KR102005579B1

KR102005579B1 - 세포배양용 다공성 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102005579B1
Application number: KR1020120130729A
Authority: KR
Inventors: 최성욱; 문승관; 오명진
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-19
Filing date: 2012-11-19
Publication date: 2019-07-30
Also published as: KR20140063964A

Abstract

본 발명은 균일한 크기를 가지며 기공의 크기를 조절할 수 있는 세포배양용 다공성 지지체 및 이러한 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다공성 지지체는 균일한 기공 사이즈, 우수한 상호작용, 개방된 표면 기공을 가져 세포가 안정적으로 배양될 수 있는 지지체의 역할을 하며, 다공성 지지체의 기공 크기와 개수를 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 세포의 생장 환경을 조절할 수 있다. 또한, 개방된 표면 기공은 영양소의 공급, 가스의 확산, 신진대사 폐기물 제거 등을 용이하게 하고, 세포의 분포와 생존력을 강화시켜 세포 배양에 적합한 환경을 제공할 수 있다.

Description

세포배양용 다공성 지지체 및 이의 제조방법{Porous scaffold for cell culture and preparation method thereof}

본 발명은 균일한 크기를 가지며 기공의 크기와 기공도를 조절할 수 있는 세포배양용 다공성 지지체 및 이러한 지지체의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 생명 과학과 공학의 개념을 응용한 복합 학문으로 생체 조직의 구조와 기능 사이의 이해를 바탕으로 인체 조직의 대체품을 만들어 이를 체내에 이식함으로써 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 이러한 조직공학은 사람이나 동물의 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리시킨 후 지지체(스캐폴드)에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체나 동물 내에 이식하는 것을 기본원리로 한다.

조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관 및 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기에 적용되고 있는데, 이러한 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 지지체가 제공되어야 한다. 이상적인 지지체의 기본 요건은 크게 무독성, 기계적 물성 그리고 다공성을 들 수 있다.

무독성은 세포-지지체 복합체를 생체조직 내 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 것을 말하며, 지지체의 기계적 물성은 세포의 성장을 충분히 지지할 수 있는 강도 등을 말하며, 지지체의 다공성은 지지체에 세포의 접착이 잘 일어날 뿐만 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고 또 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조를 말한다. 기본적으로 세포는 2차원적인 배양이 이루어지는데 이를 조직이나 장기의 형태로 배양하기 위해서는 3차원의 지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 수많은 기공을 가지고 있어 세포들이 내 외부에 부착할 수 있어야 하며 세포의 성장에 필요한 양분을 공급받고 노폐물을 배출하기 위해 열린 구조를 가져야 한다. 즉 다공성의 3차원 지지체가 필요한 것이다.

따라서 상기 기본적 요건을 만족하는 지지체로는 동물 체내의 세포외 기질과 유사한 것이 적합하며, 상기 세포외 기질과 같은 다공성을 가진 지지체를 제조하는 방법이 연구되어 왔다. 대표적인 방법으로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.

이러한 지지체는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 지지체 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 지지체는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 지지체를 제조하기 위해 생분해성 고분자 물질을 사용하는 것이 일반적이다.

전술한 다공성 구조를 가지는 생분해성 고분자로 이루어진 지지체에 이식되는 조직세포는 계속적인 성장에 의하여 일련의 조직을 형성하게 되는데, 일반적인 생체조직의 재생은 재생하고자 하는 생체조직 형태로 지지체 모양을 제조한 후, 상기 지지체 내부에 조직세포를 이식하고, 이식된 조직세포를 성장시키는 방법을 이용하고 있다. 그러나 이러한 방법은 영양분 및 산소가 지지체의 내부 안쪽으로 용이하게 전달되지 못하고, 세포조직의 성장이 균일하지 않으며, 설령 지지체의 두께가 매우 얇다 하여도 그 중심부까지 조직세포가 성장하는 것이 어렵다는 문제점 등이 있다.

대한민국 등록특허 10-871652 대한민국 등록특허 10-499096

이에 본 발명자들은 간단한 유체장치를 사용하여 균일한 기공 사이즈, 우수한 상호작용, 개방된 표면 기공을 갖는 다공성 지지체를 성공적으로 개발하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 세포가 잘 자랄 수 있도록 내부에 형성되는 기공의 크기를 조절할 수 있는 세포배양용 다공성 지지체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상술한 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 수용성 생체적합성 고분자 용액을 연속상으로 공급하고, 유기용매를 불연속상으로 공급하여 유기용매 방울을 포함하는 수용성 고분자 방울을 형성하는 단계; (b) 다수의 작은 유기용매 방울을 포함하는 수용성 고분자 방울을 동결시키는 단계; 및 (c) 유기용매를 제거하는 단계;를 포함하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, (c) 단계의 유기용매를 제거하는 단계 이후, 형성된 지지체를 가교시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 수상에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기용매는 물과 섞이지 않는 용매로서, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 수용성 생체적합성 고분자 용액은 4 ~ 100℃에서 지속적으로 가열하면서 공급하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 불연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min로 일정하게 유지하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계의 유기용매 제거는 0℃이하에서 탄소수 1 내지 4의 알코올에 담가서 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교는 가교제로서 제니핀(genipin), 포름알데히드 (formaldehyde), 글루타알데히드(glutaraldehyde), N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드 (EDC)와 N-하이드록시석신이미드 (NHS), 염화칼슘(CaCl₂) 또는 트리폴리포스페이트(tripolyphosphate)를 사용하여 반응시켜 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가교 단계 이후, 반응하지 않고 남은 가교제를 세척하는 단계 및 형성된 다공성 지지체를 건조하는 단계를 추가로 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 방법으로 제조된 세포배양용 다공성 지지체를 제공한다.

나아가 본 발명은, (a) 합성고분자 용액을 연속상으로 공급하고, 수용성 생체적합성 고분자 용액을 불연속상으로 공급하여 물방울을 포함하는 합성고분자 방울을 형성하는 단계; (b) 다수의 작은 물방울을 포함하는 합성고분자 방울을 동결시키는 단계; 및 (c) 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 합성고분자는 유기용매에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethyl methacrylate), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 다공성 지지체는 균일한 기공 사이즈, 우수한 상호작용, 개방된 표면 기공을 가져 세포가 안정적으로 배양될 수 있는 지지체의 역할을 하며, 다공성 지지체 내의 기공 크기(pore size)와 개수(기공도, porosity)를 자유롭게 조절할 수 있기 때문에 세포의 생장 환경을 조절할 수 있다. 또한, 개방된 표면 기공은 영양소의 공급, 가스의 확산, 신진대사 폐기물 제거 등을 용이하게 하고, 세포의 분포와 생존력을 강화시켜 세포 배양에 적합한 환경을 제공할 수 있으며, 세포 독성이 없어 생체에 적용하는데 문제가 없다.

도 1A는 본 발명의 일실시예에 따른 균일한 기공 사이즈를 갖는 다공성 지지체를 제조하는데 사용한 유체 장치의 개략도이며, 도 1B는 불연속 및 연속상의 유량이 각각 0.2 및 0.12 mL/min일 때, 유리 모세관 끝에서 다수의 톨루엔 방울을 포함하는 젤라틴 방울의 형성을 나타내는 time-lapse 광학 현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체의 SEM(Scanning Electronic Microscope)사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 불연속상의 유량이 0.2 mL/min일 때 연속상의 유량 변화에 따른 내부 톨루엔 방울의 직경과 개수를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 불연속상의 유량이 0.2 mL/min일 때 연속상의 유량 변화에 따른 다공성 젤라틴 지지체의 직경을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 불연속상의 유량이 0.2 mL/min일 때 연속상의 서로 다른 유량에서 제조된 다공성 젤라틴 지지체의 SEM 사진이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 젤라틴 지지체의 내부 기공을 확인하기 위하여 젤라틴 지지체를 얇게 절단한 박편의 광학 현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 다공성 젤라틴 지지체의 세포배양 효과를 확인하기 위해, 섬유아세포를 젤라틴 지지체 상에 분주하고 LIVE/DEAD염색 후 형광현미경을 사용하여 젤라틴 지지체 상의 세포를 관찰한 형광이미지이다.

본 발명은 균일한 크기를 가지며 기공의 크기를 조절할 수 있는 세포배양용 다공성 지지체 및 이러한 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 간단한 유체장치를 사용하여 균일한 기공 사이즈, 우수한 상호작용, 개방된 표면 기공을 갖으며, 기공의 크기를 자유롭게 조절할 수 있는 다공성 지지체를 제조하였다는 점에 특징이 있다.

따라서, 본 발명에서는 3차원 세포 배양을 위해 중요한 다공성 지지체에서 균일한 기공 구조를 제조할 수 있는 신규한 방법을 제시하였으며, 이러한 방법으로 제조한 균일한 크기를 갖는 다공성 지지체를 제공한다. 본 발명에서는 수중 유적형(oil-inwater emulsion)을 기본으로 하는 간단한 유체 장치를 이용하여 균일한 기공 사이즈를 갖는 단분산(monodisperse) 다공성 지지체를 제조하는 방법을 제공한다. 기공의 개수, 사이즈 및 기공의 개방성은 각 단계에서 유량을 변경함으로써 쉽게 조절할 수 있다. 또한, 본 발명에서는 섬유아세포의 배지에서 균일한 기공 사이즈를 갖는 다공성 지지체가 세포배양에 적용될 수 있음을 평가하였다.

“조직공학”은 일반적으로 이식에 적합한 지지체 상에 또는 내에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것으로서 정의된다. 일반적으로, 대부분의 조직들은 계층적인 여러 가지 세포로 구성되어있으며, 분리시켰을 때 많은 세포들이 작은 규모에서 본래의 형태를 다시 형성할 수 있지만 그 세포들은 큰 형태를 이루기 위해 보조 지지체를 필요로 한다. 이러한 보조 지지체는 생체 내에서나 외에서나 세포를 모아 점착시킬 수 있어야하고 조직으로 발전시키기 위한 잠재적 장소가 되어야하며 점착된 세포들과 주변의 숙주 세포들이 새로운 조직을 형성할 수 있도록 해주어야 하는 특성을 충분히 발휘할 수 있어야 한다.

“지지체”는 스캐폴드(Scaffold)라고도 하며, 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 지지체는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 그 이유는 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어져야 함은 물론 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 지지체의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 유일한 방법이기 때문이다.

인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할도 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 충분히 조직으로서 본연의 기능과 역할을 수행하게 되면 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다.

이상적인 생체적합성 지지체의 속성에는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체 내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력, 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력이 포함되어야 한다. 또한, 뼈 조직 공학을 위한 지지체는 세포 부착, 증식, 조직 성장 및 적절한 영양분 공급을 수행할 수 있는 생물학적 환경을 조성하기 위해 높은 다공성과 상호 연결된 기공 구조가 필수적이다.

이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생체적합성 고분자를 들 수 있다. 생체적합성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있는 능력이 있고, 생체 내에서나 생체 외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공해주기에 세포증식 및 세포분화를 위한 합성 세포외 기질로 사용하기에 좋은 물질이다.

본 발명에 있어서 상기 “생체적합성”은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 의미하며, “생체적합성 고분자”란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.

상기 생체적합성 고분자는 일정 기간 후 체내에서 자발적으로 분해되는 것으로, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않아야 한다.

본 발명에서 이러한 생체적합성 고분자로는 체내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 제한없이 사용할 수 있는데, 예를 들어 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 생체적합성 고분자 중에서도 젤라틴이 본 발명의 기술을 적용하는데 바람직하다.

또한, 상기 생체적합성 고분자는 중량평균 분자량이 5,000 내지 2,000,000, 보다 바람직하게는 70,000 내지 90,000 범위인 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는 지지체의 내부에 기공을 형성하기 위한 기공유도물질(porogen)로 유기용매를 사용한다. 유기용매는 수성 생체적합성 고분자 용액 내 유기용매 방울의 유화안정성(emulsion stability)을 가지고 있는 물질이어야 하며, 수성 생체적합성 고분자상에서 응집되지 않고 큰 생체적합성 고분자 방울 내에 완전히 포집되어야 한다. 이러한 유기용매로는 물과 섞이지 않는 용매로서 예를 들어, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 클로로포름(chloroform)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법은 (a) 수용성 생체적합성 고분자 용액을 연속상으로 공급하고, 유기용매를 불연속상으로 공급하여 유기용매 방울을 포함하는 수용성 고분자 방울을 형성하는 단계; (b) 다수의 작은 유기용매 방울을 포함하는 고분자 방울을 동결시키는 단계; 및 (c) 유기용매를 제거하는 단계를 포함할 수 있으며, 추가로 상기 (c) 단계 후, 형성된 지지체를 가교시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제조방법의 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

우선, 수용성 생체적합성 고분자 용액과 유기용매를 각기 다른 경로를 통해 공급한다. 이때, 수용성 생체적합성 고분자 용액을 공급하는 통로 내부에 유기용매를 공급하는 통로가 위치하여 생체적합성 고분자 방울 내부에 유기용매 방울이 포함되어 형성될 수 있도록 장치를 구성하는 것이 바람직하다(도 1 참조). 상기 수용성 생체적합성 고분자 용액은 4 ~ 100℃에서 지속적으로 가열하면서 공급하는 것이 좋다.

본 발명에서는 다수의 작은 유기용매 방울은 유리 모세관의 끝의 수성 생체적합성 고분자상에서 응집되지 않고 큰 생체적합성 고분자 방울 내에 완전히 포집된다.

또한, 유기용매가 차지하는 공간이 정확히 유기용매의 제거 후 나타나는 지지체의 기공이 되기 때문에 수성 생체적합성 고분자 용액 내 유기용매 방울의 유화안정성(emulsion stability)은 필수적이다. 또한, 유기용매 방울이 결과적으로 다공성 생체적합성 고분자 지지체 사이의 상호 연결성을 보장하기 위해 주변의 방울들과 긴밀하게 접촉해 있는 것이 중요하다.

본 발명에서는 용액 공급관의 크기를 조절함으로써 지지체의 직경과 기공 사이즈를 조절할 수 있으며, 유량을 조절함으로써 기공 사이즈 및 기공 개수를 조절할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 수용성 생체적합성 고분자 용액은 연속상(continuous phase)으로 공급하고, 유기용매를 불연속상(discontinuous phase)으로 공급하여 유기용매 방울을 포함하는 생체적합성 고분자 방울을 형성할 수 있다. 연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min 범위에서 목표로 하는 기공 사이즈 및 기공 개수에 맞춰서 조절하고, 불연속상의 유량은 0.001 ~ 30mL/min로 일정하게 유지한다.

다음으로, 형성된 수많은 작은 유기용매 방울을 포함하는 생체적합성 고분자 방울을 동결시킨다. 동결은 액화질소(collection phase)를 이용하여 진행할 수 있으며, 이외에 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 동결방법은 모두 적용할 수 있다.

다음으로, 동결된 생체적합성 고분자 방울에서 유기용매를 제거하는 과정은, 0℃ 이하, 바람직하게는 -10 ~ -30℃에서 사전 냉각된 에탄올에 담가서 생체적합성 고분자 방울 내부에 존재하는 유기용매를 제거한다. 이후 동결건조 과정을 더 진행할 수 있다.

마지막으로, 형성된 생체적합성 고분자 지지체를 가교시킨다. 생체적합성 고분자 지지체의 가교는 제니핀(genipin) 등과 같은 천연가교제 또는 포름알데히드(formaldehyde), 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 디알데히드 전분(dialdehyde starch), 에폭시 화합물(epoxy compound), 글루타르알데히드 글리옥살, 글리옥살, 2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논, 트리폴리포스페이트 나트륨염, 디아세트알데히드 PEG, 스클레르알데히드(scleraldehyde), 디에틸스쿠아레이트, 에피클로로히드린 등의 합성 가교제를 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 가교제들 중에서도 천연가교제인 제니핀(genipin)이 안전성, 생체적합성, 가교 입자의 생체 내에서의 보다 느린 분해 속도 등의 측면에서 다른 가교제들보다 바람직하다.

본 발명의 제조방법은 반응하지 않고 남은 가교제를 세척하는 단계 및 형성된 다공성 생체적합성 고분자 지지체를 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

나아가 본 발명은, 세포배양용 다공성 지지체의 제조를 위해 다음과 같은 방법도 제공할 수 있다.

즉, (a) 합성고분자 용액을 연속상으로 공급하고, 수용성 생체적합성 고분자 용액을 불연속상으로 공급하여 물방울을 포함하는 합성고분자 방울을 형성하는 단계; (b) 다수의 작은 물방울을 포함하는 합성고분자 방울을 동결시키는 단계; 및 (c) 유기용매를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

이때 상기 합성고분자는 앞서 기술한 바와 같이, 유기용매에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethyl methacrylate), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 유기용매는 물과 섞이지 않는 용매로서, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료

톨루엔(J.T.Baker)은 불연속상(discontinuous phase)으로 사용하고, 젤라틴(Type A, from porcine skin, Sigma-Aldrich)은 연속상(continuous phase)으로 사용하였다. 제니핀(Genipin)(Sigma-Aldrich)은 젤라틴의 가교제(crosslinking agent)로 사용하였다. 유리 모세관 튜브 및 Tygon튜브는 각각 Ace Glass와 Saint-Gobain Corporation으로부터 구입하여 사용하였다.

다공성 젤라틴 지지체의 제조 및 특성

유체 장치는 Tygon 튜브(1/32 in. i.d.× 3/32 in. o.d.), 유리 모세관(0.5 mm i.d.× 0.9 mm o.d.) 및 30G 바늘(needle)로 이루어진다. 바늘과 유리 모세관을 Tygontube 안으로 넣어 두 개의 흐름 채널을 제조하였으며, 에폭시 접착제로 고정하였다. 수용성 젤라틴 용액(7 wt%)은 연속상으로 유체 장치에 투입되고, 디지털 온도 조절기(HTC210K, LK Labkorea Inc., Korea)를 사용하여 55℃에서 지속적으로 가열하였다. 그리고 톨루엔은 불연속상으로 투입하였다. 불연속상 및 연속상은 미리 정해진 유량으로 시린지 펌프(NE-1000, New Era Pump Systems Inc., USA)를 사용하여 유체 장치 안으로 투입하였다. 연속상의 유량은 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.20, 및 0.24 mL/min으로 변화시켰고, 불연속상은 0.2mL/min으로 일정하게 유지하였다. 수많은 작은 톨루엔 방울을 포함하는 젤라틴 방울을 동결시키기 위해 액화질소(collection phase)로 떨어뜨렸다. 동결된 젤라틴 방울은 냉장고(-20℃) 내 필터 페이퍼 상에 1시간 동안 놔두고, 톨루엔을 제거하기 위해 -20℃에서 사전 냉각된 에탄올에 하루 동안 담가둔 후, 동결건조시켰다. 제조된 다공성 지지체는 orbital shaker 상에서 24시간 동안 제니핀(1 w/v%)으로 에탄올에서 가교결합시켰다. 가교결합된 다공성 지지체는 색이 흰색에서 다크블루로 변화하였다.

수용성 젤라틴 용액 내에 있는 톨루엔 방울의 갯수를 확인하기 위하여, 수많은 작은 톨루엔 방울을 포함하는 젤라틴 방울(with Oil Red O)을 연속상의 서로 다른 유량에서 슬라이드 글라스 상에 조심스럽게 모으고, 휴대용 디지털 현미경(AM-413ZT, AnMo Electronics Corp, Taiwan)으로 강도를 측정하였다(n=50). 똑같은 방법으로 수용성 젤라틴 용액 내에 존재하는 톨루엔 방울의 사이즈를 확인하기 위해 광학 현미경 사진(IX71, Olympus, Japan)에서 강도를 측정하였다(n=100). 톨루엔 방울의 평균 직경은 이미지 처리 소프트웨어(ImageJ, National Institute of Health, USA)를 사용하여 광학 현미경 사진으로부터 산출하였다. SEM(S-4800, Hitachi, Japan)은 젤라틴 다공성 지지체의 형상을 관찰하기 위해 사용하였다. 평균 직경 및 표면 기공의 갯수는 ImageJ software를 사용하여 SEM 사진(n=25)으로부터 얻었으며, 지지체에서 표면 기공의 갯수는 SEM에서 관찰된 표면 기공 갯수를 duplicating하여 얻었다. CV값은 CV=starndard deviation/average diameter × 100으로 정의한다. 다공성 지지체는 파라핀에 12시간 동안 담그고, 70℃에서 3시간 동안 대류식 오븐(convection oven)에서 녹였다. 이후 지지체와 파라핀은 냉각된 몰드에서 완전히 굳혔다. 파라핀 큐브는 50㎛로 자르고, 슬라이드 글라스 상에 놔두고 광학 현미경으로 관찰하였다. Automatic Rotary Microtome (Leica RM2245, Leica, Germany)는 파라핀을 절편화하여 젤라틴 지지체의 내부 기공을 확인하기 위해 사용하였다.

세포배양

NIH-3T3 섬유아세포(KCLB, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 젤라틴 다공성 지지체에서 세포 성장을 확인하기 위해 사용하였다. 세포 접종(seeding) 전에, 다공성 지지체는 70% 에탄올에 밤새 담궈 살균한 후, PBS로 5회 세척하였다. 세포 접종을 위해, 1× 10⁵cells를 배지 50mL에서 100 다공성 지지체와 함께 24시간 동안 50rpm으로 약하게 교반하면서 배양하였다. 24시간 후에 다공성 지지체와 세포는 PBS로 3회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거한 후, 24웰 플레이트에 한 웰당 3개의 다공성 지지체를 옮겼다. 배지는 10% FBS (Invitrogen Corp. Grand Island, NY) 및 1% 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신 함유, Invitrogen)를 포함하는 DMEM (Invitrogen Corp. Grand Island, NY)을 사용하였다. 배양은 37℃에서 5% CO2를 포함하는 대기 조건에서 진행하였으며, 배지는 매일 교체하였다. 세포는 서로 다른 지점에서 형광현미경으로 관찰하였다. 관찰하기 전에, 세포는 포유류의 세포(Invitrogen)에 대해 LIVE/DEADViability/Cytotoxicity Kit를 사용하여 calcein AM 및 ethidium homodimer-1로 염색하였다.

< 실시예 1>

다공성 젤라틴 지지체의 제조

본 발명에서는 균일한 기공 사이즈를 갖는 단분산 젤라틴 지지체를 제조하기 위해 도 1과 같은 유체 장치를 사용하였다.

톨루엔과 수용성 젤라틴 용액을 각각 불연속상 및 연속상으로 공급하였는데, 미리 정해진 유량으로 두 개의 시린지 펌프를 사용하여 유체 장치로 지속적으로 공급하였다. 수성 젤라틴 용액(oil-in-water emulsion)에서 균일한 톨루엔 방울은 모세관 유리를 따라 흘러 바늘의 끝에서 생성되고, 유리 모세관 끝에서 많은 톨루엔 방울을 포함하는 젤라틴 방울이 형성된다.

젤라틴 방울은 시간이 지남에 따라 크기가 커지고, 중력에 의해 모세관 유리 끝으로부터 액체질소(LN₂, -196℃)로 떨어진다. 냉각된 젤라틴 방울은 많은 구형의 톨루엔 방울을 포함하고 있다. 이와 같이 냉각된 젤라틴 방울은 냉장고(-20℃) 내의 필터 페이퍼 상에 놔두었다. -20℃에서 수용성 젤라틴 용액은 얼음과 같이 고체 상태로 유지되며, 반면에 톨루엔(용해점 -93℃)은 액체상으로 변화한다. 그러므로 수용성 젤라틴 용액이 고체 상태이기 때문에 전반적으로 구형 형태를 유지하면서 대부분의 톨루엔은 필터 페이퍼에 흡수된다. 마지막으로, 균일한 기공 구조를 갖는 다공성 젤라틴 지지체는 사전 냉각된 에탄올(-20℃)로 세척하고, 동결 건조 후 제니핀(genipin)을 사용하여 상호 연결시켜 얻었다.

본 발명에 따른 다공성 젤라틴 지지체가 형성되는 과정을 확인하기 위하여, time-lapse 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 1(B)에 나타낸 바와 같이, 불연속상의 유량이 0.2 mL/min, 연속상의 유량이 0.12 mL/min일 때 유리 모세관 끝에서 다수의 톨루엔 방울을 포함하는 젤라틴 방울이 형성되는 것을 확인하였다. 다수의 작은 톨루엔 방울은 유리 모세관의 끝의 수성 젤라틴 단계에서 응집되지 않고 큰 젤라틴 방울 내에 완전히 포집되는 것으로 확인하였다. 젤라틴 방울의 직경은 톨루엔 방울의 수가 증가함에 따라 시간이 지날수록 증가하고, 젤라틴 방울은 유리 모세관 끝으로부터 47초마다 떨어진다.

< 실시예 2>

유량 변화에 따른 다공성 지지체의 특성

연속상의 유량에 따른 변화를 확인하기 위해, 불연속상의 유량은 0.2 mL/min로 고정시키고, 연속상의 유량은 다공성 지지체의 기공 사이즈와 개수를 조절하기 위해 0.04 ~ 0.24 mL/min로 변화시켜 실험하였다.

슬라이드 글라스 상에 젤라틴 방울을 수집하여 얻은 연속상의 서로 다른 유량에서 톨루엔 방울을 광학 현미경으로 관찰하였다. 이때, 시각화를 위한 염료로 오일 레드 O를 톨루엔 상에 첨가하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 톨루엔 방울은 대부분 구형이고 균일한 것으로 나타났다.

또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 연속상의 유량이 0.04 에서 0.24 mL/min로 증가함에 따라, 톨루엔 방울의 사이즈는 871.3 ± 6.6 에서 605.1 ± 5.7㎛로 감소한 반면, 톨루엔 방울의 수는 25.1 ± 1.9 에서 51.1 ± 2.6로 증가하였다. 이는 needle의 끝부분에서 톨루엔 방울에 높은 전단 응력(shear stress)이 작용하기 때문이다.

또한, 연속상의 유량에 따른 다공성 젤라틴 지지체의 직경을 측정한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 다공성 젤라틴 지지체의 전체 직경은 모든 경우에서 3% 보다 적은 분산값 계수와 2.53 ~ 2.59mm 범위인 것으로 측정되었다.

이러한 결과들은 연속상의 유량 변화에 따라 기공의 사이즈와 개수를 쉽게 조절할 수 있음을 나타낸다.

< 실시예 3>

다공성 젤라틴 지지체의 형상 및 내부기공

서로 다른 연속상의 유량 조건에서 제조된 다공성 젤라틴 지지체의 형상을 확인하기 위해 SEM으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 0.04 mL/min의 유량에서 제조된 젤라틴 지지체는 젤라틴의 함량이 너무 낮아 낮은 기계적 강도와 붕괴된 형태를 보여준 반면, 다른 유량 조건에서 제조된 젤라틴 지지체는 구형의 다공성 구조를 갖는 것으로 나타났다.

또한, 다공성 젤라틴 지지체의 내부 기공 존재는 젤라틴 지지체를 얇게 절단한 박편을 광학 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 연속상의 유량이 증가할수록 표면 기공의 평균개수는 15.6 ± 1.1 에서 3.4 ± 1.4로 감소하였으며, 사이즈는 633.5 ± 84.9㎛ 에서 63.4 ± 13.8㎛으로 감소하였다. 이는 도 3에서 관찰되는 결과와 유사한 경향을 나타낸다.

연속상의 유량이 0.20 mL/min 이하일 때 표면에서는 오직 몇몇의 기공이 관찰되고, 이는 연속상 대 불연속상의 높은 부피비에 기인한 것이다. 이러한 경우, 젤라틴 방울에서 톨루엔 방울은 물이 존재하는 tope layer 보다 낮은 밀도(0.867 g/mL, 20 ℃)를 나타내며, 이는 더 적은 다공성 구조 때문이다.

< 실시예 4>

세포 배양 특성

세포 배양을 위한 젤라틴 지지체의 적합성을 평가하기 위해, 섬유아세포를 스피너 플라스크(spinner flask)를 사용하여 젤라틴 지지체 상에 분주하였다. 그리고 LIVE/DEAD염색 후 형광현미경을 사용하여 젤라틴 지지체 상의 세포를 시각화하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 세포의 형광현미경 사진은 젤라틴 지지체에서 높은 세포 생존력을 보여주었다. 첫째날, 세포는 젤라틴 지지체에 부착하였으며, 3일 동안 표면에 부착된 상태를 유지하였다. 10일 후, 세포는 지지체를 통하여 논에 띄게 완전히 퍼지고 확산되었다. 그것은 제조과정에서 톨루엔이 기공유도물질(porogen)로 사용되었다고 하더라도 모든 세포는 젤라틴 지지체를 통하여 확산되고, 세포에서 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.

또한, 젤라틴 지지체의 표면 기공이 배양 10일째에 명확하게 관찰되었으며, 이는 표면 기공이 세포 분화를 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 크고 개방된 기공은 세포의 침투를 용이하게 하고, 영양소/산소, 신진대사 폐기물의 자유 확산을 용이하게 하고, 지지체에서 세포의 분포와 생존력을 강화시킬 수 있음을 의미한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 수용성 생체적합성 고분자가 용해된 용액을 연속상으로 공급하고, 유기용매를 불연속상으로 공급하여 유기용매 방울을 포함하는 수용성 고분자 방울을 형성하는 단계;
(b) 다수의 작은 유기용매 방울을 포함하는 수용성 고분자 방울을 동결시키는 단계; 및
(c) 유기용매를 제거하는 단계;
를 포함하며,
상기 수용성 생체적합성 고분자는 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 이들의 혼합물이고,
상기 유기용매는 톨루엔(toluene), 벤젠(benzene), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인, 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,
(c) 단계의 유기용매를 제거하는 단계 이후, 형성된 지지체를 가교시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 수용성 생체적합성 고분자가 용해된 용액은 4 ~ 100℃에서 지속적으로 가열하면서 공급하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min인 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 불연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min로 일정하게 유지하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (c)단계의 유기용매 제거는 0℃이하에서 탄소수 1 내지 4의 알코올에 담가서 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 가교는 가교제로서 제니핀(genipin), 포름알데히드 (formaldehyde), 글루타알데히드(glutaraldehyde), N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)카르보이미드 (EDC)와 N-하이드록시석신이미드 (NHS), 염화칼슘(CaCl₂) 또는 트리폴리포스페이트(tripolyphosphate)를 사용하여 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제2항에 있어서,
상기 가교 단계 이후, 반응하지 않고 남은 가교제를 세척하는 단계 및 형성된 다공성 지지체를 건조하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포배양용 다공성 지지체의 제조방법.
제1항, 제2항 및 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 세포배양용 다공성 지지체.
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