KR101461327B1 - 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골 결손 재건수술에 사용할 수 있는 골 재생을 위한 미네랄성분의 다공성 지지체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다공성 지지체는 생체 골조직과 유사한 조직공학용 지지체를 형성할 수 있으며 특히, 다공성을 가짐으로써 조직이 잘 자라기 때문에 세포이동을 방지하여 환부에 지지체를 고정하기에 매우 유리하고 이를 이식 시 트리칼슘포스페이트가 생체 조직과 치환되어 골 재생을 유도하여 골 재생을 위한 다공성 지지체로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체 및 이의 제조방법{Porous beads with a large and open pores for tissue engineering and method thereof}

본 발명은 골 결손 재건수술에 사용할 수 있는 골 재생을 위한 미네랄성분의 다공성 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 생명 과학과 공학의 개념을 응용한 복합 학문으로 생체 조직의 구조와 기능 사이의 이해를 바탕으로 인체 조직의 대체품을 만들어 이를 체내에 이식함으로써 인체의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 이러한 조직공학은 사람이나 동물의 조직을 채취하고 그 조직으로부터 세포를 분리시킨 후 지지체(스캐폴드)에 배양하여 세포-지지체 복합체를 제조한 후, 제조된 세포-지지체 복합체를 다시 인체나 동물 내에 이식하는 것을 기본원리로 한다.

조직공학 기술은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관 및 인공근육 등 인체의 거의 모든 장기에 적용되고 있는데, 이러한 생체조직 및 장기의 재생을 최적화하기 위해서는 기본적으로 생체조직과 유사한 지지체가 제공되어야 한다. 이상적인 지지체의 기본 요건은 크게 무독성, 기계적 물성 그리고 다공성을 들 수 있다.

무독성은 세포-지지체 복합체를 생체조직 내 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 것을 말하며, 지지체의 기계적 물성은 세포의 성장을 충분히 지지할 수 있는 강도 등을 말하며, 지지체의 다공성은 지지체에 세포의 접착이 잘 일어날 뿐만 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고 또 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조를 말한다. 기본적으로 세포는 2차원적인 배양이 이루어지는데 이를 조직이나 장기의 형태로 배양하기 위해서는 3차원의 지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 수많은 기공을 가지고 있어 세포들이 내 외부에 부착할 수 있어야 하며 세포의 성장에 필요한 양분을 공급받고 노폐물을 배출하기 위해 열린 구조를 가져야 한다. 즉 다공성의 3차원 지지체가 필요한 것이다.

따라서 이러한 기본적 요건을 만족하는 지지체로는 동물 체내의 세포외 기질과 유사한 것이 적합하며, 상기 세포외 기질과 같은 다공성을 가진 지지체를 제조하는 방법이 연구되어 왔다. 대표적인 방법으로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.

또한, 이러한 지지체는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 지지체 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 지지체는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 지지체를 제조하기 위해 생분해성 고분자 물질을 사용한다.

한편, 골 결손은 교통사고나 골절, 스포츠 손상, 기타 질환으로 인하여 흔하게 일어나며 삶의 질에도 영향을 미친다. 기존의 골 결손된 부분의 재건수술 방법에는 골 이식수술을 시행하는 방법이 있다. 그 중 자가이식수술이 골 재생능력, 면역학적 반응 및 생체 적합성의 측면에서 우수하나 2차 수술이 필요로 하고 수술 공여부가 출혈에 따른 감염이 될 수 있는 문제점이 있을 뿐만 아니라 골채취량이 적어 많은 한계점을 갖는다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 자가 골의 대체재로 우수한 생체 적합성과 생체 친화성을 가지며 골 전도물질 및 골 기질과 같은 골유도 물질인 트리칼슘포스페이트 등이 많은 주목을 받고 있다. 기존에 많은 연구가 진행되었는데 Wolfe는 트리칼슘포스페이트가 생체 내에서 용해되어 생체조직과 치환된다고 보고 하였고, Chow등은 트리칼슘포스페이트의 골전도성에 관하여 연구하였으며 Frankenburg는 칼슘포스페이트 시멘트 등을 연구하였다. 이러한 연구 결과는 분말이 아닌 점도가 있는 재료로서 초기 유동성을 막으며 주입식 방법을 사용하기 때문에 사용하기도 편하고 환부에 모양을 어느 정도 유지시키는 면에서 좋지만 실제 시술 시 강도가 약하며 그 형태가 시간이 지날수록 변형되며 결국 세포이동이 일어나 환부가 아닌 다른 조직으로 이탈하여 다른 문제점을 야기한다.

따라서 다공성을 가짐으로써 조직이 지지체 안쪽까지 잘 침투하여 세포이동이 일어나지 않으면서도 강한 기계적 강도를 가질 수 있는 새로운 조직 재생용 지지체의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 10-2010-0030007

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 본 발명의 목적은 미네랄 성분을 함유하는 골 재생을 위한 다공성 지지체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은, 미네랄 성분을 함유하는 골 재생을 위한 다공성 지지체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미네랄 성분은 제삼인산칼슘(Tricalciumphospate ; TCP) 또는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite ; HAP)일 수 있다.

또한, 본 발명은, (a) 미네랄 성분을 물에 분산시켜 수용성 분산액을 제조하는 단계; (b) 수용성 분산액을 유기용매와 균질기를 사용하여 유화시키는 단계;(c) 유화액을 유체공정과 동결건조를 수행하여 지지체를 제조하는 단계; 및 (d) 지지체를 소성하는 단계를 포함하는, 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 미네랄 성분은 제삼인산칼슘(Tricalciumphospate ; TCP) 또는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite ; HAP)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계의 수용성 분산액을 제조하는 단계는 미네랄 성분 20 중량%와 생체적합성 고분자 10 중량%를 물에 분산시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 수상에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매와 유화시키는 단계는 합성고분자를 3 중량% 함유하는 유기용매를 (a) 단계의 수용성 분산액과 유화시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 합성고분자는 유기용매에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethyl methacrylate), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매는 물과 섞이지 않는 용매로서, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 유화공정은 균질기의 속도를 조절하여 다공성 지지체 내부 기공의 크기를 10 내지 22㎛로 조절 가능할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c) 단계의 유체공정은 (b) 단계의 유화액을 불연속상으로 공급하고, 유기용매를 연속상으로 공급할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 불연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min로 연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 연속상의 유량을 변경하여 다공성 지지체의 표면 기공의 크기를 6 내지 21㎛크기로 조절이 가능할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (d) 단계의 소성은 3시간 동안 25℃에서 1200℃까지 온도를 상승시키고, 다시 3시간 동안 1200℃를 유지시켜 미네랄 성분 외의 고분자를 제거하여 지지체의 기계적 강도를 증가시킬 수 있다.

본 발명은 유화 및 유체공정을 이용하여 골 재생을 위한 미네랄성분의 다공성 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 다공성 지지체는 생체 골조직과 유사한 조직공학용 지지체를 형성할 수 있으며 특히, 다공성을 가짐으로써 조직이 잘 자라기 때문에 세포이동을 방지하여 환부에 지지체를 고정하기에 매우 유리하고 이를 이식 시 트리칼슘포스페이트가 생체 조직과 치환되어 골 재생을 유도하여 골 재생을 위한 다공성 지지체로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 다공성 지지체를 제작 시 유체공정의 모식도와 공정 후 유화한 모습을 광학현미경 사진으로 나타낸 것이다.
도 2는 다공성 지지체의 소성 전후의 크기 변화와 공정 시 연속 상의 변화를 통해 지지체의 크기를 변화할 수 있는 것을 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 다공성 지지체의 형태를 확인하기 위해 SEM 사진으로 나타낸 것이다.
도 4는 다공성 지지체의 공극률을 수은압입법으로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 다공성 지지체의 안쪽과 겉 표면 쪽의 공극률을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 다공성 지지체를 생체 실험을 하여 조직들이 시간이 지날수록 지지체 안쪽까지 잘 침투한지를 헤마토신-에오신 염색법을 통해 나타낸 것이다.

본 발명은 유화 및 유체공정을 이용하여 골 재생을 위한 미네랄성분의 다공성 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 간단한 유체장치를 사용하여 생체 골조직과 유사한 조직공학용 지지체를 형성하고, 세포이동을 방지하여 환부에 지지체를 고정하기에 매우 유리하고, 골 재생을 유도하는 다공성 지지체를 제조하였다는 점에 특징이 있다.

본 발명의 특징은 미네랄 성분인 트리칼슘포스페이트와 하이드록시아파타이트를 이용하여 지지체를 만든 점에 있다. 이 재료들은 생체적합성으로 생체 조직과 비슷한 성질을 갖고 있는 물질로써 이 물질을 적절한 비율로 사용한 지지체를 환부에 사용하면 처음에는 강한 기계적 강도를 갖다가 시간이 지나면 트리칼슘포스페이트가 용해되어 생체 조직과 치환이 되고 하이드록시아파타이트는 지속적으로 강한 기계적 강도를 유지시켜준다. 본 발명의 또다른 특징은 조직이 침투하기 유리한 다공성을 가진 지지체를 제조한 데에 있다. 다공성을 가진 지지체는 안쪽까지 영양분, 산소 그리고 신진대사의 노폐물이 잘 통과할 수 있으므로 조직이 자라는데 좋은 환경을 만들어준다. 따라서 조직이 잘 자라기 때문에 세포이동을 방지하여 환부에 지지체가 고정 될 수 있도록 도와준다. 또한 본 발명의 특징은 기공을 만들기 위해 유화공정을 이용한 데에 있다. 유화 공정은 균질기의 속력에 따라 유화액의 크기가 변화함으로써 지지체의 기공 크기를 조절하게 된다. 골 세포는 5~20마이크로미터이기 때문에 기공의 크기는 10마이크로미터 이상이 되어야 한다. 본 발명은 이에 더 나아가 유화 공정을 추가하여 기공의 크기를 10마이크로미터 이상으로 분포하는 지지체를 제조함으로써 세포이동이 일어나지 않는 지지체를 형성한 것이다.

본 발명에 따른 지지체의 제조방법은 인체에 무해하며 원료의 입수가 용이하고 경제적이며 제조방법이 간단하고 다양한 성장인자 및 약물을 함유하여 제조 할 뿐만 아니라 제조 후 골 세포를 배양하여 이식 할 수 있으므로 효과적인 골 재생을 필요로 하는 모든 분야에 이용될 수 있다.

“조직공학”은 일반적으로 이식에 적합한 지지체 상에 또는 내에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것으로서 정의된다. 일반적으로, 대부분의 조직들은 계층적인 여러 가지 세포로 구성되어있으며, 분리시켰을 때 많은 세포들이 작은 규모에서 본래의 형태를 다시 형성할 수 있지만 그 세포들은 큰 형태를 이루기 위해 보조 지지체를 필요로 한다. 이러한 보조 지지체는 생체 내에서나 외에서나 세포를 모아 점착시킬 수 있어야하고 조직으로 발전시키기 위한 잠재적 장소가 되어야하며 점착된 세포들과 주변의 숙주 세포들이 새로운 조직을 형성할 수 있도록 해주어야 하는 특성을 충분히 발휘할 수 있어야 한다.

“지지체”는 스캐폴드(Scaffold)라고도 하며, 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 지지체는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 그 이유는 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어져야 함은 물론 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 지지체의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 유일한 방법이기 때문이다.

인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할도 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 충분히 조직으로서 본연의 기능과 역할을 수행하게 되면 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다.

이상적인 생체적합성 지지체의 속성에는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체 내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력, 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력이 포함되어야 한다. 또한, 뼈 조직 공학을 위한 지지체는 세포 부착, 증식, 조직 성장 및 적절한 영양분 공급을 수행할 수 있는 생물학적 환경을 조성하기 위해 높은 다공성과 상호 연결된 기공 구조가 필수적이다.

이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생체적합성 고분자를 들 수 있다. 생체적합성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있는 능력이 있고, 생체 내에서나 생체 외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공해주기에 세포증식 및 세포분화를 위한 합성 세포외 기질로 사용하기에 좋은 물질이다.

본 발명에 있어서 상기 “생체적합성”은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 의미하며, “생체적합성 고분자”란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.

상기 생체적합성 고분자는 일정 기간 후 체내에서 자발적으로 분해되는 것으로, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않아야 한다.

본 발명에서 이러한 생체적합성 고분자로는 체내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 제한없이 사용할 수 있는데, 예를 들어 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 생체적합성 고분자 중에서도 젤라틴이 본 발명의 기술을 적용하는데 바람직하다.

또한, 상기 생체적합성 고분자는 중량평균 분자량이 5,000 내지 2,000,000, 보다 바람직하게는 70,000 내지 90,000 범위인 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서는 지지체의 내부에 기공을 형성하기 위한 기공유도물질(porogen)로 유기용매를 사용한다. 유기용매는 수성 생체적합성 고분자 용액 내 유기용매 방울의 유화안정성(emulsion stability)을 가지고 있는 물질이어야 하며, 수성 생체적합성 고분자상에서 응집되지 않고 큰 생체적합성 고분자 방울 내에 완전히 포집되어야 한다. 이러한 유기용매로는 물과 섞이지 않는 용매로서 예를 들어, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 클로로포름(chloroform)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 골 재생을 위한 미네랄성분의 다공성 지지체의 제조방법을 제공할 수 있는데, 다음과 같은 단계를 통해 제조할 수 있다.

첫 번째 단계로서, 미네랄 성분인 트리칼슘포스페이트와 하이드록시아파타이트를 물에 분산 시킨 후 유기용매와 유화시키는 과정을 수행할 수 있는데, 트리칼슘포스페이트 분말(Alfa Aesar, 36731) 20 중량%와 하이드록시아파타이트(HAP) (Aldrich, 289396-100G) 20 중량%, 겔라틴(Gelatin, from porcine skin) (Sigma Aldrich, G6144-500G, Type A) 10 중량%를 물(D.W)에 분산시킨 용액 6 g에 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) (Aldrich, 440752-250G, Mw ~14.000, Mn ~10.000) 3 중량%로 톨루엔(Toluene) (J.T.Baker 9460-03)에 녹인 용액 2g을 지르코니아 볼을 사용한 볼밀과정을 이용해 20,000 rpm으로 1분 유화한다. 일반적으로 지르코니아 볼을 사용한 볼밀과정은 젤라틴을 포함하는 물상에서 미네랄 성분을 분산하기 위해 사용하였다.

지르코니아 볼을 제거한 후 유화액을 60℃로 가열한 후 유체장치에 공급한다. 이때, 유화액을 공급하는 통로 내부에 유기용매를 공급하는 통로가 위치하여 유화액 방울 내부에 유기용매 방울이 포함되어 형성될 수 있도록 장치를 구성하는 것이 바람직하다(도 1b참조). 유체장치에 유화액을 불연속상으로, 유기용매인 톨루엔을 연속상으로 공급하여 에멀전 방울을 형성한다.

상기 불연속상의 유속은 0.001 ~ 30 mL/min이며, 바람직하게는 0.05mL/min로 공급되며, 상기 연속상의 유속은 0.001 ~ 30 mL/min이며, 바람직하게는 0.6mL/min으로 공급된다.

구형 방울로 형성한 후, -20℃로 미리 냉각된 톨루엔에 넣어 겔을 형성한 후, 냉동실에 겔화된 방울을 놓아둔다.

-20℃에서 유화액 방울은 얼음과 같이 고체 상태로 유지되는 반면, 톨루엔(용해점 -93℃)은 액체상으로 변화한다.

그러므로 유화액 방울이 고체 상태이기 때문에 전반적으로 구형 형태를 유지한다. 여과지를 사용하여 여분의 톨루엔을 제거한 후 고체상태의 분산액 방울을 25℃에서 1200℃까지 3시간 안에 올려 동결 건조시키고 1200℃에서 3시간 동안 소성하였다.

따라서, 모든 유기 분자가 제거되고 미네랄 성분의 다공성 지지체만 남게된다.

또한, 상기 소성을 통해 미네랄 성분 외의 고분자를 제거하여 지지체의 기계적 강도가 증가하게 된다. 상기 소성의 과정을 거친 후 생성된 다공성 지지체는 10㎛이상인 것으로 환부에 적용시 세포이동이 일어나지 않는 것을 특징이 있다.

또한, 상기 유기용매는 물과 섞이지 않는 용매로서, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 톨루엔을 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명에 대해서 더욱 상세하게 설명할 것이나, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

수용성 분산액 제조

미네랄 성분인 TCP 분말 20중량% 및 하이드록시아파타이트(HAP) 20중량%와 젤라틴 10중량%, 물을 지르코니아 볼(1mm직경, 0.5g)을 사용하여 12시간 교반하여 분산시켰다. 지르코니아 볼을 제거한 후, 수용성 분산액을 얻었다.

< 실시예2 >

수중유적형(Oil-in water; O/W)에멀전 제조

오일인워터(O/W)에멀전은 수용성 분산액(6g)에서 PCL(폴리카프로락톤; polycaprolactome) (Aldrich, 440752-250G, Mw ~14,000, Mn ~10.000)3중량%로 톨루엔(J.T.Baker 9460-03)에 녹인 용액 2 g을 20,000rpm의 균질기(Dispenser T 10 basic, IKA Works, Inc., Wilmington, NC, USA )를 1분간 사용하여 유화시켜 준비하였다.

< 실시예 3>

미네랄 성분의 다공성 TCP 지지체의 제조

다공성 지지체를 제조하기 위해 양방향 흐름 유체장치를 사용하였으며, 양방향 흐름 유체장치는 유체 장치는 Tygon 튜브(1/32 in. i.d.× 3/32 in. o.d.), 유리 모세관(0.5 mm i.d.× 0.9 mm o.d.) 및 26G 바늘(needle)로 이루어진다. 바늘과 유리 모세관을 Tygon 튜브 안으로 넣어 두 개의 흐름 채널을 제조하였으며, 에폭시 접착제로 고정하였다.

< 실시예 3-1>

마이크로 다공성 TCP 지지체의 제조

마이크로 다공성 TCP 지지체를 제조하기 위해 상기 실시예 1의 수용성 분산액을 양방향 흐름 유체장치에 0.05mL/min의 유속으로 불연속상으로 투입되고, 디지털 온도 조절기(HTC210K, LK Labkorea Inc., Korea)를 사용하여 60℃에서 지속적으로 가열하였다. 그리고 Span 80(3 wt%)를 포함한 톨루엔 용액은 0.6mL/min으로 연속상으로 투입하였다. 불연속상 및 연속상의 유량은 시린지 펌프(NE-1000, New Era Pump Systems Inc., USA)를 사용하여 유체 장치 안으로 투입하였다(도1 a참조).

유체장치를 통해 생성된 에멀전 방울은 -20℃에서 사전 냉각된 톨루엔 담구어 동결시킨 후 냉장고(-20℃)에 6시간 동안 놔두어 동결건조시켰다. 마지막으로 25℃에서 1200℃까지 3시간 만에 올리고 1200℃에서 3시간 동안 소성시켜 마이크로 다공성 TCP 지지체를 제조하였다.

< 실시예 3-2>

매크로 다공성 지지체 제조

매크로 다공성 지지체 제조를 위해 상기 실시예 3의 양방향 흐름 유체장치를 사용하였으며, 상기 실시예 2의 O/W 에멀전을 장치에 0.05mL/min의 유속으로 불연속 상으로 투입되고, 디지털 온도 조절기(HTC210K, LK Labkorea Inc., Korea)를 사용하여 60℃에서 지속적으로 가열하였다. 그리고 Span 80(3 wt%)를 포함한 톨루엔 용액은 0.6mL/min으로 연속상으로 투입하였다(도1 b참조).

에멀전 방울은 -20℃에서 사전 냉각된 톨루엔 담구어 동결시킨 후 냉장고(-20℃)에 6시간 동안 놔두어 동결 건조시켰다. 마지막으로 25℃에서 1200℃까지 3시간 만에 올리고 1200℃에서 3시간 동안 소성시켜 매크로 다공성 TCP 지지체를 얻었다.

<실험예 1>

다공성 TCP 지지체의 특성 분석

<실험예 1-1>

마이크로 및 매크로 다공성 TCP 지지체의 유체공정 후 유화한 모습 관찰

유체공정후 유화한 모습을 관찰하기 위해 광학 현미경(IX71, Olympus, Japan)을 사용하여 관찰하였다.

도 1c 및 1e는 실시예 3-1을 통해 만들어진 톨루엔 오일상에 수용성 분산액이 분산된 형태의 오일인워터(Oil-in water; O/W)방울의 광학 현미경 이미지를 나타낸 것이고, 도 1d 및 1f는 실시예 3-2를 통해 만들어진 톨루엔 오일상에 O/W 에멀전이 분산된 오일인워터인오일(Oil-in water-in Oil; O/W/O)방울의 광학 현미경 이미지를 나타낸 것이다. 변동계수는(CV) 5% 미만이며, 직경과 균일한 형상의 구형모습 이었다.

O/W 방울과는 달리, 많고 작은 톨루엔 방울이 O/W/O 방울 내부에서 관찰되었다. 작은 톨루엔 방울은 동결 건조 및 소성 후 매크로 다공성 TCP 지지체의 기공으로 진화하였다. 상기 실시예 3의 유체공정에서 다공성 TCP 지지체의 직경은 연속상의 유량을 변경하여 기공의 균일성을 파괴하지 않고 쉽게 조정이 가능함을 알 수 있었다.

<실험예 1-2>

소성 전후 크기 변화 및 연속상 유량에 따른 다공성 TCP 지지체의 크기 변화

도 2는 다공성 지지체의 소성 전후의 크기 변화와 공정 시 연속 상유속의 변화를 통해 지지체의 크기가 변화할 수 있는 것을 그래프로 나타낸 것이다. 연속상 유속의 증가는 전단응력으로 인한 TCP 지지체의 직경 감소로 이어지며, TCP 지지체의 직경은 TCP 분말이 융합된 소성 후 대략 25%가 감소함을 알 수 있었다.

<실험예 2>

마이크로 및 매크로 다공성 TCP 지지체의 형태 관찰

도 3은 불연속 및 연속 상에서 각각의 유량 0.05와 0.6mL/min에서 만들어진 마이크로 및 매크로 다공성 TCP 지지체의 형태를 확인하기 위해 SEM으로 분석한 사진을 나타낸 것이다.

소성을 통해, 마이크로 및 매크로 다공성 TCP 지지체의 평균 직경은 각각 395.3± 6.5에서 380.3± 9.2㎛로 그리고 346.2± 4.4에서 313.2± 8.8㎛로 감소했다. 매크로 다공성 TCP 지지체에서 많은 양의 수축이 일어나는 것은 마이크로 다공성 TCP 지지체와 비교하여 낮은 TCP 함량 때문이다.

매크로 다공성 TCP 지지체(도 3b)는 마이크로 다공성 TCP 지지체(도 3a)보다 많은 수의 기공과 큰 표면의 기공을 보였다. 매크로 다공성 TCP 지지체의 내부 기공(도 3d)는 표면 기공(도 3b)보다 상당히 큼을 알 수 있다.

이러한 표면과 내부기공 사이의 크기 차이는 -20℃에서 미리 냉각된 톨루엔에서 수집되는 동안 O/W 방울의 표면과 내부 기름방울의 융합이 빠르게 동결될 수 있도록 한다.

또한, 내부 몇몇 기공은 50㎛보다 큰 사이즈였고, 매크로 다공성 TCP 지지체의 내부 기공은 상호연결이 잘 되어 있었다. 수용성 분산액을 사용하여 TCP 지지체를 만든 것보다 O/W 에멀전을 사용하여 만든 TCP 지지체의 기공이 더 크고 상호연결이 더 잘된 기공을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3>

매크로 다공성 TCP 지지체의 기공크기분포

매크로 다공성 TCP 지지체의 기공 크기 분포는 수은압입법(mercury intrusion porosimetry ; Autopore IV 9500; Micrometrics, Londonderry, NH, USA)을 사용하여 측정하였고, 각 샘플은 압축 강도 시험을 위한 나사 구동로드 프레임을 사용하여 1mm/min의 크로스 헤드 속도 100mm의 반경 5mm 높이와 실린더에서 선발하였다(도 4참조).

그 결과 매크로 다공성 TCP 지지체의 기공 크기는 6㎛내지 21㎛의 범위에 주로 분포해있음을 알 수 있었다. 그러나 수은압입법을 통한 방법은 매크로 다공성 TCP 지지체의 표면과 내부 기공을 구별하기 어려웠다. 따라서, 매크로 다공성 TCP 지지체의 횡단면과 표면의 SEM 이미지로부터 기공 크기 분포를 관찰하였다.

다공성 지지체는 파라핀에 12시간 동안 담그고, 70℃에서 3시간 동안 대류식 오븐(convection oven)에서 녹였다. 이후 지지체와 파라핀은 냉각된 몰드에서 완전히 굳혔다. 파라핀 큐브는 12㎛로 자르고, 슬라이드 글라스 상에 놔두고 광학 현미경으로 관찰하였다. Automatic Rotary Microtome (Leica RM2245, Leica, Germany)는 파라핀을 절편화하여 TCP 지지체의 내부 기공을 확인하기 위해 사용하였다.

도 5는 매크로 다공성 TCP 지지체의 표면과 내부 기공의 크기 분포를 보여준다. 표면의 평균 사이즈는 9.9± 5.9이며, 내부 기공의 평균 사이즈는 20.1± 11.4㎛였고, 이 결과는 수은압입법 결과에서 관찰된 6 내지 21㎛에서의 분포와 일치한다.

< 실험예 4>

다공성 TCP 지지체의 피하주입 및 조직학적 평가

다공성 TCP 지지체의 피하주입 시 성능을 평가하기 위해 24마리의 성인 BALB/c 쥐(성장 5주, OrientBio, Seoul, Korea)를 무작위로 두 그룹(마이크로 다공성 지지체 I와, 매크로 다공성 지지체 II)으로 나누었다. 동물에 졸레틸 50(10mg/kg,ip;VibacLaboratories,Carros,France)을 사용하여 마취시키고 무균의 다공성 지지체의 주입을 준비했다. 두 개의 시상동 주변 절개는 각 동물의 등 부분에 만들었고, 피하 얼굴면을 비절개박리를 사용하여 피하 얼굴면을 분리함으로써 두 절개의 양 옆으로 피하공간을 만들었다.

대략 30개의 다공성 지지체를 각 피하공간에 삽입하였다. 피부 절개 후, Dafilon(B. Braun Surgical S.A., Rubi, Spain)으로 마감했다. 각 그룹에서 세마리 동물은 이산화탄소 가스로 안락사 하였고 TCP 지지체를 포함하는 조직은 1, 2, 3, 4주 간격으로 주입하였다.

체외 배양 후, 샘플은 10% 포르말린(Sigma-Aldrich)에 24시간 동안 고정하고, 탈수시키고, 파라핀 왁스에 고정하고, 그리고 마이크로톰(microtome)을 사용하여 12 ㎛두께로 절편화하였다. 횡단면을 유리슬라이드에 고정시키고 TCP 지지체 사이의 기공 및 또는 빈공간으로 수여 쥐 조직의 침투를 검사하기 위해 헤마토신 에오신 (H&E)염색법으로 염색하였다. 상기 과정을 통해 준비된 슬라이드를 광학현미경을 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 마이크로 및 매크로 다공성 TCP 지지체 모두 TCP 지지체 사이의 빈 공간에 수여 조직이 침투하였으나, 매크로 다공성 TCP 지지체의 내부 기공만 시간이 지남에 따라 수여 조직으로 가득 찼다(도 6참조).

이 결과는 수여 조직 표면의 기공을 통해 내부 기공으로 침투함을 확인할 수 있었다.

따라서, 이상과 같은 실험 결과를 통해 본 발명자들의 유체 공정을 이용한 골 재생을 위한 다공성 지지체는 생체 골조직과 유사한 조직공학용 지지체를 형성할 수 있으며 특히, 다공성을 가짐으로써 조직이 잘 자라기 때문에 세포이동을 방지하여 환부에 지지체를 고정하기에 매우 유리하며 이를 이식 시 트리칼슘포스페이트가 생체조직과 치환되어 골 재생을 유도하므로 골 재생을 위한 다공성 지지체로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

1. (a) 미네랄 성분을 물에 분산시켜 수용성 분산액을 제조하는 단계;
   (b) 수용성 분산액을 유기용매와 균질기를 사용하여 유화시키는 단계;
   (c) 유화액을 유체공정과 동결건조를 수행하여 지지체를 제조하는 단계; 및
   (d) 지지체를 소성하는 단계를 포함하는, 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법으로서,
   상기 (c) 단계의 유체공정은 (b) 단계의 유화액을 불연속상으로 공급하고, 유기용매를 연속상으로 공급하는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 미네랄 성분은 제삼인산칼슘(Tricalciumphospate ; TCP) 또는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite ; HAP)인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 수용성 분산액을 제조하는 단계는 미네랄 성분 20 중량%와 생체적합성 고분자 10 중량%를 물에 분산시키는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 다공성 지지체의 제조방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 생체적합성 고분자는 수상에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 다공성 지지체의 제조방법.
5. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 유기용매와 유화시키는 단계는 합성고분자를 3 중량% 함유하는 유기용매를 (a) 단계의 수용성 분산액과 유화시키는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 다공성 지지체의 제조 방법.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 합성고분자는 유기용매에 녹거나 분산될 수 있는 고분자로서, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethyl methacrylate), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
7. 제1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 유기용매는 물과 섞이지 않는 용매로서, 톨루엔(toluene), 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
8. 제 1항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 유화공정은 균질기의 속도를 조절하여 다공성 지지체 내부 기공의 크기를 10 내지 22㎛로 조절 가능한 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 다공성 지지체의 제조방법.
9. 제 1항에 있어서,
   상기 불연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min로 연속상의 유량은 0.001 ~ 30 mL/min인 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
10. 제 1항에 있어서,
    상기 연속상의 유량을 변경하여 다공성 지지체의 표면 기공의 크기를 6 내지 21㎛크기로 조절이 가능한 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 다공성 지지체의 제조방법.
11. 제 1항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 소성은 3시간 동안 25℃에서 1200℃까지 온도를 상승시키고, 다시 3시간 동안 1200℃를 유지시켜 미네랄 성분 외의 고분자를 제거하여 지지체의 기계적 강도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 골 재생을 위한 미네랄 성분의 다공성 지지체의 제조방법.
    
    
    
    
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