KR101637431B1 - 세포 지지체 및 골재생재 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 목적은 세포를 균일하게 분포시켜 불균일이 없는 상태로 유지할 수 있고, 또한 생체내에서 분해되는 소재로 구성되어 있는 3차원의 세포 지지체를 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지는 세포 지지체가 제공된다.
(a) 기공률: 81% 이상 99.99% 이하
(b) 평균 기공 사이즈: 10∼400㎛
(c) 기공간 연통 구멍을 가짐, 및
(d) 흡수율: 1000% 이상 9900% 이하

Description

세포 지지체 및 골재생재{CELL-SUPPORTING BODY AND BONE REGENERATION MATERIAL}
본 발명은 세포를 균일하게 분포시킬 수 있는 세포 지지체 및 골재생재에 관한 것이다.
현재, 기능 장해나 기능 부전에 빠진 생체조직·장기의 재생을 꾀하는 재생 의료의 실용화가 진행되고 있다. 재생 의료는 생체가 갖고 있는 자연치유 능력만으로는 회복할 수 없게 된 생체조직에 있어서 세포, 스캐폴드 및 성장 인자의 3인자를 사용해서 원래의 조직과 같은 형태나 기능을 다시 만들어 내는 새로운 의료기술이다. 최근에는 세포를 사용한 치료가 서서히 실현되고 있다. 예를 들면, 자가세포를 사용한 배양 표피, 자가연골세포를 사용한 연골치료, 간엽계 줄기세포를 사용한 골재생 치료, 근아세포를 사용한 심근세포 시트 치료, 각막상피 시트에 의한 각막 재생 치료, 신경 재생 치료 등을 들 수 있다. 이들 새로운 치료는 종래의 인공물에 의한 대체 의료(인공골 보충제나 히알루론산 주사)와는 달리 생체조직의 수복·재생을 꾀하므로 높은 치료 효과가 얻어진다. 실제로, 자가세포를 사용한 배양 표피나 배양 연골 등의 제품이 시판되고 있다.
그러나, 상기와 같은 세포를 사용한 치료에 있어서는 치료 효과의 불균형의 문제나, 예기치 못한 부작용의 문제가 우려되며, 또한 실제로 문제가 되고 있다. 이러한 문제의 원인으로서는 배양해서 얻어진 세포의 불균일함, 이식 부위에 있어서의 세포의 생착 불균일함이 큰 원인이라고 생각된다.
예를 들면, 연골세포에 있어서는 배양 과정에 있어서 탈분화되기 쉬운 것이 알려져 있어 상태를 일정하게 유지한 배양법이 요망되고 있다. 또한, 일반적으로 세포는 그 존재하는 상태, 특히 세포의 밀도에 의해 그 상태를 변화시켜 버리는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 현재 치료에의 응용이 기대되고 있는 간엽계 줄기세포(MSC)에 있어서는 세포밀도가 낮은 상태에서는 지방세포로, 반대로 세포밀도가 높은 상태에서는 골세포로 분화되기 쉬운 것이 알려져 있으며, 다른 세포에 있어서도 세포밀도를 일정하게 컨트롤하는 것은 매우 중요한 요소가 된다.
동시에 세포를 생체내에서의 환경에 보다 가까운 상태로 효율 좋게 배양하기 우해서는 3차원 배양 기술이 중요하다는 것이 많은 보고에 의해 실증되고 있다. 그러나, 3차원 기재에 세포를 파종한 경우 세포가 기재내에 균일하게 분포하지 않고 기재내에서 치우쳐 버리는 것이 알려져 있으므로 3차원 배양에 있어서는 세포밀도를 일정하게 유지하는 것이 곤란하다. 3차원 배양에 있어서의 세포배양은 기재의 세포에의 접착성, 기재의 구조, 기재의 친소수성 등의 물성, 및 생물학적, 화학적 성질에 의존하고 있다라고 추측되지만, 3차원 기재내에서 세포를 균일하게 분포시켜 세포밀도를 일정하게 유지하는 것은 일반적으로 곤란하다. 그 결과, 세포의 상태가 3차원 기재내에서 동일하지 않은 상태가 형성되어 버려 세포의 균일성에 문제가 발생한다.
또, 얻어진 세포의 이식 치료에 있어서는 세포의 현탁액을 주입하는 이외에도, 예를 들면 연골세포의 아테로콜라겐·겔 포매 배양과 같이 배양한 세포를 기재와 함께 이식하는 것이 행해지고 있다. 이 경우, 배양후에 3차원 기재와 세포로 이루어지는 구조물을 이식 부위의 형상에 맞춰서 트리밍해서 이식하지만, 세포가 3차원 기재내에서 불균일하게 분포할 경우, 트리밍에 의해 얻어진 이식용 단편에도 세포의 분포 불균일이 발생하여 치료 효과가 강하게 발현되는 개소와, 발현되기 어려운 개소가 생기고, 또한 세포의 밀도 불균일에 의해 이식 단편의 물리적 성질·물리적 강도에도 불균일이 생긴다. 이들 불균일은 치료 효과의 불균형이나 이식 단편의 생착율 저하의 요인이 되어 예기한 치료 효과를 높일 수 없다는 결과를 야기한다. 또한, 상기한 바와 같은 3차원 기재에 요구되는 적성으로서는 이식에 이용하는 점에서 생체 친화성, 바람직하게는 생분해성(체내에서 자연히 분해될 필요에서)을 갖는 소재로 구성되어 있는 것이 중요하다. 그러나, 이들 모두의 요건을 충족시키는 3차원 기재는 존재하고 있지 않았다.
상기와 같이 세포를 사용한 재생 의료의 관점에서 배양 공정 및 이식 공정 모두 세포를 균일하게 분포시켜 불균일이 없는 상태로 유지할 수 있는 3차원 기재임과 동시에 이식에 적용할 필요성으로부터 생체내에서 분해되는 소재로 구성되는 3차원 기재가 요구되고 있지만, 현재까지의 폴리머 다공질, 콜라겐 3차원 기재, 또는 콜라겐겔 포매 배양에서는 해결이 곤란했다.
일반적으로 생체조직은 세포와 세포외 매트릭스(고분자 구조체)로 구성되어 있으며, 여러가지 생명 현상은 이들이 복잡하게 상호작용하는 결과이다. 세포는 각종 성장 인자(약)를 방출하여 자신 또는 다른 세포의 기능에 영향을 주고 있다. 한편, 세포로부터 분비되는 세포외 매트릭스는 세포가 기능하는 수화 공간을 제공하여 약의 저장고나 스캐폴드로서의 기능을 갖고, 세포의 기능 발현이나 분화에 중대한 영향을 주고 있다.
최근 놀라운 진보를 이루고 있는 재생 의료는 인공 장기나 장기 이식을 대체할 수 있는 고도 첨단 의료로서 매우 주목을 모으고 있다. 재생 의료 실현을 위해서는 재생 의료의 주요한 요소인 세포, 배양 장치, 증식인자(약), 세포의 스캐폴드(인공세포외 매트릭스, 재료) 각각을 능숙하게 사용하는 것이 중요하다.
정형외과 영역 또는 치과 영역의 골재생은 재생 의료 영역에 있어서 매우 주목을 모으고 있는 영역의 하나로서 알려져 있다. 골질환이 다리나 허리인 경우는 보행 불능으로 되고, 치과인 경우는 식사 섭취가 곤란하게 되는 점에서 골질환은 현저한 QOL의 저하를 일으킨다.
현재, 골재생 치료 제제로서 대표적인 것으로서 척수손상을 치료하는 Infuse(BMP-2와 콜라겐 스폰지의 조합), 치조골을 재생하는 골보충제로서 BioOss(탈단백화된 소 분쇄골), Gem21(PDGF와 βTCP)이 알려져 있다. 일반적으로 골재생 치료 제제에 필요한 성질로서 1.구조유지를 위한 강도, 2.골재생을 위한 스페이스 확보, 3.골재생하는 세포의 스캐폴드, 4.골재생하는 세포의 분화와 증식을 유발하는 것, 5.골재생에 따른 분해성이 알려져 있다. 골재생 치료 제제로서의 스캐폴드 재료로서는 콜라겐이나 βTCP 등이 널리 사용되고 있다. 또한, 연구 레벨에서는 콜라겐의 변성체인 젤라틴 스폰지에 bFGF 또는 BMP-2를 스며들게 하는 것에 의한 골재생이 행해지고 있다(Journal of Neurosurgery 91851-856, 1999). 또한 골수간엽계 줄기세포를 스캐폴드 기재에 포함시켜 배양한 치료제에 의한 골재생 치료도 연구가 행해지고 있다(히로세 모토히로, 오구시 하지메「재생 배양 골조직을 사용한 뼈의 재생 의료」티슈 엔지니어링2007, 178-183;2007.7).
골재생이란 골아계 세포가 골기질을 생성해서 골세포와 골기질로 이루어지는 경질의 뼈가 형성되는 것을 나타내고, 골아계 세포에 의해 달성되는 현상이다. 체외에서 증식시킨 이식 세포(골수간엽계 줄기세포 등)를 활용하는 경우에는 원래부터 증식인자(약)에 의한 골재생 효과도 주위에 있는 숙주 유래 세포에 작용을 미침으로써 골재생을 유도하고 있다. 예를 들면, BMP는 미분화 간엽계 세포에 작용해서 골아세포로 분화시키고, 골아세포에 의한 골형성을 활성화시킨다. 따라서, 골재생의 주체는 세포에 있으므로 세포의 스캐폴드가 되는 스캐폴드 재료의 중요성은 매우 높다.
재생 의료 전반에 걸친 대표적인 스캐폴드 재료로서는 젤라틴이 잘 알려져 있다. 젤라틴은 생체 적합성이 높고, 안정성이 높은 소재로서 알려지며, 의료용도에서의 응용 실적이 높다. 마찬가지로 실적이 높은 소재로서는 콜라겐이 알려져 있지만, 젤라틴에 비해서 가용성이 낮아 용해액의 농도와 pH에 있어서의 제약이 크다(수십% 고농도·중성용액 등으로 조정할 수 없다). 그 때문에 통상이면 가공·제작·성형 가능한 것이 제한되어 버리는 점에서 젤라틴을 사용한 스캐폴드 기재가 요망된다. 그러나, 대부분 골재생 치료의 스캐폴드 재료로서 젤라틴 기재는 그다지 적합하지 않다는 인식이 일반적이다. 예를 들면, 젤라틴 스폰지는 단독으로는 골재생을 저해한다는 기재가 있다(타바타 외, Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999). 또한, 이시이들은 (치과의 전망, 97(3), 665-677, 2001), 콜라겐 스폰지와 젤라틴 스폰지가 미치는 치조골 재생능에의 영향을 조사해서 젤라틴은 콜라겐에 비해서 골재생능을 갖지 않는다고 서술되어 있다.
또, 콜라겐이나 세라믹스 재료, 합성 폴리머에 있어서도 스캐폴드 재료 단독으로의 골재생력이 불충분한 점에서 BMP나 자가혈, 자가골수 간엽계 줄기세포와의 조합이 보고되어 있는 것이 현상황이다.
이들 스캐폴드 재료에 있어서 스캐폴드 재료가 우량한 골재생능을 나타내지 않는 원인의 하나로서는 「스캐폴드 기재내로의 세포 침윤(도입) 능력」, 「스캐폴드 기재내에서의 세포 분포·유지 능력」이 불충분하다고 생각되었다. 본 발명자들은 스캐폴드 기재가 세포 지지체로서 충분한 세포 도입력·분포·유지력을 갖지 않는 것이 골재생으로 연결되지 않는 원인이라고 생각했다.
예를 들면, 일본 특허 공개 소 62-122586호 공보에 있어서는 폴리에스테르나 폴리프로필렌으로 이루어지는 기공률 40∼95%, 바람직하게는 60∼80% 이하인 다공성 지지체가 기재되어 있지만, 상기 기공률의 다공성 지지체는 세포를 균일하게 분포·유지할 수 없다. 또한, 일본 특허 공개 평 8-89239호 공보에 있어서는 다공성의 콜라겐 스폰지가 기재되어 있지만, 콜라겐 스폰지에서는 그 소수성에 의존한 것인지, 소재의 불균질성에 의한 것인지 원인은 확실하지 않지만, 세포를 3차원적으로 균일 분포시킬 수 없는 것이 알려져 있다. 또한, 미리 세포를 배양한 후에 이식하는 경우로서는 콜라겐겔로 세포를 포매해서 배양하는 겔 포매 배양이라는 방법도 존재하지만, 세포가 겔내에서 치우쳐서 분포가 불균일하게 되어 버린다.
일본 특허 공개 소 62-122586호 공보 일본 특허 공개 평 8-89239호 공보
Journal of Neurosurgery 91 851-856, 1999 히로세 모토히로, 오구시 하지메「재생 배양 골조직을 사용한 뼈의 재생 의료」티슈 엔지니어링 2007, 178-183;2007.7 치과의 전망, 97(3), 665-677, 2001
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해소하는 것을 해결해야 할 과제로 했다. 즉, 본 발명은 세포를 균일하게 분포시켜 불균일이 없는 상태로 유지할 수 있고, 또한 생체내에서 분해되는 소재로 구성되어 있는 3차원의 세포 지지체를 제공하는 것을 과제로 했다. 또한 본 발명은 스캐폴드 기재 단독으로도 골재생 능력을 갖는 골재생재, 또한 골재생에 적합하지 않다는 젤라틴 소재이어도 골재생 능력을 갖는 골재생재를 제공하는 것을 과제로 했다. 또한 본 발명은 상기 세포 지지체 또는 골재생재를 사용한 의료 재료를 제공하는 것을 과제로 했다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토하고, 세포 접착성의 생분해성 재료를 사용해서 소정의 기공률, 평균 기공 사이즈 및 흡수율을 갖고, 또한 기공간 연통 구멍을 갖는 다공질체를 제조하고, 이 다공질체에 세포를 파종해서 다공질체내에 있어서의 세포의 분포를 조사한 결과, 세포가 상기 다공질체내에 균일하게 분포하고, 또 세포가 다공질체로부터 탈락되는 일이 적고, 다공질체내에 많은 세포가 보여지는 것을 찾아냈다. 또한, 젤라틴, 유전자 재조합 젤라틴을 사용해서 제조한 상기 다공질체에 대해서 래트 두개골 결손 모델에 있어서의 골재생을 평가한 결과, 상기 다공질 구조체에서는 양호한 골재생을 나타내는 것을 찾아냈다. 본 발명은 이들의 지견에 의거해서 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의하면, 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지는 세포 지지체가 제공된다.
(a)기공률:81% 이상 99.99% 이하
(b)평균 기공 사이즈:10∼400㎛
(c)기공간 연통 구멍을 가짐, 및
(d)흡수율:1000% 이상 9900% 이하
또한 본 발명에 의하면, 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지는 골재생재가 제공된다.
(a)기공률:81% 이상 99.99% 이하
(b)평균 기공 사이즈:10∼400㎛
(c)기공간 연통 구멍을 가짐, 및
(d)흡수율:1000% 이상 9900% 이하
바람직하게는 생분해성 재료의 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값은 0.3 이하 -5.0 이상이다.
바람직하게는 생분해성 재료는 단백질, 폴리펩티드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 키틴, 키토산, 셀룰로오스 및 히알루론산으로부터 선택되는 적어도 1종 이상이다.
바람직하게는 생분해성 재료는 천연 또는 유전자 재조합 젤라틴, 천연 또는 유전자 재조합 피브로넥틴, 또는 천연 또는 유전자 재조합 라미닌이다.
바람직하게는 생분해성 재료는 가교되어 있다.
바람직하게는 가교는 알데히드류, 축합제, 또는 효소에 의해 실시된다.
바람직하게는 생분해성 재료가 유전자 재조합 젤라틴이다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은
식:A-[(Gly-X-Y)n]m-B
(식 중, A는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, B는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, n개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n은 3∼100의 정수를 나타내고, m은 2∼10의 정수를 나타낸다. 또한, n개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다)로 나타내어진다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은
식:Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
(식 중, 63개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, 63 개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다. 또한, 63개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다)로 나타내어진다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은
(1)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열, 또는
(2)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖고, 생분해성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는 본 발명의 세포 지지체는 생분해성 재료를 가교한 후, 교반하고, 그 후에 동결 건조함으로써 제조된다.
본 발명에 의하면 또한 상기한 본 발명의 세포 지지체를 포함하는 재생 의료 재료가 제공된다.
본 발명에 의하면 또한 상기한 본 발명의 세포 지지체와 이식 세포를 포함하는 재생 의료 재료가 제공된다.
바람직하게는 본 발명의 골재생재는 생분해성 재료를 가교한 후, 교반하고, 그 후에 동결 건조함으로써 제조된다.
본 발명에 의하면 또한 상기한 본 발명의 골재생재를 포함하는 재생 의료 재료가 제공된다.
본 발명에 의하면 또한 상기한 본 발명의 골재생재와 이식 세포를 포함하는 재생 의료 재료가 제공된다.
(발명의 효과)
본 발명의 세포 지지체는 세포를 균일하게 분포·유지할 수 있고, 생체내에서 분해되는 소재로 구성되어 있는 3차원의 세포 지지체이다. 본 발명의 세포 지지체는 세포 지지체 단독으로도 골재생 능력을 갖고, 골재생 치료에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 과정에서 얻어진 3차원 구조를 부여함으로써 일반적으로는 골재생에 적합하지 않는다는 젤라틴 소재이어도 골재생 능력을 갖는 스캐폴드 구조체로서 제공할 수 있다. 본 발명의 세포 지지체를 재생 의료를 위해서 사용함으로써 불균일을 억제한 치료 효과를 달성할 수 있고, 또 예기하지 못한 부작용의 문제도 해소할 수 있다.
도 1은 유전자 재조합 젤라틴의 하이드로겔을 마우스의 배부피하에 매식(埋殖)하고, 잔존 겔량을 경시적으로 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 유전자 재조합 젤라틴의 하이드로겔을 마우스의 배부피하에 매식한 후의 병리절편의 화상(헤마톡실린에오신 염색)을 나타낸다.
도 3은 유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 내부 단면 구조에 대해서 주사형 전자 현미경으로 관찰한 화상(5% 스폰지의 단면)을 나타낸다.
도 4는 유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 내부 단면 구조에 대해서 주사형 전자 현미경으로 관찰한 화상(10% 스폰지의 단면)을 나타낸다.
도 5는 콜라겐 스폰지의 절편사진(Day1)을 나타낸다.
도 6은 콜라겐 스폰지의 절편사진(Day4)을 나타낸다.
도 7은 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(10%)의 절편사진(직경 8mm, 높이 5mm)(Day1)을 나타낸다.
도 8은 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(10%)의 절편사진(직경 8mm, 높이 5mm)(Day4)을 나타낸다.
도 9는 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지의 절편사진(Day1)을 나타낸다.
도 10은 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지의 절편사진(Day4)을 나타낸다.
도 11은 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(10%)의 절편사진(2mm×2mm×3mm)(Day1)을 나타낸다.
도 12는 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(10%)의 절편사진(2mm×2mm×3mm)(Day4)을 나타낸다.
도 13은 콜라겐겔 포매 배양의 절편사진(Day1)을 나타낸다.
도 14는 콜라겐겔 포매 배양의 절편사진(Day4)을 나타낸다.
도 15는 콜라겐겔 상 배양의 절편사진(Day1)을 나타낸다.
도 16은 콜라겐겔 상 배양의 절편사진(Day4)을 나타낸다.
도 17은 세포 접착성 시험(DNA assay)의 결과를 나타낸다.
도 18은 세포 접착성 시험(DNA assay)의 결과를 나타낸다.
도 19는 유전자 재조합 젤라틴으로 코팅한 플레이트에의 세포 접착의 모양을 나타낸다.
도 20은 래트 두개골 결손 모델을 나타낸다. 좌측:육안사진, 우측:μCT사진(Micro-CT image: Tissue Eng(2007)13(3):501-12)
도 21은 골재생량 및 골재생 비율의 데이터를 나타낸다.
도 22는 유전자 재조합 젤라틴 파우더, 유전자 재조합 젤라틴 스폰지를 이식한 군의 대표적인 병리사진을 나타냈다.
도 23은 천연 젤라틴 스폰지를 이식한 군의 대표적인 병리사진을 나타냈다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대해서 상세하게 설명한다.
(1)생분해성 재료
(1-1)생분해성 재료의 종류
본 발명의 세포 지지체는 적어도 1종 이상의 생분해성 재료로 구성된다. 본 발명에서 사용하는 생분해성 재료는 생체내에서 분해되는 한, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 생분해성 재료는 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값으로 나타내어지는 친소수성 지표에 있어서 0.3 이하 -5.0 이상인 것이 바람직하고, 0.0 이하-3.0 이상인 것이 더욱 바람직하고, 상기를 만족하는 친수성 폴리펩티드가 특히 바람직하다. Grand average of hydropathicity(GRAVY)값은 『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker(ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press(2005). pp.571-607』 및 『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003).』의 방법에 의해 얻을 수 있다.
생분해성 재료의 구체예로서는 단백질, 폴리펩티드, 폴리락트산, 폴리글리콜산, PLGA, 키틴, 키토산, 셀룰로오스, 및 히알루론산으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 재료를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 중에서도 단백질 또는 폴리펩티드가 바람직하고, 특히 젤라틴, 피브로넥틴, 또는 라미닌 등이 바람직하다. 이들 단백질은 유전자 재조합체이어도 천연체이어도 좋다. 유전자 재조합 단백질의 구체예로서는 유전자 재조합 젤라틴, 프로넥틴, 유전자 재조합 피브로넥틴, 유전자 재조합 라미닌을 들 수 있다. 상기 중에서 가장 바람직한 것은 유전자 재조합 젤라틴이다. 유전자 재조합 젤라틴에 대해서는 본 명세서 중에서 후술한다.
본 발명에서 사용하는 생분해성 재료는 세포 접착성인 것이 바람직하다. 세포 접착성이 높은 소재를 사용함으로써 세포의 누출이나 불균일 분포를 억제할 수 있다고 생각되기 때문이다. 세포 접착성을 정량적으로 기술하는 것은 곤란하지만, 이들 고분자 재료에는 세포 접착성을 높이는 연구가 이루어져 있어도 좋고, 구체적인 방법으로서는 1. 「기재 표면에 대한 세포 접착 기질(피브로넥틴, 비트로넥틴, 라미닌)이나 세포 접착 서열(아미노산 1문자 표기로 나타내어지는 RGD서열, LDV서열, REDV서열, YIGSR서열, PDSGR서열, RYVVLPR서열, LGTIPG서열, RNIAEIIKDI서열, IKVAV서열, LRE서열, DGEA서열, 및 HAV서열) 펩티드에 의한 코팅」, 2. 「기재 표면의 아미노화, 양이온화」, 3. 「기재 표면의 플라즈마 처리, 코로나 방전에 의한 친수성 처리」라는 방법이 이용될 수 있다.
(1-2)가교
본 발명에서 사용하는 생분해성 재료는 가교되어 있는 것이라도 좋고, 가교되어 있지 않은 것이라도 좋지만, 가교되어 있는 것이 바람직하다. 가교 방법으로서는 열가교, 화학가교, 알데히드류(예를 들면, 포름알데히드, 글루탈알데히드 등)에 의한 가교, 축합제(카르보디이미드, 시아나미드 등)에 의한 가교, 효소가교, 광가교, UV가교, 소수성 상호작용, 수소결합, 이온성 상호작용 등 공지의 방법을 사용할 수 있지만, 글루탈알데히드를 사용해서 가교되어 있는 것이 가장 바람직하다.
광가교로서는 광반응성기를 도입한 고분자에의 광조사, 또는 광증감제의 존재화에서의 광조사에 의한 것을 들 수 있다. 광반응성기로서는 예를 들면, 신나밀기, 쿠마린기, 디티오카르바밀기, 크산텐 색소, 캠퍼퀴논을 들 수 있다.
효소에 의한 가교를 행할 경우, 효소로서는 생분해성 재료간의 가교 작용을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 트랜스글루타미나아제 및 락카아제, 가장 바람직하게는 트랜스글루타미나아제를 사용해서 가교를 행할 수 있다. 트랜스글루타미나아제로 효소 가교하는 단백질의 구체예로서는 리신 잔기 및 글루타민 잔기를 갖는 단백질이면 특별히 제한되지 않는다. 트랜스글루타미나아제는 포유류 유래의 것이어도, 미생물 유래의 것이어도 좋고, 구체적으로는 아지노모토(주)제 액티바 시리즈, 시약으로서 시판되고 있는 포유류 유래의 트랜스글루타미나아제, 예를 들면, 오리엔탈 코우보 고교(주)제, Upstate USA Inc.제, Biodesign International제 등의 모르모트 간장 유래 트랜스글루타미나아제, 염소 유래 트랜스글루타미나아제, 토끼 유래 트랜스글루타미나아제 등, 인간 유래의 혈액응고 인자(Factor XIIIa, Haematologic Technologies， Inc.사) 등을 들 수 있다.
생분해성 재료의 가교에는 생분해성 재료의 용액과 가교제를 혼합하는 과정과 이들의 균일 용액이 반응하는 과정의 2개의 과정을 갖는다.
본 발명에 있어서 생분해성 재료를 가교제로 처리할 때의 혼합 온도는 용액을 균일하게 교반할 수 있는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0℃∼40℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼30℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼25℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼15℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼10℃이며, 특히 바람직하게는 3℃∼7℃이다.
생분해성 재료와 가교제를 교반한 후에는 온도를 상승시킬 수 있다. 반응 온도로서는 가교가 진행되는 한은 특별히 한정은 없지만, 생분해성 재료의 변성이나 분해를 고려하면 실질적으로는 0℃∼60℃이며, 보다 바람직하게는 0℃∼40℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼25℃이며, 보다 바람직하게는 3℃∼15℃이며, 더욱 바람직하게는 3℃∼10℃이며, 특히 바람직하게는 3℃∼7℃이다.
(1-3)유전자 재조합 젤라틴
본 발명에서 사용할 수 있는 유전자 재조합 젤라틴은 콜라겐에 특징적인 Gly-X-Y로 나타내어지는 서열(X 및 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다)의 반복을 갖는 것이 바람직하다(복수개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다). 바람직하게는 세포 접착 시그널이 1분자 중에 2서열 이상 포함되어 있다. 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서는 콜라겐의 부분 아미노산 서열에 유래하는 아미노산 서열을 갖는 유전자 재조합 젤라틴을 사용할 수 있고, 예를 들면 EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008/103041 등에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서 바람직한 것은 이하의 형태의 유전자 재조합 젤라틴이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 천연의 젤라틴 본래의 성능으로부터 생체 적합성이 우수하고, 또한 천연 유래가 아닌 것에 의해 BSE 등의 우려가 없어 비감염성이 우수하다. 또한, 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 천연의 것에 비해서 균일하며, 서열이 결정되어 있으므로, 강도, 분해성에 있어서도 후술의 가교 등에 의해 변이를 적고 정밀하게 설계하는 것이 가능하다.
유전자 재조합 젤라틴의 분자량은 2KDa 이상 100KDa 이하인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 2.5KDa 이상 95KDa 이하이다. 보다 바람직하게는 5KDa 이상 90KDa 이하이다. 가장 바람직하게는 10KDa 이상 90KDa 이하이다.
유전자 재조합 젤라틴은 콜라겐에 특징적인 Gly-X-Y로 나타내어지는 서열의 반복을 갖는다. 여기에서, 복수개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다. Gly-X-Y에 있어서 Gly는 글리신, X 및 Y는 임의의 아미노산(바람직하게는 글리신 이외의 임의의 아미노산)을 나타낸다. 콜라겐에 특징적인 GXY서열이란 젤라틴·콜라겐의 아미노산 조성 및 서열에 있어서의 다른 단백질과 비교해서 매우 특이적인 부분 구조이다. 이 부분에 있어서는 글리신이 전체의 약 3분의 1을 차지하고, 아미노산 서열에서는 3개에 1개의 반복으로 되어 있다. 글리신은 가장 간단한 아미노산이며, 분자쇄의 배치에의 속박도 적고, 겔화에 있어서의 헤릭스 구조의 재생에 크게 기여하고 있다. X, Y로 나타내어지는 아미노산은 이미노산(프롤린, 옥시프롤린)이 많이 포함되고, 전체의 10%∼45%를 차지하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 그 서열의 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 아미노산이 GXY의 반복 구조인 것이 바람직하다.
일반적인 젤라틴은 극성 아미노산 중 전하를 갖는 것과 무전하의 것이 1:1로 존재한다. 여기에서, 극성 아미노산이란 구체적으로 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 히스티딘, 리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 아르기닌을 가리키고, 이 중 극성 무전하 아미노산이란 시스테인, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신을 가리킨다. 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서는 구성하는 전체 아미노산 중 극성 아미노산의 비율이 10∼40%이며, 바람직하게는 20∼30%이다. 또한 상기 극성 아미노산 중의 무전하 아미노산의 비율이 5% 이상 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만인 것이 바람직하다. 또한, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 티로신, 시스테인 중 어느 하나의 아미노산, 바람직하게는 2개 이상의 아미노산을 서열 상에 포함하지 않는 것이 바람직하다.
일반적으로 폴리펩티드에 있어서 세포 접착 시그널로서 작용하는 최소 아미노산 서열이 알려져 있다(예를 들면, 가부시키가이샤 나가이 출판 발행 「병태생리」Vol. 9, No.7(1990년) 527페이지). 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 이들 세포 접착 시그널을 1분자 중에 2 이상 갖는 것이 바람직하다. 구체적인 서열로서는 접착하는 세포의 종류가 많다는 점에서 아미노산 1문자 표기로 나타내어지는 RGD서열, LDV서열, REDV서열, YIGSR서열, PDSGR서열, RYVVLPR서열, LGTIPG서열, RNIAEIIKDI서열, IKVAV서열, LRE서열, DGEA서열, 및 HAV서열의 서열이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 RGD서열, YIGSR서열, PDSGR서열, LGTIPG서열, IKVAV서열 및 HAV서열, 특히 바람직하게는 RGD서열이다. RGD서열 중 바람직하게는 ERGD서열이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서의 RGD서열의 배치로서 RGD간의 아미노산수가 0∼100 사이, 바람직하게는 25∼60 사이에서 균일하지 않은 것이 바람직하다.
이 최소 아미노산 서열의 함유량은 세포 접착·증식성의 관점에서 단백질 1분자 중 3∼50개가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4∼30개, 특히 바람직하게는 5∼20개이다. 가장 바람직하게는 12개이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴에 있어서 아미노산 총수에 대한 RGD 모티프의 비율은 적어도 0.4%인 것이 바람직하고, 유전자 재조합 젤라틴이 350 이상인 아미노산을 포함하는 경우에 350의 아미노산의 각 스트레치가 적어도 1개의 RGD 모티프를 포함하는 것이 바람직하다. 아미노산 총수에 대한 RGD 모티프의 비율은 더욱 바람직하게는 적어도 0.6%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 0.8%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 1.0%이며, 더욱 바람직하게는 적어도 1.2%이며, 가장 바람직하게는 적어도 1.5%이다. 유전자 재조합 젤라틴내의 RGD 모티프의 수는 250의 아미노산당 바람직하게는 적어도 4, 더욱 바람직하게는 6, 더욱 바람직하게는 8, 더욱 바람직하게는 12 이상 16 이하이다. RGD 모티프의 0.4%라는 비율은 250의 아미노산당 적어도 1개의 RGD서열에 대응한다. RGD 모티프의 수는 정수이므로 0.4%의 특징을 충족시키기 위해서는 251의 아미노산으로 이루어지는 젤라틴은 적어도 2개의 RGD서열을 포함하지 않으면 안된다. 바람직하게는 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴은 250의 아미노산당 적어도 2개의 RGD서열을 포함하고, 보다 바람직하게는 250의 아미노산당 적어도 3개의 RGD서열을 포함하고, 더욱 바람직하게는 250의 아미노산당 적어도 4개의 RGD서열을 포함한다. 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴의 새로운 형태로서는 적어도 4개의 RGD 모티프, 바람직하게는 6개, 보다 바람직하게는 8개, 더욱 바람직하게는 12 이상 16 이하의 RGD 모티프를 포함한다.
또, 유전자 재조합 젤라틴은 부분적으로 가수분해되어 있어도 좋다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 A[(Gly-X-Y)n]mB 의 반복 구조를 갖는 것이 바람직하다. m으로서 바람직하게는 2∼10, 바람직하게는 3∼5이다. n은 3∼100이 바람직하고, 15∼70이 더욱 바람직하고, 50∼65가 가장 바람직하다.
반복단위에는 천연에 존재하는 콜라겐의 서열 단위를 복수 결합하는 것이 바람직하다. 여기에서 말하는 천연에 존재하는 콜라겐이란 천연에 존재하는 것이면 어느 것이어도 상관없지만, 바람직하게는 I형, II형, III형, IV형, 및 V형이다. 보다 바람직하게는 I형, II형, III형이다. 다른 형태에 의하면, 상기 콜라겐의 유래는 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 마우스, 래트이다. 보다 바람직하게는 인간이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴의 등전점은 바람직하게는 5∼10이며, 보다 바람직하게는 6∼10이며, 더욱 바람직하게는 7∼9.5이다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 탈아민화되어 있지 않다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 테로펩타이드를 갖지 않는다.
바람직하게는 유전자 재조합 젤라틴은 천연 콜라겐을 인코딩하는 핵산에 의해 조제된 실질적으로 순수한 콜라겐용 재료이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴으로서 특히 바람직하게는
(1)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열; 또는
(2)서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상(더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상)의 상동성을 갖고 생분해성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 유전자 재조합 젤라틴이다.
본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴은 당업자에게 공지의 유전자 재조합 기술에 의해 제조할 수 있고, 예를 들면 EP1014176A2, US6992172, WO2004-85473, WO2008/103041 등에 기재된 방법에 준해서 제조할 수 있다. 구체적으로는 소정의 유전자 재조합 젤라틴의 아미노산 서열을 인코딩하는 유전자를 취득하고, 이것을 발현 벡터에 포함하고, 재조합 발현 벡터를 제작하고, 이것을 적당한 숙주에게 도입해서 형질 전환체를 제작한다. 얻어진 형질 전환체를 적당한 배지로 배양함으로써 유전자 재조합 젤라틴이 산생되므로 배양물로부터 산생된 유전자 재조합 젤라틴을 회수함으로써 본 발명에서 사용하는 유전자 재조합 젤라틴을 조제할 수 있다.
(2)다공질체
본 발명의 세포 지지체는 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지는 것이다.
(a)기공률
본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 기공률은 부피밀도(ρ)와 진밀도(ρc)로부터 기공률(P=1-ρ/ρc(％))을 구한다. 부피밀도(ρ)는 건조 중량과 체적으로부터 산출하고, 진밀도(ρc)는 허버드 타입의 비중병법에 의해 구할 수 있다. 본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 기공률은 81% 이상 99.99% 이하이며, 바람직하게는 95.01% 이상 99.9% 이하이다.
(b)평균 기공 사이즈
본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 평균 기공 사이즈는 내부 단면 구조를 주사형 전자 현미경으로 관찰하는 것으로 구해진다. 본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 평균 기공 사이즈는 10∼400㎛이며, 바람직하게는 50∼300㎛이며, 보다 바람직하게는 70∼200㎛이다.
(c)기공간 연통 구멍
본 발명의 세포 지지체에 있어서는 기공간 연통 구멍이 존재하고 있다. 기공간 연통 구멍이 존재함으로써 스폰지 외부로부터 스폰지 심부에 이르기까지 기공이 연결됨으로써 스폰지에 파종한 세포가 스폰지 내부로 분산·확산 가능해진다. 또한, 기공간 연통 구멍은 상기 기능을 발휘하므로 10㎛ 이상인 것이 바람직하다.
(d)흡수율
본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 흡수율은 건조 중량(W0)과, 초순수를 25℃에서 5분간 자연히 흡수시켜 플라스틱 샤알레 상에서 여분의 물을 충분히 제거한 후의 물 팽윤시의 중량(W1)을 사용해서 (W1÷W0×100(%))에 의해 산출할 수 있다. 본 발명의 세포 지지체(다공질체)의 흡수율은 1000% 이상 9900% 이하이며, 바람직하게는 2000% 이상 5000% 이하이다.
생분해성 재료로 구성되는 다공질체는 공지의 방법을 사용해서 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기한 생분해성 재료를 상기한 방법으로 가교한 후, 호모지나이저를 사용해서 교반하고, 그 후에 동결 건조함으로써 생분해성 재료로 구성되는 다공질체를 제조할 수 있다.
(3)세포 지지체의 용도
본 발명의 세포 지지체는 골재생 치료용 스캐폴드 기재, 치료제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 지지체는 단독으로 골재생 치료제로서 사용할 수 있다. 골재생, 골신생이 필요한 치료인 한 질환은 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 세포 지지체는 이식 세포나 골유도 약제와 병용함으로써도 골재생 치료제로서 사용할 수 있다. 골유도 약제로서는 예를 들면 BMP(골형성 인자)나 bFGF(염기성 섬유아세포 증식인자)를 들 수 있지만 특별히 한정은 되지 않는다.
또, 본 발명의 세포 지지체는 재생 의료를 목적으로 해서 생체에 세포를 이식하기 위한 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 즉, 본 발명의 세포 지지체는 재생 의료 재료로서 사용할 수 있다. 본 발명의 세포 지지체는 재생 의료 재료로서 사용할 경우에는 본 발명의 세포 지지체에 세포를 파종하고, 세포를 내부에 포함하는 세포 지지체를 생체에 이식할 수 있다. 즉, 이식 세포를 포함하는 본 발명의 세포 지지체를 재생 의료 재료로서 사용할 수 있다. 단, 본 발명의 세포 지지체의 용도는 재생 의료에 한정되는 것은 아니고, 이식을 목적으로 하지 않는 세포의 배양에 사용할 수도 있다.
본 발명의 세포 지지체에 지지되는 세포는 목적에 따라서 적당히 선택할 수 있고, 그 종류는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 동물세포를 사용할 수 있고, 특히 인간 유래 세포를 사용할 수 있다. 동물세포(특히, 인간 유래 세포)의 종류는 만능세포, 체성 줄기세포, 전구세포, 또는 성숙세포 중 어느 것이라도 좋다. 만능세포로서는 예를 들면, ES세포, GS세포, 또는 iPS세포를 사용할 수 있다. 체성 줄기세포로서는 예를 들면, 간엽계 줄기세포(MSC), 조혈줄기세포, 또는 신경줄기세포를 사용할 수 있다. 전구세포 및 성숙세포로서는 예를 들면, 피부, 진피, 표피, 근육, 심근, 신경, 골, 연골, 내피, 뇌, 상피, 심장, 신장, 간장, 췌장, 비장, 구강내, 각막, 또는 털에 유래하는 세포를 사용할 수 있다. 이 중, 가장 바람직한 세포의 하나로서 연골세포를 들 수 있다. 인간 유래 세포로서는 예를 들면, ES세포, iPS세포, MSC, 연골세포, 골아세포, 골아전구세포, 간충직세포, 근아세포, 심근세포, 신경세포, 간세포, 베타세포, 섬유아세포, 각막내피세포, 혈관내피세포, 각막상피세포, 또는 조혈줄기세포를 사용할 수 있다. 치료 용도에 있어서는 숙주 유래의 세포를 활용해도, 외부로부터 이식 세포를 사용해도 상관없다. 또한, 세포의 유래는 자가세포 또는 타가세포 중 어느 것이라도 상관없다.
또한, 본 발명의 세포 지지체에의 세포의 파종이 필요한 경우는 상법에 의해 행하면 좋고, 적당한 용기내에 둔 본 발명의 세포 지지체에 대해서 세포를, 예를 들면 세포 현탁액으로서 파종하면 좋다.
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1:유전자 재조합 젤라틴
유전자 재조합 젤라틴(재조합 젤라틴)으로서 이하에 기재된 CBE3을 준비했다(WO2008-103041에 기재).
CBE3
분자량:51.6kD
구조: GAP[(GXY)63]3G
아미노산수:571개
RGD서열:12개
이미노산 함량:33%
거의 100%의 아미노산이 GXY의 반복 구조이다.
CBE3의 아미노산 서열에는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 티로신 및 시스테인은 포함되어 있지 않다.
CBE3은 ERGD서열을 갖고 있다.
등전점:9.34
아미노산 서열(서열표의 서열 번호 1)(WO2008/103041호 공보의 서열 번호 3과 같다. 단 말미의 X는 「P」로 수정)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAA GLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
실시예 2:유전자 재조합 젤라틴의 GRAVY의 계산 결과
유전자 재조합 젤라틴 CBE3에 대해서 단백질·폴리펩티드의 친소수성의 지표인 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값을 구했다. GRAVY값에 대해서는 『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp.571-607』 및 『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003).』의 방법에 의해 얻었다. 그 결과, 유전자 재조합 젤라틴 CBE3의 GRAVY값은 -0.682이며, 친수성이 높은 소재인 것이 밝혀졌다.
실시예 3:마우스 피하에서의 유전자 재조합 젤라틴의 분해
유전자 재조합 젤라틴 CBE3에 대해서 생체내에서의 생분해성을 증명하기 위해서 마우스 피하에서의 분해성을 조사했다. 유전자 재조합 젤라틴 CBE3에 대해서 글루탈알데히드(GA)를 사용해서 가교를 실시하고, 유전자 재조합 젤라틴 CBE3 하이드로겔(5% CBE3을 0.1% GA 가교한 겔 및 3% CBE3을 0.075% GA 가교한 겔)을 제작했다. 얻어진 하이드로겔을 DDY 마우스(수컷의 8주령)의 배부피하에 매식하고, 경시 변화를 병리절편 및 잔존 겔량을 측정했다.
잔존 겔량에 대해서는 시험 일수 기간의 경과후에 겔을 인출하고, 동결 건조하고, 잔존한 겔을 건조 중량으로 해서 초기 매입시의 건조 중량과 비교했다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 나타내는 바와 같이 5% CBE3을 0.1% GA 가교한 겔의 잔존량은 보충시에 대해서 5일에 55%, 14일에 9%가 되고, 생체내에서 서서히 분해되어 가는 것이 밝혀졌다. 3% CBE3을 0.075% GA 가교한 겔에 대해서도 그 잔존량은 5.2일에 41%, 14.2일에 7%가 되고, 생체내에서 서서히 분해되어 가는 것이 밝혀졌다. 또한, 대표적인 병리절편의 화상(헤마톡실린에오신 염색)을 도 2에 기재한다. 유전자 재조합 젤라틴 CBE3겔이 서서히 분해되어 작아져 있는 모양을 알 수 있다. 상기의 결과로부터 유전자 재조합 젤라틴을 소재로 해서 제작되는 기재는 생분해성을 갖는 것이 실증되었다.
실시예 4:유전자 재조합 젤라틴 스폰지(다공질체)의 제작
유전자 재조합 젤라틴 CBE3을 사용해서 스폰지(다공질체)를 제작했다. 본 실시예에서는 10% CBE3의 것과 5% CBE3의 것을 제작했다. 이하의 조성으로 용액을 조정하고, 글루탈알데히드를 첨가후, 4℃에서 호모지나이저(AM-11, NIHONSEIKI제)로 17,000rpm으로 4분간 교반하고, 그대로 -80℃에서 3시간 급냉한다.
조성:
5% 스폰지 10mL분(CBE3:500mg, 초순수:9424μL, 1N HCl:76μL, 3% 글루탈알데히드: 500μL)
10% 스폰지10mL분(CBE3:1g, 초순수:9348μL, 1N HCl:152μL, 3% 글루탈알데히드: 500μL)
그 후, 4℃에서 16시간 정치해서 얻어진 것을 충분량의 37℃의 0.2M 글리신 용액 중에서 4시간 진탕한다. 그 후, 10L의 초순수로 세정을 8회(총 4시간) 반복하고나서 -80℃에서 2시간 동결시킨다. 그 후, 동결 건조기로 4일간 동결 건조를 행하고, 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(다공질체)를 얻었다.
실시예 5:유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 기공률의 측정
실시예 4에서 얻어진 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에 대해서 기공률을 측정했다. 측정에 있어서는 부피밀도(ρ)와 진밀도(ρc)를 측정하고, 기공률(P=1-ρ/ρc(%))을 구했다. 유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 부피밀도(ρ)는 건조 중량과 체적으로부터 산출했다. 진밀도(ρc)는 허버드 타입의 비중병법에 의해 구했다. 샘플수(N)=4의 결과로서 5% 스폰지에서는 부피밀도가 0.03g/㎤, 진밀도가 1.01g/㎤, 기공률 97%(CV값은 7%)를 달성하고 있는 것이 밝혀졌다. 또한, 10% 스폰지에서는 부피밀도가 0.05g/㎤, 진밀도가 1.23g/㎤, 기공률 96%(CV값은 8%)를 달성하고 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 6:유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 흡수율 측정
실시예 4에서 얻어진 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에 대해서 흡수율을 측정했다. 흡수율은 건조 중량(W0)과, 초순수를 25℃에서 5분간 자연히 흡수시켜 플라스틱 샤알레 상에서 여분의 물을 충분히 제거한 후의 물 팽윤시의 중량(W1)을 사용해서 (W1÷W0×100(%))에 의해 산출했다. 그 결과, 5% 스폰지의 샘플수(N)=5의 평균으로서 흡수율은 3640(%)이며, 높은 흡수율을 갖고 있는 것이 밝혀졌다.
실시예 7:유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 SEM 화상, 및 평균 기공 사이즈의 측정
실시예 4에서 얻어진 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에 대해서 내부 단면 구조를 주사형 전자 현미경으로 관찰했다. 대표적인 SEM 화상을 도 3(5% 스폰지의 단면), 및 도 4(10% 스폰지의 단면)에 나타낸다. 이것에 의해, 얻어진 유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 다공질 내부 구조가 밝혀졌다. 내부 기공 사이즈는 10% 스폰지가 106.0±7.7㎛(직경의 개수 평균으로서)이며, 5% 스폰지가 114.8±15.8㎛였다. 또한, 도 3 및 도 4로부터도 알 수 있는 바와 같이 기공간에는 기공간 연통 구멍이 존재하고 있고, 이것에 의해 스폰지 외부로부터 스폰지 심부에 이르기까지 기공이 연결되어 있는 것을 알 수 있다. 또한, 이 기공간 연통 구멍은 10㎛ 이상의 사이즈인 것을 확인할 수 있는 점에서 세포가 대략 연통 구멍을 통과 가능한 것을 알 수 있다. 상기의 결과로부터 스폰지에 파종한 세포가 스폰지 내부로 분산·확산 가능한 것을 알 수 있다.
실시예 8:콜라겐 스폰지 및 유전자 재조합 젤라틴 스폰지내에 있어서의 세포의 분포의 비교
실시예 4에서 얻어진 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(5%, 10%)와 비교용 콜라겐 스폰지(니이타 젤라틴:35mm 디시용)에 대해서 같은 형상(직경 8mm, 높이 5mm의 원기둥상)으로 성형하고, 24구멍 배양 플레이트내에서 세포를 스폰지 상부로부터 파종했다. 파종한 세포는 인간 간엽계 줄기세포(hMSC)이며, 800만cells/mL의 농도로 배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTM BulletKitTM)로 현탁하고, 그 현탁액(250μL)을 스폰지에 파종했다. 2시간 정치후에 플레이트 저면에 배지를 첨가하고, Day1, Day4까지 배양했다. 그 결과, 콜라겐 스폰지에서는 파종한 세포가 스폰지를 통과해서 저면으로 떨어져 버리는 것이 많이 존재한 것에 비해 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 저면으로 탈락하는 세포가 적었다.
또, 세포를 파종한 스폰지에 대해서 PBS로 세정후, 10% 포름알데히드로 고정, 파라핀 포매하고, 조직 절편을 작성했다. 염색은 HE 염색을 행하고, 스폰지 내부에 있어서의 세포의 분포를 시각화했다. (도5, 6, 7, 8). 그 결과, 비교용 콜라겐 스폰지에서는 세포의 분포가 불균일하게 되어 있는 것에 대해서 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 세포가 스폰지내에 균일하게 분포하고, 또 세포가 스폰지로부터 탈락하는 경우가 적고, 스폰지내에 많은 세포가 보여지는 것이 판명되었다. 또한, 각각 절편사진을 구분하고, 각 구획에 존재하는 세포수를 카운트한 후, 각 구획의 점유 면적(스폰지내)으로 나눔으로써 단위면적당 세포수를 구했다. 구한 단위면적당 세포수에 대해서 편차를 CV값으로 도 5, 6, 7, 8에 나타냈다. 이 편차의 CV값에 의해 분포가 균일한지의 여부를 알 수 있다. 콜라겐 스폰지에서는 Day1:45%, Day4:56%로 되어 매우 분포가 불균일한 것에 비해 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 Day1:29%, Day4:30%로 분포가 균일한 것을 정량적으로도 알 수 있다. 또한, 콜라겐 스폰지에서는 스폰지 자체의 형상이 배양과 함께 변형되어 가는 것도 결점으로서 확인된 한편, 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 스폰지 자체의 형상이 확실히 유지되어 있는 것도 확인할 수 있었다.
실시예 9:아테로 콜라겐 스폰지(허니컴) 및 유전자 재조합 젤라틴 스폰지내에 있어서의 세포의 분포의 비교
실시예 4에서 얻어진 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(5%, 10%)와 비교용 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지(고켄)에 대해서 같은 형상(3mm×2mm×2mm의 직육면체)으로 성형하고, 24구멍 배양 플레이트내에서 세포를 스폰지 상부로부터 파종했다. 파종한 세포는 인간 간엽계 줄기세포(hMSC)이며, 800만cells/mL의 농도로 배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTM BulletKitTM)로 현탁하고, 그 현탁액(12μL)을 스폰지에 파종했다. 2시간 정치 후에 플레이트 저면에 배지를 첨가하고, Day1, Day4까지 배양했다. 그 결과, 비교용 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지에서는 파종한 세포가 스폰지를 통과해서 저면으로 떨어져 버리는 것이 많이 존재한 것에 비해 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 저면으로 탈락하는 세포가 적었다.
또, 세포를 파종한 스폰지에 대해서 PBS로 세정 후 10% 포름알데히드로 고정, 파라핀 포매하고, 조직 절편을 작성했다. 염색은 HE 염색을 행하고, 스폰지 내부에 있어서의 세포의 분포를 시각화했다(도 9, 10, 11, 12). 그 결과, 비교용 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지에서는 세포의 분포가 불균일하게 되어 있는 것에 대해서 본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 세포가 스폰지내에 균일하게 분포하고, 또 세포가 스폰지로부터 탈락하는 경우가 적고, 스폰지내에 많은 세포가 보여지는 것이 판명되었다. 또한, 각각 절편사진을 구분하고, 각 구획에 존재하는 세포수를 카운트한 후 각 구획의 점유 면적(스폰지내)으로 나눔으로써 단위면적당 세포수를 구했다. 구한 단위면적당 세포수에 대해서 편차를 CV값으로 도 9, 10, 11, 12에 나타냈다. 이 편차의 CV값에 의해 분포가 균일한지의 여부를 알 수 있다. 아테로 콜라겐 허니컴 스폰지에서는 Day1:66%, Day4:79%로 되어 매우 분포가 불균일한 것에 비해 유전자 재조합 젤라틴 스폰지에서는 Day1:27%, Day4:18%로 분포가 균일한 것을 정량적으로도 알 수 있다.
비교예 1:콜라겐겔 포매 배양법(비교용)
본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지내에서의 세포분포·세포배양과의 비교로서 콜라겐겔 포매 배양을 실시했다. 형상으로서는 실시예 8과 같은 원기둥상의 형태로 실시했다. 0.5% 아테로콜라겐 용액(고켄:IPC-50, AteloCell)과 배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTM BulletKitTM)을 1:1의 비율로 4℃ 빙상에서 혼합한 혼합배지를 작성했다. 혼합배지에 인간 간엽계 줄기세포(hMSC)를 800만cells/mL 농도로 현탁하고, 현탁액(500μL)을 48구멍 플레이트에 파종했다. 37℃, 5% CO2에서 30분 정치함으로써 겔화시키고, 그 후, 10분량의 배지를 첨가하여 4일간 배양(Day4)했다. 배양시 배지는 매일 새로운 배지로 교환했다. Day4의 샘플에 대해서 포르말린 고정, 파라핀 포매, 절편을 작성했다. 염색은 HE 염색을 행하고, 내부의 세포분포를 시각화했다(도 13, 14). 또한, 각각 절편사진을 구분하고, 각 구획에 존재하는 세포수를 카운트한 후, 각 구획의 점유 면적(스폰지내)으로 나눔으로써 단위면적당 세포수를 구했다. 구한 단위면적당 세포수에 대해서 편차를 CV값으로 도 13, 14에 나타냈다. 이 편차의 CV값에 의해 분포가 균일한지의 여부를 알 수 있다. 아테로 콜라겐겔 포매 배양에서는 Day1:45%, Day4:51%로 되어 매우 분포가 불균일했다. 그 결과, 아테로 콜라겐겔내에서 배양한 세포는 불균일한 상태로 되는 것이 나타내어지며, 종래 기술인 콜라겐겔 포매 배양에 있어서 문제로 되어 있는 겔내에서의 세포분포의 불균일함이 재현되었다. 또한, 콜라겐겔 포매에서는 겔 자체의 형상이 배양과 함께 변형되는 것도 결점으로서 확인되었다.
비교예 2:콜라겐 상에서의 세포파종·세포배양(비교용)
본 발명의 유전자 재조합 젤라틴 스폰지내에서의 세포분포·세포배양과의 비교로서 콜라겐겔 상으로의 세포파종·세포배양을 실시했다. 형상으로서는 실시예 8과 같은 원기둥상의 형태로 실시했다. 0.5% 아테로콜라겐 용액(고켄:IPC-50, AteloCell)과 배지(다카라 바이오:MSCGM-CDTM BulletKitTM를 4℃ 빙상에서 혼합한 혼합배지를 작성하고, 혼합배지(500μL)를 48구멍 플레이트에 첨가했다. 37℃, 5% CO2에서 30분 정치함으로써 콜라겐겔을 얻었다. 이 콜라겐겔 상에 800만cells/mL의 hMSC 세포 현탁액을 500μL 파종하고, 4일간 배양(Day4)했다. 배양시 배지는 매일 새로운 배지로 교환했다. Day4의 샘플에 대해서 포르말린 고정, 파라핀 포매, 절편을 작성했다. 염색은 HE 염색을 행하고, 내부의 세포분포를 시각화했다(도 15, 16). 그 결과, 아테로 콜라겐겔 상에 파종·배양한 세포는 겔상으로부터 겔내로 이동할 수 없고 겔내에 균일한 분포를 보이는 일은 없었다.
실시예 10:세포 접착성 시험
유전자 재조합 젤라틴 스폰지내에서 세포가 균일하게 분포 가능한 것의 요인의 하나로서 유전자 재조합 젤라틴이 세포 접착성을 갖는 것이 고려된다. 유전자 재조합 젤라틴의 세포 접착성이 높은 것에 의해 세포의 누출이나 불균일 분포를 억제할 수 있을 가능성이 있기 때문이다. 그래서, 유전자 재조합 젤라틴의 세포 접착성을 조사하기 위해서 유전자 재조합 젤라틴 CBE3의 세포에의 접착성 시험을 행했다.
사용한 세포는 HUVEC(정상 인간 제대정맥 내피세포:다카라 바이오사)를 사용했다. HUVEC는 일반적으로 각종 기재에의 세포 접착이 나쁜 세포로서 알려져 있다. HUVEC의 배양에는 내피세포 기본배지-2(무혈청)(EBMTM-2) 및 내피세포 배지키트-2(2% FBS)(EGMTM-2 BulletKitTM)를 사용했다(다카라 바이오사). 계대배양시 및 세포 박리시에는 EDTA 함유 0.25% trypsin 용액을 사용했다. T-75 플라스크ㄹ에서 충분량까지 증식시킨 HUVEC를 플라스크 저면으로부터 박리하고, 원심에 의해 상청을 제거했다. 그 후, 상기 내피세포 배지키트-2가 포함된 내피세포 기본배지-2로 세정하고, 다시 원심에 의해 상청을 제거하고, 내피세포 배지키트-2를 포함하지 않는 내피세포 기본배지-2에 0.1% BSA를 첨가한 용액을 첨가·현탁하고, 세포 계수반에서 생세포의 수를 카운트하고, 최종 세포농도를 50만cells/mL로 조정했다.
한편, 세포 접착성의 비교 시험을 위해서 각종 단백질(유전자 재조합 젤라틴 CBE3, 피브로넥틴, Fibrogen사제 콜라겐(이후 Fibrogen이라고 기재한다), 돈피 유래 젤라틴(이후, PSK라고 기재한다), 소골 유래 젤라틴(이후, G1917P라고 기재한다))으로 코팅한 플레이트의 준비를 행했다. PBS(인산 완충액)에 1mg/mL 농도로 유전자 재조합 젤라틴 CBE3을 용해시켜 유전자 재조합 젤라틴 CBE3 용해액을 제작했다. PBS(인산 완충액)에 1mg/mL 농도로 피브로넥틴을 용해시켜 피브로넥틴 용해액을 제작했다. PBS(인산 완충액)에 1mg/mL 농도로 Fibrogen을 용해시켜 Fibrogen 용해액을 제작했다. PBS(인산 완충액)에 1mg/mL 농도로 PSK를 용해시켜 PSK 용해액을 제작했다. PBS(인산 완충액)에 1mg/mL 농도로 G1917P를 용해시켜 G1917P 용해액을 제작했다. 상기 용해액은 수시로 PBS로 희석해서 플레이트 첨가에 사용했다.
플레이트에는 Non-treated 96구멍 플레이트(IWAKI)를 사용했다. Non-treated 96 구멍 플레이트에 단백질 농도가 0.02,0.1,0.2, 2.0μg/well이 되도록 PBS로 상기 용해액을 희석한 용액을 50μL/well로 첨가했다. 그 후, 37℃에서 2시간 인큐베이팅하고, 용액을 제거한 후에 모든 well에 100μL의 PBS를 첨가·세정하고, PBS를 제거(세정 공정)했다. 상기 세정 공정을 3회 행했다. 이것에 의해, 코팅 단백질 및 코팅 농도가 다른 코팅 플레이트를 얻었다.
본 코팅 플레이트에 상기에서 준비한 HUVEC 현탁액(50만cells/mL)을 100μL씩 파종했다. 37℃에서 1시간 인큐베이팅한 후, 배지를 흡인 제거하고, 100μL의 PBS를 첨가해서 세정하고, PBS는 흡인에 의해 제거했다(PBS 세정). 본 PBS 세정을 3회 행하고, PBS를 제거한 상태의 플레이트를 얻었다.
얻어진 플레이트 상의 세포수 정량에는 DNA assay를 사용했다. 얻어진 플레이트의 well에 각각 100μL의 SDS 용액(20mg의 SDS를 100mL의 1×SSC 용액으로 용해한 것: 1×SSC 용액이란 17.999g의 NaCl과 8.823g의 Na3Citrate를 2L의 초순수로 용해한 것이다)을 첨가하고, 37℃에서 1시간 정치한다. 얻어진 각각의 용액 전량을 각각 96구멍 블랙 플레이트(Non-treated)로 옮기고, 100μL의 Hoechst 용액(Hoechst 33258을 20μL와 1×SSC 용액 20mL를 혼합한 것)을 모든 well에 첨가하고, 플레이트 리더로 형광 강도를 측정했다. 사용한 플레이트 리더는 Gemini EM(몰레큘러 디바이스사), 여기 파장 355nm, 측정 파장 460nm으로 형광강도를 측정했다. 검량선은 세포수를 조정한 HUVEC 세포의 현탁액으로 작성했다.
얻어진 세포 접착성 시험(DNA assay)의 결과를 도 17 및 도 18에 나타냈다. 또한, 유전자 재조합 젤라틴으로 코팅한 플레이트에의 세포 접착의 모양을 도 19에 사진으로서 나타냈다. 상기의 결과로부터 유전자 재조합 젤라틴이 양호한 세포 접착성을 갖고 있는 것이 나타내어졌다.
실시예 11:유전자 재조합 젤라틴 파우더의 제작
유전자 재조합 젤라틴 CBE3을 사용해서 파우더(입자형상)를 제작했다. 본 실시예에서는 7.5% CBE3의 것을 제작했다. 이하의 조성으로 용액을 조정하여 글루탈알데히드를 첨가 후, 25℃에서 충분히 교반한 후, 그대로 4℃에서 16시간 가교 반응을 행한다.
조성:
7.5% 스폰지 10mL분(CBE3:750mg, 초순수:8893.6μL, 1N HCl:106.4μL, 3% 글루탈알데히드: 1000μL)
4℃에서 16시간 정치·반응해서 얻어진 것을 충분량의 37℃의 0.2M 글리신 용액내에서 4시간 진탕한다. 그 후, 10L의 초순수로 세정을 8회(총 4시간) 반복하고나서 -80℃에서 2시간 동결시킨다. 그 후, 동결 건조기로 4일간 동결 건조를 행하고, 얻어진 건조체를 뉴파워밀(오사카 케미칼, 뉴파워밀 PM-2005)로 분쇄했다. 얻어진 분쇄물에 대해서 스테인레스제 체로 사이즈 분별하여 500∼710㎛ 크기의 파우더(입자형상)를 얻었다.
실시예 12:래트 두개골 결손 모델에 있어서의 골재생 평가
골재생능을 평가하는 동물 실험 모델로서 래트 두개골 결손 모델을 사용했다(Tissue Eng(2007)13(3):501-12). 래트 두개골 결손 모델은 일반적으로 골보충제의 평가에 사용되고 있다.
Sprague-Dawley 래트(SD 래트, 수컷, 10-12주령)를 마취하고, 우측 두개골에 드릴(Osada Success 40, 오사다 덴키 고교)로 원형의 결손부(φ=5mm)를 작성했다(도 20). 골재생에 영향을 주는 결손부의 골편이나 혈액을 생리식염수로 세정, 제거했다. 제작된 결손부에 골재생 평가를 행하고 싶은 샘플을 결손부에 매식하고, 이식 샘플이 결손부로부터 비산되지 않도록 콜라겐막(BioGide)으로 뚜껑을 덮은 후, 환부 피부를 봉합했다. 소정 기간 후(2주) 래트를 개복·방혈시켜 래트를 희생시키고, 결손시킨 환부의 육안관찰을 실시한 후, 상기 두부를 포르말린 고정·탈회해서 파라핀에 포매했다. 파라핀 포매 블록을 박절하고, 얻어진 절편을 헤마토크실린-에오신(H&E) 염색해서 표본을 제작했다. 평가에 대해서는 병리표본을 광학 현미경에 의해 관찰하고, 촬영한 사진으로부터 조직을 New Bone, Mesenchyme, Granulation으로 나누고 각각의 면적을 계산했다. 결손부에 있어서의 재생골(New Bone) 비율, 또 표본 중의 재생 골량(㎛2)을 평가했다.
실시예 13:유전자 재조합 젤라틴 스폰지의 골재생율을 래트 두개골 결손부에서 평가
실시예 4에서 제작한 유전자 재조합 젤라틴 스폰지(5%), 실시예 11에서 제작한 유전자 재조합 젤라틴 파우더(입자상)를 실시예 12에서 제작한 래트 두개골 결손 부분에 이식했다. 이식물이 비산하지 않도록 콜라겐제 막(BioGide, Osteohealth사)을 설치했다. 또한, 환부에 아무 것도 적용하지 않은 군을 컨트롤군으로 했다.
그 결과, 유전자 재조합 젤라틴 파우더(입자상)를 이식한 군에서는 골재생량은 209928㎛2, 재생골 비율은 6.8%였다. 한편, 유전자 재조합 젤라틴 스폰지를 이식한 군에서는 골재생량은 732104㎛2, 재생골 비율은 50.0%로 올라 극히 골재생이 빠르게 유도되고 있는 것을 알 수 있었다. 이것에 의해, 동일 소재이어도 본 발명의 구조를 부여함으로써 골재생 효과를 현저하게 상승시키는 것이 명확해졌다.
도 21에 골재생량, 및 골재생 비율의 데이터를 표로 정리했다. 또한, 도 22에는 유전자 재조합 젤라틴 파우더를 이식한 군 및 유전자 재조합 젤라틴 스폰지를 이식한 군의 대표적인 병리사진을 나타냈다.
실시예 14:천연 젤라틴 스폰지(다공질체)의 제작
동물 유래 천연 젤라틴 APAT(Nippi, 닛삐 젤라틴·하이그레이드 젤라틴 APAT)를 사용해서 천연 젤라틴 스폰지(다공질체)를 제작했다. 본 실시예에서는 5% 농도의 것을 제작했다. 이하의 조성으로 용액을 조정하고, 글루탈알데히드를 첨가후, 4℃에서 호모지나이저(AM-11, NIHONSEIKI제)로 17,000rpm으로 4분간 교반하고, 그대로 -80℃에서 3시간 급냉한다.
조성:
5% 스폰지 10mL분(APAT:500mg, 초순수:9424μL, 1N HCl:76μL, 3% 글루탈알데히드: 500μL)
그 후, 4℃에서 16시간 정치해서 얻어진 것을 충분량의 37℃의 0.2M 글리신 용액내에서 4시간 진탕한다. 그 후, 10L의 초순수로 세정을 8회(총 4시간) 반복하고 나서 -80℃에서 2시간 동결시킨다. 그 후, 동결 건조기로 4일간 동결 건조를 행하고 천연 젤라틴 스폰지(다공질체)를 얻었다.
실시예 15:천연 젤라틴 스폰지의 골재생율을 래트 두개골 결손부에서 평가
실시예 14에서 제작한 천연 젤라틴 스폰지(5%)를 실시예 12에서 제작한 래트 두개골 결손 부분에 이식했다. 이식물이 비산하지 않도록 콜라겐제 막(BioGide, Osteohealth사)을 설치했다. 또한, 환부에 아무 것도 적용하지 않은 군을 컨트롤군으로 했다.
그 결과, 천연 젤라틴 스폰지를 이식한 군에서는 골재생량은 819960㎛2, 재생 골비율은 59.0%로 올라 극히 골재생이 빠르게 유도되고 있는 것을 알 수 있었다. 이것에 의해, 지금까지 일반적으로는 골재생에 적합하지 않다고 생각되었던 소재, 천연 젤라틴이어도 본 발명의 구조를 부여함으로써 골재생 효과를 현저하게 상승시키는 것이 가능한 것이 명확해졌다. 도 21에 골재생량, 및 골재생 비율의 데이터를 표로 정리했다. 도 23에 천연 젤라틴 스폰지를 이식한 군의 대표적인 병리사진을 나타냈다.
SEQUENCE LISTING <110> FUJIFILM Corporation <120> A cell support and a material for bone regeneration <130> 10F04559 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 571 <212> PRT <213> Recombinant <400> 1 Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly 1 5 10 15 Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu 20 25 30 Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro 35 40 45 Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly 50 55 60 Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala 65 70 75 80 Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro 85 90 95 Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly 100 105 110 Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val 115 120 125 Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro 130 135 140 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly 145 150 155 160 Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala 165 170 175 Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro 180 185 190 Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly 195 200 205 Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp 210 215 220 Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln 225 230 235 240 Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly 245 250 255 Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys 260 265 270 Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg 275 280 285 Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly 290 295 300 Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu 305 310 315 320 Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro 325 330 335 Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly 340 345 350 Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala 355 360 365 Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro 370 375 380 Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly 385 390 395 400 Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro 405 410 415 Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro 420 425 430 Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly 435 440 445 Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val 450 455 460 Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala 465 470 475 480 Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly 485 490 495 Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro 500 505 510 Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln 515 520 525 Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly 530 535 540 Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys 545 550 555 560 Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly 565 570

Claims (26)

  1. 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지고,
    (a) 기공률: 81% 이상 99.99% 이하
    (b) 평균 기공 사이즈: 10∼400㎛
    (c) 기공간 연통 구멍을 가짐, 및
    (d) 흡수율: 1000%(wt/wt) 이상 9900%(wt/wt) 이하
    상기 생분해성 재료는 천연 또는 유전자 재조합 젤라틴, 천연 또는 유전자 재조합 피브로넥틴, 또는 천연 또는 유전자 재조합 라미닌인 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료의 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값은 -5.0 이상 0.3 이하인 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료는 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 가교는 알데히드류, 축합제, 또는 효소에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  7. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료는 유전자 재조합 젤라틴인 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
    식:A-[(Gly-X-Y)n]m-B
    [식 중, A는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, B는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, n개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n은 3∼100의 정수를 나타내고, m은 2∼10의 정수를 나타낸다. 또한, n개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
  9. 제 7 항에 있어서,
    유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
    식:Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
    [식 중, 63개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, 63 개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다. 또한, 63개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 유전자 재조합 젤라틴은, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  11. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료를 가교한 후 교반하고, 그 후에 동결 건조함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 세포 지지체.
  12. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 재생 의료 재료.
  13. 제 1 항, 제 2 항, 제 5 항, 및 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 지지체와 이식 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 재생 의료 재료.
  14. 생분해성 재료로 구성되는 다공질체로서 이하의 특성을 갖는 다공질체로 이루어지고,
    (a) 기공률: 81% 이상 99.99% 이하
    (b) 평균 기공 사이즈: 10∼400㎛
    (c) 기공간 연통 구멍을 가짐, 및
    (d) 흡수율: 1000%(wt/wt) 이상 9900%(wt/wt) 이하
    상기 생분해성 재료는 천연 또는 유전자 재조합 젤라틴, 천연 또는 유전자 재조합 피브로넥틴, 또는 천연 또는 유전자 재조합 라미닌인 것을 특징으로 하는 골재생재.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료의 Grand average of hydropathicity(GRAVY)값은 -5.0 이상 0.3 이하인 것을 특징으로 하는 골재생재.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료는 가교되어 있는 것을 특징으로 하는 골재생재.
  19. 제 18 항에 있어서,
    가교는 알데히드류, 축합제, 또는 효소에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 골재생재.
  20. 제 14 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료는 유전자 재조합 젤라틴인 것을 특징으로 하는 골재생재.
  21. 제 20 항에 있어서,
    유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 골재생제.
    식:A-[(Gly-X-Y)n]m-B
    [식 중, A는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, B는 임의의 아미노산 또는 아미노산 서열을 나타내고, n개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, n은 3∼100의 정수를 나타내고, m은 2∼10의 정수를 나타낸다. 또한, n개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
  22. 제 20 항에 있어서,
    유전자 재조합 젤라틴은 하기 식으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는 골재생재.
    식:Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly
    [식 중, 63개의 X는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타내고, 63 개의 Y는 각각 독립적으로 아미노산 중 어느 하나를 나타낸다. 또한, 63개의 Gly-X-Y는 각각 동일해도 달라도 좋다]
  23. 제 20 항에 있어서,
    유전자 재조합 젤라틴은, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 골재생재.
  24. 제 14 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생분해성 재료를 가교한 후 교반하고, 그 후에 동결 건조함으로써 제조되는 것을 특징으로 하는 골재생재.
  25. 제 14 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 골재생재를 포함하는 것을 특징으로 하는 재생 의료 재료.
  26. 제 14 항, 제 15 항, 제 18 항, 및 제 19 항 중 어느 한 항에 기재된 골재생재와 이식 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 재생 의료 재료.
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