチンである、[29]〜[43]のうちいずれかに記載のマイクロキャリア。
[45] [29]〜[44]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
[46] [29]〜[44]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアの組織損傷修復のための足場としての使用。
[47] [29]〜[44]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアと細胞とを含み、上記細胞が上記マイクロキャリアの表面および/または内部に存在する複合材料。
[48] 薬理学上許容できるキャリアと、[29]〜[44]のうちいずれかに記載のマイクロキャリアまたは[47]に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
[49]80〜4000μmの内部口径を有するシリンジを通して注入できる、[47]に記載の注入用組成物。
空隙は、空間または空洞と記載することがある。
なお、本発明にかかるゼラチンは、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。
医薬または医療用途の使用のために、天然ヒトコラーゲンのアミノ酸配列と近いまたは同一のアミノ酸配列を有する、遺伝子組み換えゼラチンが好ましい。ゼラチンのアミノ酸配列は、天然ヒトコラーゲンにある繰り返しアミノ酸配列、特に、RGDを増加した遺伝子組み換えゼラチンを作るために、RGDモチーフを含む配列を含むゼラチンであることがより好ましい。選択された配列中のRGDモチーフの割合は、選択された配列の選択された長さに依存し、より短い配列の選択は、必然的に、最終的な遺伝子組み換えゼラチンのより高いRGDモチーフの割合をもたらす。選択されたアミノ酸配列の繰り返しの使用は、天然ゼラチンより高い分子量を有する遺伝子組み換えゼラチンを提供するために使用することができる。更に、天然ゼラチンと比較して、非抗原性であり、RGDを増加した遺伝子組み換えゼラチンを得ることができる。
更に他の実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンは、天然ゼラチンより低いグリコシル化、例えば、2重量%未満、好ましくは1重量%未満、より好ましくは0.5重量%未満、更に好ましくは0.2重量%未満、更に好ましくは0.1重量%未満のグリコシル化を有する。好ましい実施形態としては、遺伝子組み換えゼラチンがグリコシル化を有さないものである。グリコシル化の重量%の程度は、ゼラチンのユニット重量毎に総糖質(carbohydrate)重量を意味し、例えば、MALDI-TOF-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization mass spectrometry)またはデュボア(Dubois)による滴定法により、決定される。用語「グリコシル化」は、単糖だけでなく、多糖、例えば、ジ−、トリ−およびテトラ−サッカリドも意味する。
他の実施態様として、遺伝子組み換えゼラチンが、少なくとも5、例えば、5〜11の等電点を有し、より好ましくは6以上、更に好ましくは7以上の等電点を有する。この目的は、生理学の条件のとき、正味の正電荷をもった遺伝子組み換えゼラチンを提供することである。理論に捉われることなく、この正電荷は、しばしば、全体として負に電荷された膜を有する細胞の引き付ける力、相互作用および結合を助けると考えられる。
工程(b)で使用する、非水溶性液体は、工程(a)で使用する、非水溶性液体と同じでも異なっていてもよい。工程(a)では、非水溶性液体に対する水の体積比は、1:1より少なく、特に1:2より少ないことが好ましく、工程(b)では、非水溶性液体に対する水の体積比は、2:1より少なく、特に1:1より少ないことが好ましい。
他の実施態様としては、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン1グラムあたり0.5〜5.0mmolの架橋剤とを接触させることを含む工程により、ゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチンを架橋する。例えば、本発明にかかるゼラチンまたは遺伝子組み換えゼラチン1グラムあたり、約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0および5.0mmolの架橋剤を使用することができる。
架橋の程度は、ゼラチンマイクロキャリアが体内で分解する時間に影響を与える。そのため、意図した用途のためのマイクロキャリアの分解の割合をコントロールすることができる。これの一例は、細胞を伴わない本発明のマイクロキャリアが皺の部位で注入されるときの形成外科である。マイクロキャリア周辺の細胞は、マイクロキャリアに移動し、コロニーを作る。徐々にマイクロキャリアが周辺の酵素(例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ)により分解されていき、移動した細胞は、皺の部位を占領する。これは皺が伸ばされることになる。
工程(a)で使用される組成物(および得られる第一得エマルション)は、1〜15重量%、より好ましくは1.5〜10重量%、特に好ましくは3〜5重量%の遺伝子組み換えゼラチンを含み、10〜70重量%、より好ましくは20〜50重量%、特に好ましくは30〜40重量%の水を含み、20〜90重量%、より好ましくは40〜80重量%、特に好ましくは50〜70重量%の非水溶性液体を含み、0.5〜20重量%、より好ましくは1〜10重量%、特に好ましくは2〜6重量%の乳化剤を含むことが好ましい。
工程(a)および工程(b)で行われる混合は、いかなる適切な方法で行ってもよく、例えば、振とうまたは攪拌により行うことができる。攪拌により混合を行うことが好ましく、特に、溶解機タイプの攪拌を用いるときに、20〜5000rpm(revolutions per minute)、より好ましくは200〜1000rpm、特に好ましくは250〜600rpmの速度で攪拌することが好ましい。工程(a)での混合スピードは、工程(b)での混合スピードと同じであっても異なっていてもよい。
第二エマルションは、1〜85重量%、より好ましくは10〜65重量%、特に好ましくは25〜50重量%の第一エマルションを含み、15〜99重量%、より好ましくは35〜90重量、特に好ましくは50〜75重量%の上記非水溶性液体(即ち、工程(a)からの第一エマルションで既に存在する非水溶性液体に加える、工程(b)でのはじめて含む非水溶性液体)を含むことが好ましい。工程(b)で第一エマルションと混合する非水溶性液体は、好ましくは0〜0.1重量%、より好ましくは0重量%のHLBが8未満の乳化剤を含むことが好ましい。工程(b)で第一エマルションと混合する非水溶性液体は乳化剤を含まないことが好ましい。
工程(b)はゼラチンのゲル化温度より、1〜80℃、好ましくは、3〜70℃、特に好ましくは5〜60℃高い温度で行うことが好ましい。
ゼラチンに依存するが、工程(b)は10〜100℃、例えば、15〜70℃、特に20〜60℃の範囲の温度で通常行われる。
工程(c)で行われる冷却は、受動的でも能動的でもよい。例えば、受動的な冷却は、簡単に第二エマルションをゼラチンが凝固する温度まで自然に冷やすことにより行うことができる。能動的な冷却は、第二エマルションの温度を下げる(例えば、コントロールされた冷却速度で)ための、冷却方法(例えば氷または氷水)を使用することにより、行うことができる。能動的な冷却は、最終的なマイクロキャリアの性質を調整するのに有用である。
しかし、工程(c)は、1分あたり0.1〜20℃、より好ましくは1〜10℃の割合で、第二エマルションを冷やすように行うことが好ましい。これらの冷却速度は、特に有用な特性を有するマイクロキャリアを提供することができる。例えば、第二エマルションが60℃である場合、好ましい冷却速度は、1分あたり1.8℃である。30分後、得られる混合物は最終的に6℃の温度となる。冷却速度は、直線的であっても直線的でなくもよい。
前述のことを考慮し、第一の本発明である方法は、以下の特徴をもつことが好ましい。
(i)工程(a)で使用される組成物が、3〜5重量%の遺伝子組み換えゼラチン、30〜40重量%の水、50〜70重量%の非水溶性液体、および2〜6重量%の乳化剤を含む、
(ii)工程(a)および工程(b)の混合は、それぞれ独立に、250〜600rpmの速度で攪拌されることにより行われる、
(iii)工程(a)で非水溶性液体に対する水の体積:体積割合は、2:3〜1:3の範囲とする、
(iv)工程(a)は30〜60℃の範囲の温度で行うことが好ましい、
(v)工程(b)で使用される組成物が、25〜50重量%の第一エマルション、50〜75重量%の非水溶性液体を含み、非水溶性液体が乳化剤を含まない、
(vi)第二エマルションを1分あたり1〜10℃の割合で冷やすように、工程(c)を行うことが好ましい、および
(vii)本発明の方法は、得られる遺伝子組み換えゼラチンマイクロキャリアを架橋する工程、好ましくは、脱水熱架橋により架橋する工程を任意に更に含む。
(a)少なくとも5μm、例えば、6〜30μm、特に10〜20μmの平均径を有する表面孔。表面孔はマイクロキャリアの粒子径の5%未満の平均径を有することが好ましい。
(b)少なくとも50体積%、例えば、51〜95体積%、特に60〜90体積%の平均空隙率。
(c)20〜800μm、例えば、40〜600μm、特に100〜500μmの平均粒子径。
(d)0.04〜0.50g/cm3、例えば、0.06〜0.25g/cm3、特に0.1〜0.2g/cm3の平均 密度。
(e)2〜25cm3/g、例えば、4〜17cm3/g、特に5〜10cm3/gのタップ体積。
(f)20〜800μmの平均粒子径。少なくとも80%のマイクロキャリアは、平均粒子径の30〜200%の粒子径を有する。
表面孔の平均径は、マイクロコンピューテッドトモグラフィー(CT)画像分析により測定することができる。例えば、Skyscan 1172 MicroCT apparatus(Bruker社製)を使用でき、VGStudio MAX 2.2 softwareを備えたものが好ましい。
マイクロキャリアの平均空隙率は、下記式(1)により定義される。
P=(pvI/V)x100 % 式(1)
ここで、Pは平均空隙率であり、pvIはマイクロキャリア内の平均総空間体積であり、Vはマイクロキャリアの総体積であり、空間体積も含む。
pvIはマイクロCT測定により決定できる(例えば、Skyscan 1172 MicroCT apparatus(Bruker社製)を使用でき、VGStudio MAX 2.2 softwareを備えたものが好ましい。)。
Vはマクロキャリアの体積を測定すること(例えば、マイクロキャリアの、マイクロCT測定画像の分析により決定した大きさを使用することにより)、および、数学的な平均体積を計算することにより、算出できる。
空隙を含むマイクロキャリアを作るために使用されるゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンであることが好ましく、他の本発明に関して、ここに記載されている遺伝子組み換えゼラチンが特に好ましい。
第四の本発明によれば、ゼラチン多孔質マイクロキャリアおよび細胞を含み、細胞はマイクロキャリアの表面および/または内部に存在する、複合材料を提供し、そのマイクロキャリアは、本発明のゼラチン多孔質マイクロキャリアまたは本発明の遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアである。
栄養素は、成長させる細胞により通常選択され、多くの栄養素の混合物および培地を市販で入手できる。例えば、DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium)、BME(basal medium eagle)、DMEM/F12培地、Ham's F-10およびF-12培地、medium 199、MEM、Ames' media、BGJb medium (Fitton-Jackson Modification)、 Click's medium、CMRL-1066 medium、Fischer's medium、GMEM(Glascow Minimum Essential Medium)、IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、L-15 Medium (Leibovitz)、McCoy's 5A Modified Medium、NCTC Medium、Swim's S-77 Medium、Waymouth Medium、William's Medium EおよびRPMI 1640 Mediaを使用することができる。
組成物は、80〜4000μmの内部口径を有するシリンジを通して注入できることが好ましい。好適な薬理学上許容できるキャリアには、液体、例えば、水、エタノールならびに水および/またはエタノールを含む混合物を含む。薬理学上許容できるキャリアは無菌であることが好ましく、任意に防腐剤を含めることができる。
以下の略称を使用する。
「RG1」は、10重量%溶液、pH5.4の、RGDを増加した遺伝子組み換えゼラチン溶液(MWT:51.2 kDa)を意味する。ヒトCOLlAl-Iゼラチンのアミノ酸配列の部分をエンコードし、核酸配列を変更した核酸配列を基にゼラチンを調整した。EP-A-0926543、EP- A-1014176およびWO01/34646に記載されている方法を使用した。このゼラチンはヒドロキシプロリンを含まず、配列番号1に記載されている、以下のアミノ酸配列からなる。
配列番号1のアミノ酸配列:
GAPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPGAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPPG;
配列番号1は、571個のアミノ酸長であり、12個のRGDモチーフを含む。
「RG2」は10重量%の代わりに4重量%のゼラチンを含むことを除き、「RG1」と同じである。
「RG3」は10重量%の代わりに15重量%のゼラチンを含むことを除き、「RG1」と同じである。
「Tween(登録商標)80」はポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸モノエステルである。
「PBS」はリン酸緩衝生理食塩水である。
「DAPI」は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(細胞の染色)である。
工程(a)第一エマルションの調整
RG1 (15g)およびTween80(1.0g)の混合物を60℃に加熱し、その温度を15分維持した。非水溶性液体(コーンオイル30cm3)を550rpmで混合物を攪拌しながら、7分かけて添加した。60℃の温度を維持しながら、更に3分間、550rpmで攪拌を続けて、第一エマルションを得た。
工程(b)第二エマルションの調整
350rpmで攪拌しながら3分かけて室温で非水溶性液体(コーンオイル55cm3)に第一エマルションを滴下し加えた。添加完了したとき、20℃で3分間、攪拌を続けて、第二エマルションを得た。
工程(c)第二エマルションの冷却
工程(b)で記載した3分間の後、第二エマルションを350rpmで攪拌を続けながら5分間かけて5.5℃に冷却した。混合物が5.5℃になったとき、更に15分間、この温度で攪拌を続けた。氷浴を使用し、−1〜+1℃の温度に、アセトン(300 ml)を含む容器を冷却した。その後、350rpmで攪拌しながら、第二エマルションを冷却したアセトンに加えた。350rpmで5分攪拌した後、氷浴から容器を取り除き、室温で一時間攪拌を続け、アセトンは、混合物中に形成されたマイクロキャリアを脱水した。マイクロキャリアをろ過し取り除き、水およびコーンオイルがマイクロキャリアから除去されるまで、アセトンで数回洗浄した。その後、60℃で、オーブン中でマイクロキャリアを乾燥させた。
任意の工程(d)架橋
工程(c)から得られたマイクロキャリアを、次にように脱水熱処理することにより架橋した。
乾燥したマイクロキャリアをガラスのバイアルに置き、Binder VD53 vacuum stove中で、96時間、真空下で、145℃の温度に置いた。得られた遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアはMS1と称し、その特性を以下の表1(マイクロキャリアMS1の特性)に記載する。なお、MS1は、少なくとも半分の空隙が球状であり、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有していた。
平均空隙率は上記した式(1)により決定した。
平均粒子径は、マイクロキャリアの体積加重平均径(volume-weighted mean diameter)であり、マルヴァーン・マスターサイザー(Malvern Mastersizer)を使用し算出した。
マイクロキャリアの平均密度は1gのマイクロキャリアの総体積(空隙およびスフェア間の空間を含む)を測定し、1gをマイクロキャリアの総体積で割ることにより、算出し決定した。
マイクロキャリアの平均体積は、1gのマイクロキャリアの体積(空隙およびスフェア間の空間を含む)を測定し決定した。
下記表2に示す変更を除き、実施例1を繰り返した。得られたマイクロキャリアの特性は表3に示す。なお、MS2〜9のマイクロキャリアは、いずれも、少なくとも半分の空隙が球状であり、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有していた。一方、CMS1およびCultispher Gは、いずれも、少なくとも半分の空隙が球状ではなく、少なく半分の上記空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有していなかった。
CMS1またはCultispherGの空隙は球状ではかったため、表中の*は測定できなかった。
試料MS1、CMS1および市販のCultiSpher Gは、走査電子顕微鏡法(SEM)により分析した。得られた写真は図面に示す。MS1は図1a〜1c、比較例CMS1は図2a〜2c、および市販の CultiSpherGは図3a〜3cに示す。
図面は、MS1マイクロキャリアがうまく分離されており、よく区別された、球状の空隙を有する、実質的に球状であることを示している。一方、比較例のマイクロキャリアCMS1では、マイクロキャリアは非球形の形状、大きな表面の穴を有し、一緒に固まりとなり二次構造を与える。図2cは、比較例の方法で得られたマイクロキャリアの断面を示し、空隙が、図1aに示す本発明のマイクロキャリアと比較して、マイクロ粒子の粒子径に対して、より小さいことを示している。更に、図2cで示すマイクロ粒子の空隙は、大きさおよび形状が不規則である。
染色により測定した細胞増殖
上記実施例および比較例で記載された、架橋された、ゼラチン多孔質マイクロキャリアを含む合成物は、以下のように調整した。
それぞれのマイクロキャリア(100 mg)を評価段階でリン酸緩衝食塩水(PBS、10cm3、カルシウムおよびマグネシウムなし)中に置いた。室温で1時間後、PBSを除去することなく、マイクロキャリアをオートクレーブにより、殺菌した。殺菌後、PBSを除去し、新しいPBSを加えた。このサイクルを三回繰り返した。最終的に得られた、殺菌したマイクロキャリアは、使用するまで、4℃で10%FBS(foetal bovine serum)を含むDMEM培地中で保存した。
細胞をT75培養フラスコ中で前培養し、細胞を50〜60%密集させ、活発に増殖したとき、継代させた。細胞をPBS(1 ml/ 5 cm2)でリンスし、10%FBS(foetal bovine serum)を含むDMEM培地を除去した。トリプシン/EDTA溶液を細胞に加え(3-4 ml/75cm2)、6分間37℃でインキュベートさせた。完全培地を加え、トリプシンの量に対して、1:2の割合で使用し、トリプシンを中和させた。得られた単一細胞溶液を室温で5分間、125rpmで遠心分離させた。上澄みをとり、得られた細胞ペレット内の細胞を優しく、10% FBSを含むDMEM培地で再けん濁させた。細胞密度は顕微鏡を用い決定した。
25 mlの無菌のスピナーフラスコ(Wheaton)を純水(10 cm3)で洗浄した。評価段階で乾燥したマイクロスフェア(40mg)をそのスピナーフラスコに加えた。フラスコは細胞培養DMEM/10% FBS培地でエンド体積の8 mlまでいっぱいにした。フラスコは30分間、平衡にするためにインキュベーターに放置した。次に、培養培地に、上記したC2C12細胞(2 cm3に2 x106細胞)を加え、得られた混合物を、5分間、50 rpmで攪拌し、攪拌を止め、40分間、静置する、というサイクルで3時間、攪拌した。このサイクルは4回行った。次に、培養培地(10 cm3)の一部を加え、37℃、5%CO2、80 rpmの条件で、加湿インキュベーター中で7日間、細胞を培養した。毎日、培養培地の50%を取り除き、未使用の培養培地と取り替えた。
細胞培養7日後、得られた合成物(マイクロキャリア+細胞)をDAPIで染色した。二本鎖DNAに結合したとき、DAPIは358 nm(紫外線)の波長で吸収極大を有し、その発光極大は461 nm(青)である。細胞の核が青くハイライトされたスポットとして見ることができた。細胞の核の数をカウントし、これは、架橋されたマイクロキャリアに関連した細胞増殖の程度を示した。細胞培養後のスフェアの断面のSEM分析はマイクロスフェア内の細胞増殖の程度を明らかにした。マイクロキャリアの外表面もわずかに染色された。結果を表4(DAPI染色法により評価された増殖結果)に示す。
「+++」は目視検査により決定した「とても良好な細胞増殖」を意味する。
「++」は目視検査により決定した「良好な細胞増殖」を意味する。
「+」は目視検査により決定した「ほどほどの細胞増殖」を意味する。
表4から分かるように、実施例の細胞増殖は、CMS1およびCultiSpherGの比較例より、優れていた。
Claims (36)
- (a)水、遺伝子組み換えゼラチン、非水溶性液体、および、乳化剤を含む組成物を混合し、第一エマルションを生成する工程、
(b)ゼラチンのゲル化温度より高い温度で、前記第一エマルションと、非水溶性液体とを混合し、第二エマルションを生成する工程、および、
(c)ゼラチンが凝固する温度に第二エマルションを冷却する工程を含み、
前記工程(b)で使用する非水溶性液体が、HLB値が8未満の乳化剤を含有量0.5重量%未満で含む、遺伝子組み換えゼラチン多孔質マイクロキャリアの調整方法。 - 前記工程(b)で使用する非水溶性液体が、HLB値が8未満の乳化剤を含まない、請求項1に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記工程(b)で使用する非水溶性液体が、乳化剤を含まない、請求項1に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記工程(a)で使用する乳化剤のHLB値が9より大きい、請求項1〜3のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記第一エマルションのpHが3〜11の範囲内である、請求項1〜4のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記遺伝子組み換えゼラチンの等電点が少なくとも5である、請求項1〜5のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記遺伝子組み換えゼラチンがヒドロキシプロリンを含まない、請求項1〜6のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 更に(d)第二エマルションから凝固したゼラチンを除去する工程を含む、請求項1〜7のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも3個のRGDモチーフを含む、請求項1〜8のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記遺伝子組み換えゼラチンが少なくとも二個のリシン残基を含み、二個のリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのN末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのC末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも25%離れている、請求項1〜9のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記工程(b)で前記非水溶性液体の体積が、前記第一エマルションの体積より大きい、請求項1〜10のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記工程(c)で、0.1〜20℃/分で冷却を行う、請求項1〜11のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記第一エマルションが少なくとも1〜15重量%の遺伝子組み換えゼラチンを含む、請求項1〜12のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 前記工程(a)で使用される組成物が、
1〜15重量%の遺伝子組み換えゼラチン、
10〜70重量%の水、
20〜90重量%の非水溶性液体、および
0.5〜20重量%の乳化剤、
を含む、請求項1〜13のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。 - 更に、前記工程(b)中、および/または、工程(b)の後に、ゼラチンを架橋する工程を含む、請求項1〜14のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 更に、前記工程(b)の後に、ゼラチンの脱水熱架橋を行う工程を含む、請求項1〜15のうちいずれか一項に記載の多孔質マイクロキャリアの調整方法。
- 空隙を有し、
少なくとも半分の前記空隙が球状、および/または
少なくとも半分の前記空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有する、
ゼラチン多孔質マイクロキャリアであって、
平均粒子径が20〜800μmである、ゼラチン多孔質マイクロキャリア。 - 少なくとも5μmの平均径を有する表面孔を有する請求項17に記載のマイクロキャリア。
- 少なくとも50体積%の平均空隙率を有する、請求項17または18に記載のマイクロキャリア。
- 前記空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲にある、請求項17〜19のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 平均密度が、0.04〜0.5g/cm3である、請求項17〜20のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 平均体積が、2〜25cm3/gである、請求項17〜21のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 平均粒子径が20〜800μmであり、少なくとも80%のマイクロキャリアが、平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有する、請求項17〜22のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 少なくとも5μmの平均径を有する表面孔、
少なくとも50体積%の平均空隙率、および、
20〜800μmの平均粒子径を有し、
少なくとも半分以上の空隙が球状であり、
少なくとも80%のマイクロキャリアが平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有し、
空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲である、
請求項17に記載のマイクロキャリア。 - 少なくとも5μmの平均径を有する表面孔、
少なくとも50体積%の平均空隙率、および、
20〜800μmの平均粒子径を有し、
少なくとも半分以上の空隙が平均空隙直径に対して−30%〜+30%の直径を有し、
少なくとも80%のマイクロキャリアが平均粒子径の30%〜200%の粒子径を有し、
空隙の平均直径が、マイクロキャリアの平均粒子径の5〜25%の範囲である、
請求項17に記載のマイクロキャリア。 - 少なくとも75%の空隙が球状である、請求項24または25に記載のマイクロキャリア。
- 前記ゼラチンが遺伝子組み換えゼラチンである、請求項17〜26のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 前記ゼラチンが、等電点が少なくとも5である遺伝子組み換えゼラチンである、請求項17〜27のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 前記ゼラチンが、ヒドロキシプロリンを含まない遺伝子組み換えゼラチンである、請求項17〜28のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 前記ゼラチンが、少なくとも3つのRGDモチーフを含む遺伝子組み換えゼラチンである、請求項17〜29のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 前記ゼラチンが、少なくとも二つのリシン残基を含み、二つのリシン残基が、端のリシン残基であり、第一の端のリシン残基が、ゼラチンのN末端に最も近いリシン残基であり、第二の端のリシン残基が、ゼラチンのC末端に最も近いリシン残基であり、前記端のリシン残基が、ゼラチン中の総アミノ酸残基数の少なくとも25%離れている、遺伝子組み換えゼラチンである、請求項17〜30のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリア。
- 請求項17〜31のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアのセルキャリアとしての使用。
- 請求項17〜31のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアの、ヒトを除く組織損傷の修復のための足場としての使用。
- 請求項17〜31のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアと細胞とを含み、前記細胞が前記マイクロキャリアの表面および/または内部に存在する複合材料。
- 薬理学上許容できるキャリアと、請求項17〜31のうちいずれか一項に記載のマイクロキャリアまたは請求項34に記載の複合材料と、を含む、注入用組成物。
- 80〜4000μmの内部口径を有するシリンジを通して注入できる、請求項35に記載の注入用組成物。
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